多不饱和脂肪酸的单羟基或二羟基衍生物、其制备方法及其用途与流程

1.本发明涉及一种制备多不饱和脂肪酸的单羟基或二羟基衍生物的方法，并且涉及一种包含多不饱和脂肪酸的衍生物的复合组合物在缓解皮肤皱纹、缓解皮肤炎症或增强皮肤屏障中的用途。


背景技术：

2.由于炎症应答作为人体对病原体感染和各种有毒物质的主要防御而起到重要作用，但是同时，会充当引起各种慢性疾病的潜在因素，因此，炎症应答是一种需要通过体内的复杂调节机制来严格控制的生理现象。
3.前列腺素或白三烯是对应于omega-6多不饱和脂肪酸的花生四烯酸(c20：4n-6)的衍生物，是一种具有代表性的炎症应答起始信号物质，并且诱导炎症应答失衡，能够在体内引起各种慢性疾病。通常，认为当不产生炎症应答起始信号物质时炎症应答自然终止，并且已经开发各种甾体或非甾体抗炎治疗剂来抑制该物质的产生。然而，近年来，也通过复杂的调节过程进行炎症应答的终止机制，在该过程中，认为omega-3多不饱和脂肪酸如二十二碳六烯酸(dha，c22：6n-3)和二十碳五烯酸(epa，c20：5n-3)的羟基衍生物可以充当在炎症应答的终止机制中起作用的信号物质。那些充当炎症应答的终止机制的信号物质的羟基衍生物被称为特异性促消退介质(spms；消退素、保护素、噬消素)。已经确定，这些羟基衍生物表现出优于现有的抗炎治疗剂如皮质类固醇和非甾体抗炎药(nsaid)阿司匹林的效果。
4.另外，与主要诱导抑制炎症应答起始信号物质的产生的常规甾体或非甾体抗炎治疗剂不同，spm具有在炎症应答的所有阶段表现出功效的优点。因此，对于各种疾病，如各种慢性炎症性疾病(各种慢性炎症性疾病，如血管、心肌梗塞、中风、痴呆、骨关节炎、包括哮喘的肺病、肠胃炎、牙周炎、干眼症和脂肪肝)、感染性败血症、烧伤、伤口恢复、疼痛、癌症和糖尿病，正在积极地进行使用spm是否存在治疗效果的研究。
5.另一方面，作为体内的炎症应答终止信号物质的spm具有其中两个或三个羟基插入到omega-3多不饱和脂肪酸中的结构，并且已知，通过两种或更多种酶的连续作用产生非常微量的spm。因此，为了制备足够用于开发炎症应答终止信号物质的功效和治疗剂的spm，持续努力通过有机合成工艺制备(参见非专利文献1)，但是存在其过程非常复杂的限制。
6.因此，持续需要开发一种能够通过体外酶促反应使用omega-3多不饱和脂肪酸有效地制备单羟基或二羟基衍生物的技术。
7.另一方面，皮肤是保护人体免受外界有害环境影响的重要器官，并且是面积最大的免疫器官。构成皮肤的最外层的角质层具有对物理和化学损伤的抵抗力，并且防止微生物和有害化学物质侵入体内。此外，角质细胞、朗格汉斯细胞、成纤维细胞、肥大细胞、树突细胞和毛细血管内皮细胞形成复杂的免疫系统，从而当抗原从外部侵入时，通过免疫应答保护人体。
8.皮肤不断地受到外界的刺激(紫外线、化学物质、热、物理摩擦)，并且近来，新的刺
激物如细粉尘和蓝光也在增加。此外，已知内部因素如精神压力、睡眠障碍、营养失衡和药物治疗对皮肤造成压力。
9.根据近来的研究，由于皮肤刺激而产生炎症应答，并且研究结果公开，这种炎症应答引起皮肤老化。franceschi于2000年首次使用炎症性衰老(inflammaging)这一术语来解释炎症与衰老之间的相关性，并且研究结果不断揭示，慢性炎症是引起衰老或与衰老相关的疾病，如糖尿病、动脉硬化和痴呆症的原因。
10.在炎症开始的过程中分泌的促炎细胞因子促进基质金属蛋白酶(mmps)的表达。已知mmps的增加与皮肤老化直接相关，并且其通过分解占皮肤成分的70％的胶原蛋白而促进老化，如产生皱纹和弹性丧失。
11.通常，用于抑制皮肤老化的物质包括：酶，如用于去除活性氧的超氧化物歧化酶；抗氧化剂，如维生素c和生育酚；与肉毒杆菌相关的肽；和维生素a衍生物，如视黄醇。其中，维生素a衍生物具有优异的胶原蛋白合成能力并且在去除皱纹方面最有效，但是它们具有副作用，如对光或热不稳定、引起皮肤刺激和配方中含量不稳定。
12.特应性皮炎是由异常的遗传、环境和免疫反应以及皮肤屏障破坏引起的疾病，并且是引起干燥、瘙痒和红斑湿疹的慢性炎症性皮肤病。近来，由于环境变化、饮食习惯和环境污染，全球范围内的患病率正在增加，对解决方案的兴趣也在增加。然而，由于病因不明，因此根治困难，并且大多依赖对症治疗。
13.另一方面，认为二十二碳六烯酸(dha，c22：6n-3)和二十碳五烯酸(epa，c20：5n-3)的羟基化衍生物可以充当作用于炎症应答的终止机制的信号物质，并且那些充当炎症应答的终止机制的信号物质的物质被命名为spm(特异性促消退介质；消退素、保护素、噬消素)。
14.近来，尽管已经积极地进行对使用spm治疗各种慢性炎症性疾病(例如，血管、心肌梗塞、中风、痴呆症、骨关节炎、哮喘和其它肺病、肠胃炎、牙周炎、干眼症和脂肪肝等)、感染性败血症、烧伤、伤口恢复、疼痛、癌症和糖尿病的研究，但是对抗皮肤老化、皮肤屏障增强和特应性皮炎的效果的研究和实验仍不足。


技术实现要素：

15.技术问题
16.本发明的一个方面旨在提供一种能够由多不饱和脂肪酸制备单羟基或二羟基衍生物的酶，和能够使用所述酶在体内或体外制备多不饱和脂肪酸的单羟基或二羟基衍生物的方法。
17.本发明的另一方面旨在提供一种化妆品组合物或食品组合物，其通过皮肤皱纹预防或缓解、皮肤老化预防或缓解、皮肤炎症预防或缓解、皮肤再生和皮肤屏障增强来改善皮肤状况。
18.本发明的另一方面旨在提供一种药物组合物，用于预防或治疗选自皮肤创伤、皮肤疤痕、皮炎、特应性皮炎、瘙痒、湿疹性皮肤病、干性湿疹、脚癣、红斑、荨麻疹、牛皮癣、皮疹(weak rash)、痤疮和脱发中的一种或更多种皮肤病。
19.本发明的另一方面旨在提供一种改善皮肤状况的方法，其中，所述方法包括向对象给药有效量的包含多不饱和脂肪酸的羟基衍生物作为活性成分的复合组合物。
20.本发明的又一方面旨在提供一种预防或治疗皮肤病的方法，其中，所述方法包括
向对象给药包含多不饱和脂肪酸的羟基衍生物作为活性成分的复合组合物。
21.本发明的再一方面旨在提供一种包含多不饱和脂肪酸的羟基衍生物作为活性成分的复合组合物在用于预防或治疗皮肤病的药物的生产中的用途。
22.技术方案
23.本发明的一个方面提供一种用于制备多不饱和脂肪酸的单羟基或二羟基衍生物的酶，该酶的氨基酸序列与seq id no：1或seq id no：2具有至少90％的同源性。
24.本发明的另一方面提供一种在体外制备多不饱和脂肪酸的单羟基或二羟基衍生物的方法，其中，所述方法包括使所述用于制备单羟基或二羟基衍生物的酶与多不饱和脂肪酸反应。
25.本发明的另一方面提供一种在体内制备多不饱和脂肪酸的单羟基或二羟基衍生物的方法，其中，所述方法包括：在多不饱和脂肪酸的存在下培养转化体，在该转化体中转化有编码所述用于制备单羟基或二羟基衍生物的酶的基因；和从培养的培养物中分离多不饱和脂肪酸的单羟基或二羟基衍生物。
26.本发明的另一方面提供一种用于改善皮肤状况的化妆品组合物，其中，所述化妆品组合物包含17-羟基二十二碳六烯酸(17-hdha)、消退素d5(resolvin d5)和保护素dx(protectin dx)作为活性成分。
27.本发明的另一方面提供一种用于改善皮肤状况的食品组合物，其中，所述食品组合物包含17-羟基二十二碳六烯酸(17-hdha)、消退素d5和保护素dx作为活性成分。
28.本发明的另一方面提供一种用于预防或治疗皮肤病的药物组合物，其中，所述药物组合物包含17-羟基二十二碳六烯酸(17-hdha)、消退素d5和保护素dx作为活性成分。
29.本发明的另一方面提供一种用于改善皮肤状况的方法，其中，所述方法包括：对需要改善皮肤状况的对象给药有效量的包含17-羟基二十二碳六烯酸(17-hdha)、消退素d5和保护素dx作为活性成分的复合组合物。
30.本发明的又一方面提供一种用于预防或治疗皮肤病的方法，其中，所述方法包括：对需要治疗皮肤病的对象给药包含17-羟基二十二碳六烯酸(17-hdha)、消退素d5和保护素dx作为活性成分的复合组合物。
31.本发明的再一方面提供一种包含17-羟基二十二碳六烯酸(17-hdha)、消退素d5和保护素dx作为活性成分的复合组合物在预防或治疗皮肤病中的用途。
32.有益效果
33.根据本发明，所述酶可以通过使用多不饱和脂肪酸作为底物，在单一反应中制备单羟基或二羟基衍生物，并且可以非常有效地用于多不饱和脂肪酸的单羟基或二羟基衍生物的体外制备。
34.本发明的包含二十二碳六烯酸羟基衍生物的spms复合组合物增加胶原蛋白合成，修复受损的皮肤屏障，并且减少经皮水分流失，从而抑制皮肤老化或缓解皮肤皱纹。
35.此外，本发明的spms复合组合物具有显著改善的抑制tnf-α、il-6表达的效果、增加聚丝蛋白和兜甲蛋白的表达的效果和抗氧化效果，从而增强皮肤屏障，并且有效地预防或治疗包括特应性皮炎的各种皮肤病。
36.然而，本发明的效果不限于上面提到的那些，并且本领域技术人员将从下面描述清楚地理解本文中未提及的其它效果。
附图说明
37.图1示出了通过sds-page确认具有由seq id no：1表示的氨基酸序列的蛋白质(a)和具有由seq id no：2表示的氨基酸序列的蛋白质(b)的过表达的结果；
38.图2示出了对通过使具有由seq id no：1表示的氨基酸序列的蛋白质与二十二碳六烯酸(dha)反应得到的反应产物进行正相hplc分析的结果；
39.图3示出了对通过使具有由seq id no：2表示的氨基酸序列的蛋白质与二十二碳六烯酸(dha)反应得到的反应产物进行正相hplc分析的结果；
40.图4a至图4d示出了对于具有由seq id no：1表示的氨基酸序列的蛋白质(k1)和具有由seq id no：2表示的氨基酸序列的蛋白质(k2)，分别分析作为具有相似活性的脂氧合酶的人5lox(aaa36183)、人12lox(aaa51533)、人15lox(aaa36183)、大豆15lox(aaa33986)、马铃薯lox(aab81595)和红藻phlox2(agn54275)的氨基酸序列的同源性的结果；
41.图5示出了对于人真皮成纤维细胞，确认由具有由seq id no：1表示的氨基酸序列的蛋白质(spm 1)产生的羟基衍生物和由具有由seq id no：2表示的氨基酸序列的蛋白质(spm 2)产生的羟基衍生物的细胞毒性的结果；
42.图6示出了对于人角质细胞，确认由具有由seq id no：1表示的氨基酸序列的蛋白质(spm 1)产生的羟基衍生物和由具有由seq id no：2表示的氨基酸序列的蛋白质(spm 2)产生的羟基衍生物的细胞毒性的结果；
43.图7和图8示出了对于人角质细胞，确认由具有由seq id no：1表示的氨基酸序列的蛋白质(spm 1)产生的羟基衍生物和由具有由seq id no：2表示的氨基酸序列的蛋白质(spm 2)产生的羟基衍生物的tnf-α表达抑制活性(图7)和il-6表达抑制活性(图8)的结果；
44.图9示出了对于人真皮成纤维细胞，确认由具有由seq id no：1表示的氨基酸序列的蛋白质(spm 1)产生的羟基衍生物和由具有由seq id no：2表示的氨基酸序列的蛋白质(spm 2)产生的羟基衍生物的胶原蛋白产生提高活性的结果；
45.图10示出了对于人真皮成纤维细胞，确认由具有由seq id no：1表示的氨基酸序列的蛋白质(spm 1)产生的羟基衍生物和由具有由seq id no：2表示的氨基酸序列的蛋白质(spm 2)产生的羟基衍生物的胶原酶产生抑制活性的结果；
46.图11示出了对于人角质细胞，比较单一成分和spms复合组合物的il-6表达抑制活性的结果：图11a示出了根据17s-hdha、保护素dx和消退素d5各自的浓度的il-6表达抑制活性；图11b示出了根据本发明的spms复合组合物1至spms复合组合物3的浓度的il-6表达抑制活性；图11c示出了与单一成分相比，本发明的spms复合组合物的协同il-6表达抑制作用[未处理对照组：未用uvb照射的组，con(-)：在照射uvb之后未进行任何处理的组，con( )h.c.：在uvb照射之后用氢化可的松处理的阳性对照组]；
[0047]
图12示出了对于人真皮成纤维细胞，确认单一成分和spms复合组合物的前胶原合成效果的结果：图12a示出了根据17s-hdha、保护素dx和消退素d5各自的浓度的前胶原合成效果；图12b示出了根据本发明的spms复合组合物1至spms复合组合物3的浓度的前胶原合成效果；图12c示出了与spm单一成分相比，本发明的spms复合组合物的协同前胶原合成效果[未处理对照组：未处理的组，con( )r.p.：用棕榈酸视黄酯处理的阳性对照组]；
[0048]
图13示出了对于人真皮成纤维细胞，确认本发明的spms复合组合物的改善胶原酶(mmp-1)表达抑制能力的效果的结果[未处理对照组：未用uvb照射的组，对照组：在照射uvb
之后未进行任何处理的组，视黄酸：在uvb照射之后用视黄酸处理的阳性对照组]；
[0049]
图14示出了对于人角质细胞，确认本发明的spms复合组合物的改善tnf-α表达抑制能力的效果的结果[未处理对照组：未用uvb照射的组，对照组：在照射uvb之后未进行任何处理的组，氢化可的松：在uvb照射之后用氢化可的松处理的阳性对照组]；
[0050]
图15示出了确认本发明的spms复合组合物的no产生减少效果的结果[未处理对照组：未用uvb照射的组，对照组：在照射uvb之后未进行任何处理的组，氢化可的松：在uvb照射之后用氢化可的松处理的阳性对照组，vit.c：在uvb照射之后用维生素c处理的阳性对照组]；
[0051]
图16示出了对于由细粉尘诱导的刺激，确认本发明的spms复合组合物的减少脂类过氧化物产生的效果的结果[未处理对照组：未用细粉尘处理的组，对照组：用细粉尘诱导照射之后未进行任何处理的组，氢化可的松：用细粉尘诱导照射之后用氢化可的松处理的阳性对照组，vit.c：用细粉尘诱导照射之后用维生素c处理的阳性对照组]；
[0052]
图17示出了通过构成皮肤屏障的核心蛋白的表达水平来确认本发明的spms复合组合物的皮肤屏障改善效果的结果：图17a示出了确认丝聚蛋白的表达增加的结果，图17b示出了确认兜甲蛋白的表达增加的结果[未处理对照组：未进行任何处理的组，透明质酸：用透明质酸处理的阳性对照组]；
[0053]
图18示出了通过人体功效评价来确认本发明的spms复合组合物的皮肤屏障改善效果的结果：图18a示出了皮肤屏障指数的变化率(％)，图18b示出了皮肤屏障恢复率(％)；
[0054]
图19示出了通过人体功效评价来确认本发明的spms复合组合物的特应性皮炎的改善效果的结果：图19a示出了损伤部位的皮肤水分的变化率(％)，图19b示出了损伤部位的经皮水分流失(％)的变化率，图19c示出了损伤部位的皮肤瘙痒指数(5)的变化率；
[0055]
图20示出了通过人体功效评价来确认本发明的spms复合组合物的缓解眼部皱纹和改善皮肤水分的效果的结果：图20a示出了眼部皱纹的变化率(％)，图20b示出了眼周皮肤的水分量，图20c示出了眼周皮肤的水分改善率(％)。
具体实施方式
[0056]
下文中，将详细描述本发明。
[0057]
1.用于制备多不饱和脂肪酸的单羟基或二羟基衍生物的酶
[0058]
本发明的一个方面提供一种用于制备多不饱和脂肪酸的单羟基或二羟基衍生物的酶。
[0059]
另外，本发明的另一方面提供一种编码所述用于制备多不饱和脂肪酸的单羟基或二羟基衍生物的酶的核酸分子。
[0060]
本发明的用于制备多不饱和脂肪酸的单羟基或二羟基衍生物的酶包含由seq id no：1或seq id no：2表示的氨基酸序列，并且可以是在不影响用于制备多不饱和脂肪酸的单羟基或二羟基衍生物的酶的功能的范围内，通过氨基酸残基的删去、插入、取代或组合而具有不同序列的氨基酸的变体或片段。在相关领域中已知蛋白质和肽的水平的氨基酸交换，而不完全改变所述用于制备多不饱和脂肪酸的单羟基或二羟基衍生物的酶的活性。在一些情况下，可以通过磷酸化、硫酸化、丙烯酸化、糖基化、甲基化、法尼基化等来修饰氨基酸交换。因此，本发明包括具有与包含由seq id no：1或seq id no：2表示的氨基酸序列的
蛋白质基本相同的氨基酸序列的蛋白质，以及它们的变体或活性片段。基本相同的蛋白质是指与氨基酸序列具有至少90％，优选地至少93％，最优选地至少95％的同源性的蛋白质，但是不限于此，并且具有与所述氨基酸序列至少90％的同源性且具有相同的酶活性的蛋白质包括在本发明的范围内。
[0061]
所述用于制备多不饱和脂肪酸的单羟基或二羟基衍生物的酶的基因优选地由seq id no：3或seq id no：4表示的核苷酸序列组成。然而，在不改变由编码区域表达的酶及其变体或活性片段的氨基酸序列的范围内，编码本发明的用于制备多不饱和脂肪酸的单羟基或二羟基衍生物的酶及其变体或活性片段可以在编码区域中具有各种修饰。即使在编码区域之外的部分中，在不影响基因表达的范围内，可以具有各种突变，并且这种突变基因也包括在本发明的范围内。因此，本发明包括由与seq id no：3或seq id no：4的核酸分子基本相同的核苷酸序列组成的基因和该基因的片段。由基本相同的核苷酸序列组成的基因是指序列同源性为80％以上，优选地90％以上，最优选地95％以上的基因，但是不限于此，并且序列同源性为80％以上且具有与编码的蛋白质相同的酶活性的基因包括在本发明中。这样，本发明的用于制备多不饱和脂肪酸的单羟基或二羟基衍生物的酶的基因可以通过取代、删去和插入至少一个核苷酸或其组合而突变，只要所述基因编码具有与其相同活性的蛋白质即可，并且这些突变体也包括在本发明的范围内。
[0062]
所述用于制备多不饱和脂肪酸的单羟基或二羟基衍生物的酶中包含的由seq id no：1表示的氨基酸序列优选地通过由seq id no：3表示的核苷酸序列组成的基因来编码，并且由seq id no：2表示的氨基酸序列优选地通过由seq id no：4表示的核苷酸序列组成的基因来编码，但是本发明不限于此。所述氨基酸序列也可以通过由与seq id no：3或seq id no：4表示的核苷酸序列基本上相同的另一核苷酸序列组成的基因来编码，只要所述氨基酸序列可以编码具有相同的氨基酸序列的本发明的蛋白质即可。这些核苷酸序列可以是单链或双链的，并且可以是dna分子或rna分子。
[0063]
在本发明的一个具体实例中，本发明人已经分离并纯化了具有由seq id no：1或seq id no：2表示的氨基酸序列的蛋白质，从而发现具有由seq id no：1或seq id no：2表示的氨基酸序列的蛋白质的功能(参见图1)。作为研究其活性的结果，本发明人确认，具有由seq id no：1或seq id no：2表示的氨基酸序列的蛋白质具有能够产生单羟基衍生物，或将两个羟基引入到多不饱和脂肪酸中的二羟基衍生物的酶的活性(参见图2和图3)。
[0064]
2.用于制备多不饱和脂肪酸的单羟基或二羟基衍生物的酶的表达载体和转化体
[0065]
本发明的另一方面提供一种重组表达载体和引入有该重组表达载体的转化体，所述重组表达载体包含本发明的用于制备多不饱和脂肪酸的单羟基或二羟基衍生物的酶的基因。
[0066]
本发明的重组表达载体包含所述用于制备多不饱和脂肪酸的单羟基或二羟基衍生物的酶的基因。
[0067]
所述表达载体包括质粒载体、粘粒载体、噬菌体载体、病毒载体等，但是不限于此。
[0068]
所述重组表达载体可以根据目的根据宿主细胞的类型来适当地组合表达调控序列如启动子、终止子、增强子等，或用于分泌的序列，以便制备本发明的用于制备多不饱和脂肪酸的单羟基或二羟基衍生物的酶。
[0069]
所述表达载体还可以包括选择标记，用于选择已经引入载体的宿主细胞，并且在
可复制的表达载体的情况下，可以包括复制起点。
[0070]
另外，所述重组表达载体可以包含用于促进表达的蛋白质的纯化的序列，具体地，可以与编码用于分离和纯化的标签的基因连接，以便对编码本发明的用于制备多不饱和脂肪酸的单羟基或二羟基衍生物的酶的基因是可操作的。此时，所述用于分离和纯化的标签可以单独使用gst、poly-arg、flag、组氨酸标签(his-tag)、c-myc等，或者也可以通过顺序地连接两个或更多个标签来使用。
[0071]
所述编码用于制备多不饱和脂肪酸的单羟基或二羟基衍生物的酶的基因可以通过限制酶切割位点来克隆。当在载体中使用编码蛋白质切割酶识别位点的基因时，该基因与用于制备多不饱和脂肪酸的单羟基或二羟基衍生物的酶的基因框内(in frame)连接。当得到酶然后被蛋白裂解酶裂解时，可以制备用于制备多不饱和脂肪酸的单羟基或二羟基衍生物的原始类型的酶。
[0072]
在本发明的一个具体实例中，将本发明的用于制备多不饱和脂肪酸的单羟基或二羟基衍生物的酶的基因(包含由seq id no：3或seq id no：4表示的核苷酸序列的基因)插入到质粒载体pet28a( )中以制备重组克隆载体。除了在克隆载体的制备中使用的pet28a( )之外，已知有用于原核细胞或真核细胞的各种载体(如ppic和ppicz等)，因此，根据表达的目的，除了所述载体，还可以使用各种表达载体。
[0073]
本发明的重组表达载体包含所述用于制备多不饱和脂肪酸的单羟基或二羟基衍生物的酶的基因，因此，可以有效地用作能够制备所述酶的基因的载体。
[0074]
另外，本发明的转化体引入有包含所述编码用于制备多不饱和脂肪酸的单羟基或二羟基衍生物的酶的基因的所述重组表达载体。
[0075]
根据表达目的，将根据本发明的重组表达载体转变到选自细菌、酵母、大肠杆菌、真菌、植物细胞和动物细胞中的任意一种适当的宿主细胞中以制备转化体。例如，宿主细胞可以是大肠杆菌(大肠杆菌bl21(de3)、dh5a等)、酵母细胞(酵母菌属、毕赤酵母属等)等。此时，本领域技术人员可以根据宿主细胞的类型从本领域中已知的技术中容易地选择适当的培养方法和培养基条件等。
[0076]
作为引入重组表达载体以用于制备本发明的转化体的方法，可以使用已知技术，即，热击法、电击法等。
[0077]
在本发明的一个具体实例中，通过使用大肠杆菌作为宿主细胞，将包含编码本发明的用于制备多不饱和脂肪酸的单羟基或二羟基衍生物的酶的基因的重组表达载体转化到大肠杆菌中，来制备转化体。
[0078]
由于由转化体表达的蛋白质是具有用于制备多不饱和脂肪酸的单羟基或二羟基衍生物的酶的活性的新序列的蛋白质，因此，大规模培养转化体以表达所述基因，从而促进用于制备多不饱和脂肪酸的单羟基或二羟基衍生物的酶的大规模生产。
[0079]
3.在体外制备多不饱和脂肪酸的单羟基或二羟基衍生物的方法
[0080]
本发明的另一方面提供一种在体外制备多不饱和脂肪酸的单羟基或二羟基衍生物的方法。
[0081]
本发明的在体外制备多不饱和脂肪酸的单羟基或二羟基衍生物的方法包括：使多不饱和脂肪酸与在“1.用于制备多不饱和脂肪酸的单羟基或二羟基衍生物的酶”项中描述的用于制备单羟基或二羟基衍生物的酶反应。所述多不饱和脂肪酸是在碳之间包含三个或
更多个双键的脂肪酸，具体地是omega-3脂肪酸，更具体地是二十二碳六烯酸或二十碳五烯酸，但是不限于此。如上所述，当使用所述多不饱和脂肪酸作为用于制备单羟基或二羟基衍生物的酶的底物时，该底物包含多个双键，在双键中可以引入羟基以实现单羟基或二羟基衍生物的制备。
[0082]
本发明的在体外制备多不饱和脂肪酸的单羟基或二羟基衍生物的方法还包括：从所述酶与所述多不饱和脂肪酸的反应产物中回收单羟基或二羟基衍生物。
[0083]
所述回收可以通过进行本领域中通常进行的方法，如离心分离和过滤来实现，并且可以通过以常规方式额外进行纯化过程来实现。例如，纯化过程可以单独进行，或与诸如溶剂析出、透析、凝胶过滤、离子交换和例如反相柱色谱法的色谱法的技术组合进行。
[0084]
多不饱和脂肪酸与用于制备单羟基或二羟基衍生物的酶的反应可以在10℃至40℃的温度范围内进行，优选在15℃至35℃的温度范围内进行，但是不限于此。此外，所述反应可以在ph 4至ph 10的范围内进行，优选在ph 7至ph 9的范围内进行，但是不限于此。当所述反应在上述温度和ph范围内进行时，用于制备单羟基或二羟基衍生物的酶的活性被最大化，从而更有效地制备单羟基或二羟基衍生物。
[0085]
4.在体内制备多不饱和脂肪酸的单羟基或二羟基衍生物的方法
[0086]
本发明的另一方面提供一种在体内制备多不饱和脂肪酸的单羟基或二羟基衍生物的方法。
[0087]
本发明的在体内制备多不饱和脂肪酸的单羟基或二羟基衍生物的方法包括：在多不饱和脂肪酸的存在下培养在“2.用于制备多不饱和脂肪酸的单羟基或二羟基衍生物的酶的表达载体和转化体”项中描述的转化体，并从培养的培养物中分离多不饱和脂肪酸的单羟基或二羟基衍生物。
[0088]
在引入有包含编码所述用于制备单羟基或二羟基衍生物的酶的基因的重组表达载体的转化体中，所述用于制备单羟基或二羟基衍生物的酶可以得以表达。对于转化体中存在的用于制备单羟基或二羟基衍生物的酶，通过引用“1.用于制备多不饱和脂肪酸的单羟基或二羟基衍生物的酶”项的描述，将省略其详细描述。
[0089]
在转化体中，用于制备单羟基或二羟基衍生物的酶得以表达。因此，通过使用它，将转化体在包含多不饱和脂肪酸作为底物的培养基中培养，以制备单羟基或二羟基衍生物，而不需要单独的分离酶的过程。
[0090]
可以根据本领域中已知的适当培养基和培养条件进行转化体的培养。本领域技术人员可以根据待选择的转化体的类型容易地调节和使用培养基和培养条件。培养方法可以包括分批式、连续式、分批进料式或它们的组合。
[0091]
所述培养基可以包含各种碳源、氮源和微量元素成分。
[0092]
所述碳源可以包括，例如，糖类，如葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麦芽糖、淀粉和纤维素；动植物油，如大豆油、葵花油、蓖麻油和椰子油；脂肪酸，如棕榈酸、硬脂酸和亚油酸；醇，如甘油和乙醇；有机酸，如乙酸；或它们的组合。可以使用葡萄糖作为碳源来进行培养。所述氮源可以包括有机氮源，如蛋白胨、酵母提取物、肉汤、麦芽提取物、玉米浆(csl)和豆浆；无机氮源，如尿素、硫酸铵、氯化铵、磷酸铵、碳酸铵和硝酸铵；或它们的组合。作为磷的供应源，所述培养基可以包含，例如，磷酸二氢钾、磷酸氢二钾和它们对应的钠盐；和金属盐，如硫酸镁或硫酸铁。
[0093]
另外，所述培养基中可以包含氨基酸、维生素、适当的前体等。可以以分批或连续类型向培养基中加入培养基或单独的成分。
[0094]
另外，在培养的过程中，可以通过使用消泡剂如脂肪酸聚乙二醇酯来抑制气泡的产生。
[0095]
用于改善皮肤状况或者预防或治疗皮肤病的组合物
[0096]
另一方面，本发明的另一方面提供一种用于改善皮肤状况或者预防或治疗皮肤病的组合物。
[0097]
在一个具体的实施方案中，本发明提供一种用于改善皮肤状况的组合物，包含17-羟基二十二碳六烯酸(17-hdha)、消退素d5和保护素dx作为活性成分。
[0098]
所述17-羟基二十二碳六烯酸(17-hdha)、消退素d5和保护素dx是来自omega-3脂肪酸，即，二十二碳六烯酸(dha)的脂氧合酶(lox)代谢物，并且是一种特异性促消退介质(spm)。
[0099]
所述17-羟基二十二碳六烯酸(17-hdha)是(
±
)17-羟基(二羟基)-4z，7z，10z，13z，15e，19z-二十二碳六烯酸(docosahexaenoic acid)，并且由下面式1的结构表示。
[0100]
[式1]
[0101][0102]
所述消退素d5(rvd5)是7s，17s-二羟基-4z，8e，10z，13z，15e，19z-二十二碳六烯酸(docosahexaenoic acid)，并且由下面式2的结构表示。
[0103]
[式2]
[0104][0105]
所述保护素dx(pdx)是10s，17s-二羟基-4z，7z，11e，13z，15e，19z-二十二碳六烯酸并且是蛋白质d1的异构体，并且由下面式3的结构表示。
[0106]
[式3]
[0107]
[0108]
所述17-hdha、消退素d5和保护素dx可以通过用本发明的seq id no：1或seq id no：2的酶处理二十二碳六烯酸来生物合成、化学合成或商业购买，但是不限于此。
[0109]
在本发明的一个具体实例中，作为用包含17-羟基二十二碳六烯酸(17-hdha)、消退素d5和保护素dx的复合组合物处理人真皮成纤维细胞的结果，可以确认，通过紫外线照射而增加的炎症因子的表达被抑制，并且前胶原合成增加。特别地，可以确认，与单一化合物相比，本发明的复合组合物协同诱导了胶原蛋白合成效果和炎症抑制效果。此外，在人体应用实验中，可以确认，本发明的复合组合物通过恢复受损的皮肤屏障和减少经皮水分流失来缓解由特应性皮炎引起的干皮和瘙痒。
[0110]
因此，本发明的组合物可以用于改善皮肤状况。
[0111]
如本文中所使用，术语“皮肤状况”可以是由于紫外线引起的皮肤老化、斑点、雀斑、皮肤创伤、皮炎、特应性皮炎、瘙痒、湿疹性皮肤病、干性湿疹、红斑、荨麻疹、牛皮癣、皮疹或痤疮。
[0112]
皮肤老化表现出诸如皮肤弹性降低、光泽减少、皱纹产生、再生减少或严重干燥的症状，并且包括由时间流逝或外部环境引起的内在和外在老化两者。具体地，皮肤老化可以是光老化，光老化是指当皮肤反复或长期暴露于紫外线下时发生的皮肤损伤。
[0113]
另外，皱纹是指在包括面部的所有身体部位出现的皱纹，并且包括静态皱纹和动态皱纹两者。
[0114]
如本文中所使用，术语“改善皮肤状况”是包括预防或缓解皮肤皱纹、预防或缓解皮肤老化、预防或缓解皮肤炎症、皮肤细胞的增殖和再生、收缩或减少毛孔、改善皮肤屏障功能、缓解皮肤刺激、抗氧化和增强胶原蛋白合成的全部的概念。
[0115]
如本文中所使用，“包含作为活性成分”的含义是包含有效量至可以表现出皮肤改善效果的程度，例如，皱纹缓解、炎症缓解、皮肤再生、特应性皮炎缓解或皮肤屏障增强和改善。
[0116]
根据本发明的一个实施方案，所述组合物可以通过抑制基质金属蛋白酶(mmp)的表达或活性来促进细胞中胶原蛋白的合成或抑制胶原蛋白的分解。所述组合物可以，例如，通过抑制分解1型胶原蛋白的mmp-1的表达或活性来抑制细胞外基质的分解。
[0117]
根据本发明的一个实施方案，所述组合物可以具有抗氧化活性。所述组合物可以抑制脂类过氧化物的形成。根据本发明的另一实施方案，所述组合物可以抑制炎症因子。所述组合物可以抑制作为炎症引发剂的no、tnf-α和il-6。
[0118]
tnf-α(肿瘤坏死因子-a)和il-6(白细胞介素-6)是具有代表性的炎症诱导细胞因子。tnf-α是由脂多糖(lps)激活的淋巴球所产生的促炎性细胞因子，脂多糖是革兰氏阴性菌的细胞膜中的内毒素，并且il-6由巨噬细胞和t细胞分泌，以刺激免疫应答来促进炎症。
[0119]
本发明的包含17-hdha、消退素d5和保护素dx的复合组合物可以通过抑制炎性细胞因子tnf-α和il-6的表达来实现优异的抗炎作用，并且具有优异的抑制由于皮肤中发生的氧化应激而产生脂质过氧化物的抗氧化作用，从而改善皮肤对外界刺激的抵抗能力。
[0120]
根据本发明的又一实施方案，所述组合物可以用于增强皮肤屏障。
[0121]
角质层是皮肤屏障的表皮的最外层，主要由无核的扁平角质细胞组成。由细胞间脂质如神经酰胺、胆固醇和脂肪酸形成的多层脂质膜充当保护屏障以防止皮肤中的水分蒸发，所述细胞间脂质由通过正常表皮细胞的分裂和分化过程而保持的皮肤屏障的角质细胞
来合成。在这些细胞间脂质中，欧米茄羟基神经酰胺与作为角质细胞的外层的蛋白质的外皮蛋白化学共价连接，以形成角质细胞脂质包膜(cle)，以便将细胞间脂质物理稳定在多层脂质膜的形式的方面起作用，从而增强屏障功能。
[0122]
本发明的组合物通过皮肤敷用传递至角质层并且促进角质细胞的分化，从而产生增加表皮层的厚度的效果。此外，所述组合物具有优异的修复皮肤屏障的损坏的效果，由此，可以有效地用于治疗和预防因皮肤屏障损坏引起的皮肤病。由皮肤屏障损坏引起的皮肤病包括，但是不限于，特应性皮炎、干皮病、牛皮癣、鱼鳞癣、痤疮等。
[0123]
另外，通过增加丝聚蛋白和兜甲蛋白的表达来确定皮肤屏障增强效果。丝聚蛋白是在分化阶段中由角质细胞表达的数种结构蛋白中的一种，并且参与从表皮的基底层到角质层的分化。其用作皮肤保湿和皮肤膜功能的主要指标，因为它也形成用于保持皮肤组织中的水分所必需的天然水分因子(nmf)的主要成分。由于丝聚蛋白或兜甲蛋白的基因表达显著增加，根据本发明的包含17-hdha、消退素d5和保护素dx的复合组合物具有优异的皮肤屏障保护、增强和改善功能。
[0124]
由于作为活性成分被包含的17-hdha、消退素d5和保护素dx的复杂的协同作用，因此，本发明的包含17-hdha、消退素d5和保护素dx的复合组合物可以实现显著改善的il-6表达抑制效果和前胶原合成效果，特别是与使用相同浓度的这些化合物中的各一种相比(图11和图12)。
[0125]
在本发明的一个实施方案中，所述复合物包含重量比为3至85∶10至60∶5至50，例如，重量比为3∶10∶5，重量比为5∶60∶50，重量比为85∶10∶5的17-hdha、消退素d5和保护素dx，但是不限于此。在本发明的一个实例中，使用包含重量比为3∶47∶50、25∶56∶19和84∶10∶6的17-hdha、消退素d5和保护素dx的复合组合物来确认皮肤改善效果。
[0126]
另一方面，所述用于改善皮肤状况的组合物可以用作化妆品组合物、药物组合物或食品组合物。
[0127]
因此，在一个方面，本发明提供一种用于改善皮肤状况的化妆品组合物，包含17-羟基二十二碳六烯酸(17-hdha)、消退素d5和保护素dx作为活性成分。
[0128]
包含17-羟基二十二碳六烯酸(17-hdha)、消退素d5和保护素dx的复合组合物以及与皮肤状态改善相关的内容与上面描述的相同。
[0129]
当使用本发明的复合组合物作为化妆品组合物时，除了17-hdha、消退素d5和保护素dx之外，还包含化妆品组合物中常用的成分，例如，硫酸化剂、稳定剂、增溶剂、维生素、常规佐剂如颜料和香料、以及载体。
[0130]
本发明的化妆品组合物可以制备为本领域中通常制备的任意配方。所述化妆品组合物可以配制为，例如，溶液、悬浮液(无水的和水性的)、无水产品(油类和二醇类)、乳液、糊剂、凝胶、面膜(mask)、敷料(pack)、粉末、霜、洗剂(lotion)、粉末、肥皂、含表面活性剂的清洁剂、油、粉底、粉底液、蜡粉底、喷雾等，但是不限于此。更具体地，所述化妆品组合物可以被制备为配方如柔肤水(皮肤)、精华爽肤水(牛奶乳液)、精华霜、按摩霜、香精、眼霜、洁面霜、洁面泡沫、洁肤水、敷料、喷雾或粉末。在这一点上，可以进一步改善化妆品组合物的易进入性，并且可以通过实施保湿效果来防止特应性皮炎的慢性复发。
[0131]
当所述化妆品组合物的配方是糊剂、霜或凝胶时，可以使用动物油、植物油、蜡、石蜡、淀粉、黄蓍胶、纤维素衍生物、聚乙二醇、有机硅、膨润土、二氧化硅、滑石、氧化锌等作为
载体成分。
[0132]
当所述化妆品组合物的配方是粉末或喷雾时，可以使用乳糖、滑石、二氧化硅、氢氧化铝、硅酸钙或聚酰胺粉末作为载体成分，并且具体地，当配方是喷雾时，可以包含推进剂如氯氟烃、丙烷/丁烷或二甲醚。
[0133]
当所述化妆品组合物的剂型是溶液或乳液时，可以使用溶剂、增溶剂或乳化剂作为载体成分，并且其实例包括：水、乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苯甲醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、1，3-丁基乙二醇油、甘油脂肪族酯、聚乙二醇或脱水山梨糖醇脂肪酸酯。
[0134]
当所述化妆品组合物的配方是悬浮液时，可以使用：液体稀释剂，如水、乙醇和丙二醇；悬浮剂，如乙氧基化异硬脂醇、聚氧乙烯山梨糖醇酯和聚氧乙烯脱水山梨糖醇酯；微晶纤维素；偏氢氧化铝；膨润土；琼脂；黄蓍胶等作为载体成分。
[0135]
当所述化妆品组合物的配方是含表面活性剂的清洁剂时，可以使用脂肪醇硫酸盐、脂肪醇醚硫酸盐、磺基琥珀酸单酯、羟乙基磺酸盐、咪唑啉鎓衍生物、牛磺酸甲酯、肌氨酸盐、脂肪酸酰胺醚硫酸盐、烷基酰胺甜菜碱、脂肪醇、脂肪酸甘油酯、脂肪酸二乙醇酰胺、植物油、羊毛脂衍生物或乙氧基化甘油脂肪酸酯等作为载体成分。
[0136]
当所述化妆品组合物是肥皂的形式时，其可以通过包含皮肤保湿剂、乳化剂、软水剂等作为添加剂来制备。作为肥皂的基材，可以使用植物油，如椰子油、棕榈油、大豆油、橄榄油、棕榈仁油、荷荷巴油等；或动物脂肪，如牛油、猪油、牛腩、鱼油等。作为保湿剂，可以使用甘油、赤藓糖醇(detipritol)、丙二醇、丁二醇、己二醇、肉豆蔻酸异丙酯、芦荟、山梨糖醇等。作为乳化剂，可以使用天然油、蜡、烃类等，作为软水剂，可以使用edta四钠等，但是不限于此。
[0137]
所述肥皂还可以包含抗菌剂、抑泡剂、溶剂、阻蚀剂、香精、着色剂、螯合剂、防腐剂等作为添加剂。
[0138]
当本发明的组合物用作化妆品组合物时，组合物中的17-hdha、消退素d5和保护素dx可以以30μm以上，具体地35μm以上，更具体地40μm以上的浓度被包含。然而，这根据化妆品组合物被制备的形式及其具体的应用部位(面部或手)或应用剂量而改变，因此不限于此。
[0139]
本发明的另一方面提供一种用于预防或治疗皮肤病的药物组合物，其中，所述药物组合物包含17-羟基二十二碳六烯酸(17-hdha)、消退素d5和保护素dx作为活性成分。
[0140]
所述皮肤病可以是皮肤创伤、皮肤疤痕、皮炎、特应性皮炎、瘙痒、湿疹性皮肤病、干性湿疹、脚癣、红斑、荨麻疹、牛皮癣、皮疹、痤疮或脱发。
[0141]
所述包含17-羟基二十二碳六烯酸(17-hdha)、消退素d5和保护素dx的复合组合物以及与皮肤病相关的内容与上面描述的相同。
[0142]
当所述组合物用作药物组合物时，除了17-hdha、消退素d5和保护素dx之外，所述组合物还可以包含药学上可接受的载体或添加剂。
[0143]“药学上可接受的”是指待应用(指定)的对象在不抑制活性成分的活性的情况下不具有超出适应性的毒性。“载体”被定义为促进化合物加入到细胞或组织中的化合物。
[0144]
本发明的17-hdha、消退素d5和保护素dx可以单独给药，或者与任意方便的载体等结合给药，并且这种剂型可以是单次剂量或重复剂量制剂。所述药物组合物可以是固体制剂或液体制剂。固体制剂包括粉剂、颗粒剂、片剂、胶囊剂和栓剂，但是不限于此。固体制剂
可以包括载体、增味剂、粘合剂、防腐剂、崩解剂、润滑剂、填充剂等，但是不限于此。液体制剂包括溶液如水和丙二醇溶液、悬浮剂和乳剂，但是不限于此，并且可以通过加入适当的着色剂、调味剂、稳定剂、稠化剂等来制备。例如，粉剂可以通过将适当的药学上可接受的载体如乳糖、淀粉、微晶纤维素等与本发明的作为活性成分的17-hdha、消退素d5和保护素dx简单混合来制备。颗粒剂可以通过将本发明的17-hdha、消退素d5和保护素dx、适当的药学上可接受的载体和适当的药学上可接受的粘合剂如聚乙烯吡咯烷酮以及羟丙基纤维素混合，然后采用使用溶剂如水、乙醇和异丙醇的湿法造粒法，或采用使用压缩力的干法造粒法来制备。此外，片剂可以通过将颗粒与适当的药学上可接受的润滑剂如硬脂酸镁混合，然后使用压片机将混合物压片来制备。
[0145]
根据待治疗的疾病和对象的状况，本发明的17-hdha、消退素d5和保护素dx可以以口服剂、注射剂(例如，肌内注射、腹膜内注射、静脉注射、输注、皮下注射和植入物)、吸入剂、鼻腔给药剂、阴道剂、直肠给药剂、舌下剂、经皮剂、局部剂等给药，但是不限于此。衍生物可以配制为包含药学上可接受的载体、添加剂和赋形剂的适当的剂量单位制剂，它们根据给药途径而常规使用并且无毒。
[0146]
本发明的药物组合物可以以约0.0001mg/kg至约10g/kg和约0.001mg/kg至约1g/kg的日剂量给药。然而，剂量可以根据混合物的纯化程度、患者的状况(年龄、性别、体重等)和治疗的状况的严重程度而变化。根据需要，为了方便起见，每日总剂量可以在一天内分开并且以多次给药。
[0147]
当本发明的组合物用作药物组合物时，组合物中的17-hdha、消退素d5和保护素dx可以以30μm以上，具体地35μm以上，更具体地40μm以上的浓度被包含。
[0148]
本发明的另一方面提供一种用于改善皮肤状况的食品组合物，其中，所述食品组合物包含17-羟基二十二碳六烯酸(17-hdha)、消退素d5和保护素dx作为活性成分。
[0149]
所述包含17-羟基二十二碳六烯酸(17-hdha)、消退素d5和保护素dx的复合组合物以及与皮肤状态改善相关的内容与上面描述的相同。
[0150]
当所述组合物用作食品组合物时，该组合物可以包含可接受的食品补充剂添加剂，并且还可以包含在食品制备中常用的适当的载体、赋形剂和稀释剂。
[0151]
在本发明中，食品指包含一种或更多种营养物的天然产品或加工产品，具体地，指通过特定的加工过程可以直接食用的状态，并且作为常规含义，用作包括各种食物、功能性食品、饮料、食品添加剂和饮料添加剂的全部。食品的实例包括各种食物、饮料、软糖、茶、维生素复合物、功能性食品等。此外，本发明的食品包括：特殊营养食品(如配方食品、婴儿食品等)、加工肉制品、鱼肉制品、豆腐、泥状物(muk)、面条(如拉面、挂面等)、健康增补食品、调味食品(如酱油、豆瓣酱、辣椒酱、混合酱等)、调味汁、糖果(如零食)、乳制品(如发酵乳、奶酪等)、其它加工食品、泡菜、盐渍食品(各种泡菜、咸菜等)、饮料(如水果饮料、蔬菜饮料、豆奶、发酵饮料、冰淇淋等)、天然调味品(如拉面汤等)、维生素复合物、酒精饮料、酒类和其它健康增补品，但是不限于此。功能性食品、饮料、食品添加剂或饮料添加剂可以通过常规的制备方法制备。
[0152]
术语“功能性食品”是指被设计和加工为充分表现关于食品组或食品组合物的生物防御节律控制、疾病预防和恢复等的对人体的人体调节功能的食品，其具有通过使用物理、生物化学和生物技术方法等作用和表现用于特定目的的相应食品的功能的附加值，并
且具体地，可以是健康功能食品。
[0153]
本发明中使用的术语“健康功能食品”是指通过使用具有对人体有用的功能性的原料或成分以片剂、胶囊、粉末、颗粒、液体和丸剂的形式制备和加工的食品。此处，“功能”是指将营养物调节至人体的结构和功能，或者指取得对健康应用如生理作用有用的效果。本发明的健康功能食品可以通过本领域中常用的方法制备，并且可以通过在制备中加入本领域中常用的原料和成分来制备。此外，健康功能食品的配方也可以没有限制地制备，只要该配方被认为是健康功能食品即可。本发明的食品组合物可以制备为各种类型的配方，并且与常规药物不同，所述食品组合物具有的优点是，通过使用食品作为原料，没有当长时间服用药物时会发生的副作用，并且具有优异的便携性，但是本发明的健康功能食品可以被认为是用于增强皮肤改善效果的补充剂。
[0154]
另外，所述功能性食品可以包括营养学上可接受的食品补充剂添加剂，并且还可以包括在功能性食品的制备中常用的适当的载体、赋形剂和稀释剂。
[0155]
另外，在所述食品组合物中，组合物中的17-hdha、消退素d5和保护素dx可以以30μm以上，具体地35μm以上，更具体地40μm以上的浓度被包含。
[0156]
除了所述活性成分之外，本发明的食品组合物还可以包含甜味剂、调味剂、生理活性成分、矿物质等。甜味剂可以以给予食物适当甜味的量使用，并且可以是天然的或合成的。具体地，当使用天然甜味剂时，天然甜味剂的实例可以包括糖甜味剂，如淀粉糖浆干粉、蜂蜜、蔗糖、果糖、乳糖和麦芽糖。调味剂可以用于改善味道或风味，并且可以使用天然调味剂和合成调味剂两者。具体地，使用天然调味剂。在使用天然调味剂的情况下，除了调味之外，可以结合营养增强的目的。天然调味剂可以从苹果、柠檬、柑橘、葡萄、草莓、桃等中得到，或从绿茶叶、多花黄精、竹叶、肉桂、菊花叶、茉莉等中得到。此外，可以使用从人参(红参)、竹笋、芦荟和银杏中得到的调味剂。天然调味剂可以是液体浓缩物或固体提取物。在一些情况下，可以使用合成调味剂，并且合成调味剂可以使用酯、醇、醛、萜烯等。作为生理活性成分，可以使用儿茶酚，如儿茶素、表儿茶素、没食子儿茶素和表没食子儿茶素；和维生素，如视黄醇、抗坏血酸、生育酚、钙化醇、硫胺素和核黄素。作为矿物质，可以使用钙、镁、铬、钴、铜、氟、锗、碘、铁、锂、镁、锰、钼、磷、钾、硒、硅、钠、硫、钒、锌等。
[0157]
另外，除了甜味剂等之外，根据需要，本发明的食品组合物还可以包含防腐剂、乳化剂、酸化剂、增稠剂等。这些防腐剂、乳化剂等优选以非常痕量加入和使用，只要可以实现待加入的应用即可。当用数字表示时，痕量是指基于食品组合物的总重量，约0.0005重量％至约0.5重量％的范围。可以使用的防腐剂可以包括山梨酸钙钠、山梨酸钠、山梨酸钾、苯甲酸钙、苯甲酸钠、苯甲酸钾、乙二胺四乙酸(edta)等。可以使用的乳化剂的实例可以包括阿拉伯树胶、羧甲基纤维素、黄原胶、果胶等。可以使用的酸化剂的实例可以包括柠檬酸、苹果酸、富马酸、己二酸、磷酸、葡糖酸、酒石酸、抗坏血酸、乙酸、磷酸等。可以加入这些酸化剂，使得所述食品组合物具有适当的酸度，以便除了增强味道的目的之外还用于抑制微生物的增殖的目的。作为可以使用的增稠剂，可以包括悬浮剂、助沉剂、凝胶形成剂、膨大剂等。
[0158]
下文中，将通过实施例详细描述本发明。
[0159]
然而，下面的实施例是本发明的具体例示，并且本发明的内容不限于下面的实施例。
[0160]
[实施例1]
[0161]
制备包含由seq id no：1或seq id no：2表示的氨基酸序列的蛋白质
[0162]
[1-1]制备用于表达蛋白质的载体
[0163]
请求bioneer co.，ltd合成编码seq id no：1和seq id no：2的各个氨基酸的由seq id no：3和seq id no：4表示的核苷酸序列。使用各自的合成核苷酸序列作为模板，使用seq id no：5至seq id no：8的引物对在94℃下进行预变性5分钟，然后，通过将在94℃下反应30秒、在61℃下反应30秒和在72℃下反应2分钟的循环重复20次来进行pcr，以扩增seq id no：3和seq id no：4的各个基因。
[0164]
[表1]
[0165][0166]
将包含由如上所述扩增的seq id no：3和seq id no：4表示的核苷酸序列的pcr产物分别插入到质粒载体pet28a( )(novagen，usa)中，以制备重组表达载体。通过核苷酸序列分析(solgent)可以确认，由seq id no：3和seq id no：4表示的核苷酸序列适当地插入。
[0167]
[1-2]蛋白质的表达和纯化
[0168]
将在实施例[1-1]中制备的重组表达载体转化到大肠杆菌bl21(de3)中，并将各自的转化体接种到3ml的lb培养基中，并在37℃下种子培养，直至600nm处的吸光度变为2.0。然后，通过向500ml的lb培养基中加入培养有种子的培养基来进行主培养。当600nm处的吸光度变为0.6时，加入iptg(异丙基-1-硫代-β-d-半乳糖苷)至最终浓度为1mm，以诱导具有由seq id no：1表示的氨基酸序列的蛋白质和具有由seq id no：2表示的氨基酸序列的蛋白质的过表达。在如上所述诱导过表达的过程中，在加入iptg之前将培养温度保持在37℃，在加入iptg之后将培养温度降低至20℃。
[0169]
将诱导过表达的转化体的培养基离心以分离上清液，从分离了上清液的沉淀物(pellet)中裂解转化体的细胞，以得到转化体的细胞裂解物。
[0170]
作为对100μl的如上所述得到的细胞裂解物进行sds-page的结果，如图1中所示，可以确认，尺寸为约96.9kda的具有由seq id no：1表示的氨基酸序列的蛋白质(图1a)和尺寸为约96.8kda的具有由seq id no：2表示的氨基酸序列的蛋白质(图1b)得以过表达。
[0171]
关于如上所述具有由seq id no：1表示的氨基酸序列的蛋白质和具有由seq id no：2表示的氨基酸序列的蛋白质确认过表达的细胞裂解物，使用ni-nta吸附色谱分离和纯化具有由seq id no：1表示的氨基酸序列的蛋白质和具有由seq id no：2表示的氨基酸序列的蛋白质。
[0172]
[实施例2]
[0173]
确认蛋白质活性-确认单羟基或二羟基衍生物的制备活性
[0174]
对于在实施例[1-2]中纯化和分离的具有由seq id no：1表示的氨基酸序列的蛋白质和具有由seq id no：2表示的氨基酸序列的蛋白质，将各自6ku或10ku的蛋白质和100μm的二十二碳六烯酸(dha)在ph 7和室温下反应30分钟，通过加入1m的硼氢化钠来还原反应产物，使得最终浓度变为50mm，然后通过加入5μl/ml的乙酸来终止反应。
[0175]
使用固相柱(spe，c18 500mg)纯化反应产物之后，使用正相hplc分析反应产物中的化合物的类型。
[0176]
具体地，正相hplc分析如下进行：以0.5ml/min的流速经40分钟将由95％的正庚烷、5％的异丙醇、0.1％的乙酸和0.1％的2，2-二甲氧基丙烷组成的20ml的流动相在supelcosil lc-diol柱(supelco，25cm
×
3mm，5μm)上展开，最后使用二极管阵列检测器(dad)检测反应产物中的化合物。
[0177]
结果，如图2和图3中所示，可以确认，具有由seq id no：1表示的氨基酸序列的蛋白质和具有由seq id no：2表示的氨基酸序列的蛋白质两者均可以由dha制备17s-单羟基-dha、7s，17s-二羟基-dha(消退素d5)和10s，17s-二羟基-dha(保护素dx)。在每种情况下，可以确认，上述三种的单羟基或二羟基衍生物的含量分别以下面表2中所描述的比例存在。
[0178]
[表2]
[0179][0180]
[实施例3]
[0181]
蛋白质的氨基酸序列分析
[0182]
对于具有由seq id no：1表示的氨基酸序列的蛋白质和具有由seq id no：2表示的氨基酸序列的蛋白质，进行与人5lox(aaa36183)、人12lox(aaa51533)、人15lox(aaa36183)、大豆15lox(aaa33986)、马铃薯lox(aab81595)和红藻phlox2(agn54275)相比的氨基酸序列的同源性分析和系统分析。
[0183]
结果，如图4a至图4d中所示，可以确认，发现具有由seq id no：1表示的氨基酸序列的蛋白质和具有由seq id no：2表示的氨基酸序列的蛋白质表现出非常低的与人5lox(aaa36183)、人12lox(aaa51533)、人15lox(aaa36183)、大豆15lox(aaa33986)、马铃薯lox
(aab81595)和红藻phlox2(agn54275)的序列同源性。
[0184]
另外，如从图4a至图4d可以理解的，可以确认，具有由seq id no：1表示的氨基酸序列的蛋白质和具有由seq id no：2表示的氨基酸序列的蛋白质两者均具有用于与膜脂质连接的n末端区域，并且在c末端区域中表现出高相似性。具体地，确认存在与铁离子结合的残基，如his、his、his和asn/ser，以及末端氨基酸，并且存在与酶的羟基化性能密切相关的ala。
[0185]
另外，作为分析具有由seq id no：1表示的氨基酸序列的蛋白质和具有由seq id no：2表示的氨基酸序列的蛋白质的二级结构的结果，可以确认，α-螺旋结构、延伸链和无规卷曲分别以下面表3中所示的比例存在。
[0186]
[表3]
[0187][0188]
[实施例4]
[0189]
确认由本发明的蛋白质的酶活性制备的反应产物的效果-抑制皮肤老化和缓解皱纹
[0190]
如上面实施例2中，将通过使二十二碳六烯酸与本发明的具有由seq id no：1表示的氨基酸序列的蛋白质(spm 1)反应得到的产物，以及通过使二十二碳六烯酸与具有由seq id no：2表示的氨基酸序列的蛋白质(spm 2)反应得到的产物，用人真皮成纤维细胞处理以确认细胞毒性、mmp-1表达和前胶原合成效果，并且用人角质细胞处理以确认细胞毒性、tnf-α表达和il-6表达的变化。
[0191]
[4-1]确认细胞毒性
[0192]
分别用浓度为0.001ppm、0.01ppm、0.1ppm和1ppm的spm 1和spm 2处理人真皮成纤维细胞和人角质细胞，来确认细胞活性。
[0193]
结果，如图5和图6中所示，两种反应产物(spm 1、spm 2)在所有浓度下均表现出90％以上的细胞活性，由此，可以理解，通过本发明的蛋白质由dha制备的产物均没有细胞毒性。
[0194]
[4-2]确认tnf-α和il-6表达抑制活性的改善效果
[0195]
将人角质细胞以4
×
104个细胞/孔的浓度分装在48孔板中，并在5％的co2和37℃下培养24小时，然后去除培养基并用dmem无血清培养基保持饥饿状态24小时。
[0196]
用dmem(2％的fbs)将spm 1和spm 2稀释至1ppm，然后顺序地稀释至0.1ppm、0.01ppm和0.001ppm，然后如上培养并用去除了培养基的人角质细胞处理1小时。然后，对于tnf-α或il-6表达，用250μl的dpbs(welgene)交换培养基，用160mj/cm2的uvb照射，然后再次用spm 1和spm 2处理并培养24小时。此外，收集培养基之后，使用human tnf-αduoset elisa(r&d系统)测量tnf-α的量，并且使用human il-6 duoset elisa(r&d系统)测量il-6
的量。用dpbs洗涤粘附在底部的细胞，用1n的naoh溶解，并且通过bca分析来测量蛋白质的量，以测量每个给定蛋白质合成的tnf-α或il-6的量。在这一点上，通过使用不做处理的情况作为阴性对照组和用10ppm的地塞米松处理的情况作为阳性对照组，来确认两种反应产物spm 1和spm 2的效果。
[0197]
首先，在tnf-α的情况下，如图7中所示，通过照射uvb，tnf-α的表达增加约2倍。这种增加的tnf-α的表达通过用10ppm的地塞米松处理而减少约35％，而通过用1ppm的spm 1处理减少约24％，并且通过用1ppm的spm 2处理减少约56％。tnf-α的表达抑制作用表现出依赖于spm 1和spm2的处理浓度的趋势。
[0198]
接下来，在il-6的情况下，如图8中所示，通过照射uvb，il-6的表达增加约1.6倍。这种增加的il-6的表达通过用10ppm的地塞米松处理而减少约88％，而通过用1ppm的spm 1处理减少约35％，并且通过用1ppm的spm 2处理减少约92％。il-6的表达抑制作用也表现出依赖于spm 1和spm 2的处理浓度的趋势。
[0199]
由以上结果可以理解，通过本发明的蛋白质由dha制备的所有产物均具有终止炎症的作用。
[0200]
[4-3]确认前胶原合成能力的改善效果
[0201]
胶原蛋白是细胞外基质的主要成分，以被称为前胶原的前体的形式合成。已知当聚合反应发生时，前胶原从胶原蛋白分子中断裂和分离。通过测量前胶原的量，可以预计细胞中胶原蛋白生物合成的程度。
[0202]
分别用浓度为0.01ppm、0.1ppm和1ppm的spm 1和spm 2处理人真皮成纤维细胞，并且培养24小时，然后收集培养的细胞培养基，并且使用前胶原i型c-肽(pip)eia试剂盒(takara，mk101)来测量前胶原的量。在这一点上，通过使用不做处理的情况作为阴性对照组和用26.2ppm的棕榈酸视黄酯处理的情况作为阳性对照组，来确认两种反应产物spm 1和spm 2的作用。
[0203]
结果，如图9中所示，确认两种反应产物(spm 1和spm 2)均具有比未进行任何处理的阴性对照组更多的量的前胶原。具体地，在spm 2的情况下，在0.1ppm以上的浓度下，与阳性对照组(26.2ppm的棕榈酸视黄酯)相比，确认更多的量的前胶原。由此可以理解，通过本发明的蛋白质由dha制备的所有产物均改善前胶原的合成能力。
[0204]
[4-4]确认胶原酶(mmp-1)表达抑制能力的改善效果
[0205]
mmps(基质金属蛋白酶)是具有蛋白水解活性的酶，并且通过分解构成细胞外基质的蛋白质，它们对构成细胞外基质的细胞与蛋白质的结合具有重要作用。有28种类型的mmp，其中mmp-1是分解胶原蛋白的酶。在该实施例中，确认细胞中mmp-1的表达水平。
[0206]
培养人真皮成纤维细胞24小时之后，用浓度为250μl/孔的dpbs(welgene)交换培养基，并用100mj/cm2的uvb照射。然后，用dmem(2％的fbs)分别处理spm 1和spm 2以稀释至浓度为0.01ppm、0.1ppm和1ppm，并且培养48小时。收集培养的细胞培养基之后，使用human total mmp-1 elisa试剂盒(r&d systems，dy901)测量mmp-1的量。在这一点上，通过使用不做处理的情况作为阴性对照组和用6ppm的视黄酸处理的情况作为阳性对照组，来确认两种反应产物spm 1和spm 2的作用。
[0207]
结果，如图10中所示，通过照射uvb，mmp-1的表达增加约2倍。这种增加的mmp-1的表达通过用6ppm的视黄酸处理而减少约70％，通过用0.1ppm和1ppm的spm 1处理而分别减
少约17.2％和80.1％，通过用0.01ppm的spm 2处理减少约11.4％，通过用0.1ppm的spm 2处理减少约26.1％，并且通过用1ppm的spm 2处理减少约63.3％。mmp-1的表达抑制作用也表现出依赖于spm 1和spm 2的处理浓度的趋势。
[0208]
[实施例5]
[0209]
spms复合组合物的制备和单一化合物的制备
[0210]
[5-1]17-hdha、消退素d5和保护素dx的复合组合物(以下称为“spms复合组合物”)
[0211]
将具有由seq id no：1表示的氨基酸序列的脂氧合酶加入到不同浓度的二十二碳六烯酸(dha)中，并在ph 7和室温下反应30分钟。通过加入1m的硼氢化钠来还原反应产物，使得最终浓度变为50mm，然后通过加入5μl/ml的乙酸来终止反应。使用固相柱(spe，c18500mg)纯化反应产物之后，使用正相hplc分析反应产物中的化合物的类型。
[0212]
结果可以确认，由dha制备了17s-hdha、消退素d5(7s，17s-dihdha)和保护素dx(10s，17s-dihdha)。由此，制备了复合物1至复合物3，它们是分别以混合状态以如下面表4中所描述的比例存在的spms复合组合物。
[0213]
[表4]
[0214] 复合物1复合物2复合物317s-hdha32584消退素d5475610保护素dx50196
[0215]
[5-2]17-hdha、消退素d5和保护素dx的分离和纯化
[0216]
通过配备有c18柱或二醇柱的制备型hplc，通过分离和纯化来自上面实施例[5-1]的spms复合组合物的各个产物来使用17s-hdha、消退素d5(7s，17s-dihdha)和保护素dx(10s，17s-dihdha)。
[0217]
[实施例6]
[0218]
确认通过spms复合组合物的协同il-6表达抑制作用
[0219]
为了确认spms复合组合物的协同抗炎缓解作用，用作为人角质细胞的hacat细胞处理17-hdha、消退素d5和保护素dx的复合组合物(复合物1至复合物3)和各个spm单一物质，以确认il-6表达的变化。
[0220]
[6-1]实验方法
[0221]
具体地，首先，将人角质细胞以4
×
104个细胞/孔的浓度分装在48孔板中，并在5％的co2、37℃下培养24小时，然后除去培养基，并且用dmem无血清培养基保持饥饿状态24小时。
[0222]
用dmem(fbs 2％)将spms复合组合物稀释至0.5μg/ml、1μg/ml、2μg/ml和5μg/ml，然后如上培养并用去除了培养基的人角质细胞处理1小时。然后，对于il-6表达，用250μl的dpbs(welgene)交换培养基，用160mj/cm2的uvb照射，然后再次用spms处理并培养24小时。此外，收集培养基之后，使用human il-6 duoset elisa(r&d系统)测量il-6的量。用dpbs洗涤粘附在底部的细胞，用1n的naoh溶解，并且通过bca分析来测量蛋白质的量，以测量每个给定蛋白质合成的il-6的量。在这一点上，通过使用在uvb照射之后不做处理的情况作为con(-)和用10μm的氢化可的松处理的情况作为con( )，来确认本发明的spms复合组合物和各个单一成分的il-6表达抑制作用。
[0223]
[6-2]确认spm单一成分的il-6抑制作用
[0224]
结果，如表5和图11a中所示，通过用uvb照射人角质细胞，il-6的表达增加。当分别用2μg/ml的17s-hdha、保护素dx和消退素d5处理时，与con(-)相比，这种增加的il-6的表达分别减少10.8％、11.8％和0.5％，并且表现出依赖于spm的处理浓度的趋势。
[0225]
由此可以理解，17-hdha、保护素dx、消退素d5均具有炎症缓解作用。
[0226]
[表5]
[0227][0228]
[6-3]确认spms复合组合物的il-6抑制作用
[0229]
另外，如表3和图1b中所示，通过用uvb照射spms复合组合物，il-6的表达增加。当用2μg/ml的本发明的spms复合组合物(组合物1、组合物2和组合物3)处理时，与con(-)相比，这种增加的il-6的表达分别减少18％、33.8％和29.5％，并且表现出依赖于spm的处理浓度的趋势。
[0230]
由此，可以理解，本发明的spms复合组合物均具有优异的炎症缓解作用。
[0231]
[表6]
[0232][0233]
[6-4]确认spms复合组合物的协同il-6抑制作用
[0234]
如下面表7和图11c中所示，当用2μg/ml的复合组合物处理时，可以确认，与con(-)相比，组合物1中il-6的表达减少18％，组合物2中减少33.8％，组合物3中减少29.5％。当以相同的浓度的spm单一成分处理时，确认与其相比减少il-6的表达的效果增加。
[0235]
[表7]
[0236][0237]
由此，可以理解，与单一成分相比，本发明的spms复合组合物具有显著增加的炎症缓解作用。此外，上述结果表明，由于17s-hdha、pdx和rvd5的协同作用，当将它们作为复合组合物使用而不是单独使用它们时，用量会减少。由此，可以理解，可以防止当过量使用spm时可能会发生的潜在副作用。
[0238]
[实施例7]
[0239]
确认通过spms复合组合物的协同前胶原合成作用
[0240]
胶原蛋白是细胞外基质的主要成分，以被称为前胶原的前体的形式合成。已知当发生聚合反应时，前胶原从胶原蛋白分子中断裂和分离。通过测量前胶原的量，可以预计细胞中胶原蛋白生物合成的程度。
[0241]
[7-1]实验方法
[0242]
用浓度分别为0.1μg/ml、1μg/ml、2μg/ml和5μg/ml的spm单一材料及其复合组合物
(组合物1至组合物3)处理人真皮成纤维细胞，并且培养24小时，然后收集培养的细胞培养基并且使用前胶原i型c肽(pip)eia试剂盒(takara，mk101)测量前胶原的量。在这一点上，通过使用未做处理的情况作为未处理对照组和用50μm的棕榈酸视黄酯处理的情况作为con( )，来确认spm单一成分及其复合组合物(组合物1至组合物3)的作用。
[0243]
[7-2]确认spm单一成分的前胶原合成作用
[0244]
如下面表8和图12a中所示，确认17-hdha、保护素dx和消退素d5全部具有比未处理对照组更多的量的前胶原。具体地，在保护素dx和消退素d5中，在1μg/ml以上的浓度下，确认比阳性对照组(50μm的棕榈酸视黄酯)更多的量的前胶原。
[0245]
由此，可以理解，17-hdha、保护素dx、消退素d5均改善前胶原的合成能力。
[0246]
[表8]
[0247][0248]
[7-3]确认spms复合组合物的前胶原合成作用
[0249]
另外，在spms复合组合物的情况下，如下面表9和图12b中所示，确认具有不同混合比的所有组合物1至组合物3具有是未处理对照组的2至3倍以上的量的前胶原。具体地，在spms复合组合物中，在0.1μg/ml以上的浓度下，确认在所有组合物1至组合物3中比用50μm的棕榈酸视黄酯处理的con( )更多的量的前胶原。
[0250]
由此，可以理解，本发明的所有spms复合组合物显著改善前胶原合成能力。
[0251]
[表9]
[0252][0253]
[7-4]确认spms复合组合物的协同前胶原合成作用
[0254]
如下面表10和图12c中所示，确认所有spms复合组合物(组合物1、组合物2和组合物3)具有比17-hdha、保护素dx或消退素d5单一成分更多的量的前胶原。
[0255]
[表10]
[0256][0257]
由此，可以理解，与单一成分相比，本发明的spms复合组合物具有显著提高的前胶原合成能力。此外，上述结果表明，由于17s-hdha、pdx和rvd5的协同作用，当将它们作为复合组合物使用而不是单独使用它们时，用量会减少。由此，可以理解，可以防止当过量使用spm时会发生的潜在副作用。
[0258]
[实施例8]
[0259]
确认通过spms复合组合物的胶原酶(mmp-1)表达抑制能力的改善效果
[0260]
mmps(基质金属蛋白酶)是具有蛋白水解活性的酶，并且通过分解构成细胞外基质的蛋白质，它们对构成细胞外基质的细胞与蛋白质的结合具有重要作用。有28种类型的mmp，其中mmp-1是分解胶原蛋白的酶。在该实施例中，确认细胞中mmp-1的表达水平。
[0261]
具体地，培养人真皮成纤维细胞24小时之后，用浓度为250μl/孔的dpbs(welgene)交换培养基，并用100mj/cm2的uvb照射。然后，用dmem(2％的fbs)处理组合物2以分别稀释至浓度为0.1ppm、1ppm、2ppm和5ppm，并且培养48小时。收集培养的细胞培养基之后，使用human total mmp-1 elisa试剂盒(r&d systems，dy901)测量mmp-1的量。在这一点上，通过使用不做处理的情况作为阴性对照组和用20μm的视黄酸处理的情况作为阳性对照组，来确
认组合物2的作用。
[0262]
结果，如图13中所示，通过照射uvb，mmp-1的表达增加约2倍。这种增加的mmp-1的表达通过用20μm的视黄酸处理而减少约70％，通过用0.01ppm处理减少约11.4％，通过用0.1ppm处理减少约26.1％，通过用1ppm的spms复合组合物处理减少约63.3％。mmp-1的表达抑制作用也表现出依赖于spms复合组合物的处理浓度的趋势。
[0263]
由此，可以理解，本发明的spms复合组合物具有优异的缓解皮肤皱纹的作用。
[0264]
[实施例9]
[0265]
确认通过spms复合组合物的tnf-α表达抑制能力的改善效果
[0266]
tnf-α作为代表性的炎性细胞因子，已知当其表达量增加时加重炎症性皮肤病。tnf-α是一种肿瘤坏死因子，是在许多炎症应答中起到最核心作用的重要因素，并且tnf-α表达的调节在炎症性疾病中起到重要作用。因此，为了确认本发明的spms复合组合物的炎症缓解作用，确认tnf-α的表达模式。
[0267]
具体地，将人角质细胞以4
×
104个细胞/孔的浓度分装在48孔板中，并在5％的co2和37℃下培养24小时，然后除去培养基，并且用dmem无血清培养基保持饥饿状态24小时。
[0268]
用dmem(2％的fbs)将组合物2稀释至0.5μg/ml、1μg/ml、2μg/ml和5μg/ml，然后如上培养并用去除了培养基的人角质细胞处理1小时。然后，对于tnf-α表达，用250μl的dpbs(welgene)交换培养基，用160mj/cm2的uvb照射，然后再次用spms处理并培养24小时。此外，收集培养基之后，使用human tnf-αduoset elisa(r&d系统)分别测量tnf-α的量。用dpbs洗涤粘附在底部的细胞，用1n的naoh溶解，并且通过bca分析来测量蛋白质的量，以测量每个给定蛋白质合成的tnf-α的量。在这一点上，通过使用不做处理的情况作为阴性对照组和用10μm的氢化可的松处理的情况作为阳性对照组，来确认spms复合组合物的作用。
[0269]
结果，在tnf-α的情况下，如图14中所示，通过照射uvb，tnf-α的表达增加约5倍。这种增加的tnf-α的表达通过用10μm的氢化可的松处理而减少约52％，通过用1ppm的spms复合组合物处理而减少约49％。tnf-α的表达抑制作用表现出依赖于spms复合组合物的处理浓度的趋势。
[0270]
由此，可以理解，本发明的spms复合组合物具有优异的终止炎症的作用。
[0271]
[实施例10]
[0272]
确认通过spms复合组合物的n0产生减少能力的改善效果
[0273]
一氧化氮(no)是一种类型的已知在诱导炎症中起到重要作用的活性氧，是一种高反应活性的生物分子。no是参与炎症应答的关键分子，是一种炎症介质并且加速炎症应答，进一步恶化炎症应答。因此，关于由细粉尘引起的刺激，确认no的产生量。
[0274]
具体地，使用griess reagent system测量由细胞产生的no的量，以测量存在于细胞培养基中的亚硝酸盐浓度，并且使用对于亚硝酸钠的各个浓度的标准曲线确定培养基中的no浓度。
[0275]
结果，如图15中所示，可以确认，在用0.1ppm至5ppm的spms复合组合物处理的细胞中，no的产生减少39.2％至70％。
[0276]
由此，可以理解，本发明的spms复合组合物具有缓解炎症的作用。
[0277]
[实施例11]
[0278]
确认通过spms复合组合物的脂质过氧化物产生的减少能力的改善效果
[0279]
细胞的脂质过氧化是动植物在衰老或疾病状态下发生细胞损伤的机制之一，并且细胞损伤的程度可以通过测量作为脂质过氧化产物的全部丙二醛(mda)来确定。因此，对于由细粉尘引起的刺激，确认通过spms复合组合物的mda产生。
[0280]
具体地，将作为脂质过氧化产物的全部丙二醛(mda)的量与硫代巴比妥酸(tba)反应，并且通过tbars法测量mda-tba加合物。
[0281]
结果，如图16中所示，可以确认，在用0.1ppm至5ppm的spms复合组合物处理的细胞中，mda产生减少19.1％至62.7％。
[0282]
由此，可以理解，本发明的spms复合组合物具有抑制皮肤老化的作用。
[0283]
[实施例12]
[0284]
确认通过spms复合组合物的皮肤屏障改善能力的改善效果
[0285]
已知丝聚蛋白、兜甲蛋白和外皮蛋白是构成皮肤屏障的核心蛋白。其中，丝聚蛋白是由丝聚蛋白原的分解产生的蛋白质，其构成表皮的颗粒细胞中存在的透明角质颗粒(kg)，并且通过聚集角质细胞中的角蛋白丝而在皮肤屏障中起到重要作用。因此，尝试通过样品确认丝聚蛋白和兜甲蛋白的表达来确认皮肤屏障增强作用。
[0286]
在与实施例9中相同的条件下在dmem培养基中培养人角质细胞。为了确认与皮肤屏障改善能力有关的基因表达，用根据浓度的本发明的spms复合组合物处理培养的细胞并培养，然后提取rna并进行rt-pcr。使用gel文档系统和image j程序分析扩增的基因。
[0287]
结果，如图17a和图17b中所示，当用50ppm的透明质酸，即阳性对照组处理时，丝聚蛋白的表达增加52.6％，并且兜甲蛋白的表达增加97.7％。可以确认，当用0.1ppm至5ppm的本发明的spms复合组合物处理时，丝聚蛋白增加31.3％至52.8％，兜甲蛋白增加31.8％至88.5％。
[0288]
由此，可以理解，本发明的spms复合组合物具有增强皮肤屏障的作用。
[0289]
[实施例13]
[0290]
使用spms霜的人体功效评价
[0291]
使用spms复合组合物以下面表11中所示的组成制备霜(霜s)。对于比较实验，神经酰胺霜(霜c)和基础霜(霜b)也以下面组成制备。
[0292]
[表11]
[0293] 霜s霜c霜bspms复合组合物2.00
‑‑
神经酰胺ac45-1.00-甘油5.005.005.001，2-己二醇2.002.002.00油适量适量适量防腐剂适量适量适量纯净水适量适量适量
[0294]
(单位：重量份)
[0295]
[13-1]确认通过spms霜的皮肤屏障改善功效
[0296]
对12名女性(平均年龄为45
±
5.54岁)进行皮肤屏障改善的人体功效评价。使用前臂作为试验部位，并将物理损伤分为3个试验部位和对照部位(未应用)，并应用于4个部位。
然后，将霜s(spm霜)、霜c(神经酰胺霜)和霜b(基础霜)在每个指定部位上每天使用两次并持续1周，并且与对照部位(未应用)相比进行设备测量。在皮肤损伤前、皮肤损伤后立即、使用实验产品1天后、4天后和7天后进行测量和功效问卷评价。通过使用tewameter tm300测量tewl(经表皮水分流失)来确认皮肤屏障改善效果。
[0297]
结果，如图18a中所示，与基础霜相比，最广泛用作皮肤屏障改善材料的神经酰胺霜没有显著改善，而与未应用组和基础霜相比，spm霜具有统计学上显著的皮肤屏障改善效果(使用两组假设方差相等的双尾检验，t检验；使用4天后p＜0.034，使用7天后p＜0.027)。此外，作为比较皮肤屏障恢复率(％)的结果，可以确认，与基础霜和神经酰胺霜相比，spm霜具有相对优势，如图18b中所示(wilcoxon符号秩检验；*p≤0.05，**p≤0.01，***p≤0.001)。
[0298]
[13-2]确认通过spms霜的特应性皮炎改善功效
[0299]
对22名受试者进行缓解由干燥引起的瘙痒的人体功效评价。测量皮肤水分之后，通过匹配各组之间的平均值，将11人随机分配各个实验产品霜s和霜c中，让他们使用各个产品。使用前臂和干燥病变部位为试验部位，并且在产品使用前、产品使用2周后和产品使用4周后进行设备测量和功效问卷评价。
[0300]
通过使用comeometer cm825测量皮肤水分、使用tewameter tm300测量皮肤水分流失、并且评价瘙痒改善(vas)，来确认特应性皮炎的改善效果。
[0301]
确认皮肤保湿效果
[0302]
如图19a中所示，可以确认，与产品使用前相比，用于缓解特应性皮炎的干燥症状而最广泛使用的神经酰胺霜表现出增加的皮肤水分含量，但是没有统计显著性，而spm霜在病变部位的皮肤水分方面表现出统计学上显著的改善功效(使用2周、4周；＜0.014，p＜0.0115)。
[0303]
确认损伤部位的皮肤屏障改善效果
[0304]
如图19b中所示，同样在经皮水分流失量的变化率方面，与产品使用前相比，神经酰胺霜表现出减少的经皮水分流失，但是没有统计显著性，而spm霜在损伤部位的经皮水分流失方面表现出统计学上显著的改善功效(使用4周；p＜0.01451)。
[0305]
确认瘙痒缓解效果
[0306]
如图19c中所示，在瘙痒缓解效果方面，可以确认，在使用spm霜和神经酰胺霜2周和4周后，瘙痒指数在统计学上显著改善。
[0307]
由此，可以理解，本发明的spm霜表现出与神经酰胺相同水平或更高的皮肤保湿、改善皮肤屏障和缓解瘙痒的效果，神经酰胺通常用作用于缓解皮肤瘙痒和干痒、防止由诸如特应性皮炎的干皮病引起的水分流失和用于改善皮肤屏障的功能性材料。
[0308]
[13-3]确认通过spms霜的缓解眼部皱纹和改善皮肤水分的作用
[0309]
对20名选择的试验对象进行霜a和霜s缓解眼部皱纹和改善皮肤水分的人体功效评价。使用眼部区域作为试验部位，并且分别指示10名受试者使用霜a，其余10名受试者使用霜s，每天两次，持续8周。在使用实验产品前、使用4周后和使用8周后，通过对试验对象进行设备测量来确认缓解皱纹和改善皮肤水分的效果。
[0310]
具体地，使用antera 3d cs测量眼部皱纹，使用comeometer测量皮肤水分。
[0311]
确认缓解眼部皱纹的作用
[0312]
如图20a中所示，可以确认，与产品使用前相比，使用包含作为用于皱纹缓解的功能性关注成分的视黄醇的霜a的皮肤皱纹缓解率(％)没有统计显著性，而与使用4周前和8周前相比，spm霜表现出显著的皮肤皱纹缓解率(％)(t检验(两组假设方差相等，双尾检验)；*，p≤0.05)；**，p≤0.01；***，p≤0.001)。
[0313]
确认眼部保湿作用
[0314]
如图20b和图20c中所示，在使用spm霜和视黄醇霜8周时，眼周皮肤中的水分表现出统计学上显著的增加，而spm霜与视黄醇霜之间没有统计学上的显著差异。
[0315]
由此，可以理解，本发明的spm霜表现出与用于皱纹缓解的认可材料视黄醇相同水平的或更高水平的增加眼周皮肤的水分量和缓解眼周的皮肤皱纹的效果。
[0316]
如上所述，虽然已经示例性地描述了本发明的优选实施例，但是本发明的范围不仅限于上述具体的实施例，并且本领域技术人员能够在本发明所附权利要求书的范围内适当地修改本发明。