高产过氧化物淬灭控制的多糖解聚及其组合物的制作方法

高产过氧化物淬灭控制的多糖解聚及其组合物
相关申请的交叉引用
1.本技术要求于2019年11月14日提交的美国临时专利申请第62/935,583号的权益和优先权，该申请的全文通过引用纳入本文。
技术领域
2.本发明的内容总体上涉及多糖解聚，具体涉及用于生产寡糖的多糖解聚，更具体地，涉及使用化学氧化和裂解的多糖解聚，甚至更具体地，涉及用于多糖解聚和生产寡糖的受控的寡糖生成(“cog”)方法，所述方法通过使用芬顿试剂氧化多糖材料以提供过氧化氢自由基处理过的多糖，然后使用相容的过氧化物淬灭/裂解试剂(pqc-试剂)对处理过的多糖进行过氧化物消除(过氧化物淬灭)和受控裂解以消除残留的过氧化氢并引发高产的多糖裂解，同时最大限度地减少或消除不需要的副反应。


背景技术：

3.寡糖是碳水化合物的短链，通常长度范围为3个至20个单体。寡糖已被证明具有多种功能(例如，生物活性功能等)，这些功能受许多结构属性的影响，例如立体化学、分支、聚合度、单糖组成和糖苷键位置(amicucci,nandita et al.2019)。例如，来自人乳中的寡糖(hmo)可促进初生于婴儿肠道的某些微生物的生长，同时还能调节免疫系统，减少腹泻的发生，并保护宿主免受病原体粘附(morrow,ruiz-palacios et al.2004,locascio,ni否nuevo et al.2007,smilowitz,lebrilla et al.2014)。
4.目前，生物合成是用于大规模生产人乳寡糖的主要工具(merighi et al.2016,yu et al.2018)。此外，除了hmo和其他两种常见的寡糖(低聚半乳糖(gos)和低聚果糖(fos))之外，几乎没有进行什么工作来扩展寡糖的制造领域(gosling et al.2010,dominguez et al.2014)。多糖(例如，均聚物多糖或杂聚物多糖)可以包含例如多达至100,000个的单体构件(building block)，并且普遍存在于所有生物体中，包括例如植物、哺乳动物、真菌、细菌、硅藻和藻类(bar-on et al.2018)。多糖通常因其流变特性而被使用，但最近对其的益生元(prebiotic)和免疫调节潜力进行了探索，然而，这些特性受到其低溶解度和胞间运输的限制(hamakerand tuncil 2014)。因此，具有与其亲本多糖相似的表位的可溶的且易于运输的寡糖可以为微生物组调节和免疫调节提供更有效的途径。
5.从大的多糖解到寡糖的聚成可以提供从天然起始材料生产大量结构多样的寡糖的机会。酶促方法已被用于从多糖中生产寡糖，然而，它们固有的特异性限制了每种酶只能解聚单一类型的糖苷键，从而只能解聚数量非常有限的多糖(pauly et al.1999,bauer et al.2006)。用于解聚多糖的化学方法虽然在本领域中是已知的，并不是常规使用的，但可以提供了更稳健和更广泛的多糖解聚途径。
6.例如，氧化化学通常用于修饰碳水化合物的分子量和官能团(et al.2015,sun et al.2015)。芬顿化学反应和类芬顿化学反应依赖过渡金属和过氧化氢来产生可以驱动许多氧化反应的过氧化氢自由基(wardman and candeias 1996)。目前，芬顿
化学反应已大规模用于废水处理(wang et al.2016)。最近描述了一种方法，其使用芬顿化学反应进行多糖解聚，然后使用强阿伦尼乌斯碱(arrhenius base)(na

oh-、k

oh-或ca
2
(oh-)2)进行裂解(amicucci,park et al.2018)。然而，使用这种强阿伦尼乌斯碱作为裂解剂的多糖解聚，不仅需要使用大规模透析来去除残留的反应后盐(在中和强阿伦尼乌斯碱之后)，而且还会在强阿伦尼乌斯碱裂解步骤和裂解后(例如透析)的步骤中发生“剥离(peeling)”(cancilla et al.1998)和脱靶副反应(例如，c-6氧化产生含有寡糖的糖醛酸和其他潜在不需要的物质)。这是因为虽然强阿伦尼乌斯碱裂解剂“淬灭”了芬顿反应(即，通过使金属离子反应物絮凝)，但这种碱不会(如下文所公开)淬灭/消除残留的过氧化物或过氧化物自由基本身。此外，在用于过氧化反应和裂解步骤的最优过氧化物和ph浓度/条件下，这种剥离和脱靶反应可能会成为问题，而如果使用较低浓度或次优条件，可能会影响寡糖产量。


技术实现要素：

7.可以从以下方面对本公开的各个方面进行描述：
8.1.一种用于裂解多糖的方法，其包括：使多糖与含有过氧化物剂(agent)和金属离子的芬顿试剂在反应混合物中进行反应，以提供处理过的多糖；以及用氮基裂解试剂(reagent)裂解所述处理过的多糖以产生具有所述多糖特征的至少一种多糖裂解产物和/或寡糖。
9.2.方面1所述的方法，其中裂解产生具有所述多糖特征的多糖裂解产物混合物和/或寡糖混合物。
10.3.方面1或2所述的方法，其中所述芬顿试剂包括过氧化氢和一种或多种选自以下的金属：过渡金属fe(ii)、fe(iii)、cu(i)、cu(ii)、mn(ii)、zn(ii)、ni(ii)和co(ii)；碱土金属ca(ii)和mg(ii)；以及镧系元素ce(iv)。
11.4.方面1-3中任一项所述的方法，其中所述氮基裂解试剂是选自氢氧化铵、碳酸氢铵、氨、尿素、氨基钠、二甲胺、三甲胺、吡啶和n,n-二异丙基乙胺中的一种或多种。
12.5.方面4所述的方法，其中所述氮基裂解试剂是选自氢氧化铵、碳酸氢铵和氨中的一种或多种。
13.6.方面1-5中任一项所述的方法，其中所述氮基裂解试剂也是过氧化物淬灭剂，并且多糖裂解的引发与过氧化物淬灭的引发是同时的(commensurate)或是基本同时的。
14.7.方面1-6中任一项所述的方法，其中所述氮基裂解剂不是过氧化物淬灭剂，并且所述方法还包括用另外的过氧化物淬灭剂引发过氧化物淬灭。
15.8.方面7所述的方法，其中所述另外的过氧化物淬灭剂包括过氧化物淬灭酶或一种或多种列于表1中的过氧化物淬灭剂。
16.9.方面6-8中任一项所述的方法，其中所述另外的过氧化物淬灭剂也是可裂解所述处理过的多糖的另外的多糖裂解试剂。
17.10.方面1-5和方面7-9中任一项所述的方法，其中在用所述氮基裂解试剂引发多糖裂解之前、用所述氮基裂解试剂引发多糖裂解之时或用所述氮基裂解试剂引发多糖裂解之后引入所述另外的过氧化物淬灭剂。
18.11.方面1-10中任一项所述的方法，其还包括通过蒸发去除所述氮基裂解试剂和/或淬灭剂，或一种或多种它们的反应组分。
19.12.方面1-11中任一项所述的方法，其中相对于用强阿伦尼乌斯碱裂解所述处理过的多糖，所述寡糖的产量提高和/或其中脱靶副反应减少和/或剥离减少。
20.13.方面1-12中任一项所述的方法，其中所述多糖来源于选自如下的至少一种材料或以选自如下的至少一种材料的形式呈现：植物、细菌、酵母、藻类、动物、真菌和废产物流材料。
21.14.方面13所述的方法，其中所述多糖包括选自以下的一种或多种：直链淀粉(amylose)、支链淀粉(amylopectin)、β-葡聚糖(betaglucan)、普鲁兰多糖、木葡聚糖、阿拉伯半乳聚糖i和阿拉伯半乳聚糖ii、鼠李半乳糖醛酸聚糖i、鼠李半乳糖醛酸聚糖ii、聚半乳糖醛酸、聚葡萄糖、半乳聚糖、阿拉伯聚糖、阿拉伯木聚糖、木聚糖(例如，山毛榉木聚糖)、糖原、甘露聚糖、葡甘露聚糖、凝胶多糖、半乳甘露聚糖、地衣多糖(lichenan)和菊粉。
22.15.方面1-14中任一项所述的方法，其中所述反应和所述裂解改变了包括所述多糖的材料的至少一种结构性质和/或化学性质，其中所述性质选自溶解度、质地、孔隙率、渗透性、弹性、流变特性和化学反应性。
23.16.一种组合物，其包含通过方面1-15中任一项所述的方法产生的一种或多种多糖裂解产物、寡糖、或多糖裂解产物和/或寡糖的混合物。
24.17.一种调节微生物生长和/或微生物代谢或宿主代谢的方法，其包括在体外或体内使微生物与根据方面16所述的组合物接触。
25.18.一种用于裂解多糖的方法，其包括：
26.使多糖与含有过氧化物剂和金属离子的芬顿试剂在反应混合物中进行反应，以提供处理过的多糖；以及
27.在过氧化物淬灭剂的存在下，用多糖裂解剂裂解所述处理过的多糖以产生具有所述多糖特征的至少一种多糖裂解产物和/或寡糖。
28.19.方面18所述的方法，其中裂解产生多糖裂解产物的混合物和/或具有多糖特征的寡糖混合物。
29.20.方面18或19所述的方法，其中所述芬顿试剂包括一种或多种选自以下的金属：过渡金属fe(ii)、fe(iii)、cu(i)、cu(ii)、mn(ii)、zn(ii)、ni(ii)和co(ii)；碱土金属ca(ii)和mg(ii)；以及镧系元素ce(iv)。
30.21.方面18-20中任一项所述的方法，其中所述多糖裂解剂包括一种或多种强阿伦尼乌斯碱、弱阿伦尼乌斯碱或非阿伦尼乌斯碱。
31.22.方面18-21中任一项所述的方法，其中所述多糖裂解剂包括一种或多种选自以下的氮基裂解试剂：氢氧化铵、碳酸氢铵、氨、尿素、氨基钠、二甲胺、三甲胺、吡啶和n,n-二异丙基乙胺。
32.23.方面22所述的方法，其中所述氮基裂解试剂是选自氢氧化铵、碳酸氢铵和氨中的一种或多种。
33.24.方面18-23中任一项所述的方法，其中所述多糖裂解剂也是所述过氧化物淬灭剂，并且多糖裂解的引发与过氧化物淬灭的引发是同时的或基本同时的。
34.25.方面18-23中任一项所述的方法，其中所述多糖裂解剂不是所述过氧化物淬灭
剂。
35.26.方面24或25所述的方法，其中所述过氧化物淬灭剂包括过氧化物淬灭酶或一种或多种列于表1中的过氧化物淬灭剂。
36.27.方面26所述的方法，其中所述过氧化物淬灭剂也是裂解所述处理过的多糖的另外的多糖裂解试剂。
37.28.方面18-23和方面25-27中任一项所述的方法，其中在用所述多糖裂解试剂引发多糖裂解之前、用所述多糖裂解试剂引发多糖裂解之时或用所述多糖裂解试剂引发多糖裂解之后引入所述过氧化物淬灭剂。
38.29.方面18-28中任一项所述的方法，其还包括通过蒸发去除所述多糖裂解剂和/或淬灭剂，或一种或多种它们的反应组分(例如，作为气体)。
39.30.方面18-29中任一项所述的方法，其中相对于用强阿伦尼乌斯碱裂解所述处理过的多糖，所述寡糖产量提高和/或其中脱靶副反应减少和/或剥离减少。
40.31.方面18-30中任一项所述的方法，其中所述多糖来源于选自如下的至少一种材料或以选自如下的至少一种材料的形式呈现：植物、细菌、酵母、藻类、动物、真菌和废产物流材料。
41.32.方面30所述的方法，其中所述多糖包括选自以下的一种或多种：直链淀粉、支链淀粉、β-葡聚糖、普鲁兰多糖、木葡聚糖、阿拉伯半乳聚糖i和阿拉伯半乳聚糖ii、鼠李半乳糖醛酸聚糖i、鼠李半乳糖醛酸聚糖ii、聚半乳糖醛酸、聚葡萄糖、半乳聚糖、阿拉伯聚糖、阿拉伯木聚糖、木聚糖(例如，山毛榉木聚糖)、糖原、甘露聚糖、葡甘露聚糖、凝胶多糖、半乳甘露聚糖、半乳聚糖、地衣多糖和菊粉中的一种或多种。
42.33.方面18-32中任一项所述的方法，其中所述反应和所述裂解改变了包括所述多糖的材料的至少一种结构性质和/或化学性质，其中所述性质选自溶解度、质地、孔隙率、渗透性、弹性、流变特性和化学反应性。
43.34.一种组合物，其包含通过方面18-33中任一项所述的方法产生的一种或多种多糖裂解产物、寡糖、或多糖裂解产物和/或寡糖的混合物。
44.35.一种调节微生物生长和/或微生物代谢或宿主代谢的方法，其包括在体外或体内使微生物与根据方面34所述的组合物接触。
45.36.一种寡糖混合物，其通过包括以下的方法产生：
46.a)使一种或多种多糖与包括过氧化物剂和金属离子的芬顿试剂接触以形成混合物；
47.b)允许所述芬顿试剂与所述多糖反应指定反应时间；以及
48.c)在经过步骤b的所述指定反应时间后，向所述混合物中加入也可以是过氧化物淬灭试剂的裂解剂，
49.其中产生了寡糖混合物。
50.37.方面36所述的寡糖混合物，其中所述芬顿试剂包括过氧化氢和一种或多种选自以下的金属：过渡金属fe(ii)、fe(iii)、cu(i)、cu(ii)、mn(ii)、zn(ii)、ni(ii)和co(ii)；碱土金属ca(ii)和mg(ii)；以及镧系元素ce(iv)。
51.38.方面36或37所述的寡糖混合物，其中所述也可以是过氧化物淬灭试剂的裂解剂是氮基裂解剂。
52.39.方面38所述的寡糖混合物，其中所述氮基裂解试剂是选自氢氧化铵、碳酸氢铵、氨、尿素、氨基钠、二甲胺、三甲胺、吡啶和n,n-二异丙基乙胺中的一种或多种。
53.40.方面38或39所述的寡糖混合物，其中所述于氮基裂解试剂是选自氢氧化铵、碳酸氢铵和氨中的一种或多种。
54.41.方面36至40中任一项所述的寡糖混合物，其中所述也可以是过氧化物淬灭试剂的裂解剂既是裂解试剂又是过氧化物淬灭剂，并且多糖裂解的引发与过氧化物淬灭的引发是同时的或基本同时的。
55.42.方面36至41中任一项所述的寡糖混合物，其中所述也可以是过氧化物淬灭试剂的裂解剂不是过氧化物淬灭剂，并且所述方法还包括用另外的过氧化物淬灭剂引发过氧化物淬灭。
56.43.方面42所述的寡糖混合物，其中所述另外的过氧化物淬灭剂包括过氧化物淬灭酶或一种或多种列于表1中的过氧化物淬灭剂。
57.44.方面42或43所述的寡糖混合物，其中所述另外的过氧化物淬灭剂也是裂解所述处理过的多糖的额外的多糖裂解试剂。
58.45.方面42至44中任一项所述的寡糖混合物，其中在用所述也可以是过氧化物淬灭试剂的裂解剂引发多糖裂解之前、用所述也可以是过氧化物淬灭试剂的裂解剂引发多糖裂解之时或用所述也可以是过氧化物淬灭试剂的裂解剂引发多糖裂解之后引入所述另外的过氧化物淬灭试剂。
59.46.方面36至45中任一项所述的寡糖混合物，其中在步骤(c)之后，通过蒸发去除所述也可以是过氧化物淬灭试剂的裂解剂和任何另外的多糖裂解试剂，或一种或多种它们的反应组分。
60.47.方面36至46中任一项所述的寡糖混合物，其中所述寡糖混合物由不同的寡糖组合组成，除了在步骤(c)中使用强阿伦尼乌斯碱作为裂解试剂的以外。
61.48.方面36至47中任一项所述的寡糖混合物，其中步骤(a)中的所述一种或多种多糖来源于选自如下的至少一种材料或以选自如下的至少一种材料的形式呈现：植物、细菌、酵母、藻类、动物、真菌和废产物流材料。
62.49.方面36至48中任一项所述的寡糖混合物，其中步骤(a)的所述一种或多种多糖包括选自以下的一种或多种：直链淀粉、支链淀粉、β-葡聚糖、普鲁兰多糖、木葡聚糖、阿拉伯半乳聚糖i和阿拉伯半乳聚糖ii、鼠李半乳糖醛酸聚糖i、鼠李半乳糖醛酸聚糖ii、聚半乳糖醛酸、聚葡萄糖、半乳聚糖、阿拉伯聚糖、阿拉伯木聚糖、木聚糖(例如，山毛榉木聚糖)、糖原、甘露聚糖、葡甘露聚糖、凝胶多糖、半乳甘露聚糖、地衣多糖和菊粉中的一种或多种。
63.50.一种用于裂解多糖的方法，其包括：
64.a)使一种或多种多糖与包括过氧化物试剂和金属离子的芬顿试剂接触以形成混合物；
65.b)允许所述芬顿试剂与所述多糖反应指定反应时间；以及
66.c)在经过步骤b的所述指定反应时间后，向所述混合物中加入也可以是过氧化物淬灭试剂的裂解剂。
67.51.方面50所述的方法，其中步骤(a)和(b)在ph 4至ph 7的ph下进行。
68.52.方面50或51所述的方法，其中步骤(a)和(b)在ph 4.5至ph 6.5的ph下进行。
69.53.方面50至52中任一项所述的方法，其中步骤(a)和(b)在ph 5至ph 6的ph下进行。
70.54.方面50至53中任一项所述的方法，其中步骤(c)在6至11的ph下进行。
71.55.方面50至54中任一项所述的方法，其中步骤(c)在6.5至9.5的ph下进行。
72.56.方面50至55中任一项所述的方法，其中步骤(c)在7至9的ph下进行。
73.57.方面50至56中任一项所述的方法，其中步骤(c)在7至8的ph下进行。
74.58.方面50至57中任一项所述的方法，其中步骤(a)和(b)在10摄氏度至70摄氏度的温度中进行。
75.59.方面50至58中任一项所述的方法，其中步骤(a)和(b)在20摄氏度至60摄氏度的温度中进行。
76.60.方面50至59中任一项所述的方法，其中步骤(a)和(b)在25摄氏度至55摄氏度的温度中进行。
77.61.方面50至60中任一项所述的方法，其中步骤(c)在10摄氏度至70摄氏度的温度中进行。
78.62.方面50至61中任一项所述的方法，其中步骤(c)在20摄氏度至60摄氏度的温度中进行。
79.63.方面50至62中任一项所述的方法，其中步骤(c)在25摄氏度至55摄氏度的温度中进行。
80.64.方面50至63中任一项所述的方法，其中所述芬顿试剂包括过氧化氢和一种或多种选自以下的金属：过渡金属fe(ii)、fe(iii)、cu(i)、cu(ii)、mn(ii)、zn(ii)、ni(ii)和co(ii)；碱土金属ca(ii)和mg(ii)；以及镧系元素ce(iv)。
81.65.方面64所述的方法，其中所述芬顿试剂包括过氧化氢和一种或多种选自fe(ii)、fe(iii)、cu(i)和cu(ii)的金属。
82.66.方面65所述的方法，其中所述芬顿试剂包括过氧化氢和fe(iii)。
83.67.方面50至66中任一项所述的方法，其中所述也可以是过氧化物淬灭试剂的裂解剂既是过氧化物淬灭剂又是裂解剂。
84.68.方面50至67中任一项所述的方法，其中所述也可以是过氧化物淬灭试剂的裂解剂是选自氢氧化铵、碳酸氢铵、氨、尿素、氨基钠、二甲胺、三甲胺、吡啶和n,n-二异丙基乙胺中的一种或多种。
85.69.方面68所述的方法，其中也可以是过氧化物淬灭试剂的所述裂解剂是选自氢氧化铵、碳酸氢铵和氨中的一种或多种。
86.70.方面50至69中任一项所述的方法，其中所述也可以是过氧化物淬灭试剂的裂解剂是裂解剂而不是过氧化物淬灭剂，并且所述方法还包括用另外的作为过氧化物淬灭剂的剂引发过氧化物淬灭。
87.71.方面70所述的方法，其中所述另外的过氧化物淬灭剂包括过氧化物淬灭酶或一种或多种列于表1中的过氧化物淬灭剂。
88.72.方面70或71所述的方法，其中所述另外的过氧化物淬灭剂也是裂解所述处理过的多糖的另外的多糖裂解试剂。
89.73.方面70至72中任一项所述的方法，其中在用所述也可以是过氧化物淬灭试剂
的裂解剂引发多糖裂解之前、用所述也可以是过氧化物淬灭试剂的裂解剂引发多糖裂解之时或用所述也可以是过氧化物淬灭试剂的裂解剂引发多糖裂解之后引入所述另外的过氧化物淬灭试剂.
90.74.方面50至73中任一项所述的方法，其还包括通过蒸发去除所述也可以是过氧化物淬灭试剂的裂解剂和/或淬灭剂，或一种或多种它们的反应组分。
91.75.方面50至74中任一项所述的方法，其中相对于在步骤(c)中用强阿伦尼乌斯碱裂解所述处理过的多糖，所述寡糖产量提高和/或其中脱靶副反应减少和/或剥离减少。
92.76.方面50至75中任一项所述的方法，其中所述一种或多种多糖来源于选自如下的至少一种材料或以选自如下的至少一种材料的形式呈现：植物、细菌、酵母、藻类、动物、真菌和废产物流材料。
93.77.方面50至76中任一项所述的方法，其中所述一种或多种多糖包括选自以下的一种或多种：直链淀粉、支链淀粉、β-葡聚糖、普鲁兰多糖、木葡聚糖、阿拉伯半乳聚糖i和阿拉伯半乳聚糖ii、鼠李半乳糖醛酸聚糖i、鼠李半乳糖醛酸聚糖ii、聚半乳糖醛酸、聚葡萄糖、半乳聚糖、阿拉伯聚糖、阿拉伯木聚糖、木聚糖(例如，山毛榉木聚糖)、糖原、甘露聚糖、葡甘露聚糖、凝胶多糖、半乳甘露聚糖、地衣多糖和菊粉中的一种或多种。
94.78.方面50至77中任一项所述的方法，其中所述反应和所述裂解改变了包括所述一种或多种多糖的材料的至少一种结构和/或化学性质，其中所述性质选自溶解度、质地、孔隙率、渗透性、弹性、流变特性和化学反应性。
95.79.方面50至78中任一项所述的方法，其中步骤中(b)的所述指定反应时间为1小时至3小时。
96.80.方面50至79中任一项所述的方法，其中步骤中(b)的所述指定反应时间为1.5至2.5小时。
97.81.方面50至80中任一项所述的方法，其中进行步骤(c)，使得步骤(c)通过蒸发所述也可以是过氧化物淬灭试剂的裂解剂来结束。
98.82.一种组合物，其包括通过方面50-81中任一项所述的方法产生的一种或多种多糖裂解产物、寡糖、或多糖裂解产物和/或寡糖的混合物。
99.83.一种调节微生物生长和/或微生物代谢或宿主代谢的方法，其包括在体外或体内使微生物与根据方面82所述的组合物接触。
100.84.一种包含α-1,4葡萄糖主链的合成寡糖，其中所述合成寡糖中单体的总数为3至30。
101.85.方面84所述的合成寡糖，其中所述合成寡糖可包可以α-1,4方式终止或延伸的α-1,4,6葡萄糖支链。
102.86.方面84或85所述的合成寡糖，其中所述寡糖由表6中的质量和保留时间标识符来描述。
103.87.方面86所述的合成寡糖，其中化合物1、化合物7、化合物10、化合物12、化合物14、化合物16、化合物17、化合物18、化合物22、化合物24、化合物26、化合物28的总和构成表6所示的峰体积的至少94％。
104.88.方面86所述的合成寡糖，其中化合物1、化合物7、化合物10、化合物12、化合物14、化合物16、化合物17、化合物18、化合物22、化合物24、化合物26、化合物28的总和构成表
1,6木糖支链。
124.108.方面106或107所述的合成寡糖，其中所述寡糖由表8中的质量和保留时间标识符来描述。
125.109.方面108所述的合成寡糖，其中化合物1、化合物3、化合物6、化合物7、化合物9、化合物16、化合物18、化合物20、化合物21、化合物22、化合物24、化合物26的总和构成表8所示的峰体积的至少58％。
126.110.方面108所述的合成寡糖，其中化合物1、化合物3、化合物6、化合物7、化合物9、化合物16、化合物18、化合物20、化合物21、化合物22、化合物24、化合物26的总和构成表8所示的峰体积的45％至65％。
127.111.方面108所述的合成寡糖，其中化合物1、化合物3、化合物7、化合物9、化合物18的总和构成表8所示的峰体积的至少36％。
128.112.方面108所述的合成寡糖，其中化合物1、化合物3、化合物7、化合物9、化合物18的总和构成表8所示的峰体积的30％至45％。
129.113.方面106至112中任一项所述的合成寡糖，其中所述合成寡糖包括在表5中作为木葡聚糖描述的那些峰的10％以内1h-13c2d-nmr(hsqc)峰。
130.114.方面106至112中任一项所述的合成寡糖，其中所述合成寡糖包含20％至40％的末端木糖、末端葡萄糖、(β-1,4、β-1,4,6和β-1,6)葡萄糖键、β-2,1木糖键和末端半乳糖键。
131.115.方面106至112中任一项所述的合成寡糖，其中所述合成寡糖包含40％至60％的末端木糖、末端葡萄糖、(β-1,4、β-1,4,6和β-1,6)葡萄糖键、β-2,1木糖键和末端半乳糖键。
132.116.方面106至112中任一项所述的合成寡糖，其中所述合成寡糖包含60％至80％的末端木糖、末端葡萄糖、(β-1,4、β-1,4,6和β-1,6)葡萄糖键、β-2,1木糖键和末端半乳糖键。
133.117.方面106至112中任一项所述的合成寡糖，其中所述合成寡糖包含至少80％的末端木糖、末端葡萄糖、(β-1,4、β-1,4,6和β-1,6)葡萄糖键、β-2,1木糖键和末端半乳糖键。
134.118.一种合成寡糖，其包含组合的β-1,4葡萄糖和β-1,3葡萄糖主链，其中所述合成寡糖中单体的总数为3至30。
135.119.方面118所述的合成寡糖，其中所述合成寡糖包含以重复方式交替的β-1,4葡萄糖和β-1,3葡萄糖。
136.120.方面118或119所述的合成寡糖，其中所述合成寡糖由表9和表13中的质量和保留时间标识符来描述。
137.121.方面120所述的合成寡糖，其中化合物2、化合物4、化合物12、化合物14的总和构成表13所示的峰体积的至少42％。
138.122.方面120所述的合成寡糖，其中化合物2、化合物4、化合物12、化合物14的总和构成表13所示的峰体积的35％至50％。
139.123.方面120所述的合成寡糖，其中化合物1、化合物2、化合物4、化合物6、化合物7、化合物12的总和构成表13所示的峰体积的至少62％。
140.124.方面120所述的合成寡糖，其中化合物1、化合物2、化合物4、化合物6、化合物
7、化合物12的总和构成表13所示的峰体积的55％至75％。
141.125.方面120所述的合成寡糖，其中化合物5、化合物11、化合物14、化合物16、化合物20、化合物22、化合物27、化合物31、化合物32、化合物33的总和构成表9所示的峰体积的至少73％。
142.126.方面120所述的合成寡糖，其中化合物5、化合物11、化合物14、化合物16、化合物20、化合物22、化合物27、化合物31、化合物32、化合物33的总和构成表9所示的峰体积的65％至85％。
143.127.方面120所述的合成寡糖，其中化合物1、化合物5、化合物6、化合物14、化合物16、化合物21、化合物27、化合物33、化合物38、化合物40的总和构成表9所示的峰体积的至少51％。
144.128.方面120所述的合成寡糖，其中化合物1、化合物5、化合物6、化合物14、化合物16、化合物21、化合物27、化合物33、化合物38、化合物40的总和构成表9所示的峰体积的40％至60％。
145.129.方面120至128中任一项所述的合成寡糖，其中所述合成寡糖包含在表5中描述为地衣多糖或β葡聚糖的那些峰的10％以内的1h-13c 2d-nmr(hsqc)峰。
146.130.方面120至129中任一项所述的合成寡糖，其中所述合成寡糖包含20％至40％的末端葡萄糖、β-1,4葡萄糖键和β-1,3葡萄糖键。
147.131.方面120至129中任一项所述的合成寡糖，其中所述合成寡糖包含40％至60％的末端葡萄糖、β-1,4葡萄糖键和β-1,3葡萄糖键。
148.132.方面120至129中任一项所述的合成寡糖，其中所述合成寡糖包含60％至80％的末端葡萄糖、β-1,4葡萄糖键和β-1,3葡萄糖键。
149.133.方面120至129中任一项所述的合成寡糖，其中所述合成寡糖包含至少80％的末端葡萄糖、β-1,4葡萄糖键和β-1,3葡萄糖键。
150.134.一种包含β-1,4半乳糖主链的合成寡糖，其中所述合成寡糖中单体的总数为3至30。
151.135.方面134所述的合成寡糖，其中所述合成寡糖在22-4-％的几率包含α-1,6甘露糖支链。
152.136.方面134或135所述的合成寡糖，其中所述合成寡糖由表10和表18中的质量和保留时间标识符来描述。
153.137.方面136所述的合成寡糖，其中化合物4、化合物7、化合物11、化合物20、化合物26、化合物38、化合物41、化合物44的总和构成表10所示的峰体积的至少38％。
154.138.方面136所述的合成寡糖，其中化合物4、化合物7、化合物11、化合物20、化合物26、化合物38、化合物41、化合物44的总和构成表10所示的峰体积的至少30％至50％。
155.139.方面136所述的合成寡糖，其中化合物4、化合物5、化合物6、化合物7、化合物10、化合物11、化合物12、化合物20、化合物26、化合物37的总和构成表10所示的峰体积的至少55％。
156.140.方面136所述的合成寡糖，其中化合物4、化合物5、化合物6、化合物7、化合物10、化合物11、化合物12、化合物20、化合物26、化合物37的总和构成表10所示的峰体积的45％至65％。
157.141.方面136所述的合成寡糖，其中化合物4、化合物5、化合物8、化合物9、化合物10、化合物13、化合物18、化合物20、化合物24、化合物31的总和构成表18所示的峰体积的至少51％。
158.142.方面136所述的合成寡糖，其中化合物4、化合物5、化合物8、化合物9、化合物10、化合物13、化合物18、化合物20、化合物24、化合物31的总和构成表18所示的峰体积的40％至60％。
159.143.方面136所述的合成寡糖，其中化合物5、化合物8、化合物13、化合物18、化合物20、化合物24、化合物31、化合物35、化合物39的总和构成表18所示的峰体积的至少33％。
160.144.方面136所述的合成寡糖，其中化合物5、化合物8、化合物13、化合物18、化合物20、化合物24、化合物31、化合物35、化合物39的总和构成表18所示的峰体积的25％至40％。
161.145.方面136至144中任一项所述的合成寡糖，其中所述合成寡糖包括在表5中描述为半乳甘露聚糖和刺槐豆胶的那些峰的10％以内的1h-13c 2d-nmr(hsqc)峰。
162.146.方面136至145中任一项所述的合成寡糖，其中所述合成寡糖包含20％至40％的末端半乳糖、末端甘露糖、β-1,4甘露糖键和β-1,4,6甘露糖键。
163.147.方面136至145中任一项所述的合成寡糖，其中所述合成寡糖包含40％至60％的末端半乳糖、末端甘露糖、β-1,4甘露糖键和β-1,4,6甘露糖键。
164.148.方面136至145中任一项所述的合成寡糖，其中所述合成寡糖包含60％至80％的末端半乳糖、末端甘露糖、β-1,4甘露糖键和β-1,4,6甘露糖键。
165.149.方面136至145中任一项所述的合成寡糖，其中所述合成寡糖包含至少80％的末端半乳糖、末端甘露糖、β-1,4甘露糖键和β-1,4,6甘露糖键。
166.150.一种包含β-1,3半乳糖主链的合成寡糖，其中所述合成寡糖中单体的总数为3至30。
167.151.方面150所述的合成寡糖，其中所述合成寡糖包括长度为1-4的β-1,6半乳糖支链、β-1,3半乳糖支链和β-1,3,6半乳糖支链和末端阿拉伯糖帽。
168.152.方面150或151所述的合成寡糖，其中所述合成寡糖由表11中的质量和保留时间标识符来描述。
169.153.方面152所述的合成寡糖，其中化合物7、化合物9、化合物11、化合物19、化合物25、化合物27、化合物30、化合物32、化合物36、化合物37、化合物41、化合物44、化合物47、化合物54、化合物59的总和构成表11所示的峰体积的至少35％。
170.154.方面152所述的合成寡糖，其中化合物7、化合物9、化合物11、化合物19、化合物25、化合物27、化合物30、化合物32、化合物36、化合物37、化合物41、化合物44、化合物47、化合物54、化合物59的总和构成表11所示的峰体积的28％至42％。
171.155.方面152所述的合成寡糖，其中化合物5、化合物9、化合物10、化合物12、化合物14、化合物18、化合物25、化合物32、化合物37、化合物53的总和构成表11所示的峰体积的至少50％.
172.156.方面152所述的合成寡糖，其中化合物5、化合物9、化合物10、化合物12、化合物14、化合物18、化合物25、化合物32、化合物37、化合物53的总和构成表11所示的峰体积的40％至60％。
173.157.方面152至156中任一项所述的合成寡糖，其中所述合成寡糖包括在表5中作为阿拉伯半乳聚糖描述的那些峰的10％以内的1h-13c 2d-nmr(hsqc)峰。
174.158.方面152至157中任一项所述的合成寡糖，其中所述寡糖包含20％至40％的末端半乳糖、末端阿拉伯糖、β-1,3半乳糖、β-1,3,6半乳糖。
175.159.方面152至157中任一项所述的合成寡糖，其中所述寡糖包含40％至60％的末端半乳糖、末端阿拉伯糖、β-1,3半乳糖、β-1,3,6半乳糖。
176.160.方面152至157中任一项所述的合成寡糖，其中所述寡糖包含60％至80％的末端半乳糖、末端阿拉伯糖、β-1,3半乳糖、β-1,3,6半乳糖。
177.161.方面152至157中任一项所述的合成寡糖，其中所述寡糖包含至少80％的末端半乳糖、末端阿拉伯糖、β-1,3半乳糖、β-1,3,6半乳糖。
178.162.一种包含β-1,3葡萄糖主链的合成寡糖，其中所述合成寡糖中单体的总数为3至30。
179.163.方面162所述的合成寡糖，其中所述合成寡糖由表12中的质量和保留时间标识符来描述。
180.164.方面162或163所述的合成寡糖，其中化合物1、化合物4、化合物7、化合物9、化合物10的总和构成表12所示的峰体积的至少91％。
181.165.方面162或163所述的合成寡糖，其中化合物1、化合物4、化合物7、化合物9、化合物10的总和构成表12所示的峰体积的至少80％至98％。
182.166.方面162或163所述的合成寡糖，其中化合物2、化合物3、化合物5、化合物6、化合物8的总和构成表12所示的峰体积的至少8％。
183.167.方面162或163所述的合成寡糖，其中化合物2、化合物3、化合物5、化合物6、化合物8的总和构成表12所示的峰体积的至少1％至15％。
184.168.方面162至167中任一项所述的合成寡糖，其中所述合成寡糖包括在表5中作为凝胶多糖描述的那些峰的10％以内的1h-13c2d-nmr(hsqc)峰。
185.169.方面162至168中任一项所述的合成寡糖，其中所述寡糖包含20％至40％的末端葡萄糖和β-1,3葡萄糖键。
186.170.方面162至168中任一项所述的合成寡糖，其中所述寡糖包含40％至60％的末端葡萄糖和β-1,3葡萄糖键。
187.171.方面162至168中任一项所述的合成寡糖，其中所述寡糖包含60％至80％的末端葡萄糖和β-1,3葡萄糖键。
188.172.方面162至168中任一项所述的合成寡糖，其中所述寡糖包含至少80％的末端葡萄糖和β-1,3葡萄糖。
189.173.一种包含重复线性β-1,4甘露糖的主链的合成寡糖，其中所述合成寡糖中单体的总数为3至30。
190.174.方面173所述的合成寡糖，其中所述寡糖由表14中的质量和保留时间标识符来描述。
191.175.方面173或174所述的合成寡糖，其中化合物2、化合物6、化合物10、化合物11、化合物14、化合物19、化合物20、化合物21、化合物25、化合物27的总和构成表14所示的峰体积的至少58％。
192.176.方面173或174所述的合成寡糖，其中化合物2、化合物6、化合物10、化合物11、化合物14、化合物19、化合物20、化合物21、化合物25、化合物27的总和构成表14所示的峰体积的至少50％至70％。
193.177.方面173至176中任一项所述的合成寡糖，其中所述合成寡糖包括在表5中作为甘露聚糖描述的那些峰的10％以内的1h-13c2d-nmr(hsqc)峰。
194.178.方面173至177中任一项所述的合成寡糖，其中所述合成寡糖包含20％至40％的末端甘露糖和β-1,4甘露糖键。
195.179.方面173至177中任一项所述的合成寡糖，其中所述合成寡糖包含40％至60％的末端甘露糖和β-1,4甘露糖键。
196.180.方面173至177中任一项所述的合成寡糖，其中所述合成寡糖包含60％至80％的末端甘露糖和β-1,4甘露糖键。
197.181.方面173至177中任一项所述的合成寡糖，其中所述合成寡糖包含至少80％的末端甘露糖和β-1,4甘露糖键。
198.182.一种包含β-1,4木糖主链的合成寡糖，其中所述合成寡糖中单体的总数为3至30。
199.183.方面182所述的合成寡糖，其中所述合成寡糖在约13％的主链单元上包含α-1,2葡萄糖醛酸-4-ome支链。
200.184.方面182或183所述的合成寡糖，其中所述寡糖由表15中的质量和保留时间标识符来描述。
201.185.方面182至184中任一项所述的合成寡糖，其中化合物3、化合物4、化合物10、化合物14、化合物15的总和构成表15所示的峰体积的至少66％。
202.186.方面182至184中任一项所述的合成寡糖，其中化合物3、化合物4、化合物10、化合物14、化合物15的总和构成表15所示的峰体积的55％至75％。
203.187.方面182至184中任一项所述的合成寡糖，其中化合物2、化合物6、化合物7、化合物8、化合物9、化合物11、化合物12、化合物13的总和构成表15所示的峰体积的至少31％。
204.188.方面182至184中任一项所述的合成寡糖，其中化合物2、化合物6、化合物7、化合物8、化合物9、化合物11、化合物12、化合物13的总和构成表15所示的峰体积的20％至40％。
205.189.方面182至188中任一项所述的合成寡糖，其中所述合成寡糖包括在表5中作为木聚糖描述的那些峰的10％以内的1h-13c2d-nmr(hsqc)峰。
206.190.方面182至189中任一项所述的合成寡糖，其中所述合成寡糖包含20％至40％的末端木糖、β-1,4木糖键和末端葡萄糖醛酸-4-ome。
207.191.方面182至189中任一项所述的合成寡糖，其中所述合成寡糖包括40％至60％的末端木糖、β-1,4木糖键和末端葡萄糖醛酸-4-ome。
208.192.方面182至189中任一项所述的合成寡糖，其中所述合成寡糖包含60％至80％的末端木糖、β-1,4木糖键和末端葡萄糖醛酸-4-ome。
209.193.方面182至189中任一项所述的合成寡糖，其中所述合成寡糖包含至少80％的末端木糖、β-1,4木糖键和末端葡萄糖醛酸-4-ome。
210.194.一种包含β-1,4半乳糖主链的合成寡糖，其中所述合成寡糖中单体的总数为3
至30。
211.195.方面195所述的合成寡糖，其中所述合成寡糖在线性重复链中包含β-1,4键的半乳糖。
212.196.方面194或195所述的合成寡糖，其中所述合成寡糖由表16中的质量和保留时间标识符来描述。
213.197.方面196所述的合成寡糖，其中化合物2、化合物5、化合物9、化合物11、化合物13的总和构成表16所示的峰体积的至少37％。
214.198.方面196所述的合成寡糖，其中化合物2、化合物5、化合物9、化合物11、化合物13的总和构成表16所示的峰体积的30％至45％。
215.199.方面196所述的合成寡糖，其中化合物2、化合物5、化合物6、化合物7、化合物9、化合物10、化合物12、化合物15的总和构成表16所示的峰体积的至少77％。
216.200.方面196所述的合成寡糖，其中化合物2、化合物5、化合物6、化合物7、化合物9、化合物10、化合物12、化合物15的总和构成表16所示的峰体积的65％至85％。
217.201.方面194至200中任一项所述的合成寡糖，其中所述合成寡糖包含20％至40％的末端半乳糖和β-1,4半乳糖键。
218.202.方面194至200中任一项所述的合成寡糖，其中所述合成寡糖包含40％至60％的末端半乳糖和β-1,4半乳糖键。
219.203.方面194至200中任一项所述的合成寡糖，其中所述合成寡糖包含60％至80％的末端木糖和β-1,4木糖键。
220.204.方面194至200中任一项所述的合成寡糖，其中所述合成寡糖包含至少80％的末端木糖和β-1,4木糖键。
221.205.一种包含具有β-1,4甘露糖和β-1,4葡萄糖的主链的合成寡糖，其中所述合成寡糖中单体的总数为3至30。
222.206.方面205所述的合成寡糖，其中所述合成寡糖在线性重复链中包含β-1,4连接的甘露糖，所述线性重复链中约每隔2个单元有一个β-1,4葡萄糖。
223.207.方面205或206所述的合成寡糖，其中所述合成寡糖由表17中的质量和保留时间标识符来描述。
224.208.方面207所述的合成寡糖，其中化合物7、化合物8、化合物13、化合物15、化合物18、化合物33、化合物36、化合物39、化合物64、化合物68、化合物71、化合物72、化合物73、化合物74的总和构成表17所示的峰体积的至少39％。
225.209.方面207所述的合成寡糖，其中化合物7、化合物8、化合物13、化合物15、化合物18、化合物33、化合物36、化合物39、化合物64、化合物68、化合物71、化合物72、化合物73、化合物74的总和构成表17所示的峰体积的30％至50％。
226.210.方面207所述的合成寡糖，其中化合物4、化合物7、化合物8、化合物13、化合物16、化合物18、化合物33、化合物36、化合物39、化合物74的总和构成表17所示的峰体积的至少37％。
227.211.方面207所述的合成寡糖，其中化合物4、化合物7、化合物8、化合物13、化合物16、化合物18、化合物33、化合物36、化合物39、化合物74的总和构成表17所示的峰体积的至少30％至50％。
228.212.方面205至211中任一项所述的合成寡糖，其中所述合成寡糖包括在表5中作为葡甘聚糖描述的那些峰的10％以内的1h-13c2d-nmr(hsqc)峰。
229.213.方面205至212中任一项所述的合成寡糖，其中所述合成寡糖包含20％至40％的末端甘露糖、末端葡萄糖、β-1,4甘露糖键和β-1,4葡萄糖键。
230.214.方面205至212中任一项所述的合成寡糖，其中所述寡糖包含40％至60％的末端甘露糖、末端葡萄糖、β-1,4甘露糖键和β-1,4葡萄糖键。
231.215.方面205至212中任一项所述的合成寡糖，其中所述寡糖包含60％至80％的末端甘露糖、末端葡萄糖、β-1,4甘露糖键和β-1,4葡萄糖键。
232.216.方面205至212中任一项所述的合成寡糖，其中所述寡糖包含至少80％的末端甘露糖、末端葡萄糖、β-1,4甘露糖键和β-1,4葡萄糖键。
233.217.一种从玉米纤维中产生的合成寡糖。
234.218.方面217所述的合成寡糖，其中所述合成寡糖包含β-1,4木糖主链，其中所述合成寡糖中单体的总数为3至30。
235.219.方面218所述的合成寡糖，其中所述合成寡糖还包括α-1,3阿拉伯糖支链和/或α-1,2阿拉伯糖支链。
236.220.方面217至219中任一项所述的合成寡糖，其中所述合成寡糖由表19中的质量和保留时间标识符来描述。
237.221.方面220所述的合成寡糖，其中化合物1、化合物4、化合物8、化合物9、化合物10、化合物16的总和构成表19所示的峰体积的至少44％。
238.222.方面220所述的合成寡糖，其中化合物1、化合物4、化合物8、化合物9、化合物10、化合物16的总和构成表19所示的峰体积的35％至55％。
239.223.方面220所述的合成寡糖，其中化合物9、化合物10、化合物11、化合物13、化合物14、化合物15、化合物17的总和构成表19所示的峰体积的至少54％。
240.224.方面220所述的合成寡糖，其中化合物9、化合物10、化合物11、化合物13、化合物14、化合物15、化合物17的总和构成表19所示的峰体积的45％至65％。
241.225.方面220所述的合成寡糖，其中化合物1、化合物2、化合物3、化合物4、化合物5、化合物7的总和构成表19所示的峰体积的至少23％。
242.226.方面220所述的合成寡糖，其中化合物1、化合物2、化合物3、化合物4、化合物5、化合物7的总和构成表19所示的峰体积的15％至35％。
243.227.方面220所述的合成寡糖，其中化合物8、化合物12、化合物16的总和构成表19所示的峰体积的至少12％。
244.228.方面220所述的合成寡糖，其中化合物8、化合物12、化合物16的总和构成表19所示的峰体积的至少5％至20％。
245.229.方面217至228中任一项所述的合成寡糖，其中所述合成寡糖包括在表5中作为玉米纤维描述的那些峰的10％以内的1h-13c2d-nmr(hsqc)峰。
246.230.方面217至228中任一项所述的合成寡糖，其中所述合成寡糖包含20％至40％的末端木糖、末端阿拉伯糖、β-1,4阿拉伯糖键和α-1,3阿拉伯糖键和α-1,2阿拉伯糖键。
247.231.方面217至228中任一项所述的合成寡糖，其中所述合成寡糖包含40％至60％的末端木糖、末端阿拉伯糖、β-1,4阿拉伯糖键和α-1,3阿拉伯糖键和α-1,2阿拉伯糖键。
248.232.方面217至228中任一项所述的合成寡糖，其中所述合成寡糖包含60％至80％的末端木糖、末端阿拉伯糖、β-1,4阿拉伯糖键和α-1,3阿拉伯糖键和α-1,2阿拉伯糖键。
249.233.方面217至228中任一项所述的合成寡糖，其中所述合成寡糖包含至少80％的末端木糖、末端阿拉伯糖、β-1,4阿拉伯糖键和α-1,3阿拉伯糖键和α-1,2阿拉伯糖键。
250.234.通过方面1至33或50至81中任一项所述的方法产生的寡糖库，其不包括一种或多种表20中所示的称为fitdog的解聚过程独有的寡糖。
251.235.方面84至233中任一项所述的合成寡糖，其中所述合成寡糖不包括一种或多种表20中所示的称为fitdog的解聚过程独有的寡糖。
附图说明
252.本专利或申请文件包含至少一幅彩色附图。在提出请求和支付必要的费用之后，专利局将提供本专利或专利申请公布的彩色附图副本。
253.图1通过本发明的非限制性实施例显示了通过不同裂解试剂和在不同温度下来自刺槐豆胶(locust bean gum)的寡糖总产量的比较。
254.图2通过本发明的非限制性实施例显示了于45℃反应的不同裂解试剂的刺槐豆胶寡糖图谱。
255.图3通过本发明的非限制性实施例显示了在27℃与三种示例性裂解试剂孵育一小时后残留的过氧化氢。
256.图4通过本发明的非限制性实施例显示了在不同温度下与碳酸氢铵孵育一小时后的过氧化氢浓度和ph。
257.图5a和图5b通过本发明的非限制性实施例显示了两种废蒸馏酒糟(distiller’s grain)部分的液相色谱-质谱。
258.图6显示了由支链淀粉产生的寡糖的hplc/q-tof色谱图。寡糖是通过使用氢氧化铵或氢氧化钠的碱裂解步骤产生的。
259.图7显示了由支链淀粉产生的寡糖的单糖组成。寡糖是通过使用氢氧化铵或氢氧化钠的碱裂解步骤产生的。将单糖丰度相对于对照丰度标准化。
260.图8显示了对通过使用不同的强阿伦尼乌斯碱和含氮碱的碱裂解步骤产生的支链淀粉寡糖的寡糖分析。
261.图9显示了由支链淀粉产生的寡糖的细菌生长。寡糖是通过使用氢氧化铵或氢氧化钠的碱裂解步骤产生的。
262.图10显示了刺槐豆胶多糖和刺槐豆胶寡糖的单糖组成。
263.图11显示了hplc/q-tof色谱图，其显示了cog产生的刺槐豆胶寡糖。
264.图12显示了使用不同催化剂和不同条件的玉米纤维寡糖产量的比较。
265.图13显示了cog产生的寡糖的1h-13c hsqc nmr光谱。
266.图14显示了带注释的提取离子色谱图，其中标记了最丰富的寡糖。
267.图15显示了带注释的玉米纤维的连锁分析色谱图。
具体实施方式
268.提供了用于从多糖(ps)中生产寡糖的高产过氧化物淬灭控制方法(受控的寡糖生
成(“cog”)方法)，其包括多步反应(例如，两步、三步等的反应)，所述多步反应包括使用芬顿系统/试剂的初始氧化步骤和随后的使用以下任一种的过氧化物淬灭/ps裂解步骤：也用作过氧化物淬灭剂的ps裂解剂；或将ps裂解剂与不干扰ps裂解反应的相容的过氧化物淬灭试剂结合使用。在所述方法中，所述ps裂解剂可以是例如弱阿伦尼乌斯碱或非阿伦尼乌斯碱。在所述方法中，优选地，ps裂解引发剂也用作过氧化物淬灭剂以淬灭(例如，充分减少或消除)残留的过氧化氢和/或其自由基以最大限度减少或消除脱靶副反应。例如，本发明的方法包括使多糖与过氧化氢和本文所述的合适的金属或金属离子(例如，fe(ii)、fe(iii)、cu(i)、cu(ii)、ca(ii)、mg(ii)、mn(ii)、zn(ii)、ni(ii)、ce(iv)、co(ii)或其他金属离子)反应，然后用诸如碳酸氢铵、氢氧化铵、氨、尿素、氨基钠或其他铵基试剂的高产过氧化物淬灭剂/裂解剂裂解氢过氧化物处理过的多糖中的糖苷键，从而从母体(起始材料)多糖产生高产量的寡糖和较低分子量多糖(仍然是多糖的多糖裂解产物)，同时减少或消除剥离和不需要的副反应。
269.在本文所述的方法中，裂解试剂(裂解引发剂)也可以是，并且优选是过氧化物淬灭试剂，并且在任一种情况下都可以与另外的相容的过氧化物淬灭剂组合使用，所述过氧化物淬灭剂可以是裂解剂或也可以不是裂解剂。示例性的裂解剂和/或过氧化物淬灭剂列于表1中。
270.在所公开的cog方法中，使用过氧化物淬灭剂淬灭(例如，充分减少或消除)残留的过氧化氢和/或其自由基本身，最大限度地减少或消除了脱靶副反应。
271.在所公开的cog方法中，使用特定的弱阿伦尼乌斯碱和/或非阿伦尼乌斯碱(例如，铵基过氧化物淬灭剂/ps裂解试剂等；例如，参见表1)不仅提供了改进的高产寡糖生产(相对于本领域中使用的强阿伦尼乌斯碱)，而且还消除了对昂贵且耗时的反应后浓缩和脱盐步骤的需要。表1.示例性多糖(ps)裂解剂和/或过氧化物淬灭剂。
272.在所述方法中，所述裂解引发剂可以并且优选地也用作过氧化物淬灭剂以淬灭(充分减少或消除)残留的过氧化物和/或其自由基以减少或消除剥离和不需要的副反应。或者，可以在添加相容的过氧化物淬灭剂(其也可以是裂解试剂)之后或同时将高产裂解剂添加到反应中。在所述方法中，所述过氧化物淬灭剂/裂解剂可以是并且优选地选自本文所
述的一种或多种氮基试剂(例如参见上表1)，并且其不仅提供了高产的裂解和残留过氧化物的淬灭，也提供了裂解特异性裁剪(例如，通过用更大的部分(moiety)替换氮结合的氢以在空间上阻碍或以其他方式改变裂解剂的进入或活性)。
273.所述方法，有时在本文中被称为“cog”方法，能通过消化来自任何来源(包括但不限于植物、细菌、动物、藻类和菌类)的多糖有效地生产生物活性寡糖和低分子量多糖。在一些方面，所述寡糖在3至20的聚合度(dp)范围中产生。在一些方面，多糖被分解成更小的多糖。在一些方面，所描述的方法将产生用于分析和用于生物活性食品的寡糖，所述生物活性食品是益生元、抗癌、抗病原体的或具有其他功能(增强生物燃料产量、其他化合物的可提取性等)。所述cog方法可用于将多糖(例如，来自植物、细菌或酵母、藻类、动物、真菌和废产物流)转化为生物活性的寡糖或更小的多糖。
274.在一些方面，可以对所得寡糖进行表征(结构和/或活性/性质)。在一些方面，产物混合物的高效液相色谱-质谱(lc-ms)分析显示，许多寡糖的结构的尺寸范围为从3至20(或例如从3至多达200)的dp，这取决于多糖的来源和反应条件。所述寡糖的结构和组成将取决于多糖的来源。
275.在一些方面，提供了从天然多糖来源中产生由从3至20(或例如3至多达200)的dp组成的寡糖。所述多糖可以包括例如来自植物、藻类、细菌、动物、真菌和废产物流的那些多糖。在一些方面，所述多糖可以来自食物、农业或生物燃料废物以及来自通常不被视为食物的来源。在一些方面，多糖的来源是加工食品和植物产品。
276.在一些方面，所述cog方法提供了从细菌细胞壁多糖中产生寡糖(例如，具有3至20(或例如3至多达200)的dp)。
277.在一些方面，所述cog方法提供了从酵母细胞壁多糖中产生寡糖(例如，具有3至20(或例如3至多达200)的dp)。
278.在一些方面，所述cog方法提供了从藻类多糖中产生寡糖(例如，具有3至20(或例如3至多达200)的dp)。
279.在一些方面，所述寡糖是生物活性寡糖(例如，有益于人类肠道的细菌所消耗的生物活性寡糖)。在一些方面，所述寡糖被有益于阴道微生物组、有益于呼吸道或有益于皮肤的细菌消耗。在一些方面，所述寡糖被有益于土壤微生物组的细菌消耗。在一些方面，所述生物活性寡糖可以调节免疫系统(例如，对于对已知或未知的刺激反应不足或反应过度)。在一些方面，所述生物活性寡糖起到阻断病原体的功能。在一些方面，所述寡糖被用作生产生物燃料的原材料。在一些方面，所述寡糖可用于调节微生物代谢物产出。
280.在一些方面，所述寡糖是刺激土壤的微生物群生长的选择性碳底物。在一些方面，在对土壤进行熏蒸或灭菌之后，将所述寡糖加入到土壤中。如果不加以控制，可获得的有机碳可将土壤生态导向致病的方向。通过提供选择性地刺激有益土壤微生物群的生长(或为有益土壤微生物群提供生长优势)的具体寡糖，可以减少土壤中的土壤病原体群。在一些方面，如本文所述制备的一种或多种寡糖的组合可以与一种或多种微生物(例如，有益的土壤微生物)一起加入土壤中，以在土壤中达到所需的微生物补充或微生物平衡，或以减少或消除病原体或不需要的微生物。在一些方面，所述寡糖可以选择性地促进可以通过代谢土壤中的杂质(contaminant)或污染物(pollutant)(例如化学品，重金属等)来修复土壤的细菌的生长和定殖。在一些方面，可以通过重组方法设计细菌以消耗具体的寡糖结构。在一些方
面，所述寡糖可以选择性地促进可以天然或重组地产生杀虫化合物的细菌的生长。在一些方面，所述寡糖可以选择性地促进天然或重组地产生除草化合物的细菌的生长。
281.在一些方面，所述寡糖可以配制成用于口腔卫生的产品。在某些方面，所述口腔卫生产品可以是牙膏、漱口水、口香糖、薄荷糖、糖果、锭剂和牙线。在一些方面，所述寡糖可以约10mg/次的剂量配置。在一些方面，所述寡糖可以约100mg/次的剂量配置。在一些方面，所述寡糖可以约200mg/次或更多/次的剂量配置。
282.在一些方面，所述寡糖的形式可以是肠内施用组合物，局部施用组合物，阴道内施用组合物，或一次性吸收制品，例如尿布、裤子、成人失禁产品、尿布或裤子的吸水性衬垫、纸巾或诸如卫生巾、卫生棉条和卫生护垫(panty liner)的女性卫生用品。
283.在一些方面，肠内施用组合物包含0.5g至15g的寡糖，更优选地为1g至10g。例如，所述肠内施用组合物可包含2g至7.5g的寡糖。优选地，局部施用组合物和阴道内施用组合物包含0.1g至10g的寡糖，更优选地为0.2g至7.5g。例如，局部或阴道内施用组合物可包含0.5g至5g的寡糖。当以一次性吸收制品的形式时，可以以每平方米0.2g至200g的量涂覆或浸渍所述制品的至少一部分，优选为每平方米5.0g至100g，更优选为每平方米8.0g至50g。在女性需要改善泌尿生殖健康或治疗的情况下，所述女性可以先施用较高剂量，然后施用较低剂量。优选地，所述较高剂量施用长达14天，例如长达7天。所述较低剂量可以在很长一段时间内施用。在女性需要治疗以降低细菌性阴道病、细菌性阴道病复发、尿路感染或尿路感染复发的风险的情况下，所述女性可以在很长一段时间内施用较低的维持剂量。
284.在一些方面，如本文所述通过所述cog方法制备的一种或多种的寡糖可用于产生用于食物补充的益生元。在一些方面，所述寡糖可用于调节有需要的受试者(例如超重和肥胖的儿童或其他受试者)的食欲控制和/或能量(热量)摄入控制。
285.在一些方面，提供了一种方法，使用本文所述的cog反应条件从包含多糖的不溶性纤维中产生可溶性纤维。通过仅在一定程度上进行反应(例如，多糖材料的部分解聚)，可以产生具有所需特征的组合物(例如，凝胶或油膏)。所述cog方法可用于软化或改变包含暴露于(例如，浸渍或在一定程度上渗透)反应组分的含多糖材料的质地，孔隙率或反应特性。在一些方面，所述cog方法可用于在工业加工之前软化(例如，通过部分解聚)植物和/或植物材料、动物、细菌和真菌的细胞壁。在一些方面，软化植物的细胞壁可以导致有价值的组分的更大提取性。在一些方面，软化植物或植物材料的细胞壁可以导致更容易物理去除或分离需要的部分和/或不需要的部分(例如，壳、皮(skin)、果皮(peel)、种子)。在一些方面，本发明可用于“软化”植物、细菌、动物和真菌的细胞壁，以在细胞修饰(例如，核酸(例如，dna和/或rna)转染和/或修饰)之前产生可渗透的膜。在一些方面，所述cog方法可用于改变树胶(gum)、凝胶和其他碳水化合物衍生的组织/感官改性剂的流变特性。在一些方面，所述cog方法可用于产生较小的分子量的碳水化合物和/或多糖和/或寡糖以用于生产生物乙醇、生物燃料或其他下游化合物。
286.可溶性纤维产物可用于许多用途，包括但不限于医疗产品和设备，食品(即增稠剂、营养改良剂(amendment)、风味剂和/或调味剂)，土壤改良剂(以设计、平衡或富集特定的有益的土壤微生物组组分)，以及纤维产品(例如，新型纺织品、绳、可生物降解包装等)。在一些方面，例如，所述不溶性纤维是棉，其可以使用本文所述的cog方法进行处理或进行部分地处理，以获得一种或多种所需特征(例如，柔软度、强度、弹性、吸收性等)。在一些方
面，本文所述的cog方法可以对不溶性纤维进行改性以使其可溶。
287.在优选的方面，所述cog方法用于从多糖中产生寡糖。在一些方面，所述cog方法包括，使反应混合物中的多糖与过氧化氢和合适的过渡金属、碱土金属或镧系元素(例如fe(ii)、fe(iii)、cu(i)、cu(ii)、ca(ii)、mg(ii)、mn(ii)、zn(ii)、ni(ii)、ce(iv)、co(ii))反应；随后用诸如碳酸氢铵，氢氧化铵、氨、尿素、氨基钠或其他氮基试剂、和/或其他弱阿伦尼乌斯碱基或非阿伦尼乌斯碱(例如，见上表1)中的一种或多种的高产过氧化物淬灭/裂解试剂裂解经过氧化羟基处理过的多糖中的糖苷键，从而从所述多糖中产生高产量的寡糖，同时减少或消除剥离和不需要的副反应。在本文公开的方法中，所述反应混合物包含过渡金属或碱土金属。在一些方面，所述过渡金属选自fe(ii)、fe(iii)、cu(i)、cu(ii)、mn(ii)、zn(ii)、ni(ii)、co(ii)。在一些方面，所述反应混合物包含选自钙或镁(例如，ca(ii)，mg(ii))的碱土金属。在一些方面，所述金属可以选自镧系元素(例如，ce(iv))。
288.在一些方面，所述裂解试剂可包含选自氢氧化铵、氨、碳酸氢铵、尿素等的至少一种试剂或它们的组合(例如，参见表1)。在一些方面，所述裂解试剂可以包括醇或胺的共轭碱。在一些方面，所述裂解试剂可以包括甲醇钠、乙醇钠、叔丁醇钠或其他去质子化醇。在一些方面，所述裂解试剂可以是一种或多种相对“大体积碱”或包含一种或多种相对“大体积碱”，例如叔丁醇、三乙胺或其他空间位阻碱。在一些方面，使用这种大体积的裂解试剂/碱导致可及的糖苷键的选择性裂解，以提供独特/特异于所述裂解试剂/碱的寡糖谱(profile)。在一些方面，所述裂解试剂本身不是碱，而是由一种或多种反应剂组成或包括一种或多种反应剂，所述反应剂反应产生碱性条件和/或分解产物。在本文所述的所有方法中，所述裂解试剂(裂解引发剂)也可以是并且优选是过氧化物淬灭试剂，并且在任一种情况下都可以与另外的相容的过氧化物淬灭剂组合使用，所述另外的相容的过氧化物淬灭剂可以是裂解剂，也可以不是裂解剂。
289.在一些方面，所述反应混合物中的过渡金属或碱土金属的浓度为至少约0.65nm(例如，至少在0.5nm至0.7nm范围中的值)。在一些方面，所述反应混合物中的过渡金属或碱土金属的浓度为0.65nm至500nm。在一些方面，所述反应混合物中的过氧化物剂(例如，过氧化氢)的浓度为至少约0.02m(例如，至少在0.015m至0.025m范围中的值)。在一些方面，所述反应混合物中的过氧化物剂(例如，过氧化氢)的浓度为0.02m至1m。在一些方面，所述裂解试剂/碱是氢氧化铵、氨、碳酸氢铵、弱阿伦尼乌斯碱、非阿伦尼乌斯碱、路易斯碱和/或bronsted-lowry碱或包括氢氧化铵、氨、碳酸氢铵、弱阿伦尼乌斯碱、非阿伦尼乌斯碱、路易斯碱和/或bronsted-lowry碱。此外，可以使用两种或更多种裂解试剂/碱(例如，如本文所讨论的裂解试剂/碱)的组合。在一些方面，强阿伦尼乌斯碱(例如，na

oh-、k

oh-或ca
2
(oh-)2)可以与本文所讨论的裂解试剂/碱组合使用。在一些方面，氨气可以通过起泡或作为大气组分与溶液接触以充当裂解试剂和/或淬灭试剂。在一些方面，所述裂解试剂的浓度为至少约0.1m( /-20％)。在一些方面，所述裂解试剂的浓度为0.1m至5.0m。在一些方面，所述裂解试剂作为饱和溶液或不溶性物质存在。在一些方面，所述裂解试剂使溶液ph达到7.5、8、9、10、12或更高。在本文所述的所有方法中，所述裂解试剂(裂解引发剂)也可以是并且优选是过氧化物淬灭试剂，并且在任一种情况下都可以与另外的相容的过氧化物淬灭剂组合使用，所述另外的相容的过氧化物淬灭剂可以是裂解剂，也可以不是裂解剂。在一些方面，所述多糖包括直链淀粉(amylose)、支链淀粉(amylopectin)、β-葡聚糖(betaglucan)、普鲁
兰多糖、木葡聚糖、阿拉伯半乳聚糖i和阿拉伯半乳聚糖ii、鼠李半乳糖醛酸聚糖i、鼠李半乳糖醛酸聚糖ii、聚半乳糖醛酸、聚葡萄糖、半乳聚糖、阿拉伯聚糖、阿拉伯木聚糖、木聚糖(例如，山毛榉木聚糖)、糖原、甘露聚糖、葡甘露聚糖、凝胶多糖、半乳甘露聚糖、半乳聚糖、地衣多糖(lichenan)和菊粉中的一种或多种。在一些方面，所述多糖来自植物来源或动物来源。在一些方面，所述多糖来自细菌来源、酵母来源或藻类来源。在一些方面，所述多糖是(任选冻干的)植物材料的形式。在一些方面，所述植物材料是刺槐豆胶、胡芦巴(fenugreek)种子、蒸馏酒糟或废蒸馏酒糟或它们的一些部分或提取物。在一些方面，所述方法还包括从寡糖混合物中纯化一种或多种寡糖。
290.在一些方面，在反应之前，所述方法包括使多糖与一种或多种多糖降解酶接触。在一些方面，所述一种或多种多糖降解酶包括例如淀粉酶、异淀粉酶、纤维素酶、麦芽糖酶、葡聚糖酶、木聚糖酶、乳糖酶或它们的组合。
291.在一些方面，可以在反应之前用酸、碱和/或氧化剂和还原剂对多糖材料进行预处理。
292.还提供了组合物，其包括使用上文或本文其他地方公开的cog方法产生的寡糖混合物，或使用上文或本文其他地方的cog方法产生的一种或多种纯化的寡糖。
293.在一些方面，所述cog方法包括使一种或多种微生物(例如，细菌、真菌、酵母)与包含一种寡糖或寡糖混合物的组合物接触，以选择性地刺激所述一种或多种微生物的生长。在一些方面，所述微生物包括益生菌微生物。在一些方面，所述一种或多种微生物在动物的肠道中，并且将所述组合物施用于所述动物。在一些方面，将所述一种或多种微生物(益生元微生物)与组合物分别(例如，依次)施用于所述动物，或与组合物同时施用于所述动物(例如，施用包括所述益生菌微生物和一种寡糖或寡糖混合物的组合物)。在一些方面，所述一种或多种微生物位于或被引入到动物或人的特定位置或内腔(例如阴道)中。在一些方面，所述益生菌微生物是假链状双歧杆菌(bifidobacterium pseudocatenulatum)。在一些方面，所述益生菌微生物是卷曲乳杆菌(lactobacillus crispatus)。在一些方面，所述一种或多种微生物是土壤微生物、口腔微生物(例如细菌)或皮肤微生物。在一些方面，所述一种或多种寡糖可以与抗生素治疗一起施用。在一些方面，所述一种或多种寡糖可以与抗生素治疗和一种或多种益生菌一起施用。在一些方面，所述一种或多种寡糖可以与确定的细菌群或未确定的细菌群一起施用。在一些方面，所述一种或多种寡糖可以用作赋形剂。定义
294.如本文所用，术语“多糖”是指多糖或包含多糖的材料，在任一情况下，其中可通过本文公开的cog方法裂解至少多糖组分。此外，如本文所用，术语“多糖”是指任何碳水化合物聚合物(例如，二糖、寡糖、多糖)并且还可以连接到其他非碳水化合物部分(例如，糖蛋白、蛋白聚糖、糖肽、糖脂、糖缀合物、糖苷)。
295.如本文所用，术语“过氧化物剂”是指包含氧-氧键的化合物，其可以在光、温度或催化剂(例如金属和酶)的作用下自然产生r-o和/或r-o-o类，其中“r”是指连接到分子其余部分的氢或碳基团。一方面，过氧化物剂是过氧化氢。
296.寡糖的“聚合度”或“dp”是指作为具体碳水化合物一部分的糖单体单元的总数。例如，四半乳寡糖的dp为4，具有3个半乳糖部分和一个葡萄糖部分。
297.术语“双歧杆菌(bifidobacterium)”及其同义词是指具有对人类有益特性的厌氧
菌属。双歧杆菌是构成肠道菌群的主要细菌菌株之一，该细菌存在于胃肠道中并对其宿主的健康有益(guarner and malagelada 2003)。
[0298]“益生元(prebiotic)”或“益生元营养物”通常是不可消化的食物成分，当摄入时，通过选择性刺激胃肠道中一种或有限数量的微生物的生长和/或活性而对宿主产生有益的影响。如本文所用，术语“益生元”是指处于其非天然存在状态(例如，在纯化、化学合成或酶促合成之后，而不是例如在全人乳中)的上述不可消化的食物成分。
[0299]“益生菌(probiotic)”是指当以足够的量施用时会给宿主带来健康益处的活的微生物。
[0300]
如本文所用，应用于所公开方法的“剥离反应”或“剥离”是指通过从聚合物的还原端释放单体单元的机制的碳水化合物的连序碱降解。
[0301]
如本文所用，优选地，如应用于所公开方法的“裂解剂”或“裂解试剂”是指用于在多糖的过氧化羟基氧化后用于裂解多糖的单个或一组非阿伦尼乌斯碱和/或弱阿伦尼乌斯碱。在某些方面，裂解剂或裂解试剂破坏多糖中的糖苷键，糖苷键可以存在于多糖的任何两种糖之间。在本文所述的方法中，所述裂解试剂(裂解引发剂)也可以是并且优选是过氧化物淬灭试剂，并且在任一种情况下都可以与另外的相容的过氧化物淬灭剂组合使用，所述另外的相容的过氧化物淬灭剂也可以是裂解剂，也可以不是裂解剂。在一些方面，裂解试剂可以是酶。在一些方面，所述裂解试剂酶可以是糖基水解酶、溶解性多糖单加氧酶、糖基转移酶、转糖苷酶、多糖裂解酶、碳水化合物结合组件、糖基转移酶、碳水化合物酯酶、包含两种或更多种前述酶的混合物，或任何具有碳水化合物活性的酶。在一些方面，裂解试剂可以是固相酸催化剂或固相碱催化剂。
[0302]
如本文所用，“碱”是指可以接受来自过氧化氢氧化的碳水化合物、水或非水溶剂的氢离子的化合物或所述化合物的集合。术语“碱”可以包括路易斯碱、非阿伦尼乌斯碱、弱阿伦尼乌斯碱、通过分解产生氢氧根离子、路易斯碱、非阿伦尼乌斯碱或弱阿伦尼乌斯碱的其他分子，或可接受来自过氧化羟基氧化的碳水化合物的氢离子的其他化合物。如本文所用，除非另有说明，“碱”明确不指强阿伦尼乌斯碱(例如，na

oh-、k

oh-或ca
2
(oh-)2)。
[0303]
如本文所用，应用于所公开方法的“碳酸氢铵”是指固体碳酸氢铵，和/或包含以下的水溶液：铵和碳酸氢盐；铵、oh-和co2；氨、h2o和co2；或任何上述产物及其平衡产物。
[0304]
如本文所用，应用于所公开方法的“氢氧化铵”是指氢氧化铵水溶液，和/或包含以下的溶液：氨和h2o；铵和oh-；氨和oh-；或任何上述产物及其平衡产物。
[0305]
如本文所用，应用于所公开方法的“强阿伦尼乌斯碱”是指在水中完全解离以将一个或多个氢氧根离子释放到溶液中的化合物。如本文所用，应用于所公开方法的“强阿伦尼乌斯碱”明确指koh、naoh、ba(oh)2、csoh、sr(oh)2、ca(oh)2、lioh和rboh。
[0306]
如本文所用，应用于所公开方法的“弱阿伦尼乌斯碱”是指在水中不完全解离以将一个或多个氢氧根离子释放到溶液中的化合物，例如氢氧化铵、h2o等。由于本文使用“弱阿伦尼乌斯碱”，因此没有能同时满足强阿伦尼乌斯碱和弱阿伦尼乌斯碱的定义的化合物。
[0307]
如本文所用，应用于所公开方法的“非阿伦尼乌斯碱”是指可以提供电子(例如，路易斯碱)、接受质子(例如，bronstead-lowry碱)或通过其分解释放氢氧根离子(nh4hco3)，但明确不能算作阿伦尼乌斯碱的化合物或原子。
[0308]
如本文所用，应用于所公开方法的“路易斯碱”是指可以提供电子对的化合物或原
子(例如，f-、苯、h-、吡啶、乙腈、丙酮、尿素等)。
[0309]
如本文所用，应用于所公开的方法的“bronsted-lowry碱”是指可以接受或结合氢离子的化合物或原子(例如甲醇，甲醛，氨等)。
[0310]
如本文所用，应用于所公开的方法的“过氧化物淬灭试剂”是指不是强阿伦尼乌斯碱，可以将过氧化氢，过氧化自由基和过氧化羟基自由基转化为较弱反应性状态或非反应性状态的化合物或原子(例如，氢氧化铵，碳酸氢铵，氨等)。在某些方面，本文所定义的过氧化物淬灭试剂将过氧化氢以及由过氧化氢产生的自由基转化成较弱反应性物质(例如水)。在某些方面，过氧化物淬灭试剂可以将过氧化氢浓度降至零、低于5mg/l、低于10mg/l、低于25mg/l，或低于50mg/l。在某些方面，过氧化物淬灭试剂可以形成水、氢氧化物离子或氧气。在某些方面，可以使用酶来淬灭过氧化物质。在某些方面，这些酶可包括过氧化氢酶。在某些方面，这些酶可以来自动物来源。在某些方面，这些酶可以来自牛肝。在某些方面，所述酶可以来自微生物来源。在某些方面，所述酶可以是重组的。在某些方面，可以混合不同的酶以淬灭过氧化物质。
[0311]
如本文所用的，应用于所公开的方法的“氮基”是指包含至少一个氮原子和四个取代基的化合物，所述四个取代基可包含孤电子对、氢或碳原子的任何组合(例如氨、氨基钠、三甲胺、二乙胺、n,n-二异丙基乙胺，尿素、吡啶、氢氧化铵、碳酸氢铵等)。表1中列出了示例性的氮基过氧化物淬灭剂、氮基ps裂解剂。氮基试剂可具有未取代的铵基或取代的铵基，且可以以中性和/或离子形式存在。
[0312]
如本文所用，“反应混合物”是指包含括试剂的混合物，所述试剂可发生化学反应以形成不同于所述试剂的产物。
[0313]
如本文所用，“处理过的多糖”是指已经与至少一种能够与多糖反应的试剂(例如，酶或芬顿试剂)接触的多糖。
[0314]
如本文所用，“多糖裂解产物”是由多糖的化学裂解和/或酶裂解形成的产物。
[0315]
如本文所用，“寡糖”是指低分子量的多糖，是3至30个单糖单元的聚合物。寡糖可以是线性聚合物、支链聚合物、具有侧链糖单体的主体线性聚合物，或其任何组合。
[0316]
如本文所用，“多糖”是指大于30个单糖单元的单糖单元的聚合物。多糖可以是线性聚合物、支化聚合物、具有侧链糖单体的主体线性聚合物，或它们的任何组合。
[0317]
如本文所用，“芬顿试剂”是指包括过氧化物剂和金属的试剂。在某些方面，所述过氧化物剂是过氧化氢。在某些方面，所述金属是fe(ii)、fe(iii)、cu(i)、cu(ii)、mn(ii)、zn(ii)、ni(ii)和co(ii)；碱土金属ca(ii)和mg(ii)；镧系元素ce(iv)或它们的任何组合。
[0318]
如本文所用，短语“与过氧化物淬灭的引发是基本同时的”是指裂解反应的时机(timing)与过氧化物淬灭反应的时机之间的关系，表明裂解反应的引发和过氧化物淬灭反应的引发发生在彼此的短时间内(例如，约数秒，或约几分钟，但不超过一天)。
[0319]
如本文所用的“指定反应时间”或“反应时间”是指提供时间以允许反应向所加入的试剂和通过试剂反应产生的产物之间的平衡状态进行。在某些方面，指定反应时间允许有足够的时间达到平衡。在某些其他方面，指定反应时间，虽然允许反应有时间向平衡进行，但不提供达到平衡所需的时间。
[0320]
如本文所用，术语“合成寡糖”是指通过多糖的解聚产生的寡糖。根据本文所述的方法，通过解聚杂聚物多糖和均聚物多糖，可以获得根据本发明的合成寡糖。在某些方面，
术语合成寡糖是指通过本文公开的方法产生的寡糖库(pool)。
[0321]
如本文所用，术语“杂聚多糖”是指包含两种或多种通过相同类型的糖苷键或不同类型的糖苷键连接在一起的单糖亚单位的多糖；杂聚物多糖还包括包有通过不同类型的糖苷键连接在一起的相同种类的重复单糖亚单位的多糖。杂聚多糖中的糖苷键可以是β1-2键、β1-3键、β1-4键、β1-6键、α1-3键、α1-4键、α1-6键或它们的组合。杂聚多糖的实例包括但不限于木葡聚糖、地衣多糖、β-葡聚糖、葡甘露聚糖、半乳甘露聚糖、阿拉伯聚糖、木聚糖和阿拉伯木聚糖。
[0322]
如本文所用，当术语“约”和“近似”用于修饰数值或范围中指定的量，表明该数值以及与本领域技术人员已知的值的合理偏差，例如
±
20％、
±
10％、或
±
5％，均在所列值的预期含义内。
[0323]
如本文所公开的，受控的寡糖生成(“cog”)是将多糖受控降解为寡糖的方法。在一些方面，粗制的多糖首先用过氧化氢和过渡金属、碱土金属或镧系元素催化剂进行初始氧化处理，以使糖苷键更加不稳定。然后使用氢氧化铵、碳酸氢铵、氨、尿素等，或其他弱阿伦尼乌斯或非阿伦尼乌斯碱进行裂解，以产生多种独特的寡糖(独特的寡糖谱)或更小的多糖。在一些方面，立即进行过氧化物淬灭和/或中和以分别减少不需要的氧化或剥离。在一些方面，允许处理过的样品(例如，经芬顿试剂处理后的包含多糖原材料)在降低的温度、环境温度或室温下与裂解试剂反应，以促进寡糖的产生。在一些方面，所述裂解反应在4℃至100℃、20℃至80℃、30℃至60℃或40℃进行。在一些方面，裂解和过氧化物淬灭是即时的。在一些方面，裂解步骤进行10分钟至30分钟、20分钟至60分钟、30分钟至120分钟。在一些方面，裂解步骤进行2小时至6小时、3小时至12小时、6小时至24小时或更长。在一些方面，裂解步骤是过夜进行的。在本文所述的所有方法中，所述裂解试剂(裂解引发剂)也可以是并且优选是过氧化物淬灭试剂，并且在任一种情况下都可以与另外的相容的过氧化物淬灭剂组合使用，所述另外的相容的过氧化物淬灭剂可以是裂解剂，也可以不是裂解剂。所公开的cog方法具有从多种碳水化合物来源(例如，含多糖的原材料)产生大量的生物活性寡糖的能力。
[0324]
在某些方面，裂解多糖的方法包括多个步骤。例如，所述方法可以包括：a)使一种或多种多糖与包括过氧化物试剂和金属离子的芬顿试剂接触以形成混合物；b)允许所述芬顿试剂与所述多糖反应指定反应时间；c)在步骤b之后，向所述混合物中加入也可以是过氧化物淬灭试剂的裂解剂。在这方面，使所述多糖与所述芬顿试剂接触(步骤a)并允许经过指定反应时间(步骤b)的步骤可以在相同ph或不同ph下进行，其中所述ph选自ph 3至ph 8、ph 4至ph 7、ph 4.5至ph 6.5以及ph 5至ph 6的范围。所述ph可以是指定ph值范围中的任何可能值。加入也可以是过氧化物淬灭试剂的裂解剂的步骤(步骤c)可以在选自ph 6至ph 11、ph 6.5至ph 9.5、ph 7至ph 9以及ph7至ph 8的范围的ph下进行。该ph可以是指定ph值范围中的任何可能值。在这方面，使所述多糖与所述芬顿试剂接触的步骤(步骤a)和经过指定反应时间(步骤b)可以在相同温度或不同温度进行，其中所述温度选自10摄氏度至70摄氏度、20摄氏度至60摄氏度，以及25摄氏度至55摄氏度的温度范围。所述温度可以是指定温度值范围中的任何可能值。加入也可以是过氧化物淬灭试剂的裂解剂的步骤(步骤c)可以在选自10至70摄氏度、20至60摄氏度和25至55摄氏度的温度范围的温度进行。该温度可以是指定温度值范围中的任何可能值。
[0325]
在一些方面，可以用合适的树脂材料处理寡糖材料。所述合适的树脂材料可以包括阴离子交换、阳离子交换、脱色、螯合特性。例如，合适的树脂可包括但不限于ionac nm-60、mbd-10ultra、thermax tulsion mb、cole-parmer rr-1400、amberlite mb20、dowex monosphere mr-450。可以组合两种或多种树脂以产生混合床树脂。样品可以用碳处理。所述碳可以是活性炭、木炭、石墨化碳、多孔石墨化碳或任何以净化为目的而添加的碳基材料。
[0326]
如果需要，在用cog方法处理所得多糖之前，可任选地用一种或多种多糖降解酶来处理多糖以降低所述多糖的平均尺寸或复杂性。多糖酶的非限制性实例包括例如淀粉酶、异淀粉酶、纤维素酶、麦芽糖酶、葡聚糖酶、乳糖酶、木聚糖酶、阿拉伯糖酶、果胶酶、甘露聚糖酶或它们的组合。在一些方面，通过添加或去除单体单元，碳水化合物活性酶可用于修饰所得产物以制备新产物。
[0327]
在所述cog方法中，初始的氧化处理可包括过氧化氢和过渡金属、碱土金属或镧系金属，其中可以单独使用或组合使用这些金属。在所述cog方法中，不同的金属可用于产生具有特征性聚合度(dp)或优选聚合度的寡糖或寡糖谱。在所述cog方法中，不同的金属可用于从相似的原材料产生不同的寡糖谱。在所述方法的氧化处理之后是过氧化物淬灭/裂解处理。所述cog方法能够从具有不同支化度以及具有多种单糖组成(包括天然多糖和改性多糖)的多糖生成寡糖。所述cog方法适用于来自任何来源的多糖。示例性的多糖底物包括但不限于直链淀粉、支链淀粉、β-葡聚糖、普鲁兰多糖、木葡聚糖、阿拉伯半乳聚糖i和阿拉伯半乳聚糖ii、鼠李半乳糖醛酸聚糖i、鼠李半乳糖醛酸聚糖ii、聚半乳糖醛酸、聚葡萄糖、半乳聚糖、阿拉伯聚糖、阿拉伯木聚糖、木聚糖(例如，山毛榉木聚糖)、糖原、甘露聚糖、葡甘露聚糖、凝胶多糖、半乳甘露聚糖、半乳聚糖、地衣多糖和菊粉中的一种或多种。可以使用含多糖的材料的原始或天然来源和形式。含多糖的材料可以是天然形式，或者在与反应物接触之前可以被渗透、研磨、切碎、空化或以其他方式分开或改变。
[0328]
通过所述cog方法产生获得的一种或多种寡糖(例如混合物)可具有范围为2至200的平均dp，例如2至100或3至20或5至50，或低于天然多糖的任何dp，或前述示例性范围的任何子范围中的任何值。
[0329]
通过所述cog方法产生获得的一种或多种寡糖(例如混合物)可以具有多种用途。在一些方面，所述一种或多种寡糖可用作益生元以选择性地刺激一种或多种益生菌的生长。在一些方面，所述寡糖组合物可以作为益生元制剂(即，没有细菌)或作为益生菌制剂(即，具有一种或多种所需要的细菌，例如本文所述的双歧杆菌)施用。通常，人类或动物可食用或以其他方式适当施用的任何食物或饮料都可用于制备包含含益生元和益生菌寡糖的组合物的制剂。示例性食物包括具有半液体黏稠度以允许本文所述的益生元和益生菌组合物易于且均匀分散的那些食物。然而，其他黏稠度(例如，粉末、液体等)也可以不受限制地使用。因此，此类食物包括但不限于基于乳制品的产品，例如奶酪、白软干酪(cottage cheese)、酸奶和冰淇淋。加工过的水果和蔬菜，包括那些针对婴儿/幼儿的水果和蔬菜，例如苹果酱或豌豆泥和胡萝卜泥，也适合与本发明的寡糖组合使用。婴儿谷类食品(诸如基于大米或基于燕麦的谷类食品)和诸如cream of wheat
tm
等的成人谷类食品也适合与所述寡糖组合使用。cog产物也可用于医疗食品，例如，如pedialyte
tm
、ensure
tm
等。除了针对人类消费的食品外，动物饲料也可以补充含益生元和益生菌寡糖的组合物。
[0330]
或者，通过所述cog方法处理的含多糖的材料和/或含寡糖的组合物(例如，含益生元和益生菌寡糖的组合物)可用于补充饮料。此类饮料的实例包括但不限于婴儿配方食品、后续配方食品、幼儿饮料、牛奶、发酵奶、果汁、水果饮料和运动饮料。许多婴儿和幼儿配方食品是本领域已知的并且是可商购的，包括例如carnation good start
tm
(nestle nutrition division；glendale，calif.)和由mayfield dairy farms(athens,tenn.)生产的nutrish ab
tm
。婴儿或宝宝配方食品的其他实例包括美国专利第5,902,617号中公开的那些。所述组合物的其他有益制剂包括补充动物奶，例如牛奶。
[0331]
或者，可以将含益生元和益生菌寡糖的组合物配制成丸剂或片剂或封装在胶囊中，例如明胶胶囊。片剂形式可任选地包括例如乳糖、蔗糖、甘露醇、山梨糖醇、磷酸钙、玉米淀粉、马铃薯淀粉、微晶纤维素、明胶、胶体二氧化硅、滑石、硬脂酸镁、硬脂酸和其他赋形剂中的一种或多种、着色剂、填充剂、粘合剂、稀释剂、缓冲剂、润湿剂、防腐剂、调味剂、染料、崩解剂和药学上相容的载体。锭剂(lozenge)或糖果形式可以调味剂(例如蔗糖)中包含组合物，以及在惰性基质中包含组合物的软锭剂(pastille)，例如除了活性成分外，包含本领域已知的载体的明胶和甘油或蔗糖和阿拉伯胶乳剂、凝胶等的惰性基质。含有益生元或益生菌寡糖的制剂还可以包含常规的食品补充剂的填充剂和增量剂，例如米粉。该产品还可用于帮助其他营养物质和矿物质的吸收。
[0332]
在一些方面，含益生元或益生菌寡糖的组合物将包含或进一步包含非人类蛋白质、非人类脂质、非人类碳水化合物或其他非人类组分。例如，在一些方面，所述组合物可以包含牛(或其他非人)乳蛋白、大豆蛋白、大米蛋白、β-乳球蛋白、乳清、大豆油或淀粉。在一些方面，所述寡糖与多糖组合。在一些方面，所述寡糖与其母体多糖组合。
[0333]
含益生元和益生菌寡糖的组合物的剂量将根据个体的需要而变化，和/或将考虑诸如年龄(婴儿与成人)、体重和有益肠道细菌损失的原因(例如，抗生素治疗、化学治疗、放射治疗、疾病或年龄)等因素。在本公开的上下文中，施用方案和个体施用量或个体消耗量应当优选随时间推移足以让有益细菌在肠道中的定殖。施用方案和/或剂量大小也将由可能伴随所提供的含益生元或益生菌寡糖的组合物的施用的任何不良副作用的存在、性质和程度来确定。在一些施用方面，剂量范围将有效地作为食品补充剂并用于重建肠道中有益细菌。在一些施用方面，本发明的寡糖组合物的剂量范围为约1微克/l至约25克/l的寡糖。在一些方面，寡糖组合物的剂量为约100微克/l至约15克/l的寡糖。在一些方面，寡糖组合物的剂量为约1g/l至10g/l、5g/l至15g/l、10g/l至50g/l或多达200g/l。在一些方面，所述剂量为50g/天至70g/天。在一些方面，所述剂量为10g/天。在一些方面，所述剂量为1g/天至10g/天。在一些方面，所述剂量超过100g/天。在一些方面，所述剂量为0.25g/天至3g/天。示例性双歧杆菌剂量包括但不限于每剂约104至约10
12
个菌落形成单位(cfu)。一个更有利的范围是约106cfu至约10
10
cfu。其他细菌也可以以类似的浓度给药，但不限于每剂约104至约10
12
个菌落形成单位(cfu)或每剂约106cfu至约10
10
cfu。
[0334]
所公开的含益生元或益生菌寡糖的制剂可以施用于任何有此需要的受试者/个体。在一些方面，所述个体是婴儿或幼儿。例如，在一些方面，所述个体年龄小于，例如3个月、6个月、9个月、1岁、2岁或3岁。在一些方面，所述个体为3岁至18岁。在一些方面，所述个体是成年人(例如，18岁或以上)。在一些方面，所述个体超过50岁、55岁、60岁、65岁、70岁或75岁。在一些方面，所述个体具有免疫缺陷(例如，所述个体患有aids或正在接受化学治疗、
免疫治疗或放射治疗)。
[0335]
可包括在本发明中的益生菌组合物中的示例性双歧杆菌包括但不限于bifidobacterium longum subsp.infantis、b.longum subsp.longum、短双歧杆菌(bifidobacterium breve)、青春双歧杆菌(bifidobacterium adolescentis)以及假链状双歧杆菌(b.pseudocatenulatum)。所用的双歧杆菌将部分取决于目标消费者。
[0336]
应当理解，本文所述的制剂中包括其他双歧杆菌因子对一些应用可能是有利的。此类附加组分可包括但不限于诸如raffinose(rhone-poulenc,cranbury,new jersey)、菊粉(imperial holly corp.,sugar land,texas)和nutraflora(golden technologies,westminister,colorado)的低聚果糖，以及乳糖，低聚木糖，大豆低聚糖(soyoligosaccharide)，乳果糖/乳糖醇和低聚半乳糖等。在一些应用中，所述制剂可以包括其他有益细菌，例如乳酸杆菌(lactobacillus)、瘤胃球菌(rumminococcus)、阿克曼氏菌(akkermansia)、拟杆菌(bacteroides)、粪杆菌(faecalibacterium)。本文所述cog产品可用于刺激酵母。
[0337]
如本文所述的寡糖可用于刺激任何种类的微生物。可以被所述寡糖刺激的微生物的实例包括，例如，土壤微生物(例如，菌根真菌和细菌以及用作土壤接种剂的其他微生物，例如固氮螺菌(azosprillum sp.))、口腔细菌(例如，变异链球菌(streptococcus mutans)、格氏链球菌(streptococcus gordonii)、血链球菌(streptococcus sanguis)和口腔链球菌(s.oralis))和皮肤细菌(例如痤疮丙酸杆菌(propionibacterium acnes)，还有氨氧化细菌，包括但不限于亚硝化单胞菌(nitrosomonas)、亚硝化球菌(nitrosococcus)、亚硝化螺旋菌(nitrosospira)、nitrosocvstis、亚硝化叶菌(nitrosolobus)和亚硝基弧菌(nitrosovibrio)。
[0338]
在一些方面，对有需要的人或动物施用所公开的寡糖组合物。例如，在一些方面，将所述寡糖组合物施用于具有至少一种以下病症的人或动物：炎症性肠道综合征、便秘、腹泻、结肠炎、克罗恩病、结肠癌、功能性肠道障碍(fbd)、肠易激综合征(ibs)、过量硫酸盐还原菌、炎性肠病(ibd)和溃疡性结肠炎。肠易激综合征(ibs)的特征是腹痛和不适、腹胀、和肠功能改变、便秘和/或腹泻。ibs共有三种：主要便秘型ibs(c-ib)，交替型ibs(a-ibs)和主要腹泻型ibs(d-ibs)。所述寡糖组合物对于例如，抑制或延长溃疡性患者的复发周期是有用的。可施用所述寡糖组合物来治疗或预防任何形式的功能性肠道障碍(fbd)，特别是肠易激综合征(ms)，例如主要便秘型ibs(c-ibs)、交替型ibs(a-ibs)和主要腹泻型ibs(d-ibs)；功能性便秘和功能性腹泻。fbd是一系列慢性的或半慢性胃肠道疾病的总称，这些胃肠道疾病与肠疼痛、肠功能紊乱和社会干扰有关。
[0339]
在一些方面，所述寡糖组合物可以用作填充剂(bulking-agent)。在一些方面，所述寡糖组合物可以在低糖食品应用中用作填充剂。在一些方面，这些寡糖可以用作不影响风味、气味、流变特性和质地特性的填充剂。
[0340]
在另一个方面，将所述寡糖组合物施用于那些需要刺激免疫系统和/或促进对细菌感染或酵母菌感染(例如念珠菌病(candidiasis)或硫酸盐还原菌引起的疾病)的抗性的人。
[0341]
本公开的一些方面提供了包括一个含葡萄糖单体的主链的合成寡糖，其中每个葡萄糖单体任选地与侧链的木糖单体键合，并且其中合成寡糖的单体总数的范围为3至30。此
类合成寡糖可以通过例如根据本文所述方法解聚木葡聚糖来获得。已知木葡聚糖包含具有单个单元的木糖支链的葡萄糖主链，其中木糖支链可以用半乳糖封端(endcap)或阿拉伯糖封端修饰。例如，罗望子木葡聚糖包含一个β1,4-连接的葡萄糖主链，并具有频繁出现的α1,6-连接的木糖的单个单元支链，其有时可以进一步连接到单个β1,2-连接的半乳糖封端。在其他的木葡聚糖来源中，阿拉伯糖可以α1,2连接到木糖残基。来自其他来源的木葡聚糖可能包含以α1,2连接到半乳糖的单个岩藻糖残基。
[0342]
在一些方面，所述寡糖包括2个、3个、4个、5个或6个己糖残基。在一些方面，所述寡糖包含1个、2个、3个或更多个戊糖残基。在一些方面，所述寡糖包含相同数量的己糖残基和戊糖残基。在一些方面，所述寡糖包含比己糖残基更少的戊糖残基。
[0343]
在一些方面，所述合成寡糖的主链中的葡萄糖单体是β1-4连接的葡萄糖单体。在一些方面，每个侧链木糖单体通过α1-6键与主链中的葡萄糖单体键合。
[0344]
在一些方面，所述合成寡糖还包括一个与一个或多个侧链木糖单体键合的半乳糖单体。在一些方面，每个半乳糖单体通过β1-2连接与所述侧链木糖单体键合。在一些方面，所述合成寡糖还包括一个与一个或多个半乳糖单体键合的岩藻糖单体。在一些方面，每个岩藻糖单体通过α1-2键与所述半乳糖单体键合。
[0345]
在一些方面，所述合成寡糖还包括一个与一个或多个侧链木糖单体键合的阿拉伯糖单体。在一些方面，所述阿拉伯糖单体通过α1-2键与所述侧链木糖单体键合。
[0346]
在一些方面，所述合成寡糖包含2个至4个在主链中的葡萄糖单体、1个至2个与主链中的不同葡萄糖单体键合的侧链木糖单体以及0至2个与不同木糖单体键合的半乳糖单体。
[0347]
本公开的一些方面提供了具有一个含甘露糖单体的主链的合成寡糖，其中每个甘露糖单体任选地与侧链半乳糖单体键合，并且其中所述合成寡糖中单体的总数为3个至30个。此类合成寡糖可以通过例如根据本文所述的方法解聚半乳甘露聚糖来获得。由诸如曲霉来源产生的半乳甘露聚糖包含一个β1-4甘露糖主链，并具有频繁出现的含单个单元的α1-6半乳糖支链。
[0348]
本公开的一些方面提供了包含甘露糖单体和葡萄糖单体的合成寡糖，其中所述合成寡糖中单体的总数为3个至30个。此类合成寡糖可以通过例如根据本文所述方法解聚葡甘露聚糖来获得。葡甘露聚糖是一种主要存在于魔芋根中多糖。该聚合物包含β1-4连接的葡萄糖残基和甘露糖残基，这些残基被认为是以非重复出现的模式随机分布的。
[0349]
本公开的一些方面提供了具有一个含阿拉伯糖单体的主链的合成寡糖，其中每个阿拉伯糖单体任选地与侧链阿拉伯糖单体键合，并且其中所述合成寡糖中单体的总数为3个至30个。此类合成寡糖可以通过例如根据本文所述方法解聚阿拉伯聚糖来获得。阿拉伯聚糖作为侧链存在于果胶多糖鼠李半乳糖醛酸聚糖i也存在于一些分枝杆菌的细胞壁中。阿拉伯聚糖包含一个α1-5阿拉伯糖主链，并具有短α1-3阿拉伯糖支链。
[0350]
在本公开的一些方面，提供了衍生自谷类(例如，稻米、小麦、燕麦、麸皮、大麦和麦芽)中发现的β-葡聚糖的合成寡糖，例如，其由一个β1-4连接的葡萄糖主链和分散在每2至3个β1-4连接的葡萄糖残基之间的单个β1-3葡萄糖残基组成。在本公开的一些方面，提供了源自地衣多糖的合成寡糖，所述地衣多糖是在地衣中发现的多糖，具有类似于β-葡聚糖的结构，其连接由β1-4葡萄糖残基和β1-3葡萄糖残基组成。然而，与β-葡聚糖不同，地衣多糖
具有更频繁出现的β1-3键。在一些方面，类似β-葡聚糖的寡糖可来源于自废蒸馏酒糟或其他玉米产品。在一些方面，类似β-葡聚糖的寡糖可来源于燕麦和燕麦农业废弃物。在一些方面，类似β-葡聚糖的寡糖可来源于废啤酒酒糟或其他麦芽产品。
[0351]
本公开的一些方面提供了具有一个含木糖单体的主链的合成寡糖，其中每个木糖单体任选地与侧链阿拉伯糖单体或侧链葡萄糖醛酸(gluronic acid)(例如，4-o甲基化glca)键合，并且其中所述合成寡糖中单体的总数为3至30。此类合成寡糖可以通过例如根据本文所述的方法解聚木聚糖和/或阿拉伯木聚糖来获得。木聚糖是一种多糖，常见于双子叶植物的次生细胞壁和大多数草类的细胞壁中。该结构包含一个β1-4木糖主链，并且通常包含α1-2葡萄糖醛酸支链，其中可以包含单个甲基基团。在一些实施方案中，可以使用已知包含大量4-o-甲基-葡萄糖醛酸支链的山毛榉木聚糖。阿拉伯木聚糖是一种常见于谷物中的多糖，其包含一个β1-4木糖主链，并具有α1-2阿拉伯糖支链和α1-3阿拉伯糖支链。本公开的一些方面提供了合成的类似阿拉伯木聚糖的寡糖。本公开的一些方面提供了来自废蒸馏酒糟、玉米纤维或其他基于玉米的流的合成的类似阿拉伯木聚糖的寡糖。本公开的一些方面提供了来自废蒸馏酒糟、玉米纤维或其他基于玉米的流的合成的类似阿拉伯木聚糖的寡糖。本公开的一些方面提供了来自废啤酒酒糟或其他基于谷物的流的合成的类似阿拉伯木聚糖的寡糖。
[0352]
在一些方面，合成寡糖也可以通过根据本文所述方法解聚均聚物多糖来获得。如本文所用，术语“均聚物多糖”是指含相同种类的重复单糖亚单元的多糖，其通过相同类型的糖苷键连接在一起，所述糖苷键包括但不限于β1-3键、β1-4键、β1-6键、α1-3键、α1-4键和α1-6键的组合。均聚物的实例包括但不限于凝胶多糖、半乳聚糖和甘露聚糖。均聚物包括但不限于凝胶多糖(一种β1-3连接的葡萄糖的线性聚合物，是农杆菌的胞外多糖)、半乳聚糖(一种β1-4连接的半乳糖的线性聚合物，其在随后的阿拉伯呋喃糖苷酶处理以去除阿拉伯糖单元之前以阿拉伯半乳聚糖的形式分离出来)和甘露聚糖(一种β1-3连接的葡萄糖的线性聚合物，是农杆菌和一些坚果的胞外多糖)。
[0353]
在一些方面，所述合成寡糖可以通过任何合适的方法来制备，包括但不限于受控寡糖生成(cog)，其是一种用于将多糖控制降解成寡糖的方法。在一些方面，首先用过氧化氢和过渡金属或碱土金属(例如硫酸铁(iii))催化剂对粗制多糖进行初始氧化处理，以使糖苷键更不稳定。然后使用弱阿伦尼乌斯碱或非阿伦尼乌斯碱进行碱诱导的裂解，从而产生多种寡糖。可以立即进行中和以减少任何剥离反应。所述方法能够从多种碳水化合物来源中产生大量具有生物活性的寡糖。
[0354]
如果需要，在用氧化处理和金属催化剂处理所得多糖之前，可任选地用一种或多种多糖降解酶处理多糖以降低多糖的平均尺寸或复杂性。多糖酶的非限制性实例包括例如淀粉酶、异淀粉酶、纤维素酶、麦芽糖酶、葡聚糖酶或它们的组合。
[0355]
初始氧化处理可以包括过氧化氢和过渡金属或碱土金属。已经测试了具有不同氧化态、尺寸、元素周期表族和配位数的金属，以了解cog工艺的应用。每种不同的金属都在cog反应中表现出活性。虽然这些金属可与任何多糖一起使用，但不同的金属可用于产生具有优先聚合度的寡糖。氧化处理之后是碱处理。所述方法能够从具有不同支化度并具有多种单糖组成的多糖(包括天然多糖和改性多糖)中产生寡糖。
[0356]
还提供了包含两种或更多种如本文所述的不同合成寡糖的混合物。未纯化或半纯
化的解聚产物可用于制备寡糖混合物，或者，可将寡糖纯化以产生特殊配制的库。例如，可以通过解聚多糖均聚物、多糖杂聚物或其组合来获得所述混合物中的合成寡糖。在一些方面，所述混合物中的至少一种合成寡糖是通过解聚木葡聚糖、凝胶多糖、半乳聚糖、甘露聚糖、地衣多糖、β-葡聚糖、葡甘露聚糖、半乳甘露聚糖、阿拉伯聚糖、木聚糖、阿拉伯木聚糖、本文所述的其他聚合物或它们的组合来获得的。在一些方面，基于所述混合物中寡糖的总量，所述混合物中至少一种合成寡糖的量为至少1％。所述合成寡糖可以，例如，以约1％至约99％、或约5％至约95％、或约10％至约90％、或约20％至约80％，或约30％至约70％的量存在。所述合成寡糖可以，例如，以约1％至约10％、或约10％至约20％、或约20％至约30％、或约30％至约40％、或约40％至约50％、或约50％至约60％、或约60％至约70％、或约70％至约80％、或约80％至约90％、或约90％至约99％的量存在。该百分比可以是基于所述混合物中寡糖的总摩尔数的摩尔％，或基于所述混合物中寡糖的总重量的重量％。在一些方面，至少一种合成寡糖的量为至少5mol％。
[0357]
本文所述的合成寡糖和组合物可用作合生元、益生元、免疫调节剂、消化助剂、食品添加剂、药物赋形剂或分析标准品。所述合成寡糖可以与其他成分结合生产食品和补充剂，包括婴儿配方食品、老年补充剂、烘焙面粉和休闲食品。所述合成寡糖可以与有益细菌结合以形成合生元。所述合成寡糖也可用作药物产品。
[0358]
所述合成寡糖可用于人类、其他哺乳动物或植物根际中的具体微生物的生长或维持。所述合成寡糖可以包含具体的糖苷键，其不能被特定宿主(例如人、家畜或宠物)消化，但能够被具体的共生微生物群或益生菌群代谢。因此，所述合成寡糖可以作为载体将外源微生物(益生微生物或生物治疗微生物)运输到具体的生态位，或作为宿主中已经存在的微生物的营养来源。
[0359]
木葡聚糖可用于具体拟杆菌属物种的选择性生长，如卵形拟杆菌(b.ovatus)(larsbrink et al.2014)。已经证明，具有糖苷水解酶基因的木聚糖利用基因座属于可以在卵形拟杆菌中找到的gh5和gh31家族。当用作唯一碳源时，这些基因的存在允许该物种的生长。肠道中的其他主要拟杆菌属物种，例如多形拟杆菌(b.thetaiotaomicron)、粪拟杆菌(b.caccae)或脆弱拟杆菌(b.fragilis)，在其基因组中缺乏该基因座或该基因座的一部分，因此无法代谢木葡聚糖。
[0360]
当拟杆菌属物种的基因组编码属于gh16家族的具体类型的糖苷水解酶时，凝胶多糖可用于具体拟杆菌属物种(例如多形拟杆菌或吉氏拟杆菌(b.distasonis))的选择性生长。该基因的直向同源基因在其他拟杆菌属物种(如粪拟杆菌或卵形拟杆菌)的基因组中不存在，并且无法在凝胶多糖上生长(salyerss et al.1997)。
[0361]
β-葡聚糖或地衣多糖可用于具体拟杆菌属物种(如卵形拟杆菌)的选择性生长。该物种在其基因组中编码一种特定类型的gh16，具有β1-3,4葡聚糖活性(tamura et al.2017)。已经证明，这种多糖可以促进厚壁菌门(firmicutes)物种的生长，例如粪肠球菌(enterococcus faecium)、产气荚膜梭菌(clostridium perfingens)、roseburia inulinivorans和r.faecis(beckmann et al.2006,sheridan et al.2016)。
[0362]
半乳聚糖可以选择性使具体拟杆菌属物种生长，例如多形拟杆菌、b.dorei和卵形拟杆菌。不同类型的内切半乳聚糖酶可导致这种选择性生长，它们属于gh53和gh147家族(lammerts van bueren et al.2017,luis et al.2018)。消耗半乳聚糖的能力也在一些双
歧杆菌物种(短双歧杆菌(bif.breve)、长双歧杆菌(bif.longum)、bif long subsp.infantis)中被描述(hinz et al.2005)。
[0363]
甘露聚糖可以选择性地使具体拟杆菌属物种生长，如脆弱拟杆菌或卵形拟杆菌，它们编码gh26内切-β1-4-甘露糖苷酶(kawaguchi et al.2014)。该基因不存在于无法在甘露聚糖或葡甘露聚糖上生长的主要肠道物种如多形拟杆菌的基因组中。r.intestinalis和r.faecis可以耗尽甘露聚糖键(leanti la rosa et al.2019)，基因组中编码gh26的梭状芽孢杆菌(clostridium)簇xiva的成员同样也可以(desai et al.2016,sheridan et al.2016)。此外，gh26已在具体种类的双歧杆菌中进行了表征，例如青春双歧杆菌(bif.adolescentis)(kulcinskaja et al.2013)，证实了该物种在甘露聚糖上生长的能力。半乳甘露聚糖仅被在其基因组中编码有内切-β1-4-甘露糖苷酶gh26和α-半乳糖苷酶gh27的微生物消耗，例如卵形拟杆菌、b.xylanisolvens(reddy et al.2016)或roseburia intestinalis(desai et al.2016,leanti la rosa et al.2019)。
[0364]
木聚糖、阿拉伯聚糖和阿拉伯木聚糖可用于选择性地使具体种类的拟杆菌生长。木聚糖可以被卵形拟杆菌和单形拟杆菌(b.uniformis)代谢，而多形拟杆菌或粪拟杆菌不能在这种培养基中生长。阿拉伯聚糖促进多形拟杆菌和卵形拟杆菌的生长，而阿拉伯木聚糖则显示出对卵形拟杆菌生长的高度选择性(martens et al.2011,desai et al.2016)。已经表明，r.intestinalis、e.rectale和r.faecis的菌株可以消耗木聚糖或阿拉伯木聚糖作为唯一的碳源(desai et al.2016,sheridan et al.2016)。某些双歧杆菌具有发酵木聚糖或含阿拉伯呋喃糖基寡糖的能力。b.adolescentis在体外显示出了在木糖和阿拉伯木聚糖衍生的聚糖上的选择性生长(van laere et al.1999)。此外，另外的实验证实了b.longum subsp.longum也能够代谢阿拉伯木聚糖(margolles和de los reyes-gavil
á
n 2003)。实施例1(用氢氧化铵和碳酸氢铵作为示范性多糖(ps)裂解试剂)
[0365]
已知刺槐豆胶中的半乳甘露聚糖多糖含量很高。半乳甘露聚糖是一种多糖，其包含具有α1-6连接的半乳糖支链的β1-4连接的甘露糖主链并。半乳甘露聚糖(或使用所公开的方法可以得到的寡糖)可用于选择性地促进可解聚这些糖苷键之一或两者的细菌的生长。
[0366]
寡糖的产生。在第一个示例性方面，将刺槐豆胶(500mg)溶解在加盖的反应容器中的20ml的hplc级水中，并置于55℃和85rpm的振荡培养箱中10分钟。用碳酸氢铵(0.5m)将溶液的ph调节至5.2。将过氧化氢(5ml)和硫酸铁(iii)(50μl水中含2.75mg)添加到反应混合物中并充分混合。使加盖的反应容器中的反应在55℃和75rpm的振荡培养箱中进行2小时。使封闭的反应冷却至20℃。实施了四种裂解条件：氢氧化铵(1ml，28％v/v，至ph 10)、氢氧化钠(65μl，10.45m naoh，至ph 10)和两种浓度的碳酸氢铵(1.125g和5g，均至ph 7.5)。所有四种条件均于27℃和45℃两种温度在振荡培养箱中以70rpm反应1小时，松开盖子以释放氧气、氨气和二氧化碳气体。氢氧化铵和碳酸氢铵被去除，且从而通过蒸发中和溶液。通过添加hcl至ph 7以中和氢氧化钠。在净化(clean-up)和随后的质谱分析之前将样品储存在-20℃。
[0367]
寡糖的分离。裂解后的寡糖样品在水中重构并进行c18固相萃取。在装载和收集样
品之前，用三倍体积的乙腈和两倍体积的水作为直接的冲洗液(flow-through)洗涤固相柱。然后对经c18柱萃取的样品进行无孔石墨化碳(npgc)固相萃取。依次用两倍体积的水、两倍体积含0.01％(v/v)tfa水溶液的80％乙腈和另外两倍体积的水对npgc柱进行预洗涤。然后装载经c18柱提取的样品并用五倍体积的水洗涤，然后用含0.05％(v/v)tfa的40％乙腈洗脱。最后，通过蒸发离心将npgc后的样品完全干燥并储存在-20℃直至进行分析。
[0368]
仪器分析。在uhplc-qqq分析之前，将干燥的npgc后样品在纳米纯水中重构。使用与agilent 6495qqq ms联用的agilent 1290infinity ii uhplc进行分析分离。样品在粒径为1.9μm的50mm
×
1mm waters acquitytm beh-amide色谱柱上进行色谱分离。使用由溶剂a：(3％(v/v)乙腈/水 0.1％甲酸)和溶剂b：(95％乙腈/水)组成的二元梯度。使用流速为0.6ml/分钟的4.5分钟梯度进行色谱分离：70-67％b，第0至3分钟；67-25％b，第3至3.01分钟；25-25％b，第3.01至3.5分钟；25-70％b，第3.5至3.51分钟；70-70％b，第3.51至4.5分钟。使用电喷雾离子化作为离子源，且以正离子模式收集数据，并使用单离子监测(sim)。毛细管电压和碎裂器(fragmentor)电压分别为1800v和280v。设置四极杆来扫描与来自2至10个己糖的寡糖相对应的质量，停留时间为50ms。观察到所有离子都是它们的质子加合物。
[0369]
氢氧化铵和碳酸氢铵作为示例性ps裂解试剂。在三种裂解试剂中，氢氧化铵在45℃和27℃从刺槐豆胶中产生的总寡糖的量最高，其次是在45℃的两种碳酸氢铵浓度、在两种温度下的氢氧化钠，最后是在27℃的碳酸氢铵(图1)。出乎意料的是，氢氧化铵在不牺牲寡糖结构多样性的情况下产生了最高的寡糖总丰度(图2)，并且与氢氧化钠和碳酸氢铵相比，产生了两倍多的总寡糖。结果更是出乎意料，因为预期容易存在于氢氧化铵和氢氧化钠中的氢氧根离子的浓度将与cog反应中的ps裂解步骤中寡糖的产生相关；然而，氢氧化铵和氢氧化钠反应都达到了ph 10，这表明氢氧根离子的浓度相同。此外，考虑到在27℃时的ph仅为7.5，碳酸氢铵会产生大量的寡糖是出乎意料的，尽管它几乎与naoh作为裂解试剂的寡糖产量基本一致。根据本发明的具体方面，这些结果表明非氢氧化物介导的机制是通过碳酸氢铵介导裂解。此外，氢氧化铵作为ps裂解试剂的效率提高可能表明涉及了氢氧化物驱动和氨驱动机制的组合。
[0370]
在反应的特异性中也观察到了关于所产生的寡糖的尺寸分布的机制差异(图2)。从45℃的反应中观察到了长度为3个至10个单体的寡糖。观察到了三糖相对浓度的显著差异。两种碳酸氢铵介导的ps裂解反应产生的三糖相对丰度最高(15.0％和12.7％)，而氢氧化钠介导的ps裂解反应产生的三糖相对丰度最低(9.52％)，氢氧化铵介导的ps裂解居中(11.2％)。氢氧化钠介导的ps裂解反应和碳酸氢铵介导的ps裂解反应之间的三糖的差异产量提供了不同反应机制的额外证据，并且由氢氧化铵介导的三糖产生的中间量进一步支持了组合的ps裂解机制。其他显著差异包括氢氧化钠产生了最大相对丰度的四糖和五糖，而六糖仍然是在所有四种条件下最丰富的寡糖。此外，所有三种氮基试剂介导的裂解反应都产生了比氢氧化钠介导的更高量的十糖。
[0371]
不受机制束缚，申请人的数据与这样的机制是一致的：其中用例如氮基裂解剂(而不是用本领域中使用的强阿伦尼乌斯碱)对过氧化羟基自由基处理过的多糖的裂解是通过独特的β-消除机制进行的，所述β-消除机制涉及通过例如相对于糖苷键位于β的羟基部分的氨(或裂解剂的分解产物，例如氮基裂解剂的分解产物)的去质子化，因为相邻的酮(来自于过氧化步骤)将电子密度从氢拉走，从而使氢成为更好的离去基团。如所建议的，当例如
氨使碳水化合物去质子化时，电子形成促进糖苷键断裂的碳碳双键，从而使多糖解聚。实施例2(当使用碳酸氢铵或氢氧化铵作为多糖(ps)裂解试剂时，减少或消除了脱盐的需要)
[0372]
寡糖的脱盐是一种昂贵且耗时的过程，在本发明之前，这是使用现有的基于芬顿试剂的方法生产寡糖的主要限制。透析和色谱脱盐是从在中和用于产生寡糖的传统强阿伦尼乌斯碱(例如naoh、koh、ca(oh)2)时产生的盐(例如氯化钠、乙酸钠和氯化钾)中分离寡糖的两种常用方法。这两种方法都被证明是困难的，因为诸如氯化钠(58.44g/mol)的低分子量盐和诸如麦芽三糖(504.44g/mol)的寡糖在质量上足够接近而难以分离。这两种方法还需要在分离之前首先减少样品的体积，这进一步增加了成本和所需的处理时间。根据具体方面，目前公开的高产氮基过氧化物淬灭剂/ps裂解剂(例如，碳酸氢铵、氢氧化铵、氨等)的使用消除了通过透析或其他基于尺寸的方法进行脱盐的需要，因为这些试剂或其反应产物可以在反应完成时从溶液中蒸发。例如，根据反应机理，碳酸氢铵可以以co2、nh3和h2o的形式有效去除：而以氢氧化铵为例，根据反应机理，可以以nh3和h2o的形式去除：实施例3(铵基ps裂解试剂显示为消除过氧化氢和脱靶氧化的过氧化物淬灭试剂，并因此代表了示例性的、优选的过氧化物淬灭/ps裂解试剂)
[0373]
虽然过氧化氢是本文公开(以及在现有技术方法中)的寡糖生产中的初始氧化步骤的组分，但在随后的裂解反应步骤和任何随后的下游加工步骤中，由于过氧化氢和/或其自由基的任何残留存在，存在不需要的脱靶氧化的危险。如本领域所理解的，由于过氧化氢的高沸点(150.2℃)，其不能容易地通过标准蒸发工艺来去除。此外，它的存在会阻碍用于下游聚糖纯化和富集的色谱工作，因为许多固定相在相对高还原/氧化状态是不稳定的。去除它的策略可以包括透析、使用诸如辣根过氧化物酶等的酶，以及长时间暴露在开放的大气环境中。酶法具有快速淬灭过氧化氢的优点，但也需要在下游去除。透析和暴露于开放大气环境都会使过氧化氢(和/或其任何残留自由基)与产生的寡糖接触，这会产生副反应，包括c-6氧化以产生含糖醛酸的寡糖和其他不需要的物质。根据具体方面，当前公开的cog方法解决了这个实质性问题。
[0374]
为确定不同ps裂解试剂对过氧化氢浓度的影响，在不同温度下与不同裂解试剂孵育后，用试纸(quantofix peroxide 100
tm
)测量过氧化氢的浓度。首先将三种ps裂解试剂(氢氧化铵、碳酸氢铵和氢氧化钠)与用过氧化氢和fe(ii)处理过的刺槐豆胶一起孵育。在室温下使用氢氧化铵被证明可以快速消除过氧化氢的存在。然而，相比之下，碳酸氢铵和氢氧化钠对过氧化氢的浓度都没有影响(图3)。这证实了虽然现有的基于芬顿的方法使用强阿伦尼乌斯碱淬灭了芬顿反应，但没有淬灭或消除残留的过氧化氢本身，或没有淬灭或消除在引入强阿伦尼乌斯碱之前产生的任何残留自由基。
[0375]
根据本发明的特定方面，以下机制：
支持了申请人的观念，即氨在产生(或以其他方式引入反应)时，一些残留的过氧化氢或其自由基将被淬灭/消除。
[0376]
为了进一步测试提出的这一机制，在逐渐增高的温度下(直至65℃)将与三种裂解试剂的反应加热一小时，以驱使碳酸氢铵溶液产生更多的氨。事实上，反应ph随着温度的升高而增加，这表明存在氢氧根离子，并伴有氨气，并因此观察到了过氧化氢的同时淬灭(图4)。此外，该反应在40℃时迅速发生并且最终导致在65℃时过氧化氢水平低于可检测极限。值得注意的是，加热的氢氧化钠溶液中的过氧化氢浓度没有明显差异。该数据证实，过氧化氢在孵育时会迅速被淬灭/消除，例如，与目前公开的氮基裂解试剂一起孵育时，而不是与以前在本领域中使用过的传统的强阿伦尼乌斯碱(例如，na

oh-、k

oh-或ca
2
(oh-)2)。实施例4(氢氧化铵从废谷物部分中产生独特的寡糖谱)
[0377]
将两种废谷物部分研磨成细粉并进行实施例1中所述的过程，同时使用氢氧化铵作为过氧化物淬灭/ps裂解试剂。谷物样品代表了从生物乙醇生产过程中生产和回收的“完整”废部分和蛋白质耗尽的部分。从两个部分的解聚产物中获得的液相色谱-质谱(图5a和图5b)表明，两个部分都包括了丰富的3至10个单体单元范围的己糖低聚物；然而，更大的结构也很丰富，但在目前的条件下并没有被监测。与“完整”废谷物产物(图5a)相比，蛋白质耗尽的部分(图5b)包含更高浓度的总碳水化合物，并且产生约2倍的寡糖浓度。复杂混合物的非碳水化合物组分可以通过竞争反应的氧化电位和裂解电位来抑制反应的效果(stadtman and berlett 1991)。然而，该结果证明了所公开的cdpg方法(例如，涉及在之前的芬顿氧化之后使用非阿伦尼乌斯碱和弱阿伦尼乌斯碱作为过氧化物淬灭/ps裂解试剂)的广泛有效性。实施例5(在所公开的cog反应中，过氧化物淬灭的引发可以在多糖(ps)裂解的引发之前、之时或之后)
[0378]
上表1列出了示例性ps裂解剂和/或过氧化物淬灭剂。
[0379]
在优选的cog方法方面，如本文上文所公开和讨论的，所述cog方法通过使用过氧化氢淬灭剂(“过氧化物淬灭”剂)来减少或消除在ps裂解步骤启动后的脱靶副反应从而克服了本领域中的实质性问题。虽然现有方法是使用强阿伦尼乌斯碱(即na

oh-、k

oh-或ca
2
(oh-)2)作为ps裂解剂，据称“淬灭”最初的芬顿反应(即，通过使金属离子反应物絮凝)，这种强阿伦尼乌斯碱ps裂解剂不淬灭/消除残留的过氧化物或过氧化物自由基本身(如本文所公开的；例如，参见上述实施例3)，因此现有技术的方法容易发生不需要的副反应。
[0380]
在优选的cog方法中，优选地，ps裂解引发剂还用作过氧化物淬灭剂来淬灭(例如，充分减少或消除)残留的过氧化氢和/或其自由基本身，以最大限度减少或消除脱靶侧反应。在这些方法方面，过氧化物淬灭的引发(并且也淬灭芬顿反应)与ps裂解的引发是同时的。虽然此类cog反应可简单地被视为两步反应方面(包括芬顿氧化方面，然后是ps裂解方面)，但应理解，过氧化物的淬灭(和/或芬顿反应的淬灭)可以是立即的或界定清楚的或可
以不是立即的或界定清楚的，并且还可以发生在ps裂解方面的至少部分中；也就是说，尽管使用了如本文所公开的过氧化物淬灭剂，但此类cog反应的芬顿反应方面、过氧化物淬灭方面和/或ps裂解方面之间可以存在至少某种程度的重叠。重叠程度可以根据所用过氧化物淬灭剂的性质和量而变化。
[0381]
在具体的cog方法中，ps裂解剂(裂解引发剂)可以是过氧化物淬灭剂，也可以不是过氧化物淬灭剂，并且在任一种情况下都可以与另外的相容的过氧化物淬灭剂组合使用，所述另外的相容的过氧化物淬灭剂本身可以是裂解剂或者也可以不是裂解剂。在这些方面，可以在引入ps裂解剂之前、之时或之后将所述另外的相容的过氧化物淬灭剂引入反应中。
[0382]
在具体方面，反应中的另外的相容的过氧化物淬灭剂的引入与ps裂解剂的引入是同时的。虽然此类cog反应方面可以简单地被视为两步反应方面(包括芬顿氧化方面，然后是ps裂解方面)，但应理解，过氧化物的淬灭(和/或芬顿反应的淬灭)可以是立即的或界定清楚的或可以不是立即的或界定清楚的，并且还可以发生在至少部分的ps裂解方面中；也就是说，尽管使用了如本文所公开的过氧化物淬灭剂，但此类cog反应的芬顿反应方面、过氧化物淬灭方面和/或ps裂解方面之间可以存在至少某种程度的重叠。重叠程度可以根据所用过氧化物淬灭剂的性质和量而变化。
[0383]
在具体方面，在引入ps裂解剂之前，将另外的相容的过氧化物淬灭剂引入到反应中。虽然此类cog反应方面可以简单地被视为两步反应方面(包括芬顿氧化方面，然后是ps裂解方面)，或三步反应方面(包括芬顿氧化方面，然后是过氧化物淬灭方面，然后是ps裂解方面)，但应理解，过氧化物的淬灭(和/或芬顿反应的淬灭)可以是立即的或界定清楚的或可以不是立即的或界定清楚的，并且还可以发生在至少部分的ps裂解方面中；也就是说，尽管使用了如本文所公开的过氧化物淬灭剂，但此类cog反应的芬顿反应方面、过氧化物淬灭方面和/或ps裂解方面之间可以存在至少某种程度的重叠。重叠程度可以根据所用过氧化物淬灭剂的性质和量而变化。
[0384]
在具体方面，在引入ps裂解剂之后将另外的相容的过氧化物淬灭剂引入到反应中。虽然此类cog反应方面可以简单地被视为两步反应方面(包括芬顿氧化方面，然后是ps裂解方面)，或三步反应方面(包括芬顿氧化方面，然后是ps裂解方面，然后是过氧化物淬灭方面)，但应理解，过氧化物的淬灭(和/或芬顿反应的淬灭)可以是立即的或界定清楚的或可以不是立即的或界定清楚的，并且还可以发生在至少部分的ps裂解方面中；也就是说，尽管使用了如本文所公开的过氧化物淬灭剂，但此类cog反应的芬顿反应方面、过氧化物淬灭方面和/或ps裂解方面之间可以存在至少某种程度的重叠。重叠程度可以根据所用过氧化物淬灭剂的性质和量而变化。
[0385]
根据本发明的优选方面，在所有上述cog方法方面，使用过氧化物淬灭剂来淬灭(例如，充分减少或消除)残留的过氧化氢和/或其自由基本身，最大限度减少或消除了脱靶副反应。
[0386]
根据本发明的优选方面，在所有上述cog方法方面，使用具体的弱阿伦尼乌斯碱和/或非阿伦尼乌斯碱(例如，氮基过氧化物淬灭/ps裂解试剂等；例如，参见表1)不仅提供了改进的高产的寡糖产生(相对于在本领域中使用的强阿伦尼乌斯碱)，而且还消除了对昂贵且耗时的反应后浓缩和脱盐步骤的需要。
实施例6(与类似方法相比，cog提供了增强的生物活性)
[0387]
在某些方面，由cog产生的寡糖可用于促进发酵(生物技术、乙醇生产、食品加工)中细菌和/或人和动物的微生物群(肠道、皮肤、呼吸道、阴道、眼部、口腔)的生长。评估微生物消耗具体寡糖和寡糖组的能力的常用方法需要通过整个生长期的光密度对其进行监测。然而，如果寡糖被内源性或外源性物质污染，这些结果就可能是错误的。诸如盐、酸、金属和氧化剂/还原剂等化合物可以抑制体外系统中的细菌生长。
[0388]
寡糖的产生：在这个示例性方面，将支链淀粉(550mg)溶解在加盖的反应容器中的20ml hplc级水中，并置于55℃和85rpm的振荡培养箱中20分钟。将溶液的ph调节至5.2。将过氧化氢(5ml)和硫酸铁(ii)(50μl水中含2.75mg)添加到反应混合物中并充分混合。使加盖的反应容器中的反应在55℃和65rpm的振荡培养箱中进行两小时。封闭的反应在-20℃冰箱中冷却至12℃。使用氢氧化铵(1ml，28％v/v，至ph 10.2)或naoh(600μl，10.45m)来调节ph，样品在45℃和20rpm的振荡培养箱中反应1小时，松开盖子以允许氧气、氨气和二氧化碳气体的释放。然后将样品冷冻并冻干，然后储存在-80℃。在50ml bio-scale
tm
mini p-6脱盐柱上使用0.03m碳酸氢铵缓冲液以10ml/分钟的流速进行尺寸排阻色谱。为了脱盐的目的，在空隙体积后收集50ml的洗脱窗口，并将样品冻干至完全干燥。分析所得材料中铁、过氧化氢和硫酸盐的浓度，ph，氧化/还原电位(orp)和电导率(ec)。
[0389]
碳水化合物分析：将裂解后的寡糖样品在水中重构并进行糖醇还原。样品在65℃用2m硼氢化钠还原1小时，然后立即进行c18固相萃取。在装载和收集样品之前，用三倍体积的乙腈和两倍体积的水作为直接的冲洗液(flow-through)洗涤固相柱。然后对经c18柱萃取的样品进行无孔石墨化碳(npgc)固相萃取。依次用两倍体积的水、两倍体积含0.01％(v/v)tfa水溶液的80％乙腈和另外两倍体积的水对npgc柱进行预洗涤。然后装载经c18柱提取的样品并用五倍体积的水洗涤，然后用含0.05％(v/v)tfa的40％乙腈洗脱。最后，通过蒸发离心将npgc后的样品完全干燥并储存在-20℃直至进行分析。
[0390]
在与agilent 6530accurate-mass q-tof ms联用的agilent 1290 infinity ii hplc上进行寡糖分析。在具有由溶剂a：3％乙腈/水 0.1％甲酸，和溶剂b：10％水/乙腈 0.1％甲酸组成的二元梯度的thermo scientific hypercarb pgc柱上进行色谱分离。流速为0.15ml/分钟，梯度运行60分钟：2-15％b，第0至20分钟；15-60％b，第20至45分钟；60-99％b，第45至45.10分钟；99-99％b，第45.10至51分钟；99-2％b，第51至51.10分钟；2-2％b，第51.10至60分钟。质谱仪以正离子模式运行，参考质量为922.0098m/z。气体温度和流速分别设置为150℃和11l/分钟。喷嘴、碎裂器、撇渣器(skimmer)的电压分别设置为1500伏、75伏和60伏。使用串联质谱，在碰撞能量为1.45
×
(m/z)-3.5的情况下进行碎裂。使用agilent masshunter workstation定量分析10.1软件处理数据。对色谱图中对应于寡糖质量的主要峰进行整合。将具有2至10的dp的寡糖的响应相加以代表总寡糖峰面积。
[0391]
此外，根据amicucci等人(amicucci、galermo,et al.2019)的描述，分析了样品的单糖组成。
[0392]
细菌生长方法：在37℃的厌氧条件下，通过在补充有3％(m/v)寡糖组分的基本培养基中培养短双歧杆菌(模式生物)来评估生成的寡糖组分支持细菌生长的能力。用于这些实验的基本培养基是基础mrs(ruiz-moyano et al.2013)。在接种前，将基础mrs与乳糖和
hypercarb pgc柱上进行色谱分离。流速为0.15ml/分钟，梯度运行60分钟：2-15％b，第0至20分钟；15-60％b，第20至45分钟；60-99％b，第45至45.10分钟；99-99％b，第45.10至51分钟；99-2％b，第51至51.10分钟；2-2％b，第51.10至60分钟。质谱仪以正离子模式运行，参考质量为922.0098m/z。气体温度和流速分别设置为150℃和11l/分钟。喷嘴、碎裂器、撇渣器的电压分别设置为1500伏、75伏和60伏。使用串联质谱，在碰撞能量为1.45
×
(m/z)-3.5的情况下进行碎裂。使用agilent masshunter workstation定量分析10.1软件处理数据。对色谱图中对应于寡糖质量的主要峰进行整合。将具有2至10的dp的寡糖的响应相加以代表总寡糖峰面积。
[0397]
寡糖分析显示，在总水平和具体结构水平上的寡糖产量均不同。本实验中使用的所有碱都产生了寡糖产物。氢氧化铵产生的寡糖浓度最高，几乎是氢氧化钠产生的寡糖浓度的两倍(图9)。此外，含氮碱(dipea)产生的寡糖浓度第二高，而吡啶产生的寡糖与阿伦尼乌斯碱相当。这为被认为是良好的裂解试剂的“氮基裂解试剂”的广泛分类提供了进一步的证据。实施例8(铁(ii)与刺槐豆寡糖的产生)
[0398]
在一些方面，可以改变金属的氧化态以获得相似或不同的结果。在该描述的方面，铁(ii)被用于从刺槐豆胶多糖中产生寡糖。刺槐豆胶包含一种半乳甘露聚糖聚合物，该聚合物含有β1,4甘露糖主链，并具有α1,6半乳糖的末端支链。
[0399]
寡糖的产生：将刺槐豆胶(550mg)溶解在加盖的反应容器中的20ml的hplc级水中，并置于55℃和85rpm的振荡培养箱中20分钟。将溶液的ph调节至5.2。将过氧化氢(5ml)和硫酸铁(ii)(50μl水中含2.75mg)添加到反应混合物中并充分混合。使加盖的反应容器中的反应在55℃和65rpm的振荡培养箱中进行两小时。封闭的反应在-20℃冰箱中冷却至12℃。使用氢氧化铵(1ml 28％v/v，至ph 10.2)来调节ph，样品在45℃和20rpm的振荡培养箱中反应1小时，松开盖子以允许氧气、氨和二氧化碳气体的释放。然后将样品冷冻并冻干，然后储存在-80℃。用允许自由流动溶液所需的最小量的水使冷冻干燥的寡糖混合物再水合。然后将该溶液装载到每克(干重)粗材料含15ml混合床离子交换树脂的柱子上，并将流出物收集在塑料冷冻袋中。一旦将材料装载到柱子上，然后就用3个床体积的水冲洗柱子。最后，将流出物密封并冷冻在袋中，然后小心地粉碎并进行冻干。
[0400]
碳水化合物分析：将裂解后的寡糖样品在水中重构并进行糖醇还原。样品在65℃用2m硼氢化钠还原1小时，然后立即进行c18固相萃取。在装载和收集样品之前，用三倍体积的乙腈和两倍体积的水作为直接的冲洗液洗涤固相柱。然后对经c18柱萃取的样品进行无孔石墨化碳(npgc)固相萃取。依次用两倍体积的水、两倍体积的含0.01％(v/v)tfa水溶液的80％乙腈和另外两倍体积的水对npgc柱进行预洗涤。然后装载经c18柱提取的样品并用五倍体积的水洗涤，然后用含0.05％(v/v)tfa的40％乙腈洗脱。最后，通过蒸发离心将npgc后的样品完全干燥并储存在-20℃直至进行分析。
[0401]
(amicucci，galermo et al.2019)。在与agilent 6530accurate-mass q-tof ms联用的agilent 1290infinity ii hplc上进行寡糖分析。在具有由溶剂a：3％乙腈/水 0.1％甲酸，和溶剂b：10％水/乙腈 0.1％甲酸组成的二元梯度的thermo scientific hypercarb pgc柱上进行色谱分离。流速为0.15ml/分钟，梯度运行60分钟：2-15％b，第0至
20分钟；15-60％b，第20至45分钟；60-99％b，第45至45.10分钟；99-99％b，第45.10至51分钟；99-2％b，第51至51.10分钟；2-2％b，第51.10至60分钟。质谱仪以正离子模式运行，参考质量为922.0098m/z。气体温度和流速分别设置为150℃和11l/分钟。喷嘴、碎裂器、撇渣器的电压分别设置为1500伏、75伏和60伏。使用串联质谱，在碰撞能量为1.45
×
(m/z)-3.5的情况下进行碎裂。使用agilent masshunter workstation定量分析10.1软件处理数据。对色谱图中对应于寡糖质量的主要峰进行整合。将具有2至10的dp的寡糖的响应相加以代表总寡糖峰面积。
[0402]
结果：从刺槐豆胶的fe(ii)氧化和裂解产生的寡糖与其母体刺槐豆多糖结构相似，但聚合度要短得多。单糖分析显示了高纯度(》90％)和与母体聚合物相似的单体组成，甘露糖：半乳糖分别为3.17:1vs.4.52:1(图10)。寡糖分析揭示了长度为3至8个己糖的寡糖，其包含了大量的异构体(图11)。已知刺槐豆胶包含半乳甘露聚糖多糖，该半乳甘露聚糖多糖包含β1,4甘露糖主链、从该主链分支的单个α1,6连接的半乳糖。实施例9(源自玉米纤维的阿拉伯木聚糖寡糖。)
[0403]
玉米纤维是来自玉米生产乙醇的剩余发酵的一种高度丰富的废物流。这种材料包括若干种丰富的多糖，包括β-葡聚糖、阿拉伯木聚糖、纤维素以及残留的直链淀粉和支链淀粉。阿拉伯木聚糖组分为生产阿拉伯木聚糖寡糖提供了机会，阿拉伯木聚糖寡糖已被证明可调节肠道微生物组(neyrinck et al.2012)。
[0404]
通过氯仿萃取对玉米纤维进行纯化，其中将5g材料悬浮在100ml的氯仿中并使它们混合约2小时。然后将所得混合物用50ml的0℃的水粉碎，产生粘性材料。将混合物以6500rpm离心30分钟，弃去液体层。然后将底层重新悬浮在10ml水中并用无水乙醇在0℃粉碎。在0℃用无水乙醇进行另外两次后续洗涤以产生白色多糖沉淀。通过冻干对材料进行干燥，产生4.8g。
[0405]
在以下条件下对材料进行cog反应。将550mg材料溶解在加盖的反应容器中的20ml的hplc级水中，并置于55℃和85rpm的振荡培养箱中20分钟。将溶液的ph调节至5.2。将过氧化氢(5ml)和硫酸铜(ii)(50μl水中含2.75mg)或硫酸铁(ii)(50μl水中含2.75mg)添加到反应混合物中并充分混合。使加盖的反应容器中的反应在55℃和65rpm的振荡培养箱中进行两小时。使封闭的反应在-20℃冰箱中冷却至12℃。使用氢氧化铵(1ml 28％v/v，至ph 10.2)将ph调节至8、9或10，样品在45℃和20rpm的振荡培养箱中反应45分钟、60分钟或90分钟，松开盖子以允许氧气、氨气和二氧化碳气体的释放。然后将样品冷冻并冻干。
[0406]
用允许自由流动溶液所需的最小量的水使冷冻干燥的寡糖混合物再水合。然后将该溶液装载到每克(干重)粗材料含15ml混合床离子交换树脂的柱子上，并将流出物收集在塑料冷冻袋中。一旦将材料装载到柱子上，然后用3个床体积的水冲洗柱子。最后，将流出物密封并冷冻在袋中，然后小心地粉碎并进行冻干。
[0407]
碳水化合物分析：将裂解后的寡糖样品在水中重构并进行糖醇还原。样品在65℃用2m硼氢化钠还原1小时，然后立即进行c18固相萃取。在装载和收集样品之前，用三倍体积的乙腈和两倍体积的水作为直接的冲洗液洗涤固相柱。然后对经c18柱萃取的样品进行无孔石墨化碳(npgc)固相萃取。依次用两倍体积的水、两倍体积的含0.01％(v/v)tfa水溶液的80％乙腈和另外两倍体积的水对npgc柱进行预洗涤。然后装载经c18柱提取的样品并用
五倍体积的水洗涤，然后用含0.05％(v/v)tfa的40％乙腈洗脱。最后，通过蒸发离心将npgc后的样品完全干燥并储存在-20℃直至进行分析。
[0408]
(amicucci，galermo et al.2019)。在与agilent 6530accurate-mass q-tof ms联用的agilent 1290infinity ii hplc上进行寡糖分析。在具有由溶剂a：3％乙腈/水 0.1％甲酸，和溶剂b：10％水/乙腈 0.1％甲酸组成的二元梯度的thermo scientific hypercarb pgc柱上进行色谱分离。流速为0.15ml/分钟，梯度运行60分钟：2-15％b，第0至20分钟；15-60％b，第20至45分钟；60-99％b，第45至45.10分钟；99-99％b，第45.10至51分钟；99-2％b，第51至51.10分钟；2-2％b，第51.10至60分钟。质谱仪以正离子模式运行，参考质量为922.0098m/z。气体温度和流速分别设置为150℃和11l/分钟。喷嘴、碎裂器、撇渣器的电压分别设置为1500伏、75伏和60伏。使用串联质谱，在碰撞能量为1.45
×
(m/z)-3.5的情况下进行碎裂。使用agilent masshunter workstation定量分析10.1软件处理数据。对色谱图中对应于寡糖质量的主要峰进行整合。将具有2至10的dp的寡糖的响应相加以代表总寡糖峰面积。
[0409]
结果：从玉米纤维的cu(ii)氧化和于ph 10裂解60分钟产生的寡糖被证明在产生寡糖上是最成功的(图12)。所述寡糖的dp范围为3至4，并具有代表阿拉伯木聚糖的单糖和键谱。所述寡糖具有1.36：1的木糖：阿拉伯糖比例并且具有包括末端木糖、末端阿拉伯糖、末端半乳糖、4-木糖、3,4-木糖和4-葡萄糖的键。作为参考，图15中提供了带注释的玉米纤维的连接分析色谱图。图12显示了四种独特的玉米纤维寡糖谱。条件1产生的寡糖最多，这是在用cu(ii)的芬顿氧化后加入nh4oh达到ph 10，将溶液在45℃加热1小时的结果。条件2产生的寡糖约比条件1少5倍，这是在用cu(ii)的芬顿氧化后加入nh4oh达到ph 9，将溶液在45℃加热1.5小时的结果。条件3产生的寡糖比条件1略少，这是在用cu(ii)的芬顿氧化后加入nh4oh达到ph 8，将溶液在45℃加热0.75小时的结果。这些结果表明，ph、时间和温度是优化寡糖产量的重要因素。此外，条件4仅产生很少的寡糖，这是在用fe(ii)的芬顿氧化后加入nh4oh达到ph 10，将溶液在45℃加热1小时的结果。该结果表明，当氧化步骤中使用铜而不是铁时，一些多糖源更易于解聚。实施例10(物质组成)
[0410]
对许多富含多糖的材料被cog解离的能力进行了评估。由于先前缺乏机制，每种材料都产生了许多意想不到的寡糖产物，并在库(pool)水平(多种寡糖)和单个寡糖水平上进行了表征。在可能的情况下，通过它们的单糖和糖苷键谱、2d-nmr(表5)和液相色谱/四极杆飞行时间质谱(lc/q-tof ms)来描述库。此外，通过它们的质量、保留时间和碎裂模式(fragmentation pattern)来鉴定和表征单个寡糖。
[0411]
寡糖的产生：将阿拉伯半乳聚糖ii、地衣多糖、1,4b-甘露聚糖、木聚糖、支链淀粉、阿拉伯木聚糖、β-葡聚糖、半乳聚糖、半乳甘露聚糖、葡甘露聚糖、木葡聚糖和刺槐豆胶(550mg)溶解在加盖的反应容器中的20ml hplc级水中，并置于55℃和85rpm的振荡培养箱中20分钟。将溶液的ph调节至5.2。将过氧化氢(5ml)和硫酸铁(ii)(50μl水中含2.75mg)添加到反应混合物中并充分混合。使加盖的反应容器中的反应在55℃和65rpm的振荡培养箱中进行两小时。使封闭的反应在-20℃冰箱中冷却至12℃。使用氢氧化铵(1ml，28％v/v，至ph 10.2)来调节ph，在45℃和20rpm的振荡培养箱中反应45分钟、60分钟或90分钟，松开盖
子以允许氧气、氨气和二氧化碳气体的释放。然后将样品冷冻和冻干，然后储存在-80℃。用允许自由流动溶液所需的最小量的水使冷冻干燥的寡糖混合物再水合。然后将该溶液装载到每克(干重)粗材料含15ml混合床离子交换树脂的柱子上，并将流出物收集在塑料冷冻袋中。一旦将材料装载到柱子上，然后就用3个床体积的水冲洗柱子。最后，将流出物密封并冷冻在袋中，然后小心地粉碎并进行冻干。
[0412]
将凝胶多糖和玉米纤维(550mg)溶解在加盖的反应容器中的20ml hplc级水中，并置于55℃和85rpm的振荡培养箱中20分钟。将溶液的ph调节至5.2。将过氧化氢(5ml)和硫酸铜(ii)(50μl水中含2.75mg)添加到反应混合物中并充分混合。使加盖的反应容器中的反应在55℃和65rpm的振荡培养箱中进行两小时。使封闭的反应在-20℃冰箱中冷却至12℃。使用氢氧化铵(1ml 28％v/v，至ph 10.2)来调节ph，样品在45℃和20rpm的振荡培养箱中反应1小时，松开盖以允许氧气、氨和二氧化碳气体的释放。然后将样品冷冻和冻干，然后储存在-80℃。用允许自由流动溶液所需的最小量的水使冷冻干燥的寡糖混合物再水合。然后将该溶液装载到每克(干重)粗材料含15ml混合床离子交换树脂的柱子上，并将流出物收集在塑料冷冻袋中。一旦将材料装载到柱子上，然后就用3个床体积的水冲洗柱子。最后，将流出物密封并冷冻在袋中，然后小心地粉碎并进行冻干。
[0413]
以amicucci等人(amicucci,m.j.,galermo,a.g.,et al.(2019).international journal of mass spectrometry 438:22-28.)的方式进行单糖分析，但这适用于在agilent 6530q-tof质谱仪上运行。以galermo,a.g.,nandita,e.,et al.(2018).analytical chemistry 90(21):13073-13080的方式以及在galermo,a.g.,nandita,e.,et al.(2019).analytical chemistry 91(20):13022-13031中提供的扩展保留时间库进行糖苷键分析，这适用于在agilent 6530q-tof质谱仪上运行。以amicucci,m.j.,nandita,e.,et al.(2020).nature communications 11(1):1-12的方式进行寡糖分析。使用agilent mass hunter定性分析b.10的“按分子特征查找”功能生成寡糖峰体积。对于nmr分析，将寡糖以50mg/ml的浓度溶解在d2o中，并在600mhz bruker nmr光谱仪上分析其hsqc光谱。
[0414]
单糖组成：分析由cog反应产生的寡糖库的单糖组成，如表3所示。在经历cog反应的14个样品中测量了七种单糖。表3.要求保护的物质库组合物的单糖组成。单位代表质量的相对丰度。符号
“‑‑”
代表单糖的存在量小于聚合物总重量的2％。 葡萄糖半乳糖甘露糖阿拉伯糖木糖鼠李糖gala其他阿拉伯半乳聚糖ii
‑‑
87.28
‑‑
7.23
‑‑‑‑‑‑
1.27地衣多糖80.218.648.64
‑‑‑‑‑‑‑‑
1.111,4b-甘露聚糖4.487.6183.82.99
‑‑‑‑‑‑
1.11木聚糖5.362.044.9
‑‑
85.48
‑‑‑‑
0.78支链淀粉98.19
‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑
0.54阿拉伯木聚糖
‑‑
2.08
‑‑
36.9960.28
‑‑‑‑
0.09β-葡聚糖97.04
‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑
1.61半乳聚糖
‑‑
80.06
‑‑
9.28
‑‑
4.593.042.44半乳甘露聚糖
‑‑
18.9178.14
‑‑‑‑‑‑‑‑
0.3
葡甘露聚糖36.73
‑‑
60.45
‑‑‑‑‑‑‑‑
0.19木葡聚糖48.7514.14
‑‑‑‑
36.38
‑‑‑‑
0.48刺槐豆胶
‑‑
22.9872.91
‑‑‑‑‑‑‑‑
0.33凝胶多糖99.04
‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑
0.28玉米纤维3.076.78
‑‑
35.7648.68
‑‑‑‑
4.65
[0415]
糖苷键分析：分析由cog反应产生的寡糖库的单糖组成，如表4所示。在经历cog反应的14个样品中鉴定了16个糖苷键位置。表4.要求保护的物质库组合物的糖苷键组成。单位代表峰面积的相对丰度。符号
“‑‑”
代表糖苷键的存在量小于聚合物总重量的2％。代表糖苷键的存在量小于聚合物总重量的2％。1h-13c hsqc nmr：对除半乳聚糖之外的所有样品进行。该分析提供了每个样品的指纹图谱(fingerprint)，以便比较这些样品和未来寡糖库之间的相似性。表5列出了光谱的异头(anomeric)区域的交叉峰坐标，光谱如图13所示。
表5.cog工艺生成的寡糖的1h-13c hsqc nmr的相关性。列出的对对应于异头区域中的那些主要峰。
1h-13c hsqc nmr：寡糖有两种形式。表6-表19显示了“按分子特征查找”数据，该数据显示了质量、保留时间、组成和寡糖相对丰度。此外，我们已经在图14中提供了带注释的寡糖色谱图。
[0416]
支链淀粉是指具有α-1,4主链以及具有在可以是类似分支的线性α-1,4支链中延伸的α-1,6支链的多糖。我们产生的寡糖与这种组成非常匹配。葡萄糖组成为98.19％(表3)，糖苷键组成为17.6％的末端葡萄糖、70.23％的4-连接的葡萄糖和3.83％的4,6-连接的葡萄糖(表4)。在库中观察到29种寡糖，其长度范围为从3个戊糖至7个戊糖。最丰富的结构表示为线性α-1,4葡萄糖聚合物(3hex，4.11分钟；4hex，9.29分钟；5hex，12.31分钟；6hex，14.058；7hex，15.254分钟；8hex，16.394；9hex，18.013分钟；10hex，21.99分钟；11hex，22.911；12hex，24.55分钟)。还发现了其他异构体，它们表示为至少具有一个α-1,6支链的结构。寡糖峰和丰度的完整列表见表6。寡糖库可以通过其1h-13c2d-nmr(hsqc)指纹图谱进一步区分(图13)。显著的峰包括如表5所示的峰。表6.从支链淀粉的cog解聚产生的寡糖。hex是指己糖，pent是指戊糖，hexa是指己糖醛酸，deoxyhex是指脱氧己糖。己糖仅包括葡萄糖。
[0417]
阿拉伯木聚糖是指具有β-1,4木糖主链，主链具有比例为1比2的α-1,3和α-1,2阿拉伯糖支链的多糖。我们产生的寡糖与这种组成非常匹配。木糖组成为60.28％，然后是36.99％的阿拉伯糖和2.08％的半乳糖(表3)。糖苷键组成为30.55％的末端阿拉伯糖、31.20％的4连接的木糖、22.22％的3,4连接的木糖和2.65％的末端木糖(表4)。在库中观察到22个寡糖，其长度范围为3个戊糖至7个戊糖。最丰富的结构表示为3pent，8.612分钟和14.346分钟；4pent，20.455分钟；5pent，20.812分钟和25.947分钟；6pent，24.969分钟；7pent，27.697分钟；寡糖峰和丰度的完整列表见表7。寡糖库可以通过其1h-13c 2d-nmr(hsqc)指纹图谱进一步区分(图13)。显著的峰包括如表5所示的峰。表7.从阿拉伯木聚糖的cog解聚产生的寡糖。hex是指己糖，pent是指戊糖，hexa是指己糖醛酸，deoxyhex是指脱氧己糖。戊糖是指阿拉伯糖和木糖。
[0418]
木葡聚糖是指具有α-1,6木糖支链的β-1,4葡萄糖主链的多糖。通过添加β-2,1半乳糖，可以以1比2的比例进一步延伸支链。我们产生的寡糖与这种组成非常匹配。葡萄糖组成为48.75％，然后是36.99％的木糖和14.14％的半乳糖(表3)。糖苷键组成为分别为28.23％、20.49％、5.63％和4.23％的4-葡萄糖、4,6葡萄糖、6葡萄糖、末端葡萄糖，以及20.62％的末端半乳糖(表4)。此外，进一步的连接被认为是10.78％的末端木聚糖和5.81％的2-木聚糖(表4)。在库中观察到42种寡糖，其长度范围为从2hex1pent到5hex3pent。最丰富的结构表示为2hex1pent，6.596分钟；2hex2pent，14.055分钟；3hex1pent，12.735；3hex2pent，23.712分钟和22.6分钟；4hex2pent 24.966分钟和29.18分钟；4hex3pent 26.017。寡糖峰和丰度的完整列表见表8。寡糖库可以通过其1h-13c 2d-nmr(hsqc)指纹图谱进一步区分(图13)。显著的峰包括如表5所示的峰。表8.从木葡聚糖的cog解聚产生的寡糖。hex是指己糖，pent是指戊糖，hexa是指己糖醛酸，deoxyhex是指脱氧己糖。己糖是指葡萄糖和半乳糖。戊糖是指木糖。
[0419]
β-葡聚糖是指具有4比1的β-1,4和β-1,3的葡萄糖主链的多糖。我们产生的寡糖与这种组成非常匹配。葡萄糖组成为97.04％(表3)。糖苷键组成为分别为48.91％、30.95％和17.06％的4-葡萄糖、3葡萄糖和末端葡萄糖(表4)。在库中观察到15个寡糖，其长度范围为
从3个己糖到6个己糖。最丰富的结构表示为3hex，14.158分钟；4hex 9.81分钟和11.27分钟；5hex 7.33分钟和11.24分钟；6hex，34.032分钟。寡糖峰和丰度的完整列表见表9。寡糖库可以通过其1h-13c 2d-nmr(hsqc)指纹图谱进一步区分(图13)。显著的峰包括如表5所示的峰。表9.从β-葡聚糖的cog解聚产生的寡糖。hex是指己糖，pent是指戊糖，hexa是指己糖醛酸，deoxyhex是指脱氧己糖。己糖仅指葡萄糖。糖醛酸，deoxyhex是指脱氧己糖。己糖仅指葡萄糖。
[0420]
半乳甘露聚糖是指具有β-1,4甘露糖主链，并具有22％的α-1,3半乳糖支链的多糖。我们产生的寡糖与这种组成非常匹配。甘露糖组成为78.14％，半乳糖为18.91％(表3)。糖苷键组成为分别为47.34％、20.76％和6.52％的4-甘露糖、末端甘露糖和4,6-甘露糖，17.85％的末端半乳糖和2.34％的4-葡萄糖(表4)。在库中观察到54个寡糖，其长度范围为从3个己糖到7个己糖。最丰富的结构表示为3hex，1.489分钟；4hex 4.109分钟和5.122分钟；4hex1hexa，10.301分钟；4hex1pent，9.614分钟；5hex，7.65分钟；6hex，11.077分钟；7hex，13.245分钟。寡糖峰和丰度的完整列表见表10。寡糖库可以通过其1h-13c 2d-nmr(hsqc)指纹图谱进一步区分(图13)。显著的峰包括如表5所示的峰。表10.从半乳甘露聚糖的cog解聚产生的寡糖。hex是指己糖，pent是指戊糖，hexa是指己糖醛酸，deoxyhex是指脱氧己糖。己糖是指半乳糖和甘露糖。
[0421]
阿拉伯半乳聚糖ii是指具有β-1,3半乳糖主链、包括α-1,6阿拉伯糖、β-1,6半乳糖-β-1,6半乳糖、β-1,6半乳糖-α-1,4阿拉伯糖和β-1,4半乳糖-β-1,6半乳糖的广泛支链的多糖。我们产生的寡糖与这种组成非常匹配。半乳糖组成为87.28％，并且阿拉伯糖为
7.23％(表3)。糖苷键组成为分别为50.75％、17.33％、14.18％和11.83％的末端半乳糖、1,3半乳糖、1,3,6半乳糖和6半乳糖，以及3.28％的末端阿拉伯糖(表4)。在库中观察到62个寡糖，其长度范围为从3个己糖到6个己糖。最丰富的结构表示为3hex，2.53分钟和5.552分钟；4hex，3.534分钟和8.843分钟；5hex，10.555分钟和11.7分钟；6hex，12.269。寡糖峰和丰度的完整列表见表11。寡糖库可以通过其1h-13c 2d-nmr(hsqc)指纹图谱进一步区分(图13)。显著的峰包括表5所示的峰。表11.从阿拉伯半乳聚糖ii的cog解聚产生的寡糖。hex是指己糖，pent是指戊糖，hexa是指己糖醛酸，deoxyhex是指脱氧己糖。戊糖是指阿拉伯糖，己糖是指半乳糖。
[0422]
凝胶多糖是指具有β-1,3葡萄糖主链的多糖。我们产生的寡糖与这种组成非常匹配。葡萄糖组成为99.04％(表3)。糖苷键组成为74.84％的1,3葡萄糖和8.82％的末端葡萄糖(表4)。在库中观察到10个寡糖，其长度范围从2个己糖到6个己糖。最丰富的结构表示为2hex，1.456分钟，3hex，1.456分钟；2hex1pent，12.672分钟；4hex，24.35分钟；5hex，30.063分钟；6hex，36.833。寡糖峰和丰度的完整列表见表12。寡糖库可以通过其1h-13c 2d-nmr
(hsqc)指纹图谱进一步区分(图13)。显著的峰包括如表5所示的峰。表12.从凝胶多糖的cog解聚产生的寡糖。hex是指己糖，pent是指戊糖，hexa是指己糖醛酸，deoxyhex是指脱氧己糖。己糖是指葡萄糖。
[0423]
地衣多糖是指具有33％的几率交替出现β-1,3葡萄糖的β-1,4葡萄糖主链的多糖。我们产生的寡糖与这种组成非常匹配。葡萄糖组成为80.21％，半乳糖和甘露糖均为8.64％(表3)。糖苷键组成为分别为67.02％、8.95％和6.82％的4-甘露糖、4,6-甘露糖和末端甘露糖，19.58％的末端半乳糖(表4)。在库中观察到42个寡糖，长度范围为3个己糖至8个己糖。最丰富的结构表示为3hex1pent，7.59分钟；4hex 17.74分钟；4hex1pent，6.96分钟；5hex 15.88分钟；5hex1hexa，12.747分钟，6hex，10.877分钟；7hex，13.039分钟。寡糖峰和丰度的完整列表见表13。寡糖库可以通过其1h-13c 2d-nmr(hsqc)指纹图谱进一步区分(图13)。显著的峰包括如表5所示的峰。表13.从地衣多糖的cog解聚产生的寡糖。hex是指己糖，pent是指戊糖，hexa是指己糖醛酸，deoxyhex是指脱氧己糖。己糖是指葡萄糖。
[0424]
甘露聚糖是指具有β-1,4甘露糖主链的多糖。我们产生的寡糖与这种组成非常匹配。甘露糖组成为83.8％，其次是半乳糖、葡萄糖和阿拉伯糖，分别为7.61％、4.48％和
2.99％(表3)。糖苷键组成为分别为58.31％和34.6％的4-甘露糖和末端甘露糖，以及3.63％的末端半乳糖(表4)。在库中观察到46种寡糖，其长度范围为1个己糖和1个戊糖至5个己糖和2个戊糖。最丰富的结构表示为2hex1pent，6.624分钟和9.655分钟；2hex1pent，13.77分钟；3hex1pent 12.727分钟；3hex2pent 16.706分钟和23.412分钟；4hex1pent，19.731分钟；4hex2pent，24.422分钟。寡糖峰和丰度的完整列表见表14。寡糖的完整列表可以通过其1h-13c 2d-nmr(hsqc)指纹图谱进一步区分(图13)。显著的峰包括如表5所示的峰。表14.从甘露聚糖的cog解聚产生的寡糖。hex是指己糖，pent是指戊糖，hexa是指己糖醛酸，deoxyhex是指脱氧己糖。己糖是指甘露糖。
[0425]
木聚糖是指具有β-1,4木糖主链和13％的α-1,2葡萄糖-4-ome的多糖。我们产生的寡糖与这种组成非常匹配。木糖组成为85.48％，其次是葡萄糖、甘露糖和半乳糖，分别为5.36％、4.9％和2.04％(表3)。糖苷键组成为54.71％的1,4木糖、15.28％的1,4甘露糖、13.61％的1,4葡萄糖、7.18％的末端木糖和5.19％的末端葡萄糖(表4)。在库中观察到15个寡糖，其长度范围为2个戊糖至6个己糖和1个戊糖。最丰富的结构表示为3pent，8.429分钟；4pent，16.521分钟；4pent1hexaome，21.15分钟；5pent，23.199；6pent，26.735；6hex1pent，18.422分钟。寡糖峰和丰度的完整列表见表15。寡糖库可以通过其1h-13c 2d-nmr(hsqc)指纹图谱进一步区分(图13)。显著的峰包括如表5所示的峰。表15.从木聚糖的cog解聚产生的寡糖。hex是指己糖，pent是指戊糖，hexa是指己糖醛酸，deoxyhex是指脱氧己糖。戊糖是指木糖。1hexaome是指甲基化葡萄糖醛酸。
[0426]
半乳聚糖是指具有β-1,4半乳聚糖主链的多糖。我们产生的寡糖与这种组成非常匹配。半乳聚糖组成为80.06％，其次是阿拉伯糖、鼠李糖和半乳糖醛酸，分别为9.28％、4.59％和3.04％(表3)。糖苷键组成为分别为61.68％和33.73％的4半乳糖和末端半乳糖，以及2.02％的末端阿拉伯糖(表4)。在库中观察到17个寡糖，其长度范围为3个己糖至6个己糖和一个己糖醛酸。最丰富的结构表示为3hex，2.69分钟；2hex1pent，3.038分钟；4hex 6.614分钟；3hex1pent，7.292；3hex1hexa，8.937分钟；5hex 9.652分钟；4hex1pent，10.112分钟，6hex，11.525分钟，4hex1hexa，11.857分钟；5hex1hexa，13.573分钟。寡糖峰和丰度的完整列表见表16。寡糖库可以通过其1h-13c2d-nmr(hsqc)指纹图谱进一步区分(图13)。显著的峰包括表5中所示的峰。表16.从半乳聚糖的cog解聚产生的寡糖。hex是指己糖，pent是指戊糖，hexa是指己糖醛酸，deoxyhex是指脱氧己糖。己糖是指半乳糖。
[0427]
葡甘露聚糖是指具有60％的β-1,4甘露糖和40％的β-1,4葡萄糖的主链的多糖。我们产生的寡糖与这种组成非常匹配。甘露糖组成为60.45％，其次是36.73％的葡萄糖(表3)。糖苷键键为分别为47.58％和20.23％的4甘露糖和末端甘露糖，以及31.52％的4-葡萄糖(表4)。在库中观察到87个寡糖，其长度范围为3个己糖至8个己糖。最丰富的结构表示为3hex，6.695分钟；3hex1pent，18.947分钟；4hex 16.802分钟和17.38分钟；4hex1pent，20.328分钟；5hex 18.549分钟和25.896分钟；6hex，22.854分钟；7hex，24.537分钟。寡糖峰和丰度的完整列表见表17。表17.从葡甘露聚糖的cog解聚产生的寡糖。hex是指己糖，pent是指戊糖，hexa是指己糖醛酸，deoxyhex是指脱氧己糖。己糖是指葡萄糖和甘露糖。
[0428]
刺槐豆胶是指具有73％的β-1,4甘露糖主链的多糖，其中23％用β-1,4半乳糖修饰。我们产生的寡糖与这种组成非常匹配。甘露糖组成为72.91％，其次是22.98％的半乳糖
(表3)。糖苷键组成为分别为62.02％、8.95％和6.82％的4甘露糖、4,6甘露糖和末端甘露糖，19.58％的末端半乳糖(表4)。在库中观察到39个寡糖，其长度范围为3个己糖至7个己糖。最丰富的结构表示为3hex，11.02分钟；4hex 4.188分钟；4hex1pent，9.688分钟；5hex 7.755分钟；6hex，11.153分钟；7hex，13.293分钟。寡糖峰和丰度的完整列表见表18。寡糖库可以通过其1h-13c 2d-nmr(hsqc)指纹图谱进一步区分(图13)。显著的峰包括如表5所示的峰。表18.从刺槐豆胶的cog解聚产生的寡糖。hex是指己糖，pent是指戊糖，hexa是指己糖醛酸，deoxyhex是指脱氧己糖。己糖是指半乳糖和甘露糖。
[0429]
玉米纤维是指从废蒸馏酒糟或其他玉米流中提取的一种多糖或多糖混合物。在某些方面，玉米纤维是指从蒸馏酒糟或其他玉米流中提取的碱溶性物质。在某些方面，玉米纤维是指从蒸馏酒糟或其他玉米流中提取的酸溶性物质。在某些方面，玉米纤维是指来自蒸馏酒糟或其他玉米流的不溶性物质。玉米纤维寡糖由3.07％的葡萄糖、6.78％的半乳糖、35.76％的阿拉伯糖和48.68％的木糖组成(表3)。糖苷键组成包括5.83％的4-葡萄糖、16.33％的4-木糖、6.21％的3,4-木糖、25.05％的末端木糖、27.79％的末端阿拉伯糖(表4)。在库中观察到29个寡糖，其长度范围为3个己糖至12个己糖。最丰富的结构表示为3hex，4.11min；4hex 9.29min；5hex 12.31min；6hex，14.058；7hex，15.254min；8hex，16.394；9hex，18.013min；10hex，21.99min；11hex，22.911；12hex，24.55min。寡糖峰和丰度的完整列表见表19。寡糖库可以通过其1h-13c 2d-nmr(hsqc)指纹图谱(图13)进一步区分，该指纹图谱显示了与阿拉伯木聚糖相似的横截面坐标。显著的峰包括如表5所示的峰。表19.从玉米纤维的cog解聚产生的寡糖。hex是指己糖，pent是指戊糖，hexa是指己糖醛酸，deoxyhex是指脱氧己糖。戊糖是指木糖和阿拉伯糖。己糖是指葡萄糖和半乳糖。
实施例11(cog产物和fitdog产物的比较)
[0430]
预计通过cog产生的寡糖与通过在pct申请号pct/us2018/038350(公布为wo/2018/236917)中称为fitdog的类似方法产生的寡糖是不同的。发现在库之间的寡糖具有一些同质性；但是，也遇到了实质性差异。将cog应用于半乳甘露聚糖、阿拉伯木聚糖、木葡聚糖、葡甘露聚糖、地衣多糖、甘露聚糖、半乳聚糖、β-葡聚糖、凝胶多糖和木聚糖。通过质谱分析结果并将对应于寡糖的峰与pct申请号pct/us2020/035748中描述的峰进行了比较。
[0431]
cog寡糖产生：将半乳甘露聚糖、阿拉伯木聚糖、木葡聚糖、葡甘露聚糖、地衣多糖、甘露聚糖、半乳聚糖、β-葡聚糖、凝胶多糖和木聚糖(550mg)溶解在加盖的反应容器中的20ml的hplc级水中，并置于55℃和85rpm的振荡培养箱中20分钟。将溶液的ph调节至5.2。将过氧化氢(5ml)和硫酸铁(ii)(50μl水中含2.75mg)添加到反应混合物中并充分混合，除了对于凝胶多糖使用硫酸铜(ii)。使加盖的反应容器中的反应在55℃和65rpm的振荡培养箱中进行两小时。使封闭的反应在-20℃冰箱中冷却至12℃。使用氢氧化铵(1ml，28％v/v，至ph 10.2)来调节ph，样品在45℃和20rpm的振荡培养箱中反应1小时，松开盖子以允许氧气、氨气和二氧化碳气体的释放。用允许自由流动溶液所需的最小量的水使冷冻干燥的寡糖混合物再水合。然后将该溶液装载到每克(干重)粗材料含15ml混合床离子交换树脂的柱子上，并将流出物收集在塑料冷冻袋中。一旦将材料装载到柱子上，然后用3个床体积的水冲洗柱子。最后，将流出物密封并冷冻在袋中，然后小心地粉碎并进行冻干。
[0432]
cog产物的数据分析：以amicucci,m.j.,nandita,e.,et al.(2020).nature communications 11(1):1-12的方式进行寡糖分析。使用agilent mass hunter定性分析b.10的“按分子特征查找”功能生成寡糖峰体积。
[0433]
fitdog寡糖产生：制备含有95％(v/v)乙酸钠缓冲液(用冰醋酸调节至ph 5)，5％(v/v)过氧化氢(30％w/w)和65nm的要研究的金属配合物的溶液。将该混合物涡旋并添加到半乳甘露聚糖、阿拉伯木聚糖、木葡聚糖、葡甘露聚糖、地衣多糖、甘露聚糖、半乳聚糖、β-葡
聚糖、凝胶多糖和木聚糖中以制成1mg/ml的最终溶液。将反应在100℃孵育60分钟。反应后，加入一半反应体积的冷2m naoh并涡旋，然后加入初始反应体积的0.6％的冰醋酸进行中和。
[0434]
使用无孔石墨化碳柱(gcc-spe)分离寡糖。使用在0.1％(v/v)三氟乙酸(tfa)中的80％乙腈和纳米级纯水洗涤柱子。将寡糖上样并用5个柱体积的纳米纯水洗涤。用含0.05％(v/v)tfa的40％乙腈洗脱寡糖。
[0435]
fitdog产物的数据分析：通过agilent mass hunter定性分析，从其母体质量中手动注释fitdog的寡糖。对于此实例，数据直接从pct申请号pct/us2020/035748中获得。
[0436]
在比较cog和fitdog样品时，注意到了几个趋势。全部数据列于表20中；标出了每个工艺的独特的寡糖，而相似的寡糖可以从表20与表7-表10和表12-表18的差异中推断出来。此外，表20中的化合物的质量可以参考表7-表10和表12-表18的组成特性。对于半乳甘露聚糖，cog产生了许多由3个至5个己糖和单个戊糖组成的化合物；而fitdog工艺包括两种不同的7hex异构体。对于阿拉伯木聚糖，cog产生了几种独特的小的dp3和dp4的戊糖寡糖，而fitdog则产生了几种其他的异构体，范围为dp3至dp11，具有cog不产生的许多高dp异构体。对于木葡聚糖，fitdog倾向于产生更多的大dp异构体，而cog则产生较短的寡糖。对于葡甘露聚糖，cog产生了许多含有己糖和单个戊糖单元的异构体，而fitdog没有产生这些异构体。对于半乳聚糖，cog产生了许多含有己糖和单个戊糖单元的独特异构体，而fitdog产生了一些在cog中未发现的更大的dp8和dp9寡糖。对于β-葡聚糖，fitdog产生了更多的dp6和dp7异构体。对于地衣多糖，cog产生了许多独特的包含己糖和单个戊糖单元的异构体，而fitdog产生了许多在cog中未发现的独特的dp3至dp10寡糖。对于甘露聚糖，cog产生了许多独特的包含己糖和单个戊糖单元的异构体，而fitdog产生了许多在cog中未发现的独特的dp4至dp9寡糖。对于木聚糖，fitdog工艺产生了更多独特的具有甲基化葡萄糖醛酸残基的寡糖。对于凝胶多糖，cog产生了具有独特异构体的独特寡糖，其中所述独特异构体包含己糖和单个戊糖单元以及一种独特的dp3寡糖。
[0437]
本文公开了合成寡糖，包括通过cog工艺产生的寡糖库，其包含表20中提到的cog工艺特有的至少1个、5个、10个、15个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个或所有的寡糖。本文还公开了通过cog工艺产生的合成寡糖，包括寡糖库，但其中表20中提到的fitdog工艺特有的寡糖不以可检测的水平存在于cog产生的寡糖中。表20：galman＝半乳甘露聚糖，arabxyl＝阿拉伯木聚糖，xylglc＝木葡聚糖，glcman＝葡甘露聚糖，lich＝地衣多糖，man＝甘露聚糖，gal＝半乳聚糖，β-glc＝β-葡聚糖，curd＝凝胶多糖，xyl＝木聚糖
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