检测减肥保健品中新利司他的方法与流程

1.本发明涉及保健品质量检测技术领域，特别涉及一种检测减肥保健品中新利司他的方法。


背景技术：

2.新利司他(cetilistat/atl-962)是一种新型胃肠道脂肪酶抑制剂，能够抑制胰脂肪酶(pancreatic lipase)的活性，可用于治疗伴有血脂异常和ⅱ型糖尿病，以及经运动和饮食疗法后bmi仍在25kg/m2以上的肥胖症。新利司他的优点是既不作用于神经系统，不影响胃肠道的其他酶活性，也不被吸收进入血液，不抑制食欲。
3.减肥保健品中禁止添加脂肪酶抑制剂，然而目前检测减肥保健品中新利司他的方法还未报道。因此，如何实现减肥保健品中新利司他的检测，对减肥保健品的质量控制和市场监管至关重要。


技术实现要素：

4.基于此，本发明的目的包括提供检测减肥保健品中新利司他的方法，该方法能够实现减肥保健品中新利司他的提取及分离检测，填补了减肥保健品中新利司他检测的技术空白。
5.本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
6.一种检测减肥保健品中新利司他的方法，所述方法包括如下步骤：
7.提供对照品溶液，所述对照品溶液中的对照品包含新利司他；
8.取减肥保健品样品，用甲醇提取，收集提取液，制备供试品溶液；
9.采用高效液相色谱串联质谱法对所述对照品溶液和所述供试品溶液进行检测，根据检测结果确定所述减肥保健品样品是否含有新利司他或/和新利司他的含量；
10.所述高效液相色谱串联质谱法采用的高效液相色谱条件包括：
11.固定相：c
18
色谱柱；
12.流动相：流动相a为甲酸体积百分比为0.08％～0.12％(v/v)的甲酸水溶液，流动相b为甲酸体积百分比为0.08％～0.12％(v/v)的甲酸乙腈溶液；
13.洗脱方式：梯度洗脱；
14.梯度洗脱的程序包括：
[0015]-4min～0min，保持所述流动相a的体积百分比为90％(v/v)，
[0016]
0min～3min，保持所述流动相a的体积百分比为90％(v/v)，
[0017]
3min～11min，所述流动相a的体积百分比由90％(v/v)下降至5％，
[0018]
11min～20min，保持所述流动相a的体积百分比为5％(v/v)。
[0019]
在本发明的一些实施方式中，所述高效液相色谱条件还包括：流速为0.25ml/min～0.35ml/min。
[0020]
在本发明的一些实施方式中，所述高效液相色谱条件还包括：柱温为35℃～45℃。
[0021]
在本发明的一些实施方式中，所述高效液相色谱条件还包括：进样体积为0.8μl～1.5μl。
[0022]
在本发明的一些实施方式中，所述高效液相色谱串联质谱法的质谱条件包括：
[0023]
离子源：电喷雾离子源；
[0024]
检测方式：多反应监测；
[0025]
扫描方式：正离子模式；
[0026]
电喷雾电压：5200v～5800v；
[0027]
气帘气：32psi～38psi；
[0028]
雾化器：53psi～57psi；
[0029]
辅助气：53psi～59psi；
[0030]
离子源温度：525℃～575℃；
[0031]
干燥气、雾化气、鞘气或/和碰撞气：氮气。
[0032]
在本发明的一些实施方式中，所述对照品还包含奥利司他和利莫那班中的一种或者多种。
[0033]
在本发明的一些实施方式中，所述对照品溶液中所述对照品的浓度为8μg/l～12μg/l。
[0034]
在本发明的一些实施方式中，所述对照品溶液中的溶剂包含甲醇。
[0035]
在本发明的一些实施方式中，若所述减肥保健品样品为液态试样，则每100ml所述供试品溶液对应所述保健品样品的质量为8g～12g；
[0036]
若所述减肥保健品样品为固态试样，则每100ml所述供试品溶液对应所述保健品样品的质量为1.5g～2.5g。
[0037]
在本发明的一些实施方式中，提取的方式为超声提取，超声提取的时长为25min～35min，功率为2400w～2600w。
[0038]
在本发明的一些实施方式中，所述供试品溶液的制备步骤还包括先对提取所得产物进行纯化再收集所述提取液的步骤，纯化的方式包括：对所述提取所得产物进行离心，收集上清液，膜滤。
[0039]
在本发明的一些实施方式中，离心的条件包括：温度为2℃～4℃，转速为3800rpm～4200rpm，时间为1.5min～2.5min。
[0040]
在本发明的一些实施方式中，膜滤采用的滤膜的微孔直径为0.1μm～0.25μm。
[0041]
在本发明的一些实施方式中，所述减肥保健品样品为减肥胶囊、减肥咀嚼片、减肥咖啡、减肥口服溶液、减肥饼干或者减肥茶。
[0042]
与传统技术相比，本发明的技术效果包括：
[0043]
本发明通过采用合适的提取溶剂并配合合适的检测条件，实现了减肥保健品中新利司他的分离检测，填补了减肥保健品中新利司他检测的技术空白，为高效液相色谱串联质谱技术应用于减肥保健品中新利司他的检测奠定了理论基础。并且，本发明提供的方法加标回收率、重复性等指标均满足方法学的要求。同时，该方法前处理过程简单、成本低、耗时短，适合大批量样品同时进行检测，并能适应多种不同食品基质的检测，具有广阔的应用前景。另外，本发明提供的方法还同时适用于奥利司他和利莫那班的检测。
附图说明
[0044]
为了更清楚地说明本技术实施例中的技术方案、更完整地理解本技术及其有益效果，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单的介绍。显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本技术的一些实施例，对本领域技术人员来说，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0045]
图1为本发明实施例1检测无糖黑咖啡饮品中奥利司他的质谱图；
[0046]
图2为本发明实施例1检测无糖黑咖啡饮品中利莫那班的质谱图；
[0047]
图3为本发明实施例1检测无糖黑咖啡饮品中新利司他的质谱图；
[0048]
图4为本发明实施例2的压片糖果样品检测流程图；
[0049]
图5为本发明实施例2检测压片糖果中新利司他的提取离子色谱图；
[0050]
图6为本发明实施例2检测压片糖果中利莫那班的提取离子色谱图；
[0051]
图7为本发明实施例2检测压片糖果中奥利司他的提取离子色谱图；
[0052]
图8为本发明实施例3检测荷叶减肥胶囊中新利司他的提取离子色谱图；
[0053]
图9为本发明实施例3检测荷叶减肥胶囊中利莫那班的提取离子色谱图；
[0054]
图10为本发明实施例3检测荷叶减肥胶囊中奥利司他的提取离子色谱图；
[0055]
图11为对比例2新利司他等度洗脱的提取离子色谱图；
[0056]
图12为对比例3新利司他等度洗脱的提取离子色谱图。
具体实施方式
[0057]
下面结合附图、实施方式和实施例，对本发明作进一步详细的说明。应理解，这些实施方式和实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，提供这些实施方式和实施例的目的是使对本发明公开内容理解更加透彻全面。还应理解，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施方式和实施例，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下作各种改动或修改，得到的等价形式同样落于本技术的保护范围。此外，在下文的描述中，给出了大量具体的细节以便提供对本发明更为充分地理解，应理解，本发明可以无需一个或多个这些细节而得以实施。
[0058]
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述实施方式和实施例的目的，不是旨在于限制本发明。
[0059]
术语
[0060]
除非另外说明或存在矛盾之处，本文中使用的术语或短语具有以下含义：
[0061]
本文所使用的术语“和/或”、“或/和”、“及/或”的选择范围包括两个或两个以上相关所列项目中任一个项目，也包括相关所列项目的任意的和所有的组合，所述任意的和所有的组合包括任意的两个相关所列项目、任意的更多个相关所列项目、或者全部相关所列项目的组合。需要说明的是，当用至少两个选自“和/或”、“或/和”、“及/或”的连词组合连接至少三个项目时，应当理解，在本技术中，该技术方案毫无疑问地包括均用“逻辑与”连接的技术方案，还毫无疑问地包括均用“逻辑或”连接的技术方案。比如，“a及/或b”包括a、b和a b三种并列方案。又比如，“a，及/或，b，及/或，c，及/或，d”的技术方案，包括a、b、c、d中任一项(也即均用“逻辑或”连接的技术方案)，也包括a、b、c、d的任意的和所有的组合，也即包括
a、b、c、d中任两项或任三项的组合，还包括a、b、c、d的四项组合(也即均用“逻辑与”连接的技术方案)。
[0062]
本发明中涉及“多个”、“多种”、“多次”、“多元”等，如无特别限定，指在数量上大于2或等于2。例如，“一种或多种”表示一种或大于等于两种。
[0063]
本文中所使用的“其组合”、“其任意组合”、“其任意组合方式”等中包括所列项目中任两个或任两个以上项目的所有合适的组合方式。
[0064]
本文中，“合适的组合方式”、“合适的方式”、“任意合适的方式”等中所述“合适”，以能够实施本发明的技术方案、解决本发明的技术问题、实现本发明预期的技术效果为准。
[0065]
本文中，“优选”、“更好”、“更佳”、“为宜”仅为描述效果更好的实施方式或实施例，应当理解，并不构成对本发明保护范围的限制。
[0066]
本发明中，“进一步”、“更进一步”、“特别”等用于描述目的，表示内容上的差异，但并不应理解为对本发明保护范围的限制。
[0067]
本发明中，“可选地”、“可选的”、“可选”，指可有可无，也即指选自“有”或“无”两种并列方案中的任一种。如果一个技术方案中出现多处“可选”，如无特别说明，且无矛盾之处或相互制约关系，则每项“可选”各自独立。
[0068]
本发明中，“第一方面”、“第二方面”、“第三方面”、“第四方面”等中，术语“第一”、“第二”、“第三”、“第四”等仅用于描述目的，不能理解为指示或暗示相对重要性或数量，也不能理解为隐含指明所指示的技术特征的重要性或数量。而且“第一”、“第二”、“第三”、“第四”等仅起到非穷举式的列举描述目的，应当理解并不构成对数量的封闭式限定。
[0069]
本发明中，以开放式描述的技术特征中，包括所列举特征组成的封闭式技术方案，也包括包含所列举特征的开放式技术方案。
[0070]
本发明中，涉及到数值区间(也即数值范围)，如无特别说明，可选的数值分布在上述数值区间内视为连续，且包括该数值范围的两个数值端点(即最小值及最大值)，以及这两个数值端点之间的每一个数值。如无特别说明，当数值区间仅仅指向该数值区间内的整数时，包括该数值范围的两个端点整数，以及两个端点之间的每一个整数，在本文中，相当于直接列举了每一个整数，比如t为选自1～10的整数，表示t为选自由1、2、3、4、5、6、7、8、9和10构成的整数组的任一个整数。此外，当提供多个范围描述特征或特性时，可以合并这些范围。换言之，除非另有指明，否则本文中所公开之范围应理解为包括其中所归入的任何及所有的子范围。
[0071]
本发明中的温度参数，如无特别限定，既允许为恒温处理，也允许在一定温度区间内存在变动。应当理解的是，所述的恒温处理允许温度在仪器控制的精度范围内进行波动。允许在如
±
5℃、
±
4℃、
±
3℃、
±
2℃、
±
1℃的范围内波动。
[0072]
本发明中，％(w/w)与wt％均表示重量百分比，％(v/v)指体积百分比，％(w/v)指质量体积百分数。
[0073]
在本发明提及的所有文献都在本技术中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。除非和本技术的发明目的和/或技术方案相冲突，否则，本发明涉及的引用文献以全部内容、全部目的被引用。本发明中涉及引用文献时，相关技术特征、术语、名词、短语等在引用文献中的定义也一并被引用。本发明中涉及引用文献时，被引用的相关技术特征的举例、优选方式也可作为参考纳入本技术中，但以能够实施本发明为限。应当理
解，当引用内容与本技术中的描述相冲突时，以本技术为准或者适应性地根据本技术的描述进行修正。
[0074]
减肥保健食品中非法掺入的药物主要包括食欲抑制剂、吸收抑制剂、能量消耗增强剂和缓泻剂等，其中，脂肪酶抑制剂是吸收抑制剂中最典型的一种，其作用机制是通过抑制脂肪酶的水解能力，阻止脂肪在体内吸收，进而随食渣一起被排出体外以达到减肥目的。由于脂肪酶抑制剂不作用于中枢神经，副作用较少，因此成为唯一被fda批准可以长期用于肥胖症治疗的药物。
[0075]
传统的减肥保健食品中非法掺入的药物例如：盐酸苯丙醇胺、盐酸去甲伪麻黄碱、盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱、盐酸甲基麻黄碱、硫酸安非他明、氯噻嗪、氢氯噻嗪、盐酸甲基安非他明、咖啡因、盐酸分特拉明、盐酸氯卡色林、盐酸安非他酮、芬氟拉明、普伐他汀钠、呋塞米、盐酸n,n-双去甲基西布曲明、盐酸氟西汀、酚酞、盐酸n-单去甲基西布曲明、吲达帕胺、盐酸西布曲明、盐酸苄基西布曲明、盐酸豪莫西布曲明、吉非罗齐、比沙可啶、盐酸氯代西布曲明、苯扎贝特、布美他尼、洛伐他汀、辛伐他汀、盐酸利莫那班、非诺贝特、奥利司他。其中，奥利司他(orlistat)是一种强效的胃肠道脂肪酶抑制剂，鉴于其仅在胃肠道发挥作用，不吸收入血和参与代谢，不影响人体必需脂肪酸的吸收，因此具有良好的安全性，在美国其是唯一被fda批准可以长期用于肥胖症治疗的药物。利莫那班(rimonabant)是选择性大麻素ⅰ型受体(cb1)拮抗剂，通过阻断食欲调节涉及大麻素-1(cb1)受体，刺激减少对食物的需求，并增强产热，能显著地降低体重、缩小腰围，减少心血管疾病等。副作用包括情绪变化、恶心呕吐、腹泻、头痛、头晕和焦虑。是选择性大麻素ⅰ型受体(cb1)拮抗剂。
[0076]
上述减肥保健品中上述传统药物检测已有报道，例如cn108061777a、cn111693640a、sn/t 4051-2014、sn/t 3867-2014等记载的方法。而新利司他作为新型药物，国际、国内相关组织均尚未建立对应的检测标准，目前关于新利司他的文献也仅局限于原料测定或体内代谢状况的追踪，较少涉及在保健食品尤其是减肥保健品中的检测。并且，参照上述传统药物检测方法难以实现新利司他的分离检测，并且传统药物检测方法中样本前处理步骤比较繁琐。为此，迫切需要建立减肥保健品中新利司他的检测方法。
[0077]
本发明提供一种检测减肥保健品中新利司他的方法，所述方法包括如下步骤：
[0078]
提供对照品溶液，所述对照品溶液中的对照品包含新利司他；
[0079]
取减肥保健品样品，用甲醇提取，收集提取液，制备供试品溶液；
[0080]
采用高效液相色谱串联质谱法对所述对照品溶液和所述供试品溶液进行检测，根据检测结果确定所述减肥保健品样品是否含有新利司他或/和新利司他的含量；
[0081]
所述高效液相色谱串联质谱法的高效液相色谱条件包括：
[0082]
固定相：c
18
色谱柱；
[0083]
流动相：流动相a为甲酸体积百分比为0.08％～0.12％(v/v)的甲酸水溶液，流动相b为甲酸体积百分比为0.08％～0.12％(v/v)的甲酸乙腈溶液；
[0084]
洗脱方式：梯度洗脱；
[0085]
梯度洗脱的程序包括：
[0086]-4min～0min，保持所述流动相a的体积百分比为90％(v/v)，
[0087]
0min～3min，保持所述流动相a的体积百分比为90％(v/v)，
[0088]
3min～11min，所述流动相a的体积百分比由90％(v/v)下降至5％(v/v)，
[0089]
11min～20min，保持所述流动相a的体积百分比为5％(v/v)。
[0090]
本发明的固定相例如：c
18
色谱柱，2.1mm
×
100mm，2.7μm；waters atlantis t3，2.1mm
×
100mm，1.8μm。
[0091]
本发明梯度洗脱的程序中
“‑
4min～0mi”，负数表示进样前运行阶段。
[0092]
在本发明的一些实施方式中，所述高效液相色谱串联质谱法的高效液相色谱条件还包括：流速为0.25ml/min～0.35ml/min。本发明方法中的流速例如为：0.25ml/min、0.27ml/min、0.29ml/min、0.3ml/min、0.33ml/min、0.35ml/min。
[0093]
在本发明的一些实施方式中，所述高效液相色谱串联质谱法的高效液相色谱条件还包括：柱温为35℃～45℃。本发明方法中的柱温例如为：35℃、37℃、39℃、40℃、41℃、43℃、45℃。
[0094]
在本发明的一些实施方式中，所述高效液相色谱串联质谱法的高效液相色谱条件还包括：进样体积为0.8μl～1.5μl。本发明方法中的进样体积例如为：0.8μl、0.9μl、1μl、1.1μl、1.2μl、1.3μl、1.4μl、1.5μl。
[0095]
在本发明的一些实施方式中，所述高效液相色谱串联质谱法的质谱条件包括：
[0096]
离子源：电喷雾离子源；
[0097]
检测方式：多反应监测；
[0098]
扫描方式：正离子模式；
[0099]
电喷雾电压：5200v～5800v；
[0100]
气帘气：32psi～38psi；
[0101]
雾化器：53psi～57psi；
[0102]
辅助气：53psi～59psi；
[0103]
离子源温度：525℃～575℃；
[0104]
干燥气、雾化气、鞘气或/和碰撞气：氮气。
[0105]
本发明方法中的电喷雾电压例如为：5200v、5300v、5400v、5500v、5600v、5700v、5800v；气帘气例如为32psi、33psi、34psi、35psi、36psi、37psi、38psi。雾化器例如为53psi、54psi、55psi、56psi、57psi；辅助气例如为53psi、54psi、55psi、56psi、57psi、58psi、59psi；离子源温度例如为525℃、530℃、535℃、540℃、545℃、550℃、555℃、560℃、565℃、570℃、575℃。
[0106]
在本发明的一些实施方式中，所述对照品还包含奥利司他和利莫那班中的一种或者多种。
[0107]
奥利司他(orlistat)是一种强效的胃肠道脂肪酶抑制剂，于1998年由罗氏公司研发成功，并以处方药的方式在欧洲上市，2000年进入中国。鉴于其仅在胃肠道发挥作用，不吸收入血和参与代谢，不影响人体必需脂肪酸的吸收，因此具有良好的安全性，在美国其是唯一被fda批准可以长期用于肥胖症治疗的药物。
[0108]
利莫那班(rimonabant)是选择性大麻素ⅰ型受体(cb1)拮抗剂，通过阻断食欲调节涉及大麻素-1(cb1)受体，刺激减少对食物的需求，并增强产热，能显著地降低体重、缩小腰围，减少心血管疾病等。副作用包括情绪变化、恶心呕吐、腹泻、头痛、头晕和焦虑。是选择性大麻素ⅰ型受体(cb1)拮抗剂。
[0109]
在本发明的一些实施方式中，所述对照品溶液中所述对照品的浓度为8μg/l～12μ
g/l。对照品的浓度例如为8μg/l、8.5μg/l、9μg/l、9.5μg/l、10μg/l、10.5μg/l、11μg/l、11.5μg/l、12μg/l。
[0110]
在本发明的一些实施方式中，所述对照品溶液中的溶剂包含甲醇。
[0111]
在本发明的一些实施方式中，若所述减肥保健品样品为液态试样，则每100ml所述供试品溶液对应所述保健品样品的质量为8g～12g(例如8g、8.5g、9g、9.5g、10g、10.5g、11g、11.5g、12g)；
[0112]
若所述减肥保健品样品为固态试样，则每100ml所述供试品溶液对应所述保健品样品的质量为1.5g～2.5g(例如1.5g、1.6g、1.7g、1.8g、1.9g、2g、2.1g、2.1g、2.2g、2.3g、2.4g、2.5g)。
[0113]
在本发明的一些实施方式中，提取的方式为超声提取，超声提取的时长为25min～35min，超声提取的功率为2400w～2600w。超声提取的时长为25min、26min、27min、28min、29min、30min、31min、32min、33min、34min、35min。超声提取的功率例如为2400w、2450w、2500w、2550w、2600w。
[0114]
在本发明的一些实施方式中，所述供试品溶液的制备步骤还包括先对提取所得产物进行纯化再收集所述提取液的步骤，纯化的方式包括：对所述提取所得产物进行离心，收集上清液，膜滤。
[0115]
在本发明的一些实施方式中，离心的条件包括：温度为2℃～4℃，转速为3800rpm～4200rpm，时间为1.5min～2.5min。离心的温度例如为2℃、2.5℃、3℃、3.5℃、4℃、4.5℃。离心的转速例如为3800rpm、3900rpm、4000rpm、4100rpm、4200rpm。离心的时间例如为1.5、2min、2.5min。
[0116]
本发明提供的方法中，离心的目的主要是去除减肥保健品中的脂肪成分，更好地提取减肥样品中的新利司他，还能兼顾去除颗粒性沉淀，利于后续上机检测。
[0117]
在本发明的一些实施方式中，膜滤采用的滤膜的微孔直径为0.1μm～0.25μm。微孔直径例如0.1μm、0.22μm、0.25μm。
[0118]
在本发明的一些实施方式中，所述减肥保健品样品为减肥胶囊、减肥咀嚼片(例如压片糖果)、减肥咖啡、减肥口服溶液、减肥饼干或者减肥茶。
[0119]
具体实施例
[0120]
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，优先参考本发明中给出的指引，还可以按照本领域的实验手册或常规条件，还可以按照制造厂商所建议的条件，或者参考本领域已知的实验方法。
[0121]
下述的具体实施例中，涉及原料组分的量度参数，如无特别说明，可能存在称量精度范围内的细微偏差。涉及温度和时间参数，允许仪器测试精度或操作精度导致的可接受的偏差。
[0122]
实施例1、对无糖黑咖啡饮品样品进行回收试验
[0123]
1试剂和材料
[0124]
如无特别说明，所用试剂均为分析纯；水为符合gb/t 6682规定的一级水。
[0125]
乙腈：色谱纯。
[0126]
甲醇：色谱纯。
[0127]
乙酸铵：分析纯。
[0128]
奥利司他标准品(cas号：96829-58-2，分子式：c
29h53
no5)：纯度≥95％。
[0129]
利莫那班标准品(cas号：168273-06-1，分子式：c
22h21cl3
n4o)：纯度≥95％。
[0130]
新利司他(cas号：282526-98-1，分子式：c
25h39
no3)：纯度≥95％。
[0131]
奥利司他、利莫那班和新利司他的相关信息如下：
[0132]
表1、3种化合物中文名称、英文名称、cas号、分子式、相对分子质量、结构式
[0133][0134]
2对照品溶液的配制
[0135]
混合对照品储备液(400μg/l)：分别准确称取奥利司他、利莫那班和新利司他标准品10.0mg，用甲醇溶解并定容至25.0ml，摇匀，配制成浓度为400μg/l的标准储备液，于-20℃冰箱内保存。
[0136]
混合对照品溶液(10.0μg/l)：分别准确吸取奥利司他、利莫那班和新利司他标准储备液(400μg/l)各62.5μl/ml，置于同一25.0ml容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，配制成浓度为10.0μg/l的对照品溶液。置于0℃～4℃冰箱中保存。
[0137]
3样品的前处理
[0138]
①
准确称取5.00g(精确到0.01g)试样置于50ml容量瓶中，添加一定量的奥利司他、利莫那班和新利司他(每种药品对应3个添加水平，分别为0.05mg/kg，0.15mg/kg，0.50mg/kg)进行加标回收实验，加入5.00ml超纯水稀释试样后，用甲醇定容；
[0139]
②
将试样置于超声设备中超声30min，使目标物充分分散于目标相；
[0140]
③
将超声后的试样置于冷冻离心机中，于4000rpm下离心2min以除去脂肪后，取清液过0.22μm滤膜，待上机测试。
[0141]
4检测
[0142]
检测采用的高效液相色谱-串联质谱的检测条件包括：
[0143]
高效液相色谱条件包括：
[0144]
色谱柱：c
18
，2.1
×
100mm，2.7μm；
[0145]
流速：0.300ml/min；
[0146]
流动相：a为含0.1％(v/v)甲酸水溶液，b为含0.1％(v/v)甲酸乙腈溶液；
[0147]
梯度洗脱的程序包括：-4min～0min，90％(v/v)a；0min～3min，90％(v/v)a；3min
～11min，90％(v/v)a～5％(v/v)a；11min～20min，5％(v/v)a；
[0148]
柱温：40℃；
[0149]
进样体积：1μl。
[0150]
质谱条件的条件包括：
[0151]
离子源：电喷雾离子源(esi源)；
[0152]
扫描方式：多反应监测(mrm)；
[0153]
干燥气、雾化气、鞘气、碰撞气等均为高纯氮气或其他合适气体，使用前应调节相应参数使质谱灵敏度达到检测要求，毛细管电压、干燥气温度、鞘气温度、鞘气流量、喷嘴电压、碰撞能量、碎裂电压等参数应优化至最佳灵敏度，具体质谱参数如下：
[0154]
离子源：电喷雾离子源(esi源)；
[0155]
检测方式：多反应监测(mrm)；
[0156]
扫描方式：正离子模式；
[0157]
电喷雾电压(is)：5500v(esi )；
[0158]
气帘气(cur)：35psi；
[0159]
雾化器(gs1)：55psi；
[0160]
辅助气(gs2)：55psi；
[0161]
离子源温度(tem)：550℃。
[0162]
表2、利莫那班、奥利司他、新利司他的质谱参数
[0163][0164]
(1)定性测定
[0165]
按照高效液相色谱-串联质谱条件测定试样和标准工作溶液，记录试样和对照品溶液中各化合物的色谱保留时间，利莫那班、奥利司他和新利司他的参考出峰时间分别为10.38、12.49和14.80min。
[0166]
以相对于最强离子丰度的百分比作为定性离子对的相对丰度，记录浓度相当的试样与对照品溶液中相应成分的相对离子丰度。当试样中检出与3种化合物中某对照品质量色谱峰保留时间一致的色谱峰(变化范围在
±
2.5％之内)，并且相对离子丰度允许偏差不超过表2规定的范围，可以确定试样中检出相应化合物。
[0167]
(2)定量测定
[0168]
采用外标法对待测物进行定量。将试液注入高效液相色谱-串联质谱仪中，得到相对应的峰面积，用工作曲线对样品进行定量，根据标准曲线(表2)得到试液中奥利司他，利莫那班，新利司他的浓度，样品溶液中待测物的响应值均应在仪器测定的线性范围内。该方
法的检出限为0.05mg/kg。
[0169]
表3、三种物质标准曲线数据
[0170][0171][0172]
5结果计算
[0173]
试样中奥利司他，利莫那班，新利司他含量按公式(1)计算：
[0174][0175]
式中：
[0176]
x—试样中奥利司他，利莫那班，新利司他的含量，单位为毫克每百克(μg/l)；
[0177]
c—从标准工作曲线中得到的被测组分溶液浓度，单位为微克每毫升(μg/l)；
[0178]
v—样品溶液定容体积，单位为毫升(ml)；
[0179]
m—试样的质量，单位为克(g)；
[0180]
f—稀释倍数。
[0181]
计算结果以重复性条件下获得的两次独立测定结果的算术平均值表示，结果保留三位有效数字。
[0182]
重复以上实验3次，实验结果见表4所示。
[0183]
表4、无糖黑咖啡饮品的测试结果
[0184][0185]
图1、图2和图3分别为检测无糖黑咖啡饮品中奥利司他、利莫那班和新利司他的提取离子色谱图。
[0186]
实施例2、对压片糖果样品进行加标回收试验
[0187]
1试剂和材料
[0188]
参照实施例1。
[0189]
2对照品溶液的配制
[0190]
参照实施例1。
[0191]
3样品的前处理
[0192]
①
准确称取5g(精确到0.01g)试样置于烧杯中，加入10ml40℃-60℃温水充分溶解样品，添加一定量的奥利司他、利莫那班和新利司他(每种药品对应3个添加水平，分别为0.05mg/kg，0.15mg/kg，0.50mg/kg)进行加标回收实验；
[0193]
②
将试样转移至50ml容量瓶中，加入5ml甲醇稀释试样后，用甲醇定容；
[0194]
③
将试样置于超声设备中超声30min，使目标物充分分散于目标相；
[0195]
④
将超声后的试样置于冷冻离心机中，于4000rpm下离心2min以除去脂肪后，取清液过0.22μm滤膜，待上机测试。
[0196]
4检测
[0197]
参照实施例1。
[0198]
5结果计算
[0199]
参照实施例1。本实施例的流程见图4，重复以上实验3次，实验结果见表5所示。
[0200]
表5、压片糖果的测试结果
[0201][0202]
压片糖果中新利司他、利莫那班、奥利司他的提取离子色谱图见图5、图6、图7。
[0203]
实施例3、对荷叶减肥胶囊样品进行加标回收试验
[0204]
1试剂和材料
[0205]
参照实施例1。
[0206]
2对照品溶液的配制
[0207]
参照实施例1。
[0208]
3样品的前处理
[0209]
①
准确称取5g(精确到0.01g)试样置于烧杯中，加入10ml 40℃-60℃温水充分溶解样品，添加一定量的奥利司他、利莫那班和新利司他(每种药品对应3个添加水平，分别为0.05mg/kg，0.15mg/kg，0.50mg/kg)进行加标回收实验；
[0210]
②
将试样转移至50ml容量瓶中，加入5ml甲醇稀释试样后，用甲醇定容；
[0211]
③
将试样置于超声设备中超声30min，使目标物充分分散于目标相；
[0212]
④
将超声后的试样置于冷冻离心机中，于4000rpm下离心2min以除去脂肪后，取清液过0.22μm滤膜，待上机测试。
[0213]
4检测
[0214]
参照实施例1。
[0215]
5结果计算
[0216]
参照实施例1。
[0217]
重复以上实验3次，实验结果见表5所示。
[0218]
本方法以奥利司他、利莫那班和新利司他的信噪比(s/n)3倍、10倍计算仪器检出限和仪器定量限，结合前处理样品稀释倍数(以10倍计)，计算得到奥利司他、利莫那班和新利司他的方法检出限和方法定量限。
[0219]
经测试，奥利司他、利莫那班和新利司他的检出限分别为0.05mg/kg，定量限为0.15mg/kg，本方法灵敏，可用于多种脂肪酶抑制剂的定量分析。
[0220]
表6、荷叶减肥胶囊的测试结果
[0221][0222]
荷叶减肥胶囊中新利司他、利莫那班、奥利司他的提取离子色谱图见图8、图9、图10。
[0223]
上述实施例通过甲醇提取减肥保健品中的奥利司他、利莫那班和新利司他，采用高效液相色谱串联质谱对待测物进行分离并检测，利用保留时间、质谱特性对待测物进行定性，外标法对待测物进行定量，解决了同时检测减肥食品中多种脂肪酶抑制剂的问题，填补了检测食品中新利司他方法的空白。
[0224]
实施例4、以压片糖果为基质进行方法学验证
[0225]
实验方案如下：
[0226]
样品前处理过程：称取1.00g试样(空白样品)，按照本专利描述进行前处理。
[0227]
回收率实验：加标值0.05、0.15和1.5mg/kg，6次平行测试结果的平均值与加标值计算回收率。
[0228]
精密度实验：进行6次平行测试，计算相对标准偏差得出精密度。
[0229]
表7、新利司他回收率和精密度验证数据(n＝6)
[0230][0231]
表8、奥利司他回收率和精密度验证数据(n＝6)
[0232][0233]
表9、利莫那班他回收率和精密度验证数据(n＝6)
[0234]
[0235][0236]
对比例1
[0237]
本对比例是实施例1的对比例，相对于对比例1的主要区别包括：“3样品的前处理”步骤中，分别用超纯水、乙腈、丙酮代替甲醇。
[0238]
为了优化奥利司他、利莫那班和新利司他的提取，实验分别研究了超纯水、乙腈、丙酮、甲醇对添加0.05mg/kg奥利司他、利莫那班和新利司他的压片糖果加标样品提取效果。
[0239]
当使用超纯水提取时，奥利司他、利莫那班和新利司他的回收率分别是5％、3％、7％，所有目标化合物回收率均低于10％。
[0240]
当使用丙酮提取时，奥利司他、利莫那班和新利司他的回收率分别是55％、47％、57％，所有目标化合物回收率均低于60％。
[0241]
乙腈和甲醇的提取效果相当，乙腈提取回收率：奥利司他85％，利莫那班91％，新利司他92％，甲醇提取回收率：奥利司他83％，利莫那班89％，新利司他91％，考虑到乙腈对人体毒性比甲醇强，本发明选取甲醇进行提取。
[0242]
对比例2
[0243]
本对比例是实施例1的对比例，相对于对比例1的主要区别包括“4检测”步骤中，采用的高效液相色谱的洗脱条件不同，具体地，本对比例的洗脱条件包括：甲酸体积百分比为0.10％(v/v)的甲酸水溶液与甲酸体积百分比为0.10％(v/v)的甲酸乙腈溶液分别为50:50(v：v)，等度洗脱，洗脱效果较差，出现很多杂峰(见图11)。
[0244]
对比例3
[0245]
本对比例是实施例1的对比例，相对于对比例1的主要区别包括“4检测”步骤中，采用的高效液相色谱的洗脱条件不同，具体地，本对比例的洗脱条件包括：甲酸体积百分比为0.10％(v/v)的甲酸水溶液与甲酸体积百分比为0.10％(v/v)的甲酸乙腈溶液分别为20:80(v：v)，等度洗脱，洗脱效果较差，出现很多杂峰，不见目标峰(见图12)。
[0246]
以上所述实施方式和实施例的各技术特征可以进行任意合适方式的组合，为使描述简洁，未对上述实施方式和实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为在本说明书记载的范围中。
[0247]
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，便于具体和详细地理解本发明
的技术方案，但并不能因此而理解为对发明专利保护范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，得到的等价形式同样落于本技术的保护范围。还应当理解，本领域技术人员在本发明提供的技术方案的基础上，通过合乎逻辑的分析、推理或者有限的试验得到的技术方案，均在本发明所附权利要求的保护范围内。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求的内容为准，说明书及附图可以用于解释权利要求的内容。