一种水稻稻瘟病抗性鉴定方法

1.本发明属于水稻抗性育种技术领域，尤其涉及一种水稻稻瘟病抗性鉴定方法。


背景技术：

2.稻瘟病又名稻热病、火烧瘟、叩头瘟等，是由稻瘟病原菌引起的、发生在水稻的一种病害。稻瘟病在水稻整个生育期中都可发生，为害秧苗、叶片、穗、节等，分别称为苗瘟、叶瘟、穗瘟和节瘟。稻瘟病分布遍及世界稻区，是稻作生产中的主要病害，其中以亚洲、非洲稻区发病为重。流行年份，一般减产10-20％，重的达40-50％，局部田块甚至颗粒无收。目前本领域稻瘟病的防治方法主要有选用抗病品种，培育优质秧苗、肥水管理技术措施、加强田间管理、落实防治措施、化学药剂控制等。
3.选择抗病性较强的优质品种种植培育，能够确保种子同时具有良好的丰产性、品质型、适应性和抗逆性，在根源处提升水稻自身抵御稻瘟病感染的能力，预防稻瘟病发生。但是目前鉴定水稻稻瘟病抗性的方法主要有喷雾接种法、自然病圃法等。喷雾接种法特点是简单易行、条件易控制、结果较可靠，缺点是孢子用量大，接种效果受温度湿度影响，而且分小种或菌株接种时需要隔离设施。穗颈瘟仅仅采用田间自然诱发鉴定方法，存在发病可能不充分、结果不够精确等缺点。所以本领域亟需一种方法简单、受外界影响小、鉴定结果全面且准确的适合对大量材料进行快速鉴定的水稻稻瘟病抗性鉴定方法。


技术实现要素：

4.有鉴于此，本发明的目的在于提供一种方法简单、受外界影响小、鉴定结果全面且准确的适合对大量材料进行快速鉴定的水稻稻瘟病抗性鉴定方法。
5.为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：
6.本发明提供了一种水稻稻瘟病抗性鉴定方法，所述方法包括如下步骤：以感稻瘟病栽培稻为对照，将对照与供试稻交叉种植，待供试稻苗长至3～5叶龄时，诱导苗期叶瘟发病，进行苗期叶瘟抗性鉴定，保留表现中抗以上的供试稻，诱导穗颈瘟发病，进行穗颈瘟抗性鉴定，取表现中抗以上的供试稻的叶片，在叶片上打孔，将稻瘟病菌孢子悬浮液滴于打孔处，将叶片包裹，避光过夜，第二天开启光照/黑暗交替培养，培养5天观察病斑长度，病斑长度在2mm以下的供试稻为稻瘟病抗性稻。
7.优选的，诱导苗期叶瘟发病的方法包括如下步骤：取对照叶，在供试稻上方摇甩，使病叶中孢子散落在供试稻上，将病叶放置于供试稻叶片上。
8.优选的，诱导穗颈瘟发病的方法包括如下步骤：接种稻瘟病菌菌液浓度为2
×
10
4-5
×
104个/ml的孢子悬浮液，喷雾接种。
9.优选的，所述喷雾接种的量为每100株苗喷施20ml菌液。
10.优选的，诱导发病的方法还包括如下步骤：遮光膜覆盖，26-28℃保湿14-16h，揭膜，在自然条件下培养。
11.优选的，进行苗期叶瘟抗性鉴定或进行穗颈瘟抗性鉴定的时间为：以对照为参考
标准，对照发病21天后，即可调查。
12.优选的，所述中抗为典型纺锤形病斑，长度在2mm以下，危害面积在2％以下。
13.优选的，苗期叶瘟抗性鉴定和穗颈瘟抗性鉴定均分别进行两次，两次间隔为一个月。
14.优选的，所述稻瘟病菌孢子悬浮液中含有6-ba和吐温20，所述6-ba的浓度为10ug/ml。
15.本发明还提供了一种上述方法在水稻抗稻瘟病育种中的应用。
16.本发明的有益效果：
17.本发明提供的水稻稻瘟病抗性鉴定方法按照“自然发病-诱导发病-接种鉴定”的顺序进行抗性鉴定，苗期稻瘟病鉴定采用诱导自然发病法，病原来自天然，具有成本低、工序简便易操作等特点，适合对大量材料进行快速鉴定；抽穗期时结合稻瘟病菌生理小种接种法鉴定，结合离体鉴定试验，形成一种水稻稻瘟病田间和离体综合鉴定方法，使稻瘟病调查和鉴定结果更加全面和准确，克服了单一使用喷雾接种法、自然病圃法等鉴定方法存在的缺陷。
具体实施方式
18.本发明提供了一种水稻稻瘟病抗性鉴定方法，所述方法包括如下步骤：以感稻瘟病栽培稻为对照，将对照与供试稻交叉种植，待供试稻苗长至3～5叶龄时，诱导苗期叶瘟发病，进行苗期叶瘟抗性鉴定，保留表现中抗以上的供试稻，诱导穗颈瘟发病，进行穗颈瘟抗性鉴定，取表现中抗以上的供试稻的叶片，在叶片上打孔，将稻瘟病菌孢子悬浮液滴于打孔处，将叶片包裹，避光过夜，第二天开启光照/黑暗交替培养，培养5天观察病斑长度，病斑长度在2mm以下的供试稻为稻瘟病抗性稻。
19.在本发明中，所述交叉种植优选为按“对照-供试材料-对照-供试材料-对照”的顺序栽植，所述栽植的地方优选为鉴定圃即遮荫网室内，具体栽植时间优选为移栽供试稻种茎盆栽再生苗前20天，播种对照品种。播种前化肥与有机肥料兼用，均匀施肥。在全生育期保水，保证鉴定圃小气候的湿度要求，以利于发病。
20.在本发明中，诱导苗期叶瘟发病的方法优选的包括如下步骤：取对照叶，在供试稻上方摇甩，使病叶中孢子散落在供试稻上，将病叶放置于供试稻叶片上。在本发明中，将对照叶在供试稻上方摇甩的次数优选为2次以上，待摇甩结束后，优选的需将病叶剪碎放置在供试稻叶片上，便于诱导发病。将剪碎的病叶放在供试稻叶片上之后，优选的需遮光膜覆盖，26-28℃保湿14-16h，然后揭膜，此种方法优选的需重复进行，在本发明中，所述重复的次数优选为至少2次，然后在自然条件下培养。以感病对照为参考标准，感病对照发病时间为21天后，即可调查，保留表现中抗以上的供试稻。在本发明中，所述表现中抗以上的供试稻优选为含有典型纺锤形病斑，长度在2mm以下，危害面积在2％以下的供试稻。
21.在本发明中，上述苗期叶瘟初鉴结束后，凡初鉴表现中抗以上的材料优选的选入复鉴，初鉴和复鉴时间间隔优选为一个月，两次鉴定方法相同。
22.经苗期叶瘟抗性鉴定后，获得表现中抗以上的供试稻，继续种植，其余供试稻均拔除。种植留存的供试稻，诱导其穗颈瘟发病，进行穗颈瘟抗性鉴定。在本发明中，诱导穗颈瘟发病的方法优选的包括如下步骤：接种稻瘟病菌菌液浓度为2
×
10
4-5
×
104个/ml的孢子悬
浮液，喷雾接种。本发明对于稻瘟病菌的具体种类没有特殊限定，采用本领域常规稻瘟病菌种类均可。所述稻瘟病菌菌液的浓度优选为3
×
10
4-4
×
104个/ml，所述喷雾接种的量优选为每100株苗喷施20ml菌液，所述喷雾接种的次数优选为至少2次。喷雾接种结束后，优选的需遮光膜覆盖，26-28℃保湿14-16h，然后揭膜，此种方法优选的需重复进行，在本发明中，所述重复的次数优选为至少2次，然后在自然条件下培养。以感病对照为参考标准，感病对照发病时间为21天后，即可调查，保留表现中抗以上的供试稻，其余供试稻拔除。在本发明中，所述表现中抗以上的供试稻优选为含有典型纺锤形病斑，长度在2mm以下，危害面积在2％以下的供试稻。
23.在本发明中，上述穗颈瘟抗性鉴定初鉴结束后，凡初鉴表现中抗以上的材料优选的选入复鉴，初鉴和复鉴时间间隔优选为一个月，两次鉴定方法相同。
24.经上述苗期叶瘟和穗颈瘟抗性鉴定后留存的供试稻，进行离体鉴定试验。在本发明中，所述离体鉴定试验具体为取表现中抗以上的供试稻的叶片，在叶片上打孔，将稻瘟病菌孢子悬浮液滴于打孔处，将叶片包裹，避光过夜，第二天开启光照/黑暗交替培养，培养5天观察病斑长度，病斑长度在2mm以下的供试稻为稻瘟病抗性稻。
25.在本发明中，优选的在叶片背面打孔，本发明对于打孔的个数以及各孔孔间距离没有特殊限定，依叶片大小而定。在本发明中，所述稻瘟病菌孢子悬浮液优选的为含有6-ba和吐温20的稻瘟病菌孢子悬浮液，所述稻瘟病菌孢子悬浮液中6-ba的浓度优选为10ug/ml。在本发明具体实施例中，所述稻瘟病菌孢子悬浮液的制备方法具体为：在一个稻瘟病菌平板加入约50ml无菌水清洗，清洗后先用无菌水将纱布润湿，随后将清洗下来的孢子悬浮液过打湿的纱布过来，滤去杂质，留过滤后液体，随后加入500ul配制的6-ba母液和5ul吐温20，混匀后即得稻瘟病菌孢子悬浮液。
26.本发明还提供了一种上述方法在水稻抗稻瘟病育种中的应用。
27.下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
28.实施例1
29.以严重感病栽培稻为对照，按“对照-供试材料-对照-供试材料-对照”的顺序栽植于鉴定圃(遮荫网室内)，并在试验材料四周种植严重感病栽培稻作为诱发品种。取野生稻种茎盆栽再生苗，移栽前20d，播种对照品种；播种前化肥与有机肥料兼用，均匀施肥。在全生育期保水，保证鉴定圃小气候的湿度要求，以利于发病。田间自然抗病调查不重复栽植野生稻材料，直接利用保存在田间的材料。
30.野生稻再生苗长至3叶龄时，取严重感染稻瘟病的栽培稻病叶，在接种材料上方摇甩，使病叶中孢子散落在接种材料上，重复3次，并剪碎病叶放置于供试材料叶片上，诱导发病。然后遮光膜覆盖，26℃保湿14h，后揭膜，重复3次，在自然条件下培养。以感病对照为参考标准，感病对照发病时间为21d时即可调查。保留表现中抗以上的野生稻(含有典型纺锤形病斑，长度在2mm以下，危害面积在2％以下的野生稻)，其余野生稻拔除。上述苗期叶瘟初鉴结束后，凡初鉴表现中抗以上的材料进行复鉴，初鉴和复鉴时间间隔为一个月，复鉴的方法同上述初鉴方法。
31.继续种植培养田间留存的野生稻，进行穗颈瘟抗性鉴定，具体为：用培养好的稻瘟病菌生理小种yc25接种，接种菌液浓度为2
×
104个/ml的孢子悬浮液，喷雾接种(100株苗约
用20ml菌液)，喷雾重复3次。然后遮光膜覆盖，26℃保湿14h，后揭膜，重复3次，在自然条件下培养。以感病对照为参考标准，感病对照发病时间为21d时即可调查。保留表现中抗以上的野生稻(含有典型纺锤形病斑，长度在2mm以下，危害面积在2％以下的野生稻)，其余野生稻拔除。上述苗期叶瘟初鉴结束后，凡初鉴表现中抗以上的材料进行复鉴，初鉴和复鉴时间间隔为一个月，复鉴的方法同上述初鉴方法。
32.对经上述方法鉴定后留存的野生稻进行离体鉴定，具体为：相同部位的叶片用剪刀剪至6cm长度。用同一规格枪头于叶背面打孔，每片叶打孔3个，每个孔间距离1.5cm。将叶片平铺于0.5％的琼脂平板上，打孔的一面朝上。用枪头吸取10ul孢子悬浮液滴于打孔处。封口膜统一包好封口，25℃避光过夜。第二天开启光照/黑暗交替培养。5天后观察病斑长度，将叶表面的菌液擦拭干净，并拍照，病斑长度在2mm以下的供试稻为稻瘟病抗性稻。
33.其中孢子悬浮液的制备方法为：在稻瘟病菌平板中加入50ml无菌水清洗，清洗后先用无菌水将纱布润湿，随后将清洗下来的孢子悬浮液过打湿的纱布过来，滤去杂质，留过滤后液体，随后加入500ul配制的6-ba母液和5ul吐温20，混匀后备用。
34.其中1mg/ml的6-ba母液为：称取10mg 6-ba粉末至于无菌蓝盖瓶中，加入氢氧化钠标准溶液(称取4g氢氧化钠加入100ml的水，配成标准溶液)至完全溶解，随后定容至10ml，调ph至7.0。
35.实施例2
36.以严重感病栽培稻为对照，按“对照-供试材料-对照-供试材料-对照”的顺序栽植于鉴定圃(遮荫网室内)，并在试验材料四周种植严重感病栽培稻作为诱发品种。取野生稻种茎盆栽再生苗，移栽前20d，播种对照品种；播种前化肥与有机肥料兼用，均匀施肥。在全生育期保水，保证鉴定圃小气候的湿度要求，以利于发病。田间自然抗病调查不重复栽植野生稻材料，直接利用保存在田间的材料。
37.野生稻再生苗长至5叶龄时，取严重感染稻瘟病的栽培稻病叶，在接种材料上方摇甩，使病叶中孢子散落在接种材料上，重复2次，并剪碎病叶放置于供试材料叶片上，诱导发病。然后遮光膜覆盖，28℃保湿16h，后揭膜，重复2次，在自然条件下培养。以感病对照为参考标准，感病对照发病时间为21d时即可调查。保留表现中抗以上的野生稻(含有典型纺锤形病斑，长度在2mm以下，危害面积在2％以下的野生稻)，其余野生稻拔除。上述苗期叶瘟初鉴结束后，凡初鉴表现中抗以上的材料进行复鉴，初鉴和复鉴时间间隔为一个月，复鉴的方法同上述初鉴方法。
38.继续种植培养田间留存的野生稻，进行穗颈瘟抗性鉴定，具体为：用培养好的稻瘟病菌生理小种yc25接种，接种菌液浓度为5
×
104个/ml的孢子悬浮液，喷雾接种(100株苗用20ml菌液)，喷雾重复2次。然后遮光膜覆盖，28℃保湿16h，后揭膜，重复2次，在自然条件下培养。以感病对照为参考标准，感病对照发病时间为21d时即可调查。保留表现中抗以上的野生稻(含有典型纺锤形病斑，长度在2mm以下，危害面积在2％以下的野生稻)，其余野生稻拔除。上述苗期叶瘟初鉴结束后，凡初鉴表现中抗以上的材料进行复鉴，初鉴和复鉴时间间隔为一个月，复鉴的方法同上述初鉴方法。
39.对经上述方法鉴定后留存的野生稻进行离体鉴定，具体为：相同部位的叶片用剪刀剪至5cm长度。用同一规格枪头于叶背面打孔，每片叶打孔3个，每个孔间距离1cm。将叶片平铺于0.5％的琼脂平板上，打孔的一面朝上。用枪头吸取10ul孢子悬浮液滴于打孔处。封
口膜统一包好封口，25℃避光过夜。第二天开启光照/黑暗交替培养。5天后观察病斑长度，将叶表面的菌液擦拭干净，并拍照，病斑长度在2mm以下的供试稻为稻瘟病抗性稻。
40.其中孢子悬浮液的制备方法同实施例1。
41.实施例3
42.按照实施例1的方法对不同地区的野生稻居群进行稻瘟病抗性鉴定，抗性级别的判定标准如表1所示，具体的组别和鉴定结果如表2所示。
43.表1抗性级别的判定标准
[0044][0045]
表2不同地区野生稻居群稻瘟病抗性鉴定结果
[0046]
[0047]
[0048]
[0049]
[0050]
[0051]
[0052]
[0053][0054]
由表2可以看出，在所有调查的野生稻居群中，经田间鉴定、苗瘟鉴定和穗颈瘟鉴定三种鉴定方法先后进行鉴定后，海口市西秀镇(2居群)的1号野生稻、海口市旧州镇(11居群)的8号野生稻、文昌市锦山镇(19居群)的5号野生稻、文昌市罗豆农场(23居群)的1号野生稻、海口市三江镇(24居群)的3号野生稻、文昌市东路镇(29居群)的1号野生稻、临高县临城镇(42居群)3号野生稻、三亚市崖城镇(44居群)3和6号野生稻均表现为抗性。这些材料为开展抗稻瘟病水稻新品种(组合)选育提供了较好资源，促进水稻育种绿色持续发展。
[0055]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。