一种水媒法高效同步提取荷叶中黄酮、生物碱和多酚的方法

1.本发明属于植物有效成分提取方法领域，具体是一种荷叶功能成分提取的技术领域。


背景技术：

2.荷叶(lotus leaf)是睡莲科(nymphaeaceae)植物莲(nelumbo)的叶片，作为常用中药材具有去暑利湿、升发清阳等功效。据《本草纲目》记载：荷叶服之，令人瘦劣，生发元气，裨助脾胃。在2002年2月中华人民共和国卫生部的卫监发(2002)第45号文件中，荷叶被列入第2批“既是食品又是药品”的名单之中。荷叶分布广阔，全国其栽培面积900万-1100万亩，主要分布于湖北、湖南等省，湖北省达到150万亩左右，然而荷叶资源的利用率不到1％。大面积的荷叶没有采收利用，任其腐烂造成极大的资源浪费，甚至造成环境污染，这与我国拥有的巨大荷叶资源十分矛盾。我们认为荷叶缺乏相关的高附加值深加工产品的研发，市场需求低等因素严重制约了我国荷叶资源的合理利用，随着消费者对健康的关注，从植物中开发保健产品成为了研究热点。
3.《本草纲目》记载，“荷叶服之，令人瘦劣”，由此可见，荷叶在降脂减肥方面的功效自古就受到人们的认可。现代大量科学研究表明，荷叶具有降脂的功效。范婷婷(范婷婷2013)建立高脂大鼠模型，观察荷叶提取物对大鼠体重、血清脂质的影响，结果表明，荷叶生物碱有明显的降脂作用。许腊英等(许腊英等2003)对荷叶的降脂作用进行了研究，提取荷叶中的生物碱，选择小白鼠建立高脂模型，灌胃荷叶提取物浓缩液，通过与阳性对照组(盐酸肌琼片)比较无显著性差异，结果证明荷叶提取物具有降脂作用。关章顺等(关章顺等2003)把荷叶提取物制成胶囊，进行人体试食试验，观察其降脂效果，结果表明，荷叶提取物对人体有明显的降脂作用。荷叶中具有生理活性的主要物质有黄酮类化合物、生物碱。杜力军等以急性高脂血症小鼠为整体模型观察荷叶水提物对血清胆固醇及甘油三酯的影响,结果表明荷叶水提物有明显的调脂作用,其活性成分主要是荷叶黄酮,其次是荷叶生物碱。多酚因其多元酚的特殊分子结构使其具有抑菌、抗过敏、止血、抗肿瘤、抗衰老等多种生理活性。lee等研究指出荷叶多酚物质具有抑制血管内皮生长因子(vegf)诱导血管再生的活性，同时荷叶中多酚类物质具有较强的总还原力、清除dpph
·
自由基活力和清除亚硝酸盐活性。


技术实现要素：

4.针对现有技术存在的不足，本发明提供一种水媒法高效同步提取荷叶中黄酮、生物碱和多酚的方法。
5.本发明采用的具体方案为：
6.s1干燥荷叶粉碎后过60目筛备用；
7.s2粉碎后的荷叶粉在50℃水中浸泡30min后用柠檬酸调节ph值，加入酶制剂，50℃酶解2h；
8.s3酶解后加入表面活性剂的水溶液后，在适宜的温度时间内进行超声提取；
9.s4超声提取后过滤，提取液使用旋转蒸发仪浓缩；
10.所述提取过程中不使用有机溶剂。
11.所述酶制剂为纤维素酶和/或果胶酶。优选为夏盛液体纤维素酶spe0-17、夏盛固体纤维素酶、夏盛果胶酶、诺维信ktn02309复合酶、诺维信kon10061果胶酶中的一种或多种。
12.所述酶制剂用量为荷叶用量的0.5-2wt％，作为优选使用用量比为1:1的纤维素酶和果胶酶。
13.所述步骤s2中ph为4.0-6.0，优选为4.0、4.5、5.0、5.35。
14.所述步骤s3中表面活性剂为甘油、吐温20、吐温60、吐温80、司盘80、聚甘油月桂酸酯、聚甘油辛癸酸酯中的一种或多种，优选为吐温80和/或甘油。
15.所述步骤s3中超声时间为30-60min，超声温度为50-80℃。
16.所述制备方法中荷叶用量为5-20g/250ml。
17.与现有技术相比，本发明的有益效果：
18.1、相较于传统工业化提取使用有机溶剂(多用乙醇提取)，使用本发明方法没有有机物残留，易燃易爆的风险，且使用有机溶剂提取时荷叶中的叶绿素溶出，颜色较深，在浓缩后色素析出，并伴有其他物质的沉淀，在感官上造成了一定影响；
19.2、本发明方法中“水媒法”使用的吐温80和甘油相辅相成，应用本发明方法中的吐温80提取可高效提取出生物碱和槲皮素，两者均有良好降脂肪效果，而甘油提取在酚类物质和黄酮的提取上具有普通方法难以达到的优势，同时也解决了吐温80单一提取存在法规限量低的问题(如植物饮料中，吐温80限量为0.05％)；
20.3、相较于传统工业化提取使用有机溶剂，使用本发明方法在提取黄酮、生物碱、酚类物质时，具有不同的优势，特别体现在槲皮素，生物碱和酚类物质含量上，可能是由于有机物提取浓缩时，有机物蒸发，而生物碱类和有些黄酮类化合物不易溶于水，并且制备的提取物具有良好的稳定性，不沉淀，不析出。而本发明方法中纤维素酶果胶酶等的加入可解开细胞壁的屏障，甘油和吐温80具有增溶作用，再辅助超声等方式可很大程度上使得部分生物碱黄酮酚类物质溶解。
附图说明
21.图1不同酶制剂对提取率的影响。
22.图2夏盛及诺维信酶制剂提取液的hplc色谱图。a.液体纤维素酶酶解后提取；b.诺维信复合酶酶解后提取液；1.荷叶碱；2.槲皮素。
23.图3不同酶解ph值对提取率的影响。
24.图4超声时间对提取率的影响。
25.图5超声温度对提取率的影响。
26.图6不同浓度荷叶在1％吐温80中提取液颜色。
27.图7不同浓度荷叶对提取率的影响。a.不同浓度荷叶提取液总黄酮的含量；b.不同浓度荷叶提取液总酚的含量；c.不同浓度荷叶提取液总生物碱的含量；d.不同浓度荷叶提取液荷叶碱的含量；e.不同浓度荷叶提取液槲皮素的含量。
28.图8吐温80及甘油提取液的hplc色谱图。a.1％浓度吐温80料液比为5g荷叶/250ml提取液；b.10％浓度甘油料液比为20g荷叶/250ml提取液；1.荷叶碱；2.槲皮素。
29.图9有机提取与水媒法提取颜色差异：
30.a.不同提取方案提取液；b.不同提取方案提取液浓缩后未离心；c.不同提取方案提取液浓缩后离心；d.不同提取方案提取液浓缩后离心用水稀释5倍；
31.1.用5g荷叶1％吐温提取；2.用5g荷叶75％乙醇提取；3.用20g荷叶10％甘油提取；4.用20g荷叶75％乙醇提取；5.用5g荷叶75％乙醇提取，ph为4。
32.图10有机提取与水媒法对提取率的影响。
33.图11有机提取与水媒法提取的hplc色谱图。
34.用5g荷叶1％吐温提取；b.用5g荷叶75％乙醇提取；c.用20g荷叶10％甘油提取；d.用20g荷叶75％乙醇提取；e.用5g荷叶75％乙醇提取，ph为4；1.荷叶碱2.槲皮素。
具体实施方式
35.参考下列实施例将更容易理解本发明，给出的实施例不是限制本发明的范围。
36.《生物活性物质检测方法》
37.对实验样品采用以下生物活性物质检测方法进行测试和评价，评价结果见附图。
38.1.总黄酮含量的测定
39.配置5％亚硝酸钠溶液，10％硝酸铝溶液，5％氢氧化钠溶液作为比色溶液。
40.依次精密吸取浓缩后提取液样品各30ul，分别置10ml量瓶中，加水至4ml，加5％亚硝酸钠溶液0.4ml摇匀，放置6min；然后加10％硝酸铝溶液0.4ml，摇匀放置6min；再加5％氢氧化钠溶液4ml，加水至刻度，摇匀放置15min，以相应试剂为空白；
41.在510nm波长处测吸光度，对照标准曲线计算其含量，每个样品测3次，吸光值在0.2-0.8之间。
42.2.总酚含量的测定
43.采用folin-ciocalteu比色法测定荷叶提取物总酚含量。
44.取荷叶提取液1ml，稀释到10ml离心管，精密量取提取液稀释液0.03ml于10ml容量瓶中，加水稀释至6ml摇匀，加入0.5ml福林酚试剂，充分摇匀，静置3min；再加入20％无水na2co3溶液1.5ml摇匀后水定容至刻度摇匀；35℃水浴反应50min，冷却，以空白液作参比；
45.在760nm波长下测定吸光度值，对照标准曲线计算其含量，每个样品测3次，吸光值在0.2-0.8之间。
46.3.总生物碱含量的测定
47.邻苯二甲酸氢钾缓冲液：邻苯二甲酸氢钾在110℃下干燥2h，称取邻苯二甲酸氢钾5.10g，加适量的蒸馏水溶解，然后定容到500ml，此时溶液ph值为4.0；
48.溴甲酚绿溶液：称取溴甲酚绿0.10g，加入7.15ml 0.02mol/l naoh溶液溶解，用蒸馏水定容到250ml；
49.取10μl荷叶提取浓缩液用三氯甲烷(氯仿)定容至5ml，倒入10ml试管中，加入邻苯二甲酸氢钾缓冲液1ml，溴甲酚绿溶液1ml，振荡30s，静置30min。取下层氯仿层4ml，在414nm测定吸光度值，每个样品测3次，根据标准曲线计算总生物碱含量。
50.4.高效液相色谱法(hplc)检测荷叶碱及槲皮素含量
51.实验所使用标准品及试剂：荷叶碱标准品(≥98％上海源叶生物科技有限公司)、槲皮素标准品(≥98％上海源叶生物科技有限公司)、甲酸、乙腈均为色谱纯。
52.agilent c18柱；流动相为水(a，含0.4％甲酸)-乙腈(b)；体积流量1.0ml/min；检测波长270nm；柱温：室温；洗脱方式：梯度洗脱
[0053][0054]
样品制备：供试品溶液的制备:精密称取荷叶样品各2ml，置于具塞锥形瓶中，精密加入甲醇28ml，将塞子塞紧，超声30min，静置放冷，取上清液，经过0.22μm有机微孔滤膜过滤，取滤液，即得，每个样品测3次，样品浓度根据荷叶碱和槲皮素标准曲线计算得来。
[0055]
实施例1
[0056]
在植物提取中使用纤维素酶果胶酶等处理可解开细胞壁屏障，释放荷叶中生物碱和黄酮类物质。
[0057]
以250ml提取液为例，6.25g荷叶添加200ml水在50℃浸泡30min，用柠檬酸溶液调节ph值至4.5；以上各方案酶制剂用适量水活化后加入其中，酶解2h，再加入2.5g吐温80(1％)定容至250ml；在60℃，480w条件下超声40min后，抽滤，滤液使用旋转蒸发仪浓缩至20-40g；检测不同方案酶制剂提取液中总黄酮、总酚、总生物碱含量，高效液相色谱定量分析其荷叶碱和槲皮素含量。
[0058]
选取夏盛液体纤维素酶spe0-17、夏盛固体纤维素酶、夏盛果胶酶、诺维信ktn02309复合酶，诺维信kon10061果胶酶，分为5组进行实验；实验方案见表1。
[0059]
表1
[0060][0061]
由图1可知，酶制剂对活性物质的提取有较大影响。对比方案一、方案二、方案三，方案三在总黄酮，槲皮素的含量上有较大优势；由图2可知，高效液相色谱(hplc)图也可明显看出，使用方案三(诺维信ktn02309复合酶)比方案一(夏盛液体纤维素酶spe0-17)在槲皮素的提取上具有显著优势；对比方案三和方案五，诺维信kon10061果胶酶的添加显著提高了提取液中总生物碱的含量，其它生物活性物质均有不同程度的提高。
[0062]
实施例2
[0063]
以250ml提取液为例，6.25g荷叶添加200ml水在50℃浸泡30min，用柠檬酸溶液调节ph值至4.0-5.35；0.05g诺维信ktn02309复合酶和0.05g诺维信kon10061果胶酶活化后加入其中，搅拌均匀，酶解2h，再加入2.5g吐温80(1％)定容至250ml；在60℃，480w条件下超声
40min后，抽滤，滤液使用旋转蒸发仪浓缩至20-40g；
[0064]
检测酶解不同ph值提取液中总黄酮，总酚，总生物碱含量，高效液相色谱定量分析其荷叶碱和槲皮素含量。
[0065]
由图3可知，随着ph值的降低，总酚、总黄酮、总生物碱含量在一定范围内波动，总体增长不明显，槲皮素含量在未调ph值5.35到ph值5.0时有增长，ph4.0至5.0波动小，荷叶碱含量随着ph值降低呈逐步增加趋势。
[0066]
实施例3
[0067]
以250ml提取液为例，6.25g荷叶添加200ml水在50℃浸泡30min，用柠檬酸溶液调节ph值至4.5；0.05g夏盛液体纤维素酶spe0-17和0.05g夏盛果胶酶活化后加入其中，搅拌均匀，酶解2h，再加入上述表面活性剂，其中甘油浓度为10％，其余浓度为1％，定容至250ml；在60℃，480w条件下超声40min后，抽滤，滤液使用旋转蒸发仪浓缩至20-40g。
[0068]
选取具有增溶作用的甘油，吐温20，吐温60，吐温80，司盘80，聚甘油月桂酸酯，聚甘油辛癸酸酯作为提取溶剂，检测不同表面活性剂提取液中总黄酮，总酚，总生物碱含量，高效液相色谱定量分析其荷叶碱和槲皮素含量。
[0069]
表2不同表面活性剂对提取率的影响
[0070][0071]
从表2中可以看出，在吐温20，吐温60，吐温80中，吐温80在各类物质的提取中均有不同程度的优势，在gb 2760植物饮料的规定中，吐温系列的限量在0.5g/kg产品，这就意味着，在一瓶300ml的植物饮料中，添加吐温限量要求的荷叶提取物，终产品中荷叶碱含量小于1mg/瓶，不能满足现有技术中降脂功效每日≥2mg荷叶碱的要求，而甘油(丙三醇)在gb 2760中作为食品添加剂/加工助剂使用时没有限量要求；对比1％吐温80和10％甘油提取，吐温80在总生物碱，槲皮素含量上由较大优势，甘油提取在总酚含量上较高，两者荷叶碱含量相差不大，在实际提取过程中发现，使用甘油作为提取溶剂时，提取液颜色澄清透亮，浓缩后呈酒红色无杂质，感官评价好。
[0072]
实施例4
[0073]
以250ml提取液为例，6.25g荷叶添加200ml水在50℃浸泡30min，用柠檬酸溶液调节ph值至4.5；0.05g夏盛液体纤维素酶spe0-17和0.05g夏盛果胶酶活化后加入其中，搅拌均匀，酶解2h，2.5g吐温80(1％)定容至250ml；在在50℃-80℃，480w条件下超声30-60min后，抽滤，滤液使用旋转蒸发仪浓缩至20-40g。
[0074]
选取超声时间30min，40min，50min，60min，超声温度50℃，60℃，70℃，80℃为不同
超声条件，检测不同超声条件提取液中总黄酮，总酚，总生物碱含量，高效液相色谱定量分析其荷叶碱和槲皮素含量。
[0075]
由图4可知，在超声温度60℃，时间30min-60min范围内，在40min时，总黄酮、荷叶碱含量均达到最大值，槲皮素含量小幅度波动，因此，本发明选择40min为最佳超声时间；由图5可知，在超声时间40min，超声温度50-80℃范围内，在超声温度为60℃时总黄酮、槲皮素含量均达到最大值，荷叶碱含量小幅度波动，总酚含量差异不大，因此，本发明选择60℃为最佳超声温度。
[0076]
实施例5
[0077]
以250ml提取液为例，分别添加5g荷叶，7.5g荷叶，10g荷叶，12.5g荷叶，15g荷叶，20g荷叶在50℃，200ml水中浸泡30min，用柠檬酸溶液调节ph值至4.5；0.05g诺维信ktn02309复合酶和0.05g诺维信kon10061果胶酶活化后加入其中，搅拌均匀，酶解2h，加入1.3.3中优选的表面活性剂定容至250ml；在60℃，480w条件下超声40min后，抽滤，滤液使用旋转蒸发仪浓缩至20-40g，由于吐温提取液放置一段时间后有少量白色沉淀，本发明还对比了1％吐温80提取液离心前后的差异；检测不同料液比提取液中总黄酮，总酚，总生物碱含量，高效液相色谱定量分析其荷叶碱和槲皮素含量。
[0078]
由图6可知，1％吐温80体系中，由左至右，随着荷叶浓度的增加，提取液黄绿色变浅，溶液由澄清变浑浊。
[0079]
由图7可知，在1％吐温80溶液中随着荷叶浓度的增加，总黄酮，总酚，总生物碱没有规律性增加，呈先下降后升高态势，总体无增长，但槲皮素含量呈急剧下跌趋势；比较离心前后各活性物质含量，离心后部分物质含量虽有小幅下降，幅度不大，为充分保证提取液稳定性，在1％吐温体系中，选取5g荷叶/250ml提取液作为最适浓度；
[0080]
由图7可知，在10％甘油溶液中随着荷叶浓度的增加，总黄酮，总酚，总生物碱均呈逐渐增加趋势，槲皮素总体含量较低在小范围内波动，荷叶碱含量小幅波动后在20g荷叶/250ml提取液时达到最大值；综合考量，在10％甘油体系中，选取20g荷叶/250ml提取液。
[0081]
对比1％吐温80和10％甘油提取，1％吐温80在总生物碱、槲皮素含量上有较大优势，而甘油体系有助于总酚，总黄酮的提取；在荷叶浓度为20g荷叶/250ml提取液时，使用10％甘油作为提取溶剂提取，总黄酮含量最高可达约800mg/份，总酚含量高达约600mg/份。图8为使用1％吐温80荷叶浓度为5g荷叶/250ml提取液和10％甘油荷叶浓度为20g荷叶/250ml提取液时，高效液相色谱定量分析荷叶碱和槲皮素含量，可明显看出，前者对槲皮素的提取更有优势。
[0082]
实施例6
[0083]
干燥荷叶粉碎后过60目筛备用；粉碎后的荷叶粉在50℃水中浸泡30min后用柠檬酸调节ph值，使用0.05g诺维信ktn02309复合酶和0.05g诺维信kon10061果胶酶将荷叶在ph为4.0温度为50℃酶解2h；然后分别加入1％浓度的吐温80和10％浓度的甘油，在60℃，480w的条件下超声40分钟后过滤，提取液经过旋转蒸发仪浓缩至适宜体积。其中使用1％浓度的吐温80荷叶浓度为5g荷叶/250ml提取液，使用10％浓度的甘油荷叶浓度为20g荷叶/250ml提取液。
[0084]
对照组1：选取与实施例6相同的荷叶浓度，即5g荷叶/250ml提取液及20g荷叶/250ml提取液；不调节ph；
[0085]
对照组2：选取5g荷叶/250ml提取液ph值为4的提取方法；其余参数与对照1相同。
[0086]
检测不同料液比提取液中总黄酮，总酚，总生物碱含量，高效液相色谱定量分析其荷叶碱和槲皮素含量。
[0087]
由图9a可知，提取液未浓缩前均较为澄清，本发明中的甘油提取颜色较浅，吐温提取呈黄绿色，75％乙醇提取由于叶绿素的溶出绿色较深，当荷叶浓度为20g/250ml时，颜色非常深；由图9b可知，在提取液浓缩后，乙醇提取的2号，4号，5号均有许多沉淀，分析为叶绿素及一些不溶于水的黄酮，生物碱及其他物质的沉淀，1中底部由少量白色沉淀，甘油提取的3号呈酒红色无沉淀；图9c是图9b浓缩液离心后颜色；图9d为图9c加水稀释5倍复溶后的颜色，可以看出5种提取液复溶后澄清度良好；
[0088]
由图10可知，与有机提取相比，本发明方法中的吐温提取在槲皮素和总生物碱的提取中具有显著优势，而本发明方法中的甘油提取则在总黄酮和总酚含量上具有无可比拟的优势，75％乙醇提取时，荷叶浓度增大到20g/250ml较5g/250ml各物质的含量由显著增加，ph值由初始调节为4时，总酚和荷叶碱含量有显著提升，图11为使用高效液相色谱分析荷叶碱和槲皮素含量的差异，可明显看出本发明方法中图11a吐温提取槲皮素时的优势，而图11b、图11d和图11e使用75％乙醇提取不能有效将其提取出来，在图11e将ph调为4.0时，荷叶碱含量有明显增加。
[0089]
实施例7
[0090]
干燥荷叶粉碎后过60目筛备用；取10g荷叶添加400ml水在50℃浸泡30min，用柠檬酸溶液调节ph值至4.0，使用活化后的0.1g诺维信ktn02309复合酶和0.1g诺维信kon10061果胶酶将荷叶在ph为4.0温度为50℃酶解2h；然后加入2.5g吐温80(1％)、25g甘油定容至500ml，在60℃，480w的条件下超声40min后过滤，提取液经过旋转蒸发仪浓缩至适宜体积。测试计算得总黄酮、总酚、总生物碱、槲皮素收率。
[0091]
实施例8
[0092]
干燥荷叶粉碎后过60目筛备用；取40g荷叶添加200ml水在50℃浸泡30min，用柠檬酸溶液调节ph值至4.0，使用活化后的0.1g诺维信ktn02309复合酶和0.1g诺维信kon10061果胶酶将荷叶在ph为4.0温度为50℃酶解2h；然后加入2.5g吐温80(1％)、25g甘油定容至500ml，在60℃，480w的条件下超声40min后过滤，提取液经过旋转蒸发仪浓缩至适宜体积。测试计算得总黄酮、总酚、总生物碱、槲皮素收率。
[0093]
表3
[0094]
提取量mg/g黄酮酚生物碱荷叶碱槲皮素实施例7105.3350.7426.473.366.54实施例8112.6456.7322.393.545.12
[0095]
前述对本发明的具体示例性实施方案的描述是为了说明和例证的目的。这些描述并非想将本发明限定为所公开的精确形式，并且很显然，根据上述教导，可以进行很多改变和变化。对示例性实施例进行选择和描述的目的在于解释本发明的特定原理及其实际应用，从而使得本领域的技术人员能够实现并利用本发明的各种不同的示例性实施方案以及各种不同的选择和改变。本发明的范围意在由权利要求书及其等同形式所限定。