低级别胶质瘤细胞焦亡相关lncRNA预后模型的构建方法与流程

低级别胶质瘤细胞焦亡相关lncrna预后模型的构建方法
技术领域
1.本发明涉及医学技术领域，具体涉及一种低级别胶质瘤细胞焦亡相关 lncrna预后模型的构建方法。


背景技术：

2.胶质瘤是最常见的颅内恶性肿瘤，传统上分为低级别胶质瘤和高级别胶质瘤，低级别的胶质瘤是指who1～2级的胶质瘤。随着分子检测和测序技术的发展，低级别胶质瘤和高级别胶质瘤的区分已经从组织学向分子标志物转变。参考idh和1p/19q等分子状态，基于传统组织学的胶质瘤误诊概率约为6％～35％。2016年，who对胶质瘤进行了分子分类，指出分子特征对胶质瘤的诊断和预后有重要影响。因此，准确的诊断和分子靶向治疗对于提高低级别胶质瘤患者的生存时间和生存质量具有重要意义。
3.lncrnas是一种长度大于200个核苷酸的非编码rna。lncrnas在结构上与mrna相似，但有许多mrna不具备的特性。lncrnas的生物学功能非常多样和异质的，取决于它们的亚细胞定位，可以通过影响mrna的翻译或直接与蛋白质和其他rna物种相互作用来控制染色质修饰、染色体循环、dna 转录、编辑和稳定mrna[]。
[0004]
细胞焦亡(pyroptosis)是一种独特的程序性细胞死亡形式(programmed celldeath,pcd)，其特征是dna断裂、染色质凝结、胞肿胀，胞质外流，最终导致细胞膜破裂，既往研究发现，它与炎症性疾病和恶性肿瘤等密切相关。随着研究的不断深入，少部分肿瘤可以通过诱导细胞焦亡发生炎症反应进而促进免疫细胞t细胞抗肿瘤免疫的发生，最终诱发肿瘤细胞死亡。先前的研究报道了gasdermin相关蛋白在肿瘤诱导细胞焦亡在肿瘤免疫中发挥重要作用，但目前研究发现，在胶质瘤中非编码rna-hsa_circ_0001836被证明其下调能够诱导nlrp1上调促使胶质瘤细胞的焦亡发生。此外，细胞焦亡相关lncrna与低级别胶质瘤患者的预后评价尚不明确。因此，需要提供一种低级别胶质瘤细胞焦亡相关lncrna预后模型的构建方法，以解决上述现有存在的问题。


技术实现要素：

[0005]
有鉴于此，本发明提供一种低级别胶质瘤细胞焦亡相关lncrna预后模型的构建方法，通过tcga中低级别胶质瘤数据筛选与细胞焦亡相关lncrnas，并利用cox回归分析筛选预后相关lncrnas建立模型，并进行gsea，ssgsea 和免疫浸润相关分析，为临床低级别胶质瘤患者的治疗及预后提供重要的参考依据。
[0006]
为解决上述技术问题，本发明提供一种低级别胶质瘤细胞焦亡相关 lncrna预后模型的构建方法，包括以下步骤：
[0007]
步骤1、数据来源和处理，筛选出低级别胶质瘤患者生存的信息、与细胞焦亡强相关的lncrna；
[0008]
步骤2、利用r语言合并经步骤1中筛选的低级别胶质瘤患者生存的信息及与细胞焦亡强相关的lncrna表达矩阵信息，运行“survival”包对步骤1筛选的与细胞焦亡强相关
lncrna进行单因素cox回归分析，计算每个差异 lncrna与患者的生存风险比；
[0009]
步骤3、将步骤2中的差异lncrna进行多因素cox回归分析并建立预后风险评分模型，筛选条件设定p《0.05。
[0010]
进一步的，所述步骤3中的风险评分模型的公式为其中 coef表示lncrna在多因素cox回归分析中的回归系数，x为基因表达量，n 为对应的模型基因总数。
[0011]
进一步的，根据风险评分模型的公式计算出所有样品的风险得分，取中位值将样本分为高低风险组。
[0012]
进一步的，所述风险评分模型的高低风险组的生存分析采用r软件“survival”包进行kaplan-meier生存曲线进行绘制，同时利用“time roc”包和“ggdca”建立时间依赖型的roc曲线和dca决策曲线，并计算曲线下面积，评价模型的有效性。
[0013]
进一步的，所述风险评分模型的可靠性评价利用“rms”包绘制列线图评估实际与预测生存是否一致，并绘制校准曲线以评价模型的可靠性。
[0014]
进一步的，所述步骤1采用如下方式实现：从tcga数据库中下载lgg 患者的rna测序数据及相应的临床信息，包括若干低级别胶质瘤测序数据，应用perl软件将测序数据与临床数据合并后得到一定数量包含测序结果以及生存、年龄、性别和分级的患者数据，从分子特征数据库msig-db用pyroptosis 检索并将数据库中检索基因合并，最后得到一定数量细胞焦亡相关基因，利用皮尔逊相关性算法对低级别胶质瘤矩阵中的lncrna矩阵进行共表达分析，过滤标准为p《0.001,cor值大于0.7，筛选出一定数量与细胞焦亡强相关的 lncrna。
[0015]
本发明的上述技术方案至少包括以下有益效果：本发明通过tcga中低级别胶质瘤数据筛选与细胞焦亡相关lncrnas，并利用cox回归分析筛选预后相关lncrnas建立模型，并进行gsea，ssgsea和免疫浸润相关分析，为临床低级别胶质瘤患者的治疗及预后提供重要的参考依据。
附图说明
[0016]
图1为本发明实施例中单因素cox回归分析细胞焦亡lncrna与预后关系的森林图；
[0017]
图2为本发明实施例中相关性网络图和模型临床相关性热图，图2a为相关性网络，图2b为临床相关性热图；
[0018]
图3为本发明实施例中rs分布图及k-m法生存曲线分析，图3a为高低风险组rs分布，图3b为预后模型患者生存状况，图3c为低级别胶质瘤患者的生存曲线，图3d为预后模型的roc曲线；
[0019]
图4为本发明实施例中模型预测效能评估及列线图，图4a为各临床指标与rs的roc曲线和dca曲线分析比较，图4b为模型列线图，图4c为列线图1、3、5年校准曲线；
[0020]
图5为本发明实施例中基于高低风险分组对免疫细胞、免疫功能和免疫检查点相关性分析，图5a为不同算法免疫细胞相关性分析，图5b为免疫功能相关性分析，图5c为免疫检查点相关性分析。
具体实施方式
[0021]
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例
的附图1-5，对本发明实施例的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于所描述的本发明的实施例，本领域普通技术人员所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0022]
一种低级别胶质瘤细胞焦亡相关lncrna预后模型的构建方法，包括以下步骤：步骤1：数据来源和处理，筛选出低级别胶质瘤患者生存的信息、与细胞焦亡强相关的lncrna；采用如下方式实现：从tcga数据库中下载lgg 患者的rna测序数据及相应的临床信息，包括529例低级别胶质瘤测序数据，其中临床信息完整的样本数为523例。应用perl软件将测序数据与临床数据合并后得到508例包含测序结果以及生存、年龄、性别和分级的患者数据，由于 tcga数据库中低级别胶质瘤的转录组测序结果是公开的。因此，本研究不需要地方伦理委员会的批准。目前的研究遵循tcga的数据访问政策和出版准则。所有数据下载于2021年6月1日，从分子特征数据库msig-db用pyroptosis 检索并将数据库中检索基因合并，最后得到40个细胞焦亡相关基因，利用皮尔逊相关性算法对低级别胶质瘤矩阵中的lncrna矩阵进行共表达分析，过滤标准为p《0.001，cor值大于0.7，筛选出57个与细胞焦亡强相关的lncrna。
[0023]
步骤2：利用r语言合并经步骤1中筛选的低级别胶质瘤患者生存的信息及与细胞焦亡强相关的lncrna表达矩阵信息，运行“survival”包对步骤1筛选的与细胞焦亡强相关lncrna进行单因素cox回归分析，计算每个差异 lncrna与患者的生存风险比。
[0024]
步骤3：将步骤2中的差异lncrna进行多因素cox回归分析并建立预后风险评分模型，筛选条件设定p《0.05，风险评分模型的公式为其中coef表示lncrna在多因素cox回归分析中的回归系数，x为基因表达量，n为对应的模型基因总数。根据风险评分模型的公式计算出所有样品的风险得分，取中位值将样本分为高低风险组。所述风险评分模型的高低风险组的生存分析采用r软件“survival”包进行kaplan-meier生存曲线进行绘制，同时利用“time roc”包和“ggdca”建立时间依赖型的roc曲线和dca决策曲线，并计算曲线下面积，评价模型的有效性。所述风险评分模型的可靠性评价利用“rms”包绘制列线图评估实际与预测生存是否一致，并绘制校准曲线以评价模型的可靠性。
[0025]
1、分析和验证
[0026]
1.1基因富集分析
[0027]
采用gsea4.1.0版本软件对上述模型中7个预后相关的细胞焦亡lncrna进行基因集富集分析，研究风险评分与京都基因和基因组百科全书通路基因集(kegg)的相关性。从msigdb数据库中下载通路富集的c2.c p.kegg.v7.2.symbols基因集作为参照基因集。软件中随机组合次数设置为为 1000次，计算富集系数和标准化后的富集系数。按照错误发现率false discoveryrates，fdr)进行排序，按照p《0.05且fdr《0.01对通路进行过滤。
[0028]
1.2统计学分析
[0029]
采用4.1.3版本的r软件，cytoscape软件进行统计学分析及绘图。预后相关lncrna筛选使用皮尔逊相关性算法，生存分析采用kaplan-meier和 log-rank检验法。并对单因素及多因素cox比例风险模型分析中均以p《 0.05为差异有统计学意义gsea判断通路显著富集的标准为，p《0.05且 fdr《0.01。
[0030]
2、结果
[0031]
2.1细胞焦亡相关lncrna的筛选
[0032]
利用perl和r语言对从tcga下载的原始文件进行整理和提取，对提取好的基因矩阵区分mrna和lncrna，其中包含19541个mrna和14004个 lncrna，从中将msig-db数据库获取的40个细胞焦亡相关基因提取，根据相关性系数r≥0.7，p《0.001的标准得到57个与细胞焦亡相关的lncrnas。
[0033]
2.2预后模型构建
[0034]
将上述与细胞焦亡相关的57个lncrna与临床信息进行合并，如图1所示，单因素cox回归分析得到22个与预后相关lncrna，经多因素cox回归算法筛选，最终模型由筛选出的7个lncrna进行构建。如图2a所示，il18和 pycard与linc02285和ac004921.1都存在正相关，此外ac145098.1同时与casp5和nlrc4的相关性大于0.7。因此风险指数riskscore＝linc02285
×
(-1.38504) slc25a25-as1
×
(-0.31593) ac120036.4
×
(-0.23 671) psmb8as1
×
0.108327 cytor
×
0.2098 ac145098.1
×
0.346733 ac00492 1.1
×
0.921043。根据风险指数中位值将患者分为高风险组(n＝254)和低风险组 (n＝254)。如图2b所示，高低风险组与肿瘤的g2,g3分级显著相关(p《0.001)，同时cytor、linc02285、ac004921.1、ac145098.1、psmb8-as1在高风险组的表达明显高于低风险组，slc25a25-as1与ac120036.4则相反。
[0035]
2.3预后模型稳定性和准确性评估
[0036]
如图3a和3b所示，在同时间段内，高风险患者比低风险患者死亡率更高，风险曲线和散点图显示了模型中低级别胶质瘤患者的生存状态，同时 kaplan-meier曲线显示高风险组患者的总生存期明显低于低风险组患者(图3c, p《0.001)。采用roc曲线评价该模型风险评分的预测性能，曲线下面积在1 年达到0.854,2年达到0.826,3年达到0.805，证明了该模型的准确性(图3d)。为进一步确定risk score的风险值，利用单多因素cox回归方法对模型中riskscore和临床病理参数进行分析，如表2所示，单因素cox回归分析表明年龄、分级和风险评分均与总生存期相关(p《0.001)，多因素cox回归分析揭示了风险评分可以作为患者总生存期的一个独立预测因子(p《0.001)，此外胶质瘤的分级也与患者的总生存期相关，可以作为预后独立评估因子(p＝0.002)。如图4a所示，dca决策曲线和临床roc曲线显示了risk score作为预测因子的可靠性，同时根据模型与临床信息构建列线图预测病人三年内的生存，而列线图校准曲线进一步说明了该模型的准确性(图4b和4c)。如表3所示，gsea 分析结果表明高风险组主要富集在溶酶体和细胞凋亡等相关通路。表明该模型中的7种细胞焦亡相关lncrna的所构建的模型中，高风险组主要与上述通路有关。
[0037]
表2：单因素和多因素cox回归分析影响患者总生存期的因素
[0038][0039]
表3：高风险组基因富集通路基因集
[0040][0041]
[0042][0043]
2.4免疫相关性分析
[0044]
为了进一步探讨该模型预后与患者免疫状态的相关性，采用7种免疫细胞相关算法对两组患者的免疫细胞和免疫相关功能的浸润评分进行量化。如图 5a所示，两组之间存在显著差异的主要有t细胞，b细胞和巨噬细胞。基于 tcga-lgg数据的ssgsea对免疫细胞亚群进行相关分析，发现apc共刺激、炎症促进、检查点、t细胞共抑制等13种免疫功能评分在低风险组和高危组之间均有极显著差异(图5b，p《0.001)，并且这些免疫功能在高风险组的评分均高于低风险组。同时分析47个免疫检查点在高低风险组的表达情况显示，所有的免疫检查点在高低风险组表达均有差异，除tnfrsf25与cd200外，有明显表达的免疫检查点均在高风险组高表达，这与免疫功能的分析结果保持一致(图5c，p《0.05)。
[0045]
与其他研究相比，本发明创新点在于缩小研究范围，探索细胞焦亡相关的 lncrna对于预后的影响，首次根据细胞焦亡相关基因构建的预测模型。此外，通过对高低风险分组进行gsea、ssgsea和免疫检查点相关性分析。与单个基因预后指标相比，多个基因具有更好的准确性和稳定性。该模型是合理的，可以接受未来的临床试验，其他临床数据集将有助于重新评估风险模型的价值。因此，收集数据库以进一步验证此风险模型，随着前瞻性临床试
验的进一步验证，将在低级别胶质瘤患者咨询和个体化治疗方面取得进展。随着越来越多的研究人员提倡将靶向和常规癌症治疗与免疫治疗相结合，通过将细胞焦亡诱导剂与免疫治疗相结合来改善临床治疗。
[0046]
以上是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以作出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。