CD140a+间充质干细胞亚群在治疗神经损伤中的用途

cd140a 间充质干细胞亚群在治疗神经损伤中的用途
技术领域
1.本发明涉及生物技术领域，具体地，本发明涉及cd140a 间充质干细胞亚群在治疗神经损伤中的用途，更具体地，本发明涉及用于修复神经损伤的药物组合物、cd140a( )间充质干细胞在制备药物中的用途、用于神经细胞培养的培养基、以及促进神经细胞树突增长的非治疗性方法。


背景技术：

2.神经损伤会给患者带来长期的身心痛苦和经济负担，且目前没有令人满意的治疗方案。通常而言，神经组织的自我修复能力很弱恢复速度非常慢，对于比较严重的损伤，恢复周期通常很长一般至少要数月的时间甚至有些会遗留不同程度的后遗症。
3.因此，目前的针对神经损伤的治疗手段仍有待改进。


技术实现要素：

4.本技术是基于发明人对下列问题和事实的发现而提出的：
5.本技术的发明人在对神经损伤进行研究的过程中，意外发现，部分间充质干细胞亚群具有促进神经损伤修复的功能，并由此进行了进一步深入的研究，发明人发现cd140a( )间充质干细胞与其他的间充质干细胞亚群相比，具有更优的修复神经损伤功能。
6.在本技术的第一方面，本技术提出了一种用于修复神经损伤的药物组合物，其含有：cd140a( )间充质干细胞作为活性成分。本发明的发明人通过对间充质干细胞进行了深入研究，意外地发现，cd140a( )间充质干细胞能够有效地修复神经损伤，并且与细胞表面不表达cd140a的cd140a(-)间充质干细胞相比，cd140a( )间充质干细胞要显著地更高。当然本领域技术人员能够理解的是，本领域技术人员可以根据任何已知的表面分子对间充质干细胞进行亚群分类，本发明的发明人也是通过多种分类后发现，cd140a作为分类指标所得到的的阳性细胞能够有效地修复神经损伤。
7.在本技术的第二方面，本技术提出了cd140a( )间充质干细胞在制备药物中的用途，所述药物用于治疗或者预防神经损伤。
8.根据本技术的实施例，所述神经损伤与神经细胞内tau蛋白过度磷酸化有关。
9.根据本技术的实施例，所述神经损伤是由冈田酸引发的神经元细胞损伤。
10.根据本技术的实施例，所述神经损伤包括神经细胞损伤包括神经细胞树突轴突缩短。
11.在本技术的第三方面，本技术提出了一种用于神经细胞培养的培养基，其含有：基础培养基；和cd140a( )间充质干细胞。
12.在本技术的第四方面，本技术提出了一种促进神经细胞树突增长的非治疗性方法，其包括：在存在cd140a( )间充质干细胞的条件下，培养所述神经细胞。
13.根据本技术的实施例，所述神经细胞为人神经母细胞瘤细胞系sh-sy5y。
14.根据本技术的实施例，所述神经细胞具有树突轴突缩短、胞体肿胀和细胞分支数
减少的至少之一。
15.根据本技术的实施例，所述神经细胞内tau蛋白过度磷酸化。
附图说明
16.图1显示了免疫荧光标记oa损伤sh-sy5y后形态学变化，以及cd140a( )间充质干细胞对神经细胞的影响。con表示对照细胞，即未经过oa损伤处理的细胞，oa表示经过oa损伤处理的细胞，msc-cd140a 表示采用cd140a( )间充质干细胞修复处理的细胞，msc-cd140a-表示采用cd140a(-)间充质干细胞修复处理的细胞。
17.图2-4分别表示根据本技术实施例对各组细胞进行神经细胞特征参数进行比较的结果示意图(图2表示平均轴突长度统计，图3平均分支数统计，图4平均树突分支数统计)。
具体实施方式
18.下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
19.本发明所使用的术语“间充质干细胞”又称多潜能基质细胞，简称mscs，是属于中胚层的一类多能干细胞，主要存在于结缔组织和器官间质中，包括：骨髓、脐带、脂肪、粘膜、骨骼、肌肉、肺、肝、胰腺等组织以及羊水、羊膜、胎盘等。根据本技术的实施例，优选采用人脐带间充质干细胞。在适宜条件下可分化为脂肪、骨、软骨等多种组织细胞。本领域技术人员能够理解的是，在本文中所使用的术语“间充质干细胞”应该被理解为既包括从动物体分离的原代细胞，还包括通过间充质干细胞进行的衍生物，例如对间充质干细胞进行培养后得到的培养物，只要仍具有一定的分化能力即可。
20.如无特别说明，在本文中所述的术语“cd140a( )间充质干细胞”，也可以称为“cd140a阳性间充质干细胞”、“表达cd140a的间充质干细胞”或者“cd140a 间充质干细胞”，是指一种间充质干细胞的亚群，其细胞的表面表达cd140a(血小板衍生生长因子受体α，platelet-derived growth factor receptor-α，pdgfr-α)。本领域技术人员可以通过常规的分选手段，从多种间充质干细胞的混合物中，分离特定的干细胞亚群，例如采用特异性识别cd140a的抗体，采用流式细胞仪，可以分离相应的表面表达cd140a的间充质干细胞。当然，在获得这些间充质干细胞后，还可以对这些间充质干细胞进行培养扩增。另外，
21.本发明所使用的术语“治疗”或者任何疾病或病症，在其中一些实施方案中指改善疾病或病症(即减缓或阻止或减轻疾病或其至少一种临床症状的发展)。在另一些实施方案中，“治疗”指缓和或改善至少一种身体参数，包括可能不为患者所察觉的身体参数。在另一些实施方案中，“治疗”指从身体上(例如稳定可察觉的症状)或生理学上(例如稳定身体的参数)或上述两方面调节疾病或病症。在另一些实施方案中，“治疗”指预防或延迟疾病或病症的发作、发生或恶化。
22.在本技术的第一方面，本技术提出了一种用于修复神经损伤的药物组合物，其含有：cd140a( )间充质干细胞作为活性成分。
23.在本技术的第二方面，本技术提出了cd140a( )间充质干细胞在制备药物中的用
途，所述药物用于治疗或者预防神经损伤。
24.本发明的发明人通过对间充质干细胞进行了深入研究，意外地发现，cd140a( )间充质干细胞能够有效地修复神经损伤，并且与细胞表面不表达cd140a的cd140a(-)间充质干细胞相比，cd140a( )间充质干细胞要显著地更高。当然本领域技术人员能够理解的是，本领域技术人员可以根据任何已知的表面分子对间充质干细胞进行亚群分类，本发明的发明人也是通过多种分类后发现，cd140a作为分类指标所得到的的阳性细胞能够有效地修复神经损伤。
25.这里所使用的表达方式“神经损伤”包括与正常的神经细胞相比，神经细胞具有树突轴突缩短、胞体肿胀和细胞分支数减少的至少之一，本领域技术人员可以通过常规检验获知个体具有上述神经损伤，当然也可以确定神经损伤是否获得修复。
26.根据本技术的实施例，所述神经损伤与神经细胞内tau蛋白过度磷酸化有关。微管系统是神经细胞骨架成分，可参与多种细胞功能。微管由微管蛋白及微管相关蛋白组成，tau蛋白是含量最高的微管相关蛋白。这里所述的“过度磷酸化”是指与正常神经细胞相比，受损的神经细胞内tau蛋白的磷酸化水平更高。
27.根据本技术的实施例，所述神经损伤是由冈田酸引发的神经元细胞损伤。根据本技术的实施例，所述神经细胞为人神经母细胞瘤细胞系sh-sy5y。
28.根据本技术的实施例，所述神经损伤包括神经细胞损伤包括神经细胞树突轴突缩短。
29.在本技术的第三方面，本技术提出了一种用于神经细胞培养的培养基，其含有：基础培养基；和cd140a( )间充质干细胞。
30.在本技术的第四方面，本技术提出了一种促进神经细胞树突增长的非治疗性方法，其包括：在存在cd140a( )间充质干细胞的条件下，培养所述神经细胞。
31.根据本技术的实施例，所述神经细胞为人神经母细胞瘤细胞系sh-sy5y。
32.根据本技术的实施例，所述神经细胞具有树突轴突缩短、胞体肿胀和细胞分支数减少的至少之一。
33.根据本技术的实施例，所述神经细胞内tau蛋白过度磷酸化。
34.本领域技术人员能够理解的是，上述培养基中的基础培养基可以是任何已知的可以用于培养神经细胞的培养基，可以根据神经细胞的类型和期望的用途进行适当选择。
35.需要说明的是，神经细胞损伤的修复不仅可以应用于治疗目的，还可以应用于多个不同的非治疗目的的场景，例如在科研领域，在分离原代神经细胞后，在分离过程中或者在培养过程中，会出现神经细胞的损伤或者呈现多种损伤的性状，例如tau蛋白过度磷酸化、树突轴突缩短、胞体肿胀和细胞分支数减少的至少之一，通过采用本发明提出的方案，可以在培养的过程中添加在cd140a( )间充质干细胞，可以有效地获得健康的或者经过修复的神经细胞。
36.下面通过具体的实施例，对上述技术方案进行说明。
37.实施例1构建神经损伤模型
38.在该实施例中，发明人采用冈田酸对人神经母细胞瘤细胞系sh-sy5y进行处理，得到了模拟神经元损伤的体外模型。
39.具体的，对人神经母细胞瘤细胞系sh-sy5y进行处理的过程包括：
40.1、细胞培养：利用多孔板，将sh-sy5y细胞用含10％胎牛血清蛋白(gibco，10099141，usa)的高糖培养基(gibco，d6429，usa)培养于37℃，5％co2培养箱中；
41.2、诱导：镜下观察细胞状态良好，采用dpbs缓冲液清洗两遍后，每孔20nm加入冈田酸(sigma，o8010，usa)，37℃损伤24h。
42.在进行诱导处理后，发明人通过染色对oa损伤处理的神经细胞进行拍照，结果示意图如图1的oa列所示。如图1中以箭头所指细胞为例，经过oa损伤处理神经细胞后，细胞tau蛋白过度磷酸化，骨架蛋白稳定性降低，神经细胞树突轴突缩短，胞体肿胀，细胞分支数减少，说明模型建立成功，所得到的的oa损伤处理的神经细胞能够有效地模拟神经损伤疾病。
43.实施例2 cd140a( )间充质干细胞的分离
44.在本实施例中，通过采用流式细胞仪，对间充质干细胞进行分选，得到cd140a( )间充质干细胞和cd140a(-)间充质干细胞。
45.具体的，采用流式细胞仪分选包括如下步骤：
46.1、人脐带间充质干细胞的制备：利用组织块贴壁培养方法获得原代脐带间充质干细胞，经扩增、传代和鉴定后，存储充足数量的细胞以备后期实验；
47.2、收集细胞并孵育抗体：正常培养人脐带间充质干细胞，待细胞生长至汇合度85％-90％以上时胰酶消化，根据细胞量避光加入适量cd140a抗体(biolegend，323506，usa)，4℃孵育40min；
48.3、制单细胞悬液：清洗两次并过筛将细胞置于流式无菌分选管中，并根据使用含1x双抗的培养基重悬；
49.4、细胞分选：利用流式分选仪(bd influx ii，usa)分选获得cd140a( )和cd140a(-)间充质干细胞，阴性细胞和阳性细胞等比例收取至含培养基的收集管内；
50.5、制备条件培养基：分选后，根据细胞量选择合适接种容器，待细胞长至汇合度50％时，清洗两次，将培养基更换为高糖培养基并至37℃，5％co2孵箱孵育48h。48小时后，待其密度长到80％以上时，吸取上清，4000转/分离心10分钟，去细胞碎片，取上清，0.22μm小滤器过滤，分装，-80℃保存。
51.实施例3 cd140a( )间充质干细胞对神经细胞的修复
52.在本实施例中，采用cd140a( )间充质干细胞对实施例1中得到的神经元损伤体外模型进行处理，并观察添加cd140a( )间充质干细胞的修复效果，示意性的结果如图1～4中所示。在图1中，con表示对照细胞，即未经过oa损伤处理的细胞，oa表示经过oa损伤处理的细胞，msc-cd140a 和msc-cd140a 分别表示采用cd140a( )或cd140a(-)间充质干细胞修复处理的细胞。
53.具体的，包括下列步骤
54.1、按照实施例1所描述的方法，采用冈田酸对人神经母细胞瘤细胞系sh-sy5y进行处理构建神经损伤模型；
55.2、治疗：sh-sy5y神经损伤模型清洗两遍后，对照组和损伤组加入高糖培养基，治疗组加入收集的cd140a( )和cd140a(-)间充质干细胞的条件培养基，37℃修复12h；
56.3、活细胞染色：将接种在孔板中的模型清洗两遍后，加入hoechst 33342染料(solarbio，c0030，china)室温避光孵育10min，清洗两遍，再加入1：1000稀释的钙黄绿素
(sigma，17783，usa)室温避光孵育30min。
57.4、模型分析：
58.①
荧光拍摄：打开高内涵成像系统(opera phenix，pe，usa)，选择相应的检测孔板，并勾选对应荧光通道，显微镜放大倍数为20x，下一步设置实验及孔板名称，每孔拍摄49个视野，运行实验并拍摄荧光图像；
59.②
精准定量：打开高内涵成像系统中神经分析版块，通过细胞核确定细胞数量，通过细胞形态辨别神经结构，从而得出每个细胞的平均树突长度、平均轴突长度和平均分支数。
60.图1所示结果可以看出，cd140a( )间充质干细胞能够促进细胞树突增长，恢复了神经细胞长梭形的特征，而cd140a(-)间充质干细胞对损伤的神经细胞的修复效果并不明显。
61.图2-4展示了发明人对每个细胞的平均树突长度、平均轴突长度和平均分支数进行统计分析的结果，cd140a( )间充质干细胞与oa损伤组相比均具有统计学意义(＊p＜0.05，＊＊p＜0.01，＊*＊p＜0.001)。因此该实验结果表明了cd140a( )间充质干细胞有修复神经损伤的功能，并且修复功能显著高于cd140a(-)间充质干细胞。
62.在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
63.尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。