一种库德里阿兹威毕赤酵母三羧酸转运蛋白及其编码基因与应用

1.本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种库德里阿兹威毕赤酵母三羧酸转运蛋白及其编码基因与应用。


背景技术：

2.山葡萄又名蘡薁，药用名为木龙，是一种生长在山上的野生作物，在我国主要分布于吉林、辽宁、黑龙江、河北、河南、陕西、广西、云南等省，以野生山葡萄为原料经发酵而制成的山葡萄饮料酒是我国独有的葡萄酒种(方志，2003)。山葡萄酒营养丰富，富含有碳水化合物、蛋白质、各种矿物质、维生素和具有防治心血管疾病功能的花青素、白藜芦醇、黄酮类等高效生物活性物质，所以山葡萄酒因其独特的风味和较高的营养价值而引起了广泛的关注(张文英等，2000)。
3.山葡萄有三大特点：一是糖度低，二是酸度高，是酿酒葡萄酸度规定值的3至5倍，三是营养成分高，其多酚、单宁、花青素、白藜芦醇等物质含量均高于普通酿酒葡萄。所以山葡萄酒相对于普通葡萄酒的劣势是酸度过高而引起的适口性差，难以提高本身的档次，因此山葡萄酒降酸成为近年来行业研究的热点(丁玉萍等，2018)。目前葡萄酒降酸主要有以下三种方法：化学降酸法、物理降酸法和生物降酸法。山葡萄酒中的主要有机酸成分是酒石酸、苹果酸、琥珀酸、乳酸、乙酸、柠檬酸等。酒石酸可以通过物理降酸法和化学降酸法去除。乳酸、乙酸、琥珀酸在葡萄酒发酵过程中产生，可以通过控制发酵的条件(温度、初始糖浓度等)减少它们的含量。而苹果酸和柠檬酸需要后期利用生物降酸法二次发酵去除，但是山葡萄酒的ph在2.90左右，一般的乳酸细菌和裂殖酵母在此低ph条件下不能发挥其降酸能力(张勤等，2011；庞敏等，2019)。
4.库德里阿兹威毕赤酵母具有降解苹果酸和柠檬酸的能力，2013年，bioamber公司鉴定出了库德里阿兹威毕赤酵母的二羧酸转运蛋白(finley k r et.al.,2013)，但是至今未见有关库德里阿兹威毕赤酵母三羧酸转运蛋白的报道。为了更好地利用其降解柠檬酸的能力，需要进一步明确库德里阿兹威毕赤酵母三羧酸转运蛋白。


技术实现要素：

5.本发明所要解决的技术问题是如何调控酵母降解柠檬酸的能力。
6.为了解决上述技术问题，本发明提供了一种来源于酵母且与柠檬酸降解能力有关的蛋白，其名称为pk_jen2，是如下a1)或a2)或a3)：
7.a1)由序列表中seq id no:1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
8.a2)来源于酵母与a1)所示的蛋白质具有90％以上的同一性且与功能相同的蛋白质；
9.a3)在a1)或a2)的n末端或/和c末端连接蛋白标签得到的融合蛋白质。
10.其中，序列表seq id no:1所示的蛋白质由523个氨基酸残基组成。
11.上述蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。
12.上述蛋白质中，所述蛋白标签(protein-tag)是指利用dna体外重组技术，与目的蛋白一起融合表达的一种多肽或者蛋白，以便于目的蛋白的表达、检测、示踪和/或纯化。所述蛋白标签可为flag标签、his标签、mbp标签、ha标签、myc标签、gst标签和/或sumo标签等。
13.上述蛋白质中，同一性是指氨基酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定氨基酸序列的同一性，如ncbi主页网站的blast网页。例如，可在高级blast2.1中，通过使用blastp作为程序，将expect值设置为10，将所有filter设置为off，使用blosum62作为matrix，将gap existence cost，per residue gap cost和lambda ratio分别设置为11，1和0.85(缺省值)并进行检索一对氨基酸序列的同一性进行计算，然后即可获得同一性的值(％)。
14.上述蛋白质中，所述90％以上的同一性可为至少91％、92％、95％、96％、98％、99％或100％的同一性。
15.与蛋白pk_jen2相关的生物材料也属于本发明保护的范围。本发明所提供的与pk_jen2相关生物材料为下述b1)至b6)中的任一种：
16.b1)编码a1)或a2)或a3)所述蛋白质的核酸分子；
17.b2)含有b1)所述核酸分子的表达盒；
18.b3)含有b1)所述核酸分子的重组载体、或含有b2)所述表达盒的重组载体；
19.b4)含有b1)所述核酸分子的重组微生物、或含有b2)所述表达盒的重组微生物、或含有b3)所述重组载体的重组微生物。
20.b5)降低a1)或a2)或a3)所述蛋白质表达的核酸分子；
21.b6)含有b5)所述核酸分子的表达盒、重组载体或重组微生物。
22.其中，所述核酸分子可以是dna，如cdna、基因组dna或重组dna；所述核酸分子也可以是rna，如mrna或hnrna等。
23.上述生物材料中，b1)所述核酸分子具体可为b1)或b2)：
24.b1)序列表中seq id no:2所示dna分子；
25.b2)序列表中seq id no:6第2180-5097位核苷酸组成的dna分子。
26.其中，序列表seq id no:2所示的dna分子由1572个核苷酸组成，其编码序列表中seq id no:1所示的蛋白质。序列表seq id no:6中，第2180-3044位为pk_tdh3启动子序列，第3045-4616位为pk_jen2编码基因序列，第4617-5097位为pk_gal2终止子序列。
27.上述生物材料中，b2)所述表达盒，是指能够在宿主细胞中表达上述蛋白质的dna，该dna不但可包括启动所述蛋白质编码基因转录的启动子，还可包括终止所述蛋白质编码基因转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。
28.上述生物材料中，b5)所述核酸分子可为敲除pk_jen2编码基因的核酸分子，如序列表seq id no:5所示。
29.其中，序列表中seq id no:5由1119个核苷酸组成。序列表seq id no:5中，第1-623位为pk_jen2基因的上游同源臂的核苷酸序列，第624-1119位为pk_jen2基因的下游同源臂的核苷酸序列。
30.上述生物材料中，含有b6)所述核酸分子的重组微生物可为将能敲除所述蛋白质的编码基因的核酸分子导入酵母中得到的重组酵母，所述重组酵母不含所述蛋白质的编码
基因；如将序列表中序列5所示的dna分子导入酵母(trichoderma hypoxylon)得到的重组酵母，所述重组酵母不含所述蛋白质的编码基因。该重组酵母在本发明的一个实施例中为库德里阿兹威毕赤酵母三羧酸转运蛋白缺陷菌株cy902δura3δjen2。
31.上述生物材料中，所述重组微生物为酵母。
32.为了解决上述技术问题，本发明还提供了蛋白质pk_jen2或其生物相关材料在调控酵母降解柠檬酸能力中的应用。
33.上述应用中，所述调控酵母降解柠檬酸能力为提高酵母降解柠檬酸的能力或降低酵母降解柠檬酸的能力。
34.为了解决上述技术问题，本发明还提供蛋白pk_jen2或其生物相关材料在制备降解柠檬酸能力提高的转基因酵母中的应用。
35.为了解决上述技术问题，本发明还提供一种提高酵母降解柠檬酸能力的方法，包括如下步骤：在出发酵母菌中表达蛋白质pk_jen2的编码基因，从而提高出发酵母菌降解柠檬酸的能力。
36.为了解决上述技术问题，本发明还提供一种降低酵母降解柠檬酸能力的方法，包括如下步骤：在出发酵母菌中敲除蛋白质pk_jen2的编码基因，从而降低出发酵母菌降解柠檬酸的能力。
37.上述方法中，所述敲除蛋白质pk_jen2的编码基因可采用现有技术中的任何方式，以使基因产生缺失突变、插入突变或碱基变换突变，进而使基因的功能丧失。
38.本发明的具体实施例中采用了crispr/cas9技术敲除蛋白质pk_jen2的编码基因，其中涉及的靶序列为catttgttgaatccattgcc，所使用的sgrna(向导rna)的编码基因如序列表中seq id no.4的第1999-2094位所示。
39.进一步具体的，本发明中将能表达向导rna和cas9的重组载体pcas9-jen2grna和dna片段δpk_jen2(seq id no.5所示)导入酵母中，实现对蛋白质pk_jen2的编码基因的敲除。所述重组载体pcas9-jen2grna为利用无缝克隆技术将包含缺陷型筛选标记的dna片段、包含cas9编码基因的dna片段与包含特异sgrna序列和trna
gly
启动子的线性载体连接所得，其核苷酸序列如序列表seq id no.4所示。上述方法适用于任何酵母，只要含有上述靶序列即可。本发明列举的例子是库德里阿兹威毕赤酵母cy902尿嘧啶缺陷菌株cy902δura3。
40.为了解决上述技术问题，本发明还提供一种降低葡萄酒中酸含量的方法，包括如下步骤：1)在出发酵母菌中表达蛋白质pk_jen2的编码基因，得到转基因酵母；2)利用所述转基因酵母发酵葡萄酒，从而使葡萄酒中酸的含量降低。
41.上述方法中，所述葡萄酒为山葡萄酒；所述山葡萄酒为由山葡萄制备获得。
42.上述方法中，所述降低葡萄酒中酸含量为降低葡萄酒中柠檬酸的含量。
43.为了解决上述技术问题，本发明还提供氨基酸序列为序列表中seq id no:1所示的蛋白质在作为三羧酸转运蛋白中的应用。
44.本发明中，所述酵母为毕赤酵母；所述毕赤酵母为库德里阿兹威毕赤酵母；所述库德里阿兹威毕赤酵母为库德里阿兹威毕赤酵母cy902，菌种保藏编号为cgmcc20885。具体地，酵母可为库德里阿兹威毕赤酵母cy902尿嘧啶缺陷菌株cy902δura3或库德里阿兹威毕赤酵母三羧酸转运蛋白缺陷菌株cy902δura3δjen2。
45.本发明构建了适用于库德里阿兹威毕赤酵母crispr-cas9的编辑系统，并以此技
术对库德里阿兹威毕赤酵母进行改造，鉴定出了库德里阿兹威毕赤酵母的三羧酸转运蛋白pk_jen2。并通过实验证明，pk_jen2编码基因能够调控库德里阿兹威毕赤酵母降解柠檬酸的能力。由此可知，本发明对降解葡萄酒中的柠檬酸，改善葡萄酒的品质具有重要的意义。
附图说明
46.图1为液相色谱检测库德里阿兹威毕赤酵母菌株cy902δura3、cy902δura3δjen2和cy902δura3δjen2::jen2摇瓶中柠檬酸的结果；其中，a为2.544g/l柠檬酸标品的液相色谱图，b为液相色谱检测30g/l柠檬酸培养基中柠檬酸的结果(稀释10倍)，c为液相色谱检测菌株cy902δura3摇瓶中柠檬酸的结果(稀释10倍)，d为液相色谱检测菌株cy902δura3δjen2摇瓶中柠檬酸的结果(稀释10倍)，e为液相色谱检测菌株cy902δura3δjen2::jen2摇瓶中柠檬酸的结果(稀释10倍)。
47.图2为库德里阿兹威毕赤酵母菌株cy902δura3、cy902δura3δjen2与cy902δura3δjen2::jen2降解柠檬酸能力的对比图。
具体实施方式
48.下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
49.下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
50.下述实施例中的库德里阿兹威毕赤酵母cy902为本技术发明人前期选育的一株在ph 2.0生长良好，并能分别以苹果酸、柠檬酸作为唯一碳源生长的库德里阿兹威毕赤酵母。已于2020年10月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称cgmcc，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，其保藏编号为cgmcc no.20885，分类命名为pichia kudriavzevii；其its序列如序列表中序列7所示。
51.ypd固体培养基：蛋白胨20g，酵母提取物10g，葡萄糖20g，琼脂15g，用去离子水定容至1l，121℃灭菌15分钟得到的固体培养基。
52.ypd液体培养基：蛋白胨20g，酵母提取物10g，葡萄糖20g，用去离子水定容至1l，121℃灭菌15分钟得到的液体培养基。
53.库德里阿兹威毕赤酵母cy902中，蛋白pk_jen2编码基因的核苷酸序列如序列表的序列2所示，蛋白pk_jen2的氨基酸序列如序列表序列1所示。
54.实施例1、库德里阿兹威毕赤酵母三羧酸转运蛋白缺陷菌株cy902δura3δjen2的构建
55.一、库德里阿兹威毕赤酵母cy902尿嘧啶缺陷菌株cy902δura3的构建
56.1、库德里阿兹威毕赤酵母cy902基因组dna的提取
57.首先将库德里阿兹威毕赤酵母cy902(简称cy902)在ypd固体培养基平板上培养24h，挑取单克隆接入50ml ypd液体培养基中，在250rpm和30℃条件下培养12小时至对数生
长期，随后将过夜的菌液5000r/min离心5min，收集的菌体用于提取cy902基因组dna。
58.基因组dna提取方法：
59.①
离心获取的细胞用液氮研磨成粉末，将约500μl研磨粉末加入预先装有800μl ctab溶液的2ml离心管，颠倒摇匀。
60.②
加入400μl tris饱和酚和400μl氯仿：异戊醇(24:1)混合液，剧烈震荡成乳状。12000r/min 4℃冷冻离心15min，收集上清。
61.③
上清液中加入等体积的tris饱和酚：氯仿：异戊醇(25:24:1)，充分混匀，12000r/min4℃冷冻离心15min，收集上清。重复此步骤一次。
62.④
加入等体积的氯仿：异戊醇(24:1)萃取上清中残留的酚，充分混匀，12000r/min 4℃冷冻离心15min，收上清导入1.5ml ep管中。
63.⑤
上清液中加1/10体积的3mol/l的naoac(ph 5.2)；加入2.5倍体积的预冷无水乙醇，-20℃静置1h(或-80℃静置30min)。
64.⑥
12000r/min 4℃冷冻离心15min，去上清，加入500μl预冷70％乙醇洗涤沉淀，12000r/min 4℃冷冻离心7min，去上清。
65.⑦
通风橱中吹干残留乙醇，加入30μl ddh2o溶解dna，加1-2μl rnaes a(10mg/ml)，37℃水浴消化rna 1h；1％琼脂糖电泳检测基因组dna。-20℃保存备用。
66.2、构建敲除ura3的dna片段
67.用引物pk_ura3-up-f和pk_ura3-up-r(见表1)与引物pk_ura3-dn-f和pk_ura3-dn-r(见表1)分别对cy902基因组dna进行pcr扩增，扩增得到pk_ura3基因上游长度为1000bp的dna片段，将其命名为pk_ura3up；扩增得到pk_ura3基因下游长度为801bp的dna片段，将其命名为pk_ura3dn。
68.扩增体系为takarahs dna聚合酶5
×
buffer 10μl，dntp mix 4μl，引物各1μl，基因组dna模板0.5μl，primerstar hs聚合酶(2.5u/μl)0.5μl，补加蒸馏水至总体积50μl。
69.扩增条件为98℃预变性2min(1个循环)；98℃变性10s、56℃退火15s、72℃延伸1min(30个循环)；72℃延伸8min(1个循环)。
70.利用上海生工生物工程有限公司的pcr产物纯化试剂盒对片段pk_ura3up和pk_ura3dn。以纯化后的片段pk_ura3up和pk_ura3dn为模板，用引物pk_ura3-up-f和pk_ura3-dn-r通过overlap pcr进行pcr扩增。
71.扩增体系为takarahs dna聚合酶5
×
buffer 10μl，dntp mix 4μl，引物各1μl，pk_ura3up和pk_ura3dn模板各0.5μl，primerstar hs聚合酶(2.5u/μl)0.5μl，补加蒸馏水至总体积50μl。
72.扩增条件为98℃预变性2min(1个循环)；98℃变性10s、56℃退火15s、72℃延伸2min(30个循环)；72℃延伸8min(1个循环)。
73.利用上海生工生物工程有限公司的pcr柱式胶回收试剂盒对pcr扩增产物进行纯化回收，将纯合回收的pcr扩增产物命名为δpk_ura3。测序表明：δpk_ura3的核苷酸序列如序列表中序列3所示，其中序列表序列3第1-1000位核苷酸片段为pk_ura3基因上游dna片段pk_ura3up，第1001-1801位核苷酸片段为pk_ura3基因下游dna片段pk_ura3dn。显然，该δpk_ura3为敲除了ura基因的dna片段。
74.3、构建尿嘧啶缺陷菌株cy902δura3
75.①
以初始od
600nm
＝0.2的接种量将cy902过夜培养菌液接种到装有3ml ypd液体培养基中，在30℃，250r/min恒温摇床中培养3.5h。
76.②
取1.5ml酵母菌液(od
600nm
＝1.0-1.5)至新的1.5ml ep管中，12000r/min离心1min，除尽上清，沉淀用灭菌的去离子水洗涤两次，12000r/min离心1min，弃上清。
77.③
加入1ml酵母处理液(10mm liac；10mm dtt；0.6m山梨醇；10mm tris-hcl(ph7.5)，处理液使用时才加dtt)，25℃金属浴20min；12000r/min离心1min，除尽上清；沉淀用1ml 1m山梨醇溶液(0.22μm水系膜过膜除菌)洗涤两次，12000r/min离心1min，除尽上清。
78.④
加入60μl 1m山梨醇溶液重悬菌体，加入5μl片段δpk_ura3，吹打混匀后移至2mm电击杯中，冰浴5min；擦干电击杯，2.7kv电击一次，电击时间不能低于5.0ms。
79.⑤
电击后立即加入1ml冰浴的1m山梨醇，转移到新的1.5ml ep管中，30℃复苏1h，涂布于筛选培养基1上(筛选培养基1配方：0.8％酵母选择培养基酵母菌尿嘧啶合成缺陷型培养基sd-ura(北京泛基诺(功能基因组)科技有限公司产品，产品编号为：ygm003a-3)，2％葡萄糖，0.01％ura，1.5％琼脂，0.1％5-氟乳清酸，其余为水；各百分号均表示g/100ml)。筛选培养的条件为：30℃，培养36h以上。利用引物pk_ura3-yz-f和pk_ura3-yz-r(见表1)鉴定出正确的阳性克隆(得到2548bp pcr产物的克隆)，命名为菌株cy902δura3。
80.表1 ura3基因敲除引物
[0081][0082]
二、库德里阿兹威毕赤酵母crispr-cas9质粒的构建
[0083]
以cas9质粒p414-tef1p-cas9-cyc1t(addgene公司产品，产品编号为：43802)为模板，使用引物cas9-f和cas9-r(见表2)pcr扩增cas9基因，将得到的产物命名为cas9基因。
[0084]
以质粒pws-pk-ura-gfp(sun w,vila-santa a,liu n,et al.metabolic engineering of an acid-tolerant yeast strain pichia kudriavzevii for itaconic acid production[j].metabolic engineering communications,2020,10:e00124.)为模板，使用引物pk_ars-f和pk_eno2t-r(见表2)pcr扩增库德里阿兹威毕赤酵母自主复制序列(autonomously replicating sequence,ars)和筛选标记pk_ura3表达盒(pk_ura3p-pk_ura3-pk_eno2t)，将扩增得到的产物命名为ars-ura。
[0085]
以质粒puc57-trna-grna(由南京金斯瑞生物科技有限公司合成)为模板，使用引物trna-f和grna-r(见表2)pcr扩增载体e.coil ori-ampr-trna-jen2n20-grna，得到的产物命名为jen2n20-grna，其核苷酸序列如序列表中序列4的第1-2129位所示，其中序列表序
列4的第1999-2018位为sgrna的编码序列。sgrna靶序列为catttgttgaatccattgcc。
[0086]
将以上三种pcr产物分别进行dpn1消化处理。dpn1处理体系为：10μl 10
×
dpn1 buffer(thermo公司)、5μl dpn1(therom公司，400,000cohesive end units/ml)，80μl pcr扩增产物，补充蒸馏水至100μl，消化处理4小时，得到消化产物。将消化后的产物分别进行跑胶纯化处理，以备用。
[0087]
以cy902基因组为模板，分别利用引物rnr2p-f和rnr2p-r、cyc1t-f和cyc1t-r(见表2)进行pcr扩增，得到扩增产物rnr2p和cyc1t，将扩增产物rnr2p和cyc1t分别进行胶回收处理备用。
[0088]
将上述pcr扩增产物cas9基因、ars-ura、rnr2p、cyc1t与载体片段jen2n20-grna用无缝克隆试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司产品，其产品编号为：d7010s)进行连接处理，无缝克隆连接体系为：10μl 2
×
seamless cloning mix，cas9/ars-ura/jen2n20-grna各100ng，rnr2p/cyc1t各50ng，补充蒸馏水至20μl，50℃反应60min。将无缝克隆连接产物，转入trans1-t1感受态细胞中冰浴30分钟，42℃热激30秒，立即至于冰上2分钟。加入800μl lb培养基，250rpm，37℃孵育1小时，菌液涂在含有氨苄青霉素的lb平板上，过夜培养后，pcr筛选5个阳性单菌落，将阳性克隆进行液体培养，提取阳性克隆质粒，将其命名为pcas9-jen2grna。测序结果表明：pcas9-jen2grna的核苷酸序列如序列表序列4所示。其中，第1-2129位为jen2n20-grna，第2130-4783位为ars-ura，第4784-5583位为rnr2p，第5584-9687位为cas9基因，第9724-10022位为cyc1t。
[0089]
表2库德里阿兹威毕赤酵母crispr-cas9质粒构建引物
[0090][0091]
三、库德里阿兹威毕赤酵母三羧酸转运蛋白缺陷菌株cy902δura3δjen2的构建
三羧酸转运蛋白缺陷菌株cy902δura3δjen2的构建主要分为以下两步：
[0092]
1、构建敲除pk_jen2基因的dna片段
[0093]
以cy902基因组dna为模板，用引物pk_jen2-up-f和pk_jen2-up-r(见表3)扩增pk_jen2基因上游片段，得到长度为623bp的dna片段，将其命名为pk_jen2up；用引物pk_jen2-dn-f和pk_jen2-dn-r(见表3)扩增pk_jen2基因下游片段，得到长度为496bp的dna片段，将其命名为pk_jen2dn。
[0094]
用上海生工生物工程有限公司的pcr柱式胶回收试剂盒纯化回收增产物pk_jen2up和pk_jen2dn。以纯化得到的片段pk_jen2up和pk_jen2dn为模板，用引物pk_jen2-up-f和pk_jen2-dn-r进行overlap pcr扩增，所得扩增产物命名为δpk_jen2。δpk_jen2的核苷酸序列如序列表中序列5所示，其中序列表序列5第1-623位核苷酸片段为pk_jen2基因上游dna片段pk_jen2up，第624-1119位核苷酸片段为pk_jen2基因下游dna片pk_jen2dn。该δpk jen2为敲除了pk jen2基因的dna片段。
[0095]
表3 pk_jen2基因敲除引物
[0096][0097]
2、pk_jen2基因的敲除
[0098]
步骤一构建的菌株cy902δura3于ypd液体培养基中过夜培养。以初始od
600nm
＝0.2的接种量将菌株cy902δura3过夜培养菌液接种到装有3ml ypd液体培养基中，在30℃，250r/min恒温摇床中培养5h。然后制备cy902δura3感受态细胞，向制备好的库德里阿兹威毕赤酵母菌株cy902δura3感受态细胞同时加入片段δpk_jen2和质粒pcas9-jen2grna各5μl，吹打混匀后移至2mm电击杯中，2.7kv电击一次，电击后立即加入1ml冰浴的1m山梨醇，转移到新的1.5ml ep管中，30℃复苏1h，涂布于筛选培养基2上(筛选培养基2配方：0.8％酵母选择培养基sd-ura，2％葡萄糖，1.5％琼脂，其余为水；各百分号均表示g/100ml)。筛选培养的条件为：30℃，培养36h以上。使用引物yz-pk_jen2-f和yz-pk_jen2-r(见表3)鉴定出正确的阳性克隆(得到1280bp pcr产物的克隆)，命名为菌株cy902δura3δjen2。
[0099]
实施例2、库德里阿兹威毕赤酵母三羧酸转运蛋白过表达菌株cy902δura3δjen2::jen2的构建
[0100]
三羧酸转运蛋白过表达菌株cy902δura3δjen2::jen2的构建主要分为以下两步：
[0101]
1、过表达pk_jen2的dna片段的获得
[0102]
以质粒pws-pk-ura-gfp为模板，用引物pk_ura3p-f和pk_eno2t-r(见表4)扩增筛
选标记pk_ura3表达盒(pk_ura3p-pk_ura3-pk_eno2t)，将得到的产物命名为pk_ura3m。
[0103]
以cy902基因组dna为模板，引物pk_eno2t-pk_tdh3p-f和pk_tdh3p-r(见表4)扩增长度为865bp的三磷酸甘油醛脱氢酶启动子pk_tdh3p；引物pk_tdh3p-pk_jen2-f和pk_jen2-r(见表4)扩增三羧酸转运蛋白pk_jen2的编码基因；引物pk_jen2p-pk_gal2t-f和pk_gal2t-r(见表4)扩增长度为481bp的半乳糖透性酶终止子pk_gal2t。
[0104]
将以上得到的四个pcr扩增产物用上海生工生物工程有限公司的pcr柱式胶回收试剂盒纯化回收。以纯化得到的片段pk_ura3m、pk_tdh3p、pk_jen2和pk_gal2t为模板，用引物pk_ura3p-f和pk_gal2t-r通过overlap pcr扩增得到过表达pk_jen2基因的片段。所得扩增产物命名为ovjen2，其核苷酸序列如序列表6所示。其中，序列表序列6第1-2179位核苷酸所示的dna片段为pk_ura3m，序列表序列6第2180-3044位核苷酸所示的dna片段为三磷酸甘油醛脱氢酶启动子pk_tdh3p，序列表序列6第3045-4616位核苷酸所示的dna片段为基因pk_jen2，序列表序列6第4617-5097位核苷酸所示的dna片段为半乳糖透性酶终止子pk_gal2t。
[0105]
表4过表达pk_jen2引物
[0106][0107]
2、pk_jen2基因的过表达
[0108]
出发菌株cy902δura3δjen2于ypd液体培养基中过夜培养。以初始od
600nm
＝0.2的接种量将cy902δura3δjen2过夜培养菌液接种到装有3ml ypd液体培养基中，在30℃，250r/min恒温摇床中培养5h。然后制备cy902δura3δjen2感受态，向制备好的库德里阿兹威毕赤酵母cy902δura3δjen感受态细胞加入5μl ovjen2，吹打混匀后移至2mm电击杯中，2.7kv电击一次，电击后立即加入1ml冰浴的1m山梨醇，转移到新的1.5ml ep管中，30℃复苏1h，涂布于筛选培养基2上(筛选培养基2配方：0.8％酵母选择培养基sd-ura，2％葡萄糖，1.5％琼脂，其余为水；各百分号均表示g/100ml)。筛选培养的条件为：30℃，培养36h以上。使用引物pk_ura3p-f和pk_gal2t-r(见表4)鉴定出正确的阳性克隆(得到5097bp pcr产物的克隆)，命名为菌株cy902δura3δjen2::jen2。
[0109]
实施例3、库德里阿兹威毕赤酵母pk_jen2蛋白功能的鉴定
[0110]
摇瓶发酵：在ypd固体培养基中活化酵母菌株cy902δura3、cy902δura3δjen2和
cy902δura3δjen2::jen2，于液体合成培养基(配方：液体酵母培养基sd-ura，2％葡萄糖，0.01％ura，其余为水；各百分号均表示g/100ml)中制备种子液(30℃，250rpm，16h)，以初始od
600nm
＝0.2的接种量将菌株cy902δura3、cy902δura3δjen2和cy902δura3δjen2::jen2分别接种于含20ml以柠檬酸为唯一碳源的液体培养基(液体酵母培养基sd-ura，3％柠檬酸，0.01％ura，ph 5.0，其余为水；各百分号均表示g/100ml)的100ml三角瓶中，30℃，250rpm振荡培养24h。
[0111]
柠檬酸量的检测：取1ml发酵液，12000r/min离心5min，取上清液用无菌水稀释10倍后，用0.45μm的滤膜进行过滤处理。将稀释后的溶液通过使用安捷伦(agilent-1260)高效液相色谱仪对发酵液中的组分进行测定。发酵液中的柠檬酸浓度测定采用biorad公司的aminex hpx
–
87h有机酸分析柱(300mm
×
7.8mm，9.0μm，bio-rad，usa)，上样量20μl，流动相为10mm h2so4溶液，柱温60℃，洗脱时间30min，洗脱流速0.5ml/min。其中，以柠檬酸为标准品根据标准品的保留时间定性和采用标准曲线法(外标法)进行定量分析柠檬酸。
[0112]
柠檬酸消耗量＝0h发酵液柠檬酸量-24h发酵液柠檬酸量
[0113]
生物量的检测：取1ml发酵液，按不同浓度稀释，利用紫外分光光度计uv-2250(岛津仪器苏州有限公司)在600nm下测菌液od值，以上述以柠檬酸为唯一碳源的液体培养基为空白对照。
[0114]
如图1所示，培养结束后，在库德里阿兹威毕赤酵母菌株cy902δura3、cy902δura3δjen2和cy902δura3δjen2::jen2摇瓶中均检测到了柠檬酸。对库德里阿兹威毕赤酵母菌株cy902δura3、cy902δura3δjen2和cy902δura3δjen2::jen2摇瓶发酵消耗柠檬酸的能力进行验证。结果表明(图2)：菌株cy902δura3发酵24h后生物量是6.29
±
0.35，柠檬酸的消耗量是9.756
±
0.247g/l；三羧酸转运蛋白缺陷菌株cy902δura3δjen2发酵24h后生物量是0.252
±
0.035，柠檬酸的消耗量是0.485
±
0.087g/l；三羧酸转运蛋白过表达菌株cy902δura3δjen2::jen2发酵24h后生物量是1.95
±
0.042，柠檬酸的消耗量是6.579
±
0.218g/l。可见，在库德里阿兹威毕赤酵母中缺失pk_jen2基因后，其降解柠檬酸的能力大大降低；而在缺失突变菌株cy902δura3δjen2中表达pk_jen2基因，其降解柠檬酸的能力能够得到恢复。
[0115]
综上可知，pk_jen2蛋白是库德里阿兹威毕赤酵母中主要的三羧酸转运蛋白，其具有调控库德里阿兹威毕赤酵母降解柠檬酸的能力。
[0116]
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本技术欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本技术中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。