一种触发抗肿瘤免疫反应的光控缓释注射剂及其制备方法与流程

1.本发明属于纳米材料技术领域和纳米医疗技术领域，涉及一种触发抗肿瘤免疫反应的光控缓释注射剂及其制备方法。


背景技术：

2.左旋紫草素，是从传统药用植物紫草根组织中分离出的主要活性成分。紫草素具有广泛的抗炎活性，包括抑制促炎性细胞因子tnf-a 和gm-csf 的启动子/转录活性，阻断tnf-a pre-mrna的剪接，以及对人单核细胞中细胞因子/趋化因子表达的不同影响。文献表明，紫草素可以具有多种药理特性，例如抗肿瘤、抗菌、抗病毒、抗氧化剂、抗血小板和抗动脉粥样硬化等作用。紫草素的抗肿瘤作用被认为是通过诱导活性氧，抑制蛋白酶体活性和通过诱导坏死性坏死引起的耐药性等途径来介导的。
3.研究调查发现大多数癌症患者死于肿瘤转移，而不是原发肿瘤。传统的治疗方法,包括放射疗法、化学疗法和标准手术，对转移性肿瘤的效果较差。此外，keklikoglou课题组和volk-draper课题组还证明了，化学疗法甚至可以通过多种方式促进癌症转移。针对目前传统单一化学疗法的缺点，需要考虑使用多重疗法以实现抗肿瘤药物更好的治疗效果。
4.二维纳米材料，例如mxene材料、黑磷纳米片，独特的单片层结构可高效载药，官能团也可以进行化学修饰，且具有很好的生物相容性。mxene材料的良好的光热效果可精准控制药物释放浓度。将混合物封装至水凝胶中，方便局部给药，减少了全身给药的毒副作用。此外，水凝胶还可以延长药物作用周期，方便后期肿瘤复发或转移持续给药。不论是传统水凝胶还是温敏性水凝胶，在使用过程中都有其独特的作用优势。免疫佐剂和抗体可触发肿瘤的特异性免疫反应，并进一步放大该免疫反应。故而，本专利设计了一种触发抗肿瘤免疫反应的联合给药方法，首先，通过近红外触发光动力疗法协同化学疗法；其次，免疫佐剂促进树突细胞成熟，增强其吞噬能力；最后，抗体进一步放大肿瘤的特异性免疫反应，触发全身性抗肿瘤免疫反应。
5.上海市肺科医院在申请公布号为cn103284983a的中国专利中提供了紫草素和/或其衍生物在制备抑制癌细胞转移药物中的应用。
6.西安交通大学在申请公布号为cn109846816a的中国专利中提供了一种紫草素温敏性水凝胶及其制备方法和应用。
7.中国科学院微生物研究所在申请公布号为cn cn101057975b的中国专利中提供了一种抗免疫耐受性和免疫缺陷性病毒的鸡尾酒疫苗及其应用。


技术实现要素：

8.为了克服传统单一化学疗法的缺点，本发明的目的在于提供一种触发抗肿瘤免疫反应的光控缓释注射剂及其制备方法。
9.所述一种触发抗肿瘤免疫反应的光控缓释注射剂及其制备方法中包括：a. 抗肿瘤药物，包括但不限于左旋紫草素及其衍生物、阿霉素、紫杉醇、雷帕霉素
等；b. 二维纳米材料，包括mxene材料（包含并不仅限于ti2c、ti2n、v2c、v2n、nb2c、nb2n、ta2c、ti3c2、ti3n2、v3c2、ta3c2、ta3n2、 ti4c3、ti4n3、ta4c3、ta4n3、nb4c
3 中的任意一种或两种以上的组合）、黑磷；c. 免疫佐剂，包括但不限于toll样受体9激动剂cpg寡核苷酸、toll样受体8（tlr8）激动剂dn1508052-01、toll样受体7/8激动剂咪唑并喹啉（imdq）、 toll样受体7 激动剂 imiquimod (r837) 及shr2150等；d. 水凝胶，包括但不限于类纤维素传统水凝胶、类琼脂糖温敏性水凝胶；e. 抗体，包括但不限于pd-1、 pdl-1、 ctla-4；优选地，所述抗肿瘤药物左旋紫草素的含量为0.1～0.2 mg/ml；优选地，所述的二维纳米材料，mxene材料含量为0.5～1 mg/ml；优选地，所述水凝胶为类纤维素对室温和体内温度影响不大的传统类水凝胶，或者类琼脂糖sol-gel转变温度在20～40℃之间，保证一定的流动性方便注射。
10.本发明的目的是通过以下技术方案实现的：i、“核-壳”结构，逐级释放，包括以下步骤：1)将纤维素粉分散在水溶液中，形成1~5 wt%的纤维素溶胶；2)在步骤（1）中滴加抗体稀释液，包括pd-1或 pdl-1或ctla-4，形成抗体/纤维素水凝胶；3)将二维片状mxene材料分散到乙醇溶液中，浓度为1~5 mg/ml，包含并不仅限于ti2c、ti2n、v2c、v2n、nb2c、nb2n、ta2c、ti3c2、ti3n2、v3c2、ta3c2、ta3n2、 ti4c3、ti4n3、ta4c3、ta4n3、nb4c
3 中的任意一种或两种以上的组合；4)将步骤（3）所得滴加到20~50 ml 10~30 mg ml-1
在大豆磷脂的三氯甲烷溶液中，超声处理5~30 min以实现高分散度，随后移除有机溶剂，分散至50~250 ml去离子水中，得到改性mxene；5)在步骤（4）中滴加左旋紫草素醇溶液，浓度为0.1~0.5 mg/ml，搅拌3~6 h，得到左旋紫草素-改性mxene；6)在步骤（5）中滴加一定量的toll样受体激动剂稀释剂，包括toll样受体9激动剂cpg寡核苷酸、toll样受体8（tlr8）激动剂dn1508052-01、toll样受体7/8激动剂咪唑并喹啉（imdq）、 toll样受体7 激动剂 imiquimod (r 837)及shr2150等，搅拌12~24 h以保证充分混合均匀，得到免疫佐剂-左旋紫草素-改性mxene；7)将步骤（6）所得在60℃下与低熔点琼脂糖溶胶混合均匀；8)将步骤（2）所得水凝胶浸渍在步骤（7）所得溶胶中，冷却至室温，得到抗体/纤维素水凝胶@免疫佐剂-左旋紫草素-改性mxene水凝胶，灭菌处理，储存备用；9)用0.5或1 w/cm2的808或980 nm 激光照射步骤（8）所得2~10 min，用紫外分光光度计测定不同时间药物的释放浓度。
[0011]ⅱ、分步疗法，静脉注射，包括以下步骤：1) 将二维片状mxene材料分散到乙醇溶液中，浓度为1~5 mg/ml，包含并不仅限于ti2c、ti2n、v2c、v2n、nb2c、nb2n、ta2c、ti3c2、ti3n2、v3c2、ta3c2、ta3n2、 ti4c3、ti4n3、ta4c3、ta4n3、nb4c
3 中的任意一种或两种以上的组合；
2) 将步骤（1）所得滴加到20~50 ml 10~30 mg ml-1
在大豆磷脂的三氯甲烷溶液中，超声处理5~30 min以实现高分散度，随后移除有机溶剂，分散至50~250 ml去离子水中，得到改性mxene；3) 在步骤（2）中滴加左旋紫草素醇溶液，浓度为0.1~0.5 mg/ml，搅拌3~6 h，得到左旋紫草素-改性mxene；4) 在步骤（3）中滴加一定量的toll样受体激动剂稀释剂， 搅拌12~24 h以保证充分混合均匀，得到免疫佐剂-左旋紫草素-改性mxene；5) 将步骤（4）所得封装至类纤维素水凝胶中或类琼脂糖的温敏性水凝胶中，形成左旋紫草素-免疫佐剂-改性mxene水凝胶；6) 用0.5或1 w/cm2的808或980 nm 激光照射将步骤（5）所得2~10 min，用紫外分光光度计测定不同时间药物的释放浓度；7) 在步骤（6）之后2~6 h内，将抗体稀释液，包括pd-1或 pdl-1或ctla-4，通过静脉注射。
[0012]
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：1. 本发明所述疗法的特征是联合用药，这种疗法减少了单一用药产生的抗药性，最大限度地抑制肿瘤细胞的复发和转移，使被破坏的机体免疫功能部分甚至全部恢复；2. 本发明所述水凝胶剂型，方便局部给药，减少了全身给药的毒副作用。还可以作为药物存储库，延长药物释放周期以保证药效，方便后期肿瘤复发或转移持续给药；3. 本发明所使用的医疗材料均具有良好的生物相容性，可被人体代谢，尽可能的减小对身体的伤害；4. 本发明所述方法，二维纳米材料，载药量大，通过光热效应精准控制剂量，可持续或间断给药，同时保障对肿瘤细胞的治疗和预防。
附图说明
[0013]
图1为紫外分光光度计测定吸光度，(a) 紫草素水溶液的光学照片；(b)紫外分光光度计测定不同浓度紫草素的的吸光度及其吸收峰；(c)ti2c负载紫草素的光学照片；(d)；紫外分光光度计测定ti2c负载紫草素的的吸光度及其吸收峰；图2为纤维素的溶胶和凝胶状态，(a)可流动的纤维素溶胶；(b)半固态的纤维素水凝胶；图3为nir光控制的ti2c负载紫草素水凝胶药物输送平台， (a)ti2c负载紫草素水凝胶药物输送平台的示意图； (b)激光照射一定时间内释放的紫草素的吸收光谱。
具体实施方式
[0014]
下面结合实施例具体介绍本发明的实质性内容。
[0015]
实施例11) 将纤维素粉分散在水溶液中，形成2 wt%的纤维素溶胶；2) 在步骤（1）中滴加抗体pdl-1稀释液，形成抗体/纤维素水凝胶；3) 将二维片状ti2c分散到乙醇溶液中，浓度为1 mg/ml；4) 将步骤（3）所得滴加到40 ml 20 mg ml-1
在大豆磷脂的三氯甲烷溶液中，超声
处理5分钟以实现高分散度，随后移除有机溶剂，分散至50 ml去离子水中，得到改性ti2c；5) 在步骤（4）中滴加左旋紫草素醇溶液，浓度为0.1 mg/ml，搅拌3 h，得到左旋紫草素-改性ti2c；6) 在步骤（5）中滴加一定量的toll样受体激动剂稀释剂咪唑并喹啉（imdq）， 搅拌12 h以保证充分混合均匀，得到imdq-左旋紫草素-改性ti2c；7) 将步骤（6）所得60℃下与低熔点琼脂糖溶胶混合均匀；8) 将步骤（2）所得浸渍在步骤（7）所得中，冷却至室温，得到pdl-1/纤维素水凝胶@imdq-左旋紫草素-改性ti2c水凝胶，灭菌处理，储存备用；9) 用0.5 w/cm2的808 nm 激光照射将步骤（8）所得3 min，用紫外分光光度计测定不同时间紫草素的释放浓度。
[0016]
实施例21）将纤维素粉分散在水溶液中，形成2 wt%的纤维素溶胶；2）在步骤（1）中滴加抗体pd-1稀释液，形成pd-1/纤维素水凝胶；3）将二维片状nb2c分散到乙醇溶液中，浓度为2 mg/ml；4）将步骤（3）所得滴加到30 ml 20 mg ml-1
在大豆磷脂的三氯甲烷溶液中，超声处理10分钟以实现高分散度，随后移除有机溶剂，分散至60 ml去离子水中，得到改性nb2c；5）在步骤（4）中滴加左旋紫草素醇溶液，浓度为0.2 mg/ml，搅拌6 h，得到左旋紫草素-改性nb2c；6）在步骤（5）中滴加一定量的toll样受体激动剂稀释剂imiquimod (r837)， 搅拌24 h以保证充分混合均匀，得到r837-左旋紫草素-改性nb2c；7）将步骤（6）所得在60℃下与低熔点琼脂糖溶胶混合均匀；8）将步骤（2）所得浸渍在步骤（7）所得中，冷却至室温，得到pd-1/纤维素水凝胶@r837-左旋紫草素-改性nb2c水凝胶，灭菌处理，储存备用；9）用10 w/cm2的980 nm 激光照射将步骤（8）所得3 min，用紫外分光光度计测定不同时间紫草素的释放浓度。
[0017]
实施例31） 将二维片状ta4c3分散到乙醇溶液中，浓度为1 mg/ml；2） 将步骤（1）所得滴加到20 ml 10 mg ml-1
的大豆磷脂的三氯甲烷溶液中，超声处理20分钟以实现高分散度，随后移除有机溶剂，分散至50 ml去离子水中，得到改性ta4c3；3） 在步骤（2）中滴加左旋紫草素醇溶液，浓度为0.2 mg/ml，搅拌6 h，得到左旋紫草素-改性ta4c3；4） 在步骤（3）中滴加一定量的toll样受体激动剂稀释剂imiquimod (r837)， 搅拌24 h以保证充分混合均匀，得到r837-左旋紫草素-改性ta4c3；5） 将步骤（4）所得封装至类纤维素水凝胶中，形成r837-左旋紫草素-改性ta4c3水凝胶；6） 用0.5 w/cm2的808 nm 激光照射5 min，用紫外分光光度计测定不同时间紫草素的释放浓度；7） 在步骤（6）之后3 h内，通过静脉注射pdl-1抗体稀释液。
[0018]
实施例4
1） 将二维片状黑磷分散到乙醇溶液中，浓度为2 mg/ml；2） 将步骤（1）所得滴加到40 ml 20 mg ml-1
在大豆磷脂的三氯甲烷溶液中，超声处理30分钟以实现高分散度，随后移除有机溶剂，分散至40 ml去离子水中，得到改性黑磷；3） 在步骤（2）中滴加左旋紫草素醇溶液，浓度为0.2 mg/ml，搅拌6 h，得到左旋紫草素-改性黑磷；4） 在步骤（3）中滴加一定量的toll样受体激动剂稀释剂咪唑并喹啉（imdq）， 搅拌24 h以保证充分混合均匀，得到imdq-左旋紫草素-改性黑磷；5） 将步骤（4）所得封装至纤维素水凝胶中，形成imdq-左旋紫草素-改性黑磷水凝胶；6） 用1w/cm2的980 nm 激光照射6 min，用紫外分光光度计测定不同时间紫草素的释放浓度；7） 在步骤（6）之后2 h内，通过静脉注射pdl-1抗体稀释液。
[0019]
以上内容仅为说明本发明的技术思想，不能以此限定本发明的保护范围，凡是按照本发明提出的技术思想，在技术方案基础上所做的任何改动，均落入本发明权利要求书的保护范围之内。