一种豹纹鳃棘鲈的SSR标记及其扩增引物和应用

一种豹纹鳃棘鲈的ssr标记及其扩增引物和应用
技术领域
1.本发明涉及到分子生物学技术领域，具体涉及一种豹纹鳃棘鲈的ssr标记及其扩增引物和应用。


背景技术：

2.豹纹鳃棘鲈(plectropomus leopardus)，俗名“东星斑”，隶属鲈形目(perciformes)、鲈亚目(perciformes)、鮨科(serranidae)、石斑鱼亚科(epinephelinae)、鳃棘鲈属(plectropomus)，属暖水性岛礁海水鱼，主要分布于西太平洋至印度洋海域，是我国南方重要的养殖鱼类。豹纹鳃棘鲈肉质鲜嫩、味道鲜美，具有低脂肪、低胆固醇和高蛋白等特点，属高档食用鱼类，深受广大消费者喜爱，市场前景广阔。然而，豹纹鳃棘鲈自然数量稀少，近些年来高强度的捕捞压力已经使其资源处于枯竭状态。为了解决我国天然海域豹纹鳃棘鲈生物量急剧下降的问题，通常将人工增殖培育的豹纹鳃棘鲈幼苗投放到放流海域，以恢复或增加天然种群数量。增殖放流虽然可以显著提高放流海域的生物量和种群规模，但是也存在对种群的遗传多样性、生态适合度产生影响的问题，造成生物多样性降低和种质资源退化。因此，需要通过分子生物学等技术，对自然海域和经过人工增殖放流恢复后的豹纹鳃棘鲈种群遗传多样性进行评估。
3.遗传分子标记中，现今使用较频繁的是序列分子标记、简单序列重复(ssr)和单核苷酸多态性(snp)三种标记，每种分子标记都有各自的优缺点。ssr(simple sequence repeats)标记是近年来发展起来的一种以特异引物pcr为基础的分子标记技术，也称为微卫星dna(microsatellite dna)，是一类由几个核苷酸(一般为1～6个)为重复单位组成的长达几十个核苷酸的串联重复序列。微卫星在染色体上呈随机分布，以多拷贝方式均匀分布在真核生物的基因组中，其多态性是由重复次数不同及重复程度的不完全造成。对于已知的一条微卫星dna序列，由于其重复序列区具有相当高的突变率(每世代10
2-106次的突变)，从而产生了高水平的等位基因多态性，而位于重复区两端的侧翼区序列则相对保守。因此，利用侧翼区序列就可以设计出特异引物对该位点进行扩增，从而用于相关的多态性研究。
4.ssr分子标记的开发方法包括：基因组酶切杂交法、随机扩增杂交法、锚定pcr扩增法、富集文库分离法、基于aflp的ssr快速分离法和基于转录组测序的est-ssr法。目前使用最广泛的是高通量、操作简便的est-ssr法。然而，由于est-ssr法所获得的ssr标签位于转录区域，是基因组上ssr密度较低的区域，且可能与性状关联发生正选择，并不能完全准确反映中性的种群基因流动情况。过去，使用est-ssr法获得的豹纹鳃棘鲈ssr标记的等位基因数目为4～12个，在对遗传多样性较低的群体(如增殖放流群体)进行评估时，使用效率比较受限制。


技术实现要素：

5.因此，本发明旨在挖掘豹纹鳃棘鲈基因组中高效的ssr标记并开发引物和检测方
法，为高效评估豹纹鳃棘鲈遗传多样性奠定基础。
6.本发明的第一个目的在于提供一种高效评估豹纹鳃棘鲈种群遗传多样性的ssr标记，该标记多态性强、杂合度高。
7.上述目的是通过以下技术方案来实现的：在genbank下载纹鳃棘鲈基因组，递交号为prjdb9369，总长为748.23 mb，gc含量为39.5％，scaffold n50长度为30.01mb，contig n50长度为1.08mb。使用misa软件对ssr序列进行预测，选取3～4个重复单元的ssr，并计算出预期杂合度最高的ssr位点。
8.由此获得豹纹鳃棘鲈基因组中多态性极高的ssr位点10个，标记编号为：pldssr-01、pldssr-02、pldssr-03、pldssr-04、pldssr-05、pldssr-06、pldssr-07、pldssr-08、pldssr-09和pldssr-10；
9.所述的pldssr-01的核苷酸序列如seq id no.1所示；
10.所述的pldssr-02的核苷酸序列如seq id no.2所示；
11.所述的pldssr-03的核苷酸序列如seq id no.3所示；
12.所述的pldssr-04的核苷酸序列如seq id no.4所示；
13.所述的pldssr-05的核苷酸序列如seq id no.5所示；
14.所述的pldssr-06的核苷酸序列如seq id no.6所示；
15.所述的pldssr-07的核苷酸序列如seq id no.7所示；
16.所述的pldssr-08的核苷酸序列如seq id no.8所示；
17.所述的pldssr-09的核苷酸序列如seq id no.9所示；
18.所述的pldssr-10的核苷酸序列如seq id no.10所示。
19.本发明的第二个目的在于提供一种豹纹鳃棘鲈的ssr标记扩增引物，该引物扩增稳定、重复性好。
20.利用primer3软件，对筛选后的ssr批量设计pcr扩增产物长度为200～300bp的引物。对引物进行过滤，要求自由能大于30(无发夹结构)。使用过滤好的引物，进行基因组blast比对，挑选出特异性引物，在非ssr区域理论上没有序列扩增出，并且在ssr区域可以扩增出来。对ssr扩增片段选择多态性高、扩增良好稳定、杂合度高、扩增片段大小有差异且具有相同或接近的退火温度(58～60℃)、gc值控制在50％～60％之间。通过pcr扩增，毛细管电泳检测扩增产物大小，筛选得到上述的10对特异性扩增、高多态性的ssr标记引物，所述的引物包括：
21.针对pldssr-01位点：
22.pldssr-01-f：5'-ttcagcttcggagggtgaac-3'；
23.pldssr-01-r：5'-tgttcagtgtactgccctgg-3'；
24.针对pldssr-02位点：
25.pldssr-02-f：5'-tcacctcagcacttagggga-3'；
26.pldssr-02-r：5'-atgactgctgctcgctcatt-3'；
27.针对pldssr-03位点：
28.pldssr-03-f：5'-gcccagtgctaaagacagtca-3'；
29.pldssr-03-r：5'-cagtgtgcagtgcagctttt-3'；
30.针对pldssr-04位点：
31.pldssr-04-f：5'-tccaggttcatcctcagggt-3'；
32.pldssr-04-r：5'-ttgaagctgctgaaggtcgt-3'；
33.针对pldssr-05位点：
34.pldssr-05-f：5'-ccaactgcttcaggggacat-3'；
35.pldssr-05-r：5'-tgccggtcaggtttctcttc-3'；
36.针对pldssr-06位点：
37.pldssr-06-f：5'-gcgctctggggtcagttatt-3'；
38.pldssr-06-r：5'-ggctcctggtaacacaacga-3'；
39.针对pldssr-07位点：
40.pldssr-07-f：5'-ccacagccagaaaccatgga-3'；
41.pldssr-07-r：5'-aggtactgctgctctaggct-3'；
42.针对pldssr-08位点：
43.pldssr-08-f：5'-tgacggtcatgtctttgaggg-3'；
44.pldssr-08-r：5'-caacagtacctcccagcgag-3'；
45.针对pldssr-09位点：
46.pldssr-09-f：5'-cagttgcgctaacaggcttg-3'；
47.pldssr-09-r：5'-aaacacatgctaccagggca-3'；
48.针对pldssr-10位点：
49.pldssr-10-f：5'-agctttgttgcagcctctga-3'；
50.pldssr-10-r：5'-cagcagcatgaacaggcaag-3'。
51.优选地，所述的扩增引物的正向引物的5'端标记有荧光基团；更优选地，所述的荧光基团为rox、fam、hex或tamra。
52.本发明的第三个目的在于提供一种豹纹鳃棘鲈ssr标记的检测试剂盒，包含上述的扩增引物。
53.本发明的第四个目的在于提供一种高效评估豹纹鳃棘鲈群体遗传多样性的方法，包括以下步骤：
54.(1)收集豹纹鳃棘鲈群体样本，提取豹纹鳃棘鲈个体dna；
55.(2)以步骤(1)提取的基因组dna为模板，利用权利要求2、3或4所述的扩增引物进行pcr扩增；
56.(3)对步骤(2)扩增的pcr产物进行分型；
57.(4)对步骤(3)获得的分型结果进行遗传多样性分析。
58.优选的，步骤(2)所述的pcr扩增，其反应体系25μl，包括：不含mg
2
的10
×
pcr buffer2.5μl、25mm mgcl22.0μl、10mm dntp 0.5μl、高保真pcr酶1u、10μm正向引物0.5μl、10μm反向引物0.5μl、dna模板12.5ng，其余由无菌双蒸水补足至25μl；
59.其反应程序为：95℃预变性5分钟；95℃变性30秒，60℃退火30秒，72℃延伸30秒，共35个循环；72℃再延伸6分钟。
60.优选的，步骤(3)所述的分型，10对多态性ssr标记引物的5'端标记fam荧光基团，并利用基因型分型测序仪进行毛细管电泳分型。
61.优选的，步骤(4)所述的遗传多样性分析，利用genaiex软件进行遗传多样性分析，
包括每个位点的等位基因数(na)、有效等位基因数(ne)、香农信息指数(i)、观测杂合度(ho)、期望杂合度(he)等反映群体遗传多样性的常用指标，固定指数(f)用以衡量观测杂合度偏离hardy-weinberg平衡的程度。
62.本发明的最后一个目的在于提供上述ssr标记、扩增引物及检测试剂盒在豹纹鳃棘鲈遗传多样性分析、种群鉴定或增殖放流效果评估方面的应用。
63.与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
64.本发明基于基因组数据开发的ssr标记及引物，该开发的ssr标记比现有技术开发的标记多态性更高，对采集于不同来源的16个个体进行遗传多样性分析即获得14～18个等位基因，远高于现有技术4～12个等位基因的水平，在对遗传多样性较低的群体(如增殖放流群体)进行评估时具有优势。
65.本发明开发的ssr分子标记可用于豹纹鳃棘鲈遗传多样性分析等领域，为今后豹纹鳃棘鲈种质资源调查、放流效果评估提供理论基础。
附图说明
66.图1是16尾不同海域豹纹鳃棘鲈采集地点图，gd：广东省、gx：广西自治区、hn：海南省、ph：菲律宾、ma：马来西亚、in：印度尼西亚、au：澳大利亚。
67.图2是通过本发明分析得到16尾豹纹鳃棘鲈的遗传关系图，gd：广东省、gx：广西自治区、hn：海南省、ph：菲律宾、ma：马来西亚、in：印度尼西亚、au：澳大利亚。
具体实施方式
68.以下结合实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。
69.下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法或者按照试剂盒说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径获得。引物合成和测序由武汉天一辉远有限公司完成。
70.实施例1ssr标记分析采集自不同海域石斑鱼的遗传关系
71.在genbank下载纹鳃棘鲈基因组，递交号为prjdb9369，总长为748.23mb，gc含量为39.5％，scaffold n50长度为30.01mb，contig n50长度为1.08mb。使用misa软件对ssr序列进行预测，选取3～4个重复单元的ssr，并计算出预期杂合度最高的ssr位点。
72.利用primer3软件，对筛选后的ssr批量设计pcr扩增产物长度为200～300bp的引物。对引物进行过滤，要求自由能大于30(无发夹结构)。使用过滤好的引物，进行基因组blast比对，挑选出特异性引物，在非ssr区域理论上没有序列扩增出，并且在ssr区域可以扩增出来。对ssr扩增片段选择多态性高、扩增良好稳定、杂合度高、扩增片段大小有差异且具有相同或接近的退火温度(58～60℃)、gc值控制在50％～60％之间。通过pcr扩增，毛细管电泳检测扩增产物大小，筛选得到上述的10对特异性扩增、高多态性的ssr标记引物，所述的引物包括：
73.针对pldssr-01位点：
74.pldssr-01-f：5'-ttcagcttcggagggtgaac-3'；
75.pldssr-01-r：5'-tgttcagtgtactgccctgg-3'；
76.针对pldssr-02位点：
77.pldssr-02-f：5'-tcacctcagcacttagggga-3'；
78.pldssr-02-r：5'-atgactgctgctcgctcatt-3'；
79.针对pldssr-03位点：
80.pldssr-03-f：5'-gcccagtgctaaagacagtca-3'；
81.pldssr-03-r：5'-cagtgtgcagtgcagctttt-3'；
82.针对pldssr-04位点：
83.pldssr-04-f：5'-tccaggttcatcctcagggt-3'；
84.pldssr-04-r：5'-ttgaagctgctgaaggtcgt-3'；
85.针对pldssr-05位点：
86.pldssr-05-f：5'-ccaactgcttcaggggacat-3'；
87.pldssr-05-r：5'-tgccggtcaggtttctcttc-3'；
88.针对pldssr-06位点：
89.pldssr-06-f：5'-gcgctctggggtcagttatt-3'；
90.pldssr-06-r：5'-ggctcctggtaacacaacga-3'；
91.针对pldssr-07位点：
92.pldssr-07-f：5'-ccacagccagaaaccatgga-3'；
93.pldssr-07-r：5'-aggtactgctgctctaggct-3'；
94.针对pldssr-08位点：
95.pldssr-08-f：5'-tgacggtcatgtctttgaggg-3'；
96.pldssr-08-r：5'-caacagtacctcccagcgag-3'；
97.针对pldssr-09位点：
98.pldssr-09-f：5'-cagttgcgctaacaggcttg-3'；
99.pldssr-09-r：5'-aaacacatgctaccagggca-3'；
100.针对pldssr-10位点：
101.pldssr-10-f：5'-agctttgttgcagcctctga-3'；
102.pldssr-10-r：5'-cagcagcatgaacaggcaag-3'。
103.采集来自中国广东省(2尾)、广西自治区(2尾)、海南省(2尾)、菲律宾(2尾)、马来西亚(2尾)、印度尼西亚(4尾)、澳大利亚(2尾)合计16尾豹纹鳃棘鲈样本，采样地点如图1所示。提取使用10对引物分别对16个体进行pcr扩增分析和毛细管电泳分型，pcr扩增，其反应体系25μl，包括：不含mg
2
的10
×
pcrbuffer 2.5μl、25mm mgcl22.0μl、10mm dntp 0.5μl、高保真pcr酶1u、10μm正向引物0.5μl、10μm反向引物0.5μl、dna模板12.5ng，其余由无菌双蒸水补足至25μl；其反应程序为：95℃预变性5分钟；95℃变性30秒，60℃退火30秒，72℃延伸30秒，共35个循环；72℃再延伸6分钟。通过软件进行统计分析，结果如表1所示。通过10对多态性ssr标记引物的5’端标记fam荧光基团，并利用abi 3730xl进行基因型分型测序仪进行毛细管电泳分型。通过genaiex软件进行统计分析，结果如表1所示。
104.表1 10个ssr在16尾不同来源豹纹鳃棘鲈个体中的遗传多样性参数
[0105][0106]
(n：样品个数、na：等位基因数、ne：有效等位基因数、i：香农信息指数、ho：观测杂合度、he：期望杂合度、f：固定指数、pop：群体、mean：平均值、se：标准误)
[0107]
每个ssr标记的等位基因数(na)在14～18个之间，平均每个ssr标记有15.7个等位基因，有效等位基因在7.420～13.838之间，平均值为10.913；香农信息指数在2.435～2.724之间，平均值为2.558；观测杂合度在0.500～1.000之间，平均值为0.681；期望杂合度在0.865～0.928之间，平均值为0.906，观测杂合度明显低于期望杂合度，说明存在杂合度缺失；固定指数在-0.085～0.583之间，平均值为0.248。通过mega进行upgma聚类分析，构建聚类树如图2所示。通过ssr分析获得采集自不同海域石斑鱼的遗传关系符合地理分布。
[0108]
实施例2ssr标记分析广西北海涠洲岛附近海域3个豹纹鳃棘鲈自然群体
[0109]
采集来自广西北海涠洲岛附近海域3个豹纹鳃棘鲈自然群体，三个群体采样数目分别为29尾、24尾和25尾，使用10对引物(pldssr-01-10)分别对3个群体合计78个个体进行pcr扩增分析和毛细管电泳分型，方法及步骤参考实施例1，通过软件进行统计分析，结果如表2所示。
[0110]
表2.广西涠洲岛附近海域3个豹纹鳃棘鲈自然群体的遗传多样性参数
[0111]
[0112]
(n：样品个数、na：等位基因数、ne：有效等位基因数、i：香农信息指数、ho：观测杂合度、he：期望杂合度、f：固定指数、pop：群体、mean：平均值、se：标准误)
[0113]
广西涠洲岛附近海域3个豹纹鳃棘鲈自然群体的分析样本数分别为29、24、25，平均等位基因数分别为12.2、12.6、12.6，平均有效等位基因数分别为8.084、7.819、7.549，平均香农信息指数分别为2.241、2.225、2.216，平均观察杂合度分别为0.634、0.658、0.588，平均期望杂合度分别为0.873、0.861、0.858，评估固定指数分别为0.274、0.239、0.312。
[0114]
实施例3ssr标记对广西涠洲岛附近海域豹纹鳃棘鲈放流前后的分析
[0115]
采集来自广西北海涠洲岛附近同一海域人工增殖放流前豹纹鳃棘鲈31尾，增殖放流后豹纹鳃棘鲈37尾，使用10对引物(pldssr-01-10)分别对放流前后计68个个体进行pcr扩增分析和毛细管电泳分型，方法及步骤参考实施例1，通过软件进行统计分析，结果如表3所示。
[0116]
表3.广西涠洲岛附近海域放流前后豹纹鳃棘鲈群体的遗传多样性参数
[0117][0118]
(n：样品个数、na：等位基因数、ne：有效等位基因数、i：香农信息指数、ho：观测杂合度、he：期望杂合度、f：固定指数、pop：群体、mean：平均值、se：标准误)
[0119]
广西涠洲岛附近海域放流前后分析样本数分别为31、37，平均等位基因数分别为13.7、12.3，平均有效等位基因数分别为8.167、7.017，平均香农信息指数分别为2.309、2.130，平均观察杂合度分别为0.639、0.635，平均期望杂合度分别为0.875、0.845，评估固定指数分别为0.270、0.252。