一种胰腺癌早期诊断标志物及其组织筛选方法和应用与流程

1.本发明涉及生物医学领域，具体涉及一种胰腺癌早期诊断标志物及其组织筛选方法和应用。


背景技术：

2.胰腺导管腺癌(pdac,pancreatic ductal adenocarcinoma)占胰腺恶性肿瘤的90％以上，是最具侵袭性和致命性的癌症，5年生存率小于10％。而由于发病率上升、诊断延迟以及在治疗方面缺乏重大进展，pdac的死亡率在过去十年中上升，中位生存时间小于7个月。目前，影像学成像技术，如mri、ercp、eus、ct等在临床实践中常规应用于pdac患者的筛查、诊断和分期评估。然而，由于缺乏早期症状和诊断标志物，超过80％的pdac 患者在诊断时存在晚期或转移性疾病，错过了根治性手术的机会。
3.由于pdac缺乏早期症状和诊断标志物，使用现有技术给人们带来了早期诊断和发现的困难。然而，尽管人们在针对患者血液中潜在的pdac相关代谢物方面做了大量的努力，但这类分子很少被投入临床实践的前线，至少部分原因是缺乏低成本和高通量的分析工具。


技术实现要素：

4.本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种基于cpsi-ms和 desi-msi的代谢组学，并针对pdac代谢全景概述的表征工具，为快速分子诊断和筛查提供了强有力的方法，以辅助临床实践。
5.为了达到上述目的，本发明提供了一种胰腺癌早期诊断标志物的组织筛选方法，包含以下步骤：步骤1，分别取胰腺癌病人临床组织pdac、与其配对的正常组织pnt；步骤2，通过色谱质谱联用代谢组学分析方法，分析鉴定胰腺癌组织与正常组织之间的初步差异性代谢物；步骤3，通过质谱成像可视化示出所述的初步差异性代谢物的空间分布，找到胰腺癌组织区域中异常分布的代谢物；步骤4，对所述的异常分布的代谢物进行辅助筛选：基于组织活检，构建基于代谢组学的胰腺癌诊断lasso模型，从所述的异常分布的代谢物中筛选出胰腺癌组织中的早期诊断标志物。
6.较佳地，步骤2中，所述的色谱质谱联用代谢组学是导电聚合物喷雾电离质谱cpsi-ms联用代谢组学。
7.较佳地，步骤2中，所述的分析鉴定胰腺癌组织与正常组织之间的初步差异性代谢物包含以下步骤：
8.步骤2.1，以vip大于1.0为标准保留样本离子；
9.步骤2.2，对步骤2.1中得到的样本离子进行t检验，以fdr《0.05为标准进一步保留样本离子；
10.步骤2.3，对步骤2.2中得到的样本离子进行差异倍数分析，以差异倍数大于2.0或小于0.5为标准再进一步保留样本离子；
11.步骤2.4，将步骤2.3得到的样本离子与代谢组数据库进行比对，得到组织中76种初步差异性代谢物。
12.较佳地，步骤3中，所述的质谱成像技术为解吸电喷雾电离质谱成像 desi-msi，可视化示出每个所述的初步差异性代谢物的空间分布图进行原位验证。
13.较佳地，步骤4中，所述的辅助筛选包含以下步骤：
14.步骤4.1，将n＝150个组织样本点作为训练集，n＝90个组织样本点作为测试集，用于评估预先训练的lasso模型的表现；
15.步骤4.2，将所述的76种初步差异性代谢物纳入lasso分类器训练集的初始输入变量，只有对分类有贡献的变量被赋予非零权重，当只保留76个变量中的22个时，lasso分类器的性能在测试集上达到最高的准确率；
16.步骤4.3，引用受试者工作特征roc曲线来评价lasso模型的最佳诊断性能，以roc曲线上真实阳性率最高、假阳性率最低为截断点，得到最佳诊断性能，表明cpsi-ms数据采集结合lasso模型能够作为与组织活检互补的潜在体外诊断策略。
17.本发明还提供了一种根据上述任意一项所述的胰腺癌早期诊断标志物的组织筛选方法所得到的胰腺癌早期诊断标志物，包含甘油二酯、1-正丁胺、胞苷、组胺、磷酸胆碱、羟基亚麻酸、亚油酸、3-磷酸甘油、谷氨酸、丙烯酰肉碱、谷氨酰胺、酪氨酸、3-羟基棕榈酸、溶血磷脂胆碱(p-16:0)、丁酰肉碱、哌啶甲酸、溶血磷脂胆碱(18:2)、乙酰精胺、乳酸、组氨酸、n-甲基组胺、n-乙酰组胺中的任意一种或者任意两种以上的组合。
18.较佳地，所述的胰腺癌早期诊断标志物可应用于制备胰腺癌早期诊断试剂或试剂盒。
19.本发明还提供了一种胰腺癌早期诊断的试剂，所述的试剂能够检测样本中所述的早期诊断标志物的表达水平。
20.较佳地，所述的样本为组织样本。
21.本发明还提供了一种胰腺癌早期诊断的试剂盒，所述的试剂盒含有早期诊断标志物用于制备胰腺癌早期鉴别的诊断试剂。
22.本发明优点在于：
23.(1)本发明提供了一种胰腺癌早期诊断标志物，通过检测早期诊断标志物的表达水平，可以达到胰腺癌早期筛查和诊断的目的。
24.(2)本发明提供的胰腺癌早期诊断标志物的组织筛选方法中使用了 cpsi-ms联用代谢组学分析，使用组织样本进行检测，仅需要消耗一滴溶剂 (《10μl)进行代谢物的提取和电离，更适用于样本的高通量筛选以及整个组织中某些感兴趣区域的代谢状态的快速评估；desi-msi引入了带有随流动溶剂进行逐层扫描的电喷雾探针，并提供每个代谢物分布的空间分辨率图像，更适用于基于代谢产物的，需要复杂的区域相关代谢研究的分子病理学或更精确的外科切缘评估；本发明提供的胰腺癌早期诊断标志物的组织筛选方法，结合cpsi-ms数据采集和机器学习(ml)分析可以使工作流更经济有效，cpsi-ms数据采集结合构建的lasso模型可以作为与组织活检互补的潜在体外诊断策略。
附图说明
25.图1为本发明的pdac组织的非靶向代谢组学结果。
26.图中，(a)cpsi-msi原位代谢谱图；
27.(b)pdac和pnt的偏最小二乘判别分析(pls-da，partial least square-discriminant analysis)分类；
28.(c)最终保存pdac中与pnt标本相比有显著变化的代谢物的逐步统计分析；
29.(d)火山图突出显示了与pnt相比，pdac中代谢产物离子的显著变化 (fdr《0.05)；
30.(e)40种具有代表性的代谢产物在pnts和pdacs中的相对表达水平热图。
31.图2为本发明的pnt(a)和pdac(b)组织在全ms扫描模式下的平均质谱。
32.图3为本发明的组织中代谢物的原位验证和互补诊断性能。
33.图中，(a)desi-msi与机器学习过程示意图；
34.(b)典型的一对pdacs的光学图像，其相邻的pnts和正常对照nc组织；
35.(c)与pnts相比，pdacs中具有代表性的代谢物发生显著变化的图像；
36.(d)lasso分类器给出的所有240个组织点评分图；
37.(e)混淆矩阵，呈现针对pdac的测试由开发的lasso模型设置的分类；
38.(f)roc(receiver operating characteristic)曲线用于评估lasso模型在训练
39.集和测试集上的诊断性能；
40.(g)与pnts相比，pdacs中其余代谢物发生显著变化的图像。
41.图4为本发明的cpsi-ms和desi-msi在pdac筛查和诊断中的临床应用推荐场景。
42.图中，(a)代谢谱和快速pdac诊断可以通过cpsi-ms进行，cpsi-ms 只消耗来自这些高度可疑患者的微量活检组织(少于1mg)；
43.(b)对于手术切除pdac组织的患者，通过desi-msi结合分子病理学可以进行更精确的诊断和空间分辨率的代谢谱分析。
44.图5为本发明的对失调酶、转运体和相关底物的验证。
45.图中，(a)通过在代谢分析中搜索丰富的代谢途径；
46.(b)kegg和reactome中搜索得到的富集酶和转运蛋白；
47.(c)酶和转运体所涉及的受影响的生物功能的等级；
48.(d)pdzd、pisd、tymp和slc1a5的亚细胞位置和功能示意图；
49.(e)免疫组织化学检测pisd、pdzd11、tymp、slc1a5在组织芯片上的表达水平；
50.(f)在不同组织(pdac和pnt)中pisd、pdzd11、tymp和slc1a5的表达水平；
51.(g)slc1a5的高、低表达与pdac进展性tnm分期的相关性；
52.(h)slc1a5低表达和高表的pdac患者的生存分析。
53.图6为本发明的pisd诱导的ps/pe转化是pdac进展和预后的关键代谢过程，抑制肿瘤转移。
54.图中，(a)pisd转换ps/pe示意图；
55.(b)以ps(36:1)和pe(36:1)为典型例子，采用desi-msi表征ps和pe图像；
56.(c)pe与ps在图像像素基础上的强度比图；
57.(d)对过表达pisd的肿瘤细胞进行transwell实验；
58.(e)对过表达pisd的肿瘤细胞进行迁移实验。比例尺:10μm。试验设3 个重复，进行t检验。数值以平均值
±
sds表示。*p《0.05，**p《0.01。
59.图7为本发明的slc1a5上调pdac中的谷氨酰胺代谢。
60.图中，(a)slc1a5介导谷氨酰胺(gln)与丙氨酸(ala)跨膜交换及gls1 催化谷氨酰胺与谷氨酸(glu)转化示意图，v9302和cb839分别是针对 slc1a5和gls1的抑制剂；
61.(b)pdac(用白虚线描绘)和pnt区域ala、gln、glu分布的desi图像；
62.(c)pdac患者m0和m1期血清中gln和ala的相对水平；
63.(d)谷氨酰胺与ala、谷氨酸与谷氨酰胺的像素-像素强度比；
64.(e)正常胰腺细胞株(h6c7)与胰腺癌细胞株(sw1990和panc1)slc1a5 mrna表达水平的差异；
65.(f)slc1a5抑制剂v9302治疗后，sw1990胰腺癌细胞系的gln和ala 水平；
66.(g)不同抑制剂处理，sw1990细胞的增殖情况；
67.(h)吉西他滨(gem)与cb-839、v-9302联合应用的体外细胞活力检测；
68.(i)吉西他滨对不同处理sw1990细胞的剂量抑制关系。
69.图8为本发明的pdzd11上调pdac中嘌呤和嘧啶的转运并促进肿瘤转移。
70.图中，(a)pdzd11和tymp的脱氧尿苷转运和回收示意图；
71.(b)脱氧尿苷和尿嘧啶穿过pdac(用白线描绘)和pnt区域的desi图像和相应盒图；
72.(c)脱氧尿苷与尿嘧啶的比值图像，用于间接估计tymp的表达或活性。
具体实施方式
73.以下结合附图和实施例对本发明的技术方案做进一步的说明。
74.实验材料与方法
75.1.1实验细胞系、质粒和试剂
76.h6c7、sw1990、panc1细胞(manassas,va,usa)，谷氨酰胺酶(gls1) 抑制剂cb-839、scl1a5抑制剂v-9302、cck8(cell counting kit)试剂盒 (medchemexpress,monmouth junction,nj,usa)，强力霉素(sigma-aldrich, st.louis,mo,usa)，ab197011谷氨酰胺测定试剂盒(colorimetric)、amplite tm
比色法l-丙氨酸测定试剂盒(abcam,waltham,ma,usa)，8um transwell小室(bd biosciences,new jersey,usa)等。
77.1.2实验仪器
78.ltq orbitrap velos质谱仪(thermo scientific,san jose,ca,usa.)、商业 2d desi系统(prosolia,indianapolis,usa)、显微镜(leica,wetzlar,germany)、 infinite f500(tecan)多功能酶标仪、恒温箱(thermofisher,waltham,ma,usa) 等。
79.1.3实验方法
80.本说明书中未具体提及的实验方法均为本领域常规操作方法。
81.1.3.1 cpsi-ms代谢组学分析
82.以甲醇-水为溶剂，体积比为1:1。每次组织切片，在组织表面滴入5μl 溶剂。充分提取代谢产物30秒后，将液滴吸回，转移到离ms入口13.0mm 处的导电聚合物底物尖端。为了减少组织异质性的影响，在每个组织切片上随机微移三等份溶剂液滴，分别用cpsi-ms检测。液滴萃取加载完成后，接通对导电聚合物尖端施加的4.5kv直流高压，触发高电场诱导的液滴喷雾电离。该过程将代谢产物离子带入ltq orbitrap velos质谱仪，在正模式下记录 m/z 50-1000范围内的非靶向代谢谱。ms毛细管温度275℃，s-lens电压55v。微扫描次数设置为1次扫描，最大注射时间为400微秒。每个病例的数据采集周期为15秒，以收集足够的
代谢组学数据。
83.1.3.2 desi-msi对组织中目标代谢物的验证
84.对于组织成像，采用商业2d desi系统进行正负离子扫描模式。用商用质谱仪提供
±
4.0kv的高压，施加在喷雾头上，产生电喷雾，对冷冻切片组织内的组分进行脱吸和电离。喷雾溶剂为甲醇-水(7:3,v/v)，雾化器气体压力为1.2mpa，流量为3.0μl/min。喷头与基板的冲击角设置为55
°
。喷雾器喷嘴高度和喷嘴到输送管的距离均设定为4.5mm。在上述cpsi-ms实验中， ms采集采用相同的参数。对于组织扫描，光栅速度设置为0.2mm/sec，两次扫描之间的宽度为0.2mm。使用massimager(chemmind technologies co.， ltd,beijing,china)和自行编写的matlab(mathworks,natick,ma,usa)脚本进行目标离子图像重建。
85.实施例1利用cpsi-ms发现pdac相关代谢谱和特定代谢物的特征
86.如图1的a所示，收集了40例先前未接受治疗的i-iv期pdac患者的新鲜冷冻配对pdac组织和相邻的正常组织(adjacent normal tissue，pnt)。取15μm厚的冷冻切片进行组织病理学评价。经苏木精和伊红(h&e)染色后，由两位实验人员分别标注切片以确定pdacs和pnts的区域。随后，利用 cpsi-ms对冷冻切片进行代谢分析。针对pdac/pnt区域从每个切片中随机选择三个点(点直径约2.0mm)进行cpsi-ms数据采集。如图2所示，根据代谢产物种类的分子量分布范围，全ms扫描m/z 50-1000范围内正、负两种模式下回收的代谢产物包括氨基酸、羧酸、lyo-磷酸甘油脂、核苷酸、核苷、酰基肉碱、二酰基甘油脂、脂肪酸、甘油磷脂和多胺，cpsi-ms获得了每个样品中3829个离子的相对丰度。
87.如图1的b所示，根据偏最小二乘判别分析法pls-da评分图显示， pdacs和pnts的样本点可以分为两个簇，为了发现pdac特定的代谢物，如图1的c所示，采用几个标准来进行逐步变量选择。首先，变量重要性投影(vip)作为度量，保留n＝1151个对样本分组有高度贡献的离子(vip》1.0)，此后，在pdac和pnt冷冻切片之间，发现n＝695个离子存在显著差异 (fdr《0.05，t检验)。为了进一步选择最显著的代谢物，将范围缩小到n＝626 个离子，差异倍数(fc，fold change)大于2.0或小于0.5(pdacs vs pnts)。通过检索人类代谢组数据库和metlin代谢组学数据库，推测注释了n＝222个离子，其中确定的代谢物n＝76个(如表1)。如图1的d所示，火山图突出了前10个上调和下调的小代谢物。如图1e所示，热图显示了pdac中具有代表性的小代谢物的显著变化。下调的种类包括脂肪酸(如fa8:0,fa16:0,fa18:1, fa18:3)，天冬酰胺(asn)，鞘氨醇1-磷酸(s1p)，s-腺苷同型半胱氨酸(sah)，胞苷，胸腺嘧啶，谷氨酰胺(gln)，而上调的种类包括谷氨酸(glu)，脯氨酸(pro)，亮氨酸(leu)，瓜氨酸，次黄嘌呤(hypo)，磷酸丝氨酸(serp)和酰基肉碱(例如肉碱c2:0,c4:0,c16:0,c18:0,c18:1)。
88.表1：在pdac组织中发现的具有显著变化的代谢物
[0089][0090]
实施例2利用desi-msi对pdac特征代谢物进行原位验证和空间可视化
[0091]
如图3的b所示，为研究病例，准备了与其pnt区域配对的pdac冷冻切片，成功地可视化了76种代谢物在pdac以及cpsi-ms识别的pnt 相邻和遥远区域(pnt1和2)的空间分布(代表性图像如图3的c所示，余可见表2和图3的g)。pdac区域表现出高度富集的乳酸、亮氨酸、酰基肉碱 (ac)、单甘油酯(mg)、磷脂酰胆碱(pc)、神经酰胺(cer)、鞘磷脂(sm)。鉴于脂类可以作为膜成分和信号分子，大量脂类分子的产生与肿瘤的过度生长和进展是一致的，双甘油酯(dg)与pc之间的转化与sm与cer之间的转化耦合。(引自ogretmen b(2018)sphingolipid metabolism in cancer signalling andtherapy.nat rev cancer 18:33-50.)sm、神经酰胺(cer)和pc的富集增加可以推断出甘油脂(gl)种类来源的利用率。葡萄糖、脂肪酸(fa)、dg、甘油三酯 (tg)、ps、磷脂酰肌醇(pi)、磷脂酰甘油(pg)和多胺(除腐胺外)均下调。观察发现脂质头基，包括甘油磷酸胆碱(gpcho)、甘油磷酸乙醇胺(gpea)、甘油和甘油-3-磷酸(g3p)在pdac区域的丰度极低，而三个磷酸化头基的丰度相对较高，包括磷酸乙醇胺(pea)、磷酸胆碱(pcho)和磷酸丝氨酸(如表1)，这些结果也提示了异常的脂质代谢。
[0092]
表2：经desi-msi证实，pdac组织中代谢物明显改变
[0093]
[0094][0095]
实施例3基于代谢组学的pdac诊断模型构建
[0096]
为了补充基于组织病理学的诊断，引入lasso模型来评估判断每个 cpsi-ms样本是来自癌症还是来自正常组织的概率。基于代谢组学的建模是在由n＝150个组织样本点(n＝75pnt和n＝75pdac组织点，来自n＝25例患者)组成的训练集上进行的。另外n＝90个样本点(n＝45pnt和n＝45pdac组织点，来自n＝15例患者)作为测试集，用于评估预先训练的lasso模型在未检测病例上的表现。n＝76个之前通过代谢谱和原位验证发现的代谢物被纳入训练的初始输入变量。之所以使用lasso分类器，是因为它通过调整每个输入变量的权重系数，将特征选择嵌入到训练过程中。只有对分类有贡献的变量被赋予非零的权重。因此，当只保留76个变量中的n＝22个时，lasso分类器的性能在测试集上达到了最高的准确率。
所选代谢标志物及权重系数如表3所示。
[0097]
表3：最优lasso模型的代谢物标记物及其权重系数用于互补诊断
[0098][0099]
如图3的d所示，以0.62的lasso预测得分为阈值，pdac组和pnt组的大多数交叉验证样本在得分图中都可以很好地区分。如图3e所示，混淆矩阵显示了给出的最优lasso模型的分类结果，在测试集上达到了93.3％的总体一致性(准确率)。引入受试者工作特征(receiver operating characteristic, roc)曲线来评价lasso分类器的最佳诊断性能，该曲线下面积(area undercurve,auc)在测试集上的值为0.96(95％置信区间:0.93-1.00)。如图3的f所示，以roc曲线上真实阳性率最高、假阳性率最低为截断点，诊断性能的最佳灵敏度和特异性分别为95.6％和91.1％。这些结果表明，pdac特异性代谢组学在区分肿瘤组织和正常组织方面表现出出色的性能。因此，cpsi-ms 数据采集结合lasso模型可以作为与组织活检和病理学互补的潜在体外诊断策略。
[0100]
实施例5几种代谢酶和转运体的功能特征
[0101]
如表1所示，为了进一步确定pdac组织中cpsi-ms和desi-msi鉴定的76个代谢物的生物学后果和代谢网络，在metaboanalyst上(引自pang z, chong j,zhou g,de lima morais da,chang l,et al.(2021)metaboanalyst 5.0: narrowing the gap between raw spectra and functional insights.nucleic acidsres.)进行通路富集分析(pathway enrichment analysis，pea)，预测pdac发展过程中的相关代谢通路。如图5的a所示，发现pdac组织中这些差异富集的代谢物参与了不同的代谢途径。具体来说，如表7所示，牛磺酸和次牛磺酸代谢(如半胱氨酸、牛磺酸、次牛磺酸)，甘油磷脂代谢(如pe、pc、溶血磷脂胆碱、dg、pcho、ps、gpcho、gpea、g3p)，组氨酸代谢(如谷氨酸、尿糖酸、组氨酸、甲基组胺、组胺、天冬氨酸)，谷氨酸和谷氨酰胺代谢 (如谷氨酸、谷氨酰胺、酮戊二酸)、亚油酸代谢(亚油酸、磷脂酰胆碱)、半胱氨酸和蛋氨酸代谢(如丝氨酸、蛋氨酸、半胱氨酸、磷丝氨酸)、芳香氨基酸生物合成(如苯丙氨酸、酪氨酸)和精氨酸相关代谢物(如精氨酸、瓜氨酸、天冬
氨酸、鸟氨酸)在pdac组织中富集。
[0102]
表7：胰管腺癌组组织代谢途径改变综述
[0103][0104]
通过搜索kegg和reactome中所有的pdac相关代谢标记物，进一步进行pea。如图5的b、图5的c、表8所示，最初，预测56种有不同程度的抑制或激活的酶或蛋白质，其中，4种代谢酶和转运蛋白在候选基因中排名最高，差异均有统计学意义(p《0.05)。磷脂酰丝氨酸脱羧酶(pisd)下调， pdz结构域蛋白11(pdzd11)、胸苷磷酸化酶(tymp)和溶质载体家族1成员 5(slc1a5)上调。如图5的d所示，pdzd11和slc1a5主要参与水溶性氨基酸、维生素、游离嘌呤和嘧啶、核苷酸和核苷(引自scalise m,pochini l, console l,losso ma,indiveri c(2018)the human slc1a5(asct2)aminoacid transporter:from function to structure and role in cell biology.frontcell dev biol 6:96.)的转运。pisd主要负责磷脂酰丝氨酸(ps)转化为磷脂酰乙醇胺(pe)(引自thomas he,zhangy,stefely ja,veiga sr,thomas g,et al. (2018)mitochondrial complex i activity is required for maximal autophagy. cell rep 24:2404-2417e2408.)，而tymp分别催化胸腺嘧啶/脱氧尿嘧啶转化为胸腺嘧啶/尿嘧啶(引自tetsuhiro goto ks,kazuaki yokomizo,kazumasakuraba,youhei kitamura,atsushi shirahata,mitsuo saito,gaku kigawa, hiroshi nemoto,yutaka sanada,kenji hibi(2012)expression levels ofthymidylate synthase,dihydropyrimidine dehydrogenase,and thymidinephosphorylase in patients with colorectal cancer.anticancer research: 1757-1762.)。如图5的e、图5的f所示，使用组织芯片对92例pdac原发癌标本进行免疫组化(ihc)分析，证实了这一结果，显示与pnt相比，pdac 组织中pisd的表达降低，而slc1a5、tymp和pdzd11的表达显著增加。
[0105]
表8：根据富集的代谢途径预测相关的转运体和酶
role of mitochondrial dynamics in human cancers.am j cancerres 10:1278-1293.)。为了进一步探索其生物学意义，通过desi-msi原位成像，在配对的pdac和pnt组织冷冻切片上检测pisd的底物和产物。如图 6的b所示，desi-msi分析显示pdac中pe(pisd的产物)的相对丰度低于 pnt区域。如图6的c所示，虽然pdac和pnt区域的pdac底物ps在两个区域的丰度没有太大的差异，但pe/ps比值显著降低(p《0.05)。根据有关研究显示pisd具有抑瘤作用(引自thomas he,zhangy,stefely ja,veigasr,thomas g,et al.(2018)mitochondrial complex i activity is required formaximalautophagy.cell rep 24:2404-2417e2408)，本发明通过pdac细胞株sw1990的异位表达来检测pisd的抑瘤功能。如图6的d所示，transwell 实验显示，pisd过表达组的细胞密度明显低于对照组。如图6的e所示，细胞迁移实验显示，过pisd表达的sw1990细胞迁移距离较短。这些结果与pdac组织中pisd的下调以及pdac的肿瘤抑制功能相一致。
[0110]
通过组织芯片免疫组化检测slc1a5蛋白表达，然后根据多元分析确定的独立预测因子构建列线图。如图5的h所示，在pdac患者中，slc1a5 的高表达与tnm晚期和更高的分级显著相关。kaplan-meier法比较生存率曲线，显示slc1a5表达水平与pdac患者的总生存期呈负相关，slc1a5 高表达组的1年和3年生存率也低于slc1a5低表达组。
[0111]
如图7的a所示，slc1a5主要介导细胞外谷氨酰胺与胞浆丙氨酸的跨膜交换(引自scalise m,pochini l,console l,losso ma,indiveri c(2018)thehuman slc1a5(asct2)amino acid transporter:from function to structureand role in cell biology.front cell dev biol 6:96)。通过desi-msi和 cpsi-ms分析，如图7的b所示，观察到pdac中的谷氨酰胺和丙氨酸显著低于pnt区域。如图7的c所示，血清代谢物标记物验证进一步显示，转移(m1)期患者的谷氨酰胺和丙氨酸明显低于非转移性pdac患者(m0)。上述结果表明，谷氨酰胺酶1(gls1)介导的谷氨酰胺水解增加了谷氨酰胺的消耗。如图7的b、图7的d所示，pdac区域谷氨酸水平较高，谷氨酸与丙氨酸 (slc1a5的底物)和谷氨酸与谷氨酰胺(gls1的产物和底物)的比值较高支持谷氨酰胺的消耗。由于产物与底物的比值表明了相应酶的相对水平或活性(引自brett r.hamilton dlm,nicholas r.casewell,roberta.harrison,stephen j. blanksby,eivind a.b.undheim(2020)mapping enzyme activity on tissue byfunctional mass spectrometry imaging.angew chem int ed engl 59: 3855-3858)，这些结果与ihc结果一致，在pdac组织中slc1a5和gls1 的蛋白水平均明显高于pnt。此外，如图7的e所示，pdac细胞sw1990 中slc1a5的mrna水平高于非致瘤细胞h6c7。为了确定这是否由slc1a5 引起，本发明用slc1a5抑制剂v-9302处理sw1990 pdac细胞系，如图7 的f所示，谷氨酰胺水平降低，丙氨酸水平升高。如图7的g、图7的h、图7的i所示，v-9302和gls1抑制剂cb-839可抑制细胞增殖，并增加细胞对化疗药物吉西他滨的敏感性。
[0112]
同样，与pdzd11和tymp表达增加(如图5的d、图5的f)一致，如图8的a所示，许多差异富集的小代谢物与嘌呤和嘧啶的过度转运和代谢有关。如图8的b、图8的c、图8的d，desi-msi结果显示，检测到的大部分嘌呤和嘧啶，包括尿酸、黄嘌呤、次黄嘌呤、腺嘌呤、肌苷、胞嘧啶、脱氧尿嘧啶和胸腺嘧啶在pdac区域均较高，其中，高水平的脱氧尿苷(产物)、胸腺嘧啶(产物)和低水平的尿嘧啶(底物)与tymp的高表达一致。这与之前的一篇报道一致，即依赖tp的胸苷激酶分解代谢有助于癌细胞在低营养条件下存活(引自toi m,rahman ma,
bando h,chow lwc(2005)thymidinephosphorylase(platelet-derived endothelial-cell growth factor)in cancer biologyandtreatment.the lancet oncology 6:158-166.)。
[0113]
实施例中根据胰腺癌早期诊断标志物的组织筛选方法筛选得到的早期诊断标志物包含：甘油二酯、1-正丁胺、胞苷、组胺、磷酸胆碱、羟基亚麻酸、亚油酸、3-磷酸甘油、谷氨酸、丙烯酰肉碱、谷氨酰胺、酪氨酸、3-羟基棕榈酸、溶血磷脂胆碱(p-16:0)、丁酰肉碱、哌啶甲酸、溶血磷脂胆碱(18:2)、乙酰精胺、乳酸、组氨酸、n-甲基组胺、n-乙酰组胺中的任意一种或者任意两种以上的组合。
[0114]
可以理解的是，根据所述的胰腺癌早期诊断标志物，其还可以用于制备检测上述早期诊断标志物表达水平的检测产品。
[0115]
一些实施例中，检测产品能够是体外检测试剂。
[0116]
一些实施例中，检测产品也能够是检测试剂盒，具体的，所述的检测试剂盒含有检测试剂。
[0117]
综上所述，本发明所提出的一种胰腺癌早期诊断标志物及其组织筛选方法和应用，基于cpsi-ms和desi-msi的pdac代谢组学不仅是一种方便的表征工具，可以在原位水平上对癌症代谢进行全景概述，而且是一种快速分子诊断和筛查的稳健方法，通过实验得到的胰腺癌组织和正常组织中的差异性代谢物，可以作为胰腺癌早期诊断标志物使用，具有广泛的临床应用前景。
[0118]
尽管本发明的内容已经通过上述优选实施例作了详细介绍，但应当认识到上述的描述不应被认为是对本发明的限制。在本领域技术人员阅读了上述内容后，对于本发明的多种修改和替代都将是显而易见的。因此，本发明的保护范围应由所附的权利要求来限定。