膀胱癌诊断用尿液miRNA标志物、诊断试剂及试剂盒的制作方法

膀胱癌诊断用尿液mirna标志物、诊断试剂及试剂盒
技术领域
1.本发明涉及分子诊断技术领域，特别涉及一种膀胱癌诊断用尿液mirna标志物、诊断试剂及试剂盒。


背景技术：

2.膀胱癌(bladder cancer，bc)是起源于膀胱尿路上皮的恶性肿瘤，是泌尿系统最常见的恶性肿瘤之一,占我国泌尿生殖系肿瘤发病率的第一位。全球范围内膀胱癌发病情况：发病率位居所有恶性肿瘤第11位，膀胱癌发病存在地区性、种族性及性别的差异，可见于各年龄段，高发年龄50～70岁，且随着年龄增加，发病率也逐渐增加。
3.bc具有早期发现生存率高，高复发率需要频繁和长时间的监测的特点。虽然现在存在如手术，放疗，化疗等治疗方法，但由于晚期诊断和迅速转移，预后和5年生存率极为差。虽然诸如手术，放疗，化学疗法和治疗方法显着提高的膀胱癌患者的生活质量，但是早期诊断是提高存活率的关键。
4.目前，膀胱镜检和活检被认为是bc筛查诊断的金标准，但它们具有价格昂贵的特点，且有可能引起泌尿男生殖系统感染、尿道及膀胱出血、尿道损伤和尿道狭窄等并发症，且对低级别的肿瘤具有较低的检测敏感性。针对尿液或膀胱冲洗标本的尿细胞学检查是膀胱癌诊断和术后随诊的主要方法之一，该检测方式虽然是非侵入性的，但其在早期bc诊断上具有极低的敏感性。许多基于尿液的标志物如：核基质蛋白22(nuclear matrix protein 22，nmp22)，膀胱肿瘤抗原(bladder tumor antigen，bta)和细胞角蛋白在过去几十年中持续发展，但没一个是理想的、可用于大规模癌症筛选的标志物。因此，迫切需要开发可用于早期阶段bc诊断、监测、具有高灵敏度和特异性的筛查标志物。
5.多项研究表明，尿液中含有许多不同种类的rna，包括mrna、微小rna(mirna)和其他非编码蛋白(nc)rna。由于与血液相比更易于检测，尿液是用于泌尿系统癌症筛查的特别有吸引力的生物标志物来源，并且可以在较早阶段捕获疾病。
6.mirna是长度为18-25个核苷酸的短非编码rna，可以通过特定目标mrna的分解或通过抑制其翻译来阻止蛋白质表达，参与调控个体发育、细胞凋亡、增殖及分化等生命活动，在肿瘤的发生和发展过程中发挥着类似于致癌基因或抑癌基因的功能。mirna的表达谱具有明显的组织特异性，在不同肿瘤中具有特定的表达模式。这些特点都使得mirna有可能成为肿瘤诊断新的生物学标记和治疗靶标。
7.尽管现有的研究报道了一些泌尿系统癌证早期诊断用的mirna标志物，但这些标志物或多或少都有检测的局限性，最终能用于膀胱癌筛查的尿液mirna生物标志物以及生物标志物组合标志物还未见定论，急需开发新的适合于膀胱癌诊断用尿液mirna标志物。


技术实现要素：

8.本发明的目的在于提供一种膀胱癌诊断用尿液mirna标志物、诊断试剂及试剂盒，相对国际上报道的其它mirna标志物，具备有更高的人群特异性；所公开的mirna诊断标志
mir-18a-3p；b)比较被检测样本中与参考样本中hsa-mir-143-3p，hsa-mir-183-5p，hsa-mir-21-3p，hsa-mir-219a-5p，hsa-mir-1-3p，hsa-mir-18a-3p的表达水平；其中，被检测样本中上述mirna的任一种的表达水平与参考样本中相应mirna的表达水平相比出现显著变化，表明该个体可能患有膀胱癌。
22.具体来讲，被检测膀胱癌中任意一种mirna的表达水平比参考样本中mirna的表达水平发生显著变化时，样本提供者可能患有膀胱癌。在较佳的实施方案中，被检测尿液样本中任意16种mirna的表达水平比参考样本中mirna的表达水平发生显著变化时，样本提供者可能患有膀胱癌。在更佳的实施方案中，被检测尿液样本中6种mirna的表达水平比参考样本中mirna的表达水平发生显著变化时，样本提供者可能患有膀胱癌。
23.本发明中，参考样本来自健康人源尿液样本。
24.另一方面，本发明还提供了一种检测膀胱癌microrna的方法。具体地说，该方法包括逆转录和实时荧光定量聚合酶链式反应(rt-qpcr)。更具体地，在实时荧光定量聚合酶链式反应中，使用的引物组合为hsa-mir-143-3p，hsa-mir-183-5p，hsa-mir-21-3p，hsa-mir-219a-5p，hsa-mir-1-3p，hsa-mir-18a-3p检测的逆转录引物和pcr引物组合。
25.可以根据相关mirna的序列，对本发明的引物序列做出适当调整和修改，这些经过修改的引物序列仍可以用于检测所述mirna标志物。本发明也包括这些等同的技术方案。
26.本发明使用rt-qpcr方法，相较于基于数百个分子的芯片，具备更可靠的临床可行性和实用性，而且成本低，更易于推广。另外，对于上述mirna的检测方法，不限于本发明提供的rt-qpcr法，其他方法例如测序法，微阵列，rna印迹，生物发光和探针法等也可用于检测所述的mirna标志物。
27.申请人在研究中发现任意1种可以用于诊断膀胱癌的mirna标志物，任意2种-5种可以用于诊断膀胱癌的mirna标志物组合，利用上述标志物，膀胱癌可以被可靠地鉴定。
28.本发明公开了hsa-mir-143-3p，hsa-mir-183-5p，hsa-mir-21-3p，hsa-mir-219a-5p，hsa-mir-1-3p，hsa-mir-18a-3p在内的膀胱癌诊断标志物；hsa-mir-143-3p，hsa-mir-183-5p，hsa-mir-21-3p，hsa-mir-219a-5p，hsa-mir-1-3p，hsa-mir-18a-3p有多重核酸分子组成，每种核酸分子编码至少一个mirna序列。具体序列信息如下表1所示。
29.本发明公开的所有mirna序列均已经储存在mirbase数据库中(http://www.mirbase.org/)。
30.表1
31.本发明公开了1种膀胱癌诊断标志物组合，包含编码hsa-mir-143-3p，hsa-mir-183-5p，hsa-mir-21-3p，hsa-mir-219a-5p，hsa-mir-1-3p，hsa-mir-18a-3p多种核酸分子。编码hsa-mir-143-3p，hsa-mir-183-5p，hsa-mir-21-3p，hsa-mir-219a-5p，hsa-mir-1-3p，hsa-mir-18a-3p的任何一个或任何两个或任何三个或任何四个或任何五个或任何六个核酸分子在诊断为膀胱癌患者的尿液中的表达比对对照中的表达相比发生显著变化。在膀胱癌诊断最优的实施方案中，所述的多个核酸分子包括hsa-mir-143-3p，hsa-mir-183-5p，hsa-mir-21-3p，hsa-mir-219a-5p，hsa-mir-1-3p，hsa-mir-18a-3p的6个核酸分子组合。
32.实施例1：验证队列验证用于膀胱癌诊断的16个mirna组合一：膀胱癌诊断标志物组合研发队列尿液样本要求，采集和抽提膀胱癌诊断标志物研究中使用了2组样本，分别为病例组合对照组，病例组包含29例膀胱癌样本，对照组为88例健康人尿液样本，发现和验证了用于检测早期膀胱癌的生物标记物和生物标记物组合。研发队列中的膀胱癌病例和健康样本均来浙江大学医学院附属第二医院。
33.二：逆转录-实时荧光pcr操作过程及结果按照zymo血清血浆cfdna快速抽提试剂盒操作步骤进行抽提；抽提完成后，利用mirxe反转录试剂盒操作步骤进行反转录，反转录完成后qpcr扩增进行质检。
34.质检完成后进行样本qpcr扩增，检测312mirna的表达量，癌症和健康对照中全部312个mirna的表达没有存在明显的分级，进一步研究发现了用于膀胱癌检测的单个mirna生物标记物，校正之后发现16个mirnas的p值小于0.05，其中在膀胱癌受试者中上调了13个，下调了3个。在研发队列中提取这16个mirna绘制heatmap热图，观察到癌症和对照受试者之间存在mirna表达量的显著差异，如图1所示。
35.三：验证队列验证上述16个mirna病例-对照队列采用交叉验证(leave-one-out cross-validation)的方法检测这16种尿液mirna生物标志物。验证队列样本为117个样本，诊断效能auc＝0.732，如图2-a所示。
36.实施例2：验证队列验证用于膀胱癌诊断的最优6个mirna组合研发队列尿液样本要求，采集和抽提，逆转录-实时荧光pcr操作过程及结果和实施例1中描述相同，基于前面筛选出的16个mirna，分别使用lasso、stepwise以及穷举法等算法进行mirna组合的优化，最终确定了最优的6个mirna组合，又使用交叉验证(leave-one-out cross-validation)的方法验证hsa-mir-143-3p，hsa-mir-183-5p，hsa-mir-21-3p，hsa-mir-219a-5p，hsa-mir-1-3p，hsa-mir-18a-3p在内的6种尿液生物标志物组合(最优组合)。验证队列样本为117个样本，6个mirna组合在验证队列中的诊断效能auc＝0.857，如图2-b所示。模型判读的结果如图3所示，可以看到癌症患者的模型输出概率显著高于对照受试者，说明模型可以较好地对癌症患者和对照受试者进行预测分类。
37.基于上述对比确认6个mirna组合为诊断膀胱癌的最优组合。
38.本发明建立了一个完整的工作流程，用于发现和验证尿液mirna生物标志物组合，及成功确定了用于检测膀胱癌的生物标志物及生物标志物组合。
39.以上所述的实施例只是本发明的一种较佳的方案，并非对本发明作任何形式上的限制，在不超出权利要求所记载的技术方案的前提下还有其它的变体及改型。