一种建立具有高体胚发生能力橡胶树胚性细胞纯系以及维持其胚性形态的方法

1.本发明属于植物组织培养和细胞工程技术领域，具体涉及一种建立具有高体胚发生能力橡胶树胚性细胞纯系的方法。


背景技术：

2.橡胶树(hevea brasiliensis muell.arg.)属大戟科橡胶树属，是多年生的异花授粉乔木。其所产的天然橡胶是重要的工业原料和战略物资，在国民经济中占有举足轻重的地位。通过体细胞胚发生途径来获得再生植株是植物组培苗工厂化生产和遗传转化的重要方法。
3.而橡胶树易碎胚性愈伤组织是进行橡胶树遗传转化和开展原生质体培养与融合的最佳受体和材料来源。目前，橡胶树易碎胚性愈伤主要通过以下两种方式获得：一是在外植体启动诱导获得初代愈伤组织后再经长期的继代筛选培养，通常需要10-12个月的继代培养甚至更长时间；二是获得愈伤组织后接着诱导体细胞胚，再以体细胞胚为外植体诱导胚性愈伤组织，至少也需要6-8个月的时间。
4.现有技术中，以上两种方式获得胚性愈伤组织的频率均不高且耗时长，且胚性愈伤组织在继代过程中异质化程度高，体胚发生能力随着继代次数的增加而下降，通常在继代培养2-3年后胚性便逐渐丧失，很大程度上限制了橡胶树遗传转化和原生质体培养研究的开展及后续研究。
5.因此，迫切需要建立一种获得具有高体胚发生能力橡胶树易碎胚性愈伤组织纯系并维持其胚性形态的方法，为相关研究提供不受季节限制且充足优质的材料来源。


技术实现要素：

6.本发明的目的在于提供一种建立具有高体胚发生能力橡胶树胚性细胞纯系的方法，包括诱导初代愈伤组织、获得胚性愈伤组织和胚性愈伤组织低密度悬浮培养，即可有效建立胚性细胞纯系；将橡胶树易碎胚性愈伤组织的获得时间缩短至6个月以内，并且胚性细胞纯系的体胚诱导率高达100％，具有高体胚发生能力。
7.为实现上述目的，本发明提供一种建立具有高体胚发生能力橡胶树胚性细胞纯系的方法，具体包括以下步骤：
8.(1)诱导初代愈伤组织：选取橡胶树黄绿色未成熟雄花蕾，消毒处理，剥离出完整雄蕊接种至愈伤组织诱导培养基中，进行培养，得到初代愈伤组织；
9.(2)获得胚性愈伤组织：将步骤(1)得到的初代愈伤组织，接种至胚性愈伤组织诱导培养基中，进行培养，得到鲜黄色小颗粒状胚性愈伤组织；
10.(3)胚性愈伤组织低密度悬浮培养：挑取步骤(2)得到的胚性愈伤组织中，指定形态的胚性细胞，接种至液体培养基中，进行低密度悬浮振荡培养，即可建立具有高体胚发生能力橡胶树胚性细胞纯系；
11.其中，所述愈伤组织诱导培养基、胚性愈伤组织诱导培养基、液体培养基中均以改良的ms培养基为基本培养基；所述改良的ms培养基成分为：七水硫酸镁500mg/l、磷酸二氢钾400mg/l、无水氯化钙250mg/l、一水硫酸锰35mg/l、五水硫酸铜0.2mg/l、烟酸5mg/l、叶酸0.5mg/l和生物素0.05mg/l，其余成分与ms基本培养基相同。
12.在一优选的实施方式中，步骤(1)中，所述愈伤组织诱导培养基在改良的ms培养基中，添加如下成分：kt 0.5-1.5mg/l、naa 0.5-1.5mg/l、2,4-d 0.5-1.5mg/l、cacl
2 0.3-0.9g/l、椰子水5％、蔗糖70g/l、植物凝胶2.2g/l；调培养基的ph至5.8-6。
13.在一优选的实施方式中，步骤(1)中，所述培养条件为：27
±
2℃暗室培养25-35d。
14.在一优选的实施方式中，步骤(2)中，所述胚性愈伤组织诱导培养基在改良的ms培养基中，将大量元素含量降至原来的五分之四，同时添加如下含量成分：6-ba 0.05-0.5mg/l、naa 0.02-0.2mg/l、ga
3 0.5-1mg/l、aba 0.5-1g/l、agno
3 1-5mg/l、椰子水5％、蔗糖70g/l、植物凝胶2.2g/l；调培养基的ph至5.8-6。
15.在一优选的实施方式中，步骤(2)中，所述培养条件为：27
±
2℃暗室培养，每30d继代1次，共继代培养2-3次。
16.在一优选的实施方式中，步骤(3)中，所述指定形态的胚性细胞具体表现为：颜色鲜黄、结构紧密、表面光滑含多个小颗粒状凸起、单个凸起直径大小0.05-0.1mm。
17.在一优选的实施方式中，步骤(3)中，所述液体培养基在改良的ms培养基中，添加如下含量成分：2,4-d 2mg/l、agno
3 2mg/l、水解酪蛋白0.4g/l、天冬酰胺0.2g/l、椰子水7％、蔗糖45g/l；调培养基的ph至5.8-6。
18.在一优选的实施方式中，步骤(3)中，所述低密度悬浮振荡培养条件为：27
±
2℃暗室中，以100-150rpm振荡培养，每14天继代培养1次，继代操作时保留约1/5的旧培养液，加入新配制的液体培养基，共继代培养3-5次。
19.本发明的另一目的在于提供一种维持所建立的具有高体胚发生能力橡胶树胚性细胞纯系的胚性形态的方法，通过限定继代培养基成分以及继代培养方式，即可有效保持所建立的胚性细胞纯系；经实际实验验证，本发明技术方案中所建立的胚性细胞纯系在此继代方式培养2年后，仍可维持60％左右的体胚发生能力，为橡胶树基因转化、基因编辑和原生质体培养与融合提供良好且状态较一致的材料来源。
20.为实现上述目的，本发明提供一种维持上述所建立的具有高体胚发生能力橡胶树胚性细胞纯系的胚性形态的方法，具体包括，将建立的胚性细胞纯系转入继代培养基中，以在27
±
2℃暗室培养条件保存；每2-3周继代1次，每次继代时挑取0.3-0.5cm大小的新鲜胚性组织接种至继代培养基中，即可继代培养2年后仍保持体胚发生能力。
21.在一优选的实施方式中，所述继代培养基在改良的ms培养基中，将大量元素含量降至原来的五分之四，同时添加如下含量成分：aba 0.05-0.5mg/l、酸水解酪蛋白0.1-1g/l、椰子水5％、蔗糖30-50g/l、活性炭0.2-0.8g/l、植物凝胶2.2g/l；调培养基的ph至5.8-6；
22.所述改良的ms培养基成分为：七水硫酸镁500mg/l、磷酸二氢钾400mg/l、无水氯化钙250mg/l、一水硫酸锰35mg/l、五水硫酸铜0.2mg/l、烟酸5mg/l、叶酸0.5mg/l和生物素0.05mg/l，其余成分与ms基本培养基相同。
23.与现有技术相比，根据本发明的一种建立具有高体胚发生能力橡胶树胚性细胞纯系以及维持其胚性形态的方法，具有如下优点：
24.1、在建立胚性细胞纯系阶段，本发明通过选取指定形态的胚性愈伤组织，进行低密度悬浮培养，即可有效建立高体胚发生能力的胚性细胞纯系，所建立的胚性细胞纯系比初代愈伤组织和胚性愈伤组织，体胚诱导率和诱导系数均显著提高。
25.2、在维持胚性形态阶段，本发明中通过降低基础培养基中大量元素的含量，去除生长素和细胞分裂素，同时添加低浓度的aba、酸水解酪蛋白和活性炭，使特定形态的胚性细胞悬浮培养得到的胚性细胞团稳定增殖，并且维持在原球胚阶段，经过两年左右的继代培养仍具备较高的体胚发生能力。因此，可有效维持所建立高体胚发生能力细胞纯系的胚性形态，为橡胶树遗传转化和原生质体培养与融合提供良好的材料来源。
附图说明
26.从下面结合附图对本发明实施例的详细描述中，本发明的这些和/或其它方面和优点将变得更加清楚并更容易理解，其中：
27.图1为实施例1中步骤(1)愈伤诱导培养基诱导的初代愈伤组织形态及其体胚发生情况；其中图1-a为初代愈伤组织形态；图1-b为初代愈伤组织体胚发生情况；
28.图2为实施例1中步骤(2)胚性愈伤组织诱导培养基诱导的胚性愈伤组织形态及其体胚发生情况；其中图2-a为胚性愈伤组织形态；图2-b为胚性愈伤组织体胚发生情况；图2-c为标注部位的胚性组织在高倍显微镜下形态图；
29.图3为实施例1中步骤(3)经低密度悬浮培养建立的胚性细胞纯系及其体胚发生情况；其中图3-a为胚性细胞纯系形态；图3-b为胚性细胞纯系体胚发生情况；
30.图4为实施2中经继代培养基继代培养2年后的胚性细胞纯系形态及其体胚发生情况；其中图4-a为继代培养2年后的胚性细胞纯系形态；图4-b为继代培养2年后胚性细胞纯系体胚发生情况；
31.图5为对比例1中常规方法建立的胚性细胞系及其体胚发生情况；其中图5-a为常规方法建立的胚性细胞系形态；图5-b为胚性细胞系的体胚发生情况。
具体实施方式
32.本技术实施例通过提供一种建立具有高体胚发生能力橡胶树胚性细胞纯系以及维持其胚性形态的方法，解决现有技术中，胚性愈伤组织获得时间长、体胚诱导率低，而且体胚发生能力随继代次数增加而下降的问题。
33.本发明实施例中的技术方案为解决上述问题，总体思路如下：
34.1.以改良的ms培养基作为组培过程中的基本培养基；所述改良的ms培养基成分为：七水硫酸镁500mg/l、磷酸二氢钾400mg/l、无水氯化钙250mg/l、一水硫酸锰35mg/l、五水硫酸铜0.2mg/l、烟酸5mg/l、叶酸0.5mg/l和生物素0.05mg/l，其余成分与ms基本培养基相同。
35.2.建立具有高体胚发生能力橡胶树胚性细胞纯系的方法，具体包括以下步骤：
36.(1)诱导初代愈伤组织：选取橡胶树黄绿色未成熟雄花蕾，消毒处理，剥离出完整雄蕊接种至愈伤组织诱导培养基中，进行培养，得到初代愈伤组织；
37.其中，所述消毒处理方法无任何特殊要求，以本领域技术人员所熟知的任意方式即可；例如使用75％(v/v)酒精浸泡消毒60s，用无菌水冲洗1次后，用质量百分含量为0.1％
氯化汞水溶液消毒10min，用无菌水冲洗5次，每次3min。
38.优选的，愈伤组织诱导培养基在改良的ms培养基中，添加如下成分：kt 0.5-1.5mg/l、naa 0.5-1.5mg/l、2,4-d 0.5-1.5mg/l、cacl
2 0.3-0.9g/l、椰子水5％、蔗糖70g/l、植物凝胶2.2g/l；调培养基的ph至5.8-6。本发明中，在愈伤诱导培养基中增加了较高浓度的氯化钙，有利于提高愈伤组织的脆性。优选的，培养条件为：27
±
2℃暗室培养25-35d。
39.(2)获得胚性愈伤组织：将步骤(1)得到的初代愈伤组织，接种至胚性愈伤组织诱导培养基中，进行培养，得到鲜黄色小颗粒状胚性愈伤组织；
40.优选的，胚性愈伤组织诱导培养基在改良的ms培养基中，将大量元素含量降至原来的五分之四，同时添加如下含量成分：6-ba 0.05-0.5mg/l、naa 0.02-0.2mg/l、ga
3 0.5-1mg/l、aba 0.5-1g/l、agno
3 1-5mg/l、椰子水5％、蔗糖70g/l、植物凝胶2.2g/l；调培养基的ph至5.8-6。本发明中，在胚性愈伤组织诱导培养基中适度降低培养基中大量元素的含量，并将细胞分裂素和生长素浓度降至初代愈伤诱导培养基的1/10以下，同时添加适量的ga3、aba、agno3有利于愈伤组织产生胚性结构，并朝胚性愈伤组织的方向转变。
41.优选的，培养条件为：27
±
2℃暗室培养，每30d继代1次，共继代培养2-3次。
42.(3)胚性愈伤组织低密度悬浮培养：挑取步骤(2)得到的胚性愈伤组织中，指定形态的胚性细胞，接种至液体培养基中，进行低密度悬浮振荡培养，即可建立分散均一的具有高体胚发生能力橡胶树胚性细胞纯系；
43.其中，指定形态的胚性组织是本发明关键技术特征之一，经发明人大量筛选研究以及长期实验观察，挑选出颜色鲜黄、结构紧密、表面光滑含多个凸起、单个凸起直径大小约0.05-0.1mm的胚性组织。经实验检测，更优选的单个凸起直径大小约0.05-0.08mm的胚性组织，若单个凸起颗粒的直径超过0.1mm，此时胚性组织发育阶段靠后，培养后细胞分裂活性和体胚发生能力均较低。
44.优选的，启动悬浮培养的胚性组织为含多个凸起的胚性细胞丛，质量约0.1-1mg,添加30-50ml液体培养基。按此质量体积比选取指定形态的胚性组织可以在液体培养基中，以较低密度悬浮培养，有利于建立分散、均一的细胞纯系。若启动悬浮培养的胚性组织过多，细胞在培养过程中分裂生长较难同步，从而获得的细胞系状态不一；若启动悬浮培养的胚性组织过少，则细胞难于分裂生长，需耗费更长的时间才有可能建立细胞系。
45.优选的，液体培养基在改良的ms培养基中，添加如下含量成分：2,4-d 2mg/l、agno
3 2mg/l、水解酪蛋白0.4g/l、天冬酰胺0.2g/l、椰子水7％、蔗糖45g/l；调培养基的ph至5.8-6。在液体培养基中添加适量的agno3，可在一定程度上抑制所挑选母体胚性组织的褐化并促进其产生新的胚性细胞团。
46.优选的，所述低密度悬浮振荡培养条件为：27
±
2℃暗室中，以100-150rpm振荡培养，每14天继代1次，保留约1/5的旧培养液，更换新的液体培养基，共继代培养3-5次。每次继代培养时，用移液枪吸取5-10ml含从母体组织中新分离的直径大小约0.2-0.5mm细胞团的悬浮液，转移至新灭菌的三角瓶中，添加20-40ml新配制的液体培养基，调整细胞团和液体培养基的质量体积比约为2％。
47.3.建立具有高体胚发生能力橡胶树胚性细胞纯系的方法，具体包括以下步骤：
48.将建立的胚性细胞纯系转入继代培养基中，以在27
±
2℃暗室培养条件保存；每2-3周继代1次，每次继代时挑取0.3-0.5cm大小的新鲜胚性组织接种至继代培养基中，即可继
代培养2年后仍保持体胚发生能力。
49.优选的，继代培养基在改良的ms培养基中，将大量元素含量降至原来的五分之四，同时添加如下含量成分：aba 0.05-0.5mg/l、酸水解酪蛋白0.1-1g/l、椰子水5％、蔗糖30-50g/l、活性炭0.2-0.8g/l、植物凝胶2.2g/l；调培养基的ph至5.8-6；本发明中的继代培养基与现有技术相比，通过降低基础培养基中大量元素的含量，去除生长素和细胞分裂素，同时添加低浓度的aba、酸水解酪蛋白和活性炭，经实际验证，可以使选取的特定形态的胚性细胞得到稳定增殖，并且维持在原球胚阶段，可有效维持所建立的高体胚发生能力的细胞纯系形态。
50.下面结合具体实施方案对本发明做进一步的说明。若未特别指明，实施例中所用技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。
51.在本发明中，以橡胶树品种热垦525为试验对象，未成熟花序采自中国热带农业科学院儋州试验场基地。
52.在本发明中，所述改良的ms培养基成分为：七水硫酸镁500mg/l、磷酸二氢钾400mg/l、无水氯化钙250mg/l、一水硫酸锰35mg/l、五水硫酸铜0.2mg/l、烟酸5mg/l、叶酸0.5mg/l和生物素0.05mg/l，其余成分与ms基本培养基相同。
53.除非另有特别说明，本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等均可通过市场购买得到或者可通过现有方法制备得到。
54.在本发明中，体胚诱导率计算公式：体胚诱导率＝(诱导得到体胚的外植体数/总接种外植体数)
×
100％。
55.体胚诱导系数计算公式：体胚诱导系数＝诱导得到的体胚总数/总接种外植体数。
56.实施例1
57.建立具有高体胚发生能力橡胶树胚性细胞纯系的方法：
58.(1)诱导初代愈伤组织：选取处于黄绿色未成熟的热垦525雄花蕾，用流水冲洗20分钟，置于超净工作台上，用75％(v/v)酒精浸泡消毒60s，用无菌水冲洗1次后，用质量百分含量为0.1％氯化汞水溶液消毒10min，用无菌水冲洗5次，每次3min。
59.用解剖针和镊子从消毒后的雄花蕾中将完整的雄蕊剥离出来，接种到愈伤组织诱导培养基上，置于27℃暗室中培养30d得到初代愈伤组织，如图1-a所示。
60.所述愈伤诱导培养基以改良的ms为基本培养基，添加如下含量成分：kt1mg/l、naa 1mg/l、2,4-d 1.5mg/l、cacl
2 0.5g/l、椰子水5％、蔗糖70g/l、植物凝胶2.2g/l；调培养基的ph至5.8。
61.(2)获得胚性愈伤组织：将诱导的初代愈伤组织接种到胚性愈伤组织诱导培养基上，置于27℃暗室中培养70d，期间每30天继代培养一次，得到鲜黄色小颗粒状胚性愈伤组织，如图2-a所示。
62.所述胚性愈伤组织诱导培养基以改良的ms为基本培养基，将改良后的ms基本培养基中大量元素含量降至原来的五分之四，同时添加如下含量成分：6-ba 0.5mg/l、naa 0.2mg/l、ga
3 0.5mg/l、aba 1g/l、agno
3 2.5mg/l、椰子水5％、蔗糖70g/l、植物凝胶2.2g/l；调培养基的ph至5.8。
63.(3)胚性愈伤组织低密度悬浮培养：在体视显微镜下挑取0.5mm大小、质量约0.5mg，颜色鲜黄、结构紧密、表面光滑含多个小颗粒状凸起的胚性组织，单个小颗粒状凸起
直径大小约0.05-0.1mm。(挑取的胚性组织如图2-a中任意圆圈处所示，由图2-a中可以明显看出，每处圆圈均有多个小颗粒状凸起。图2-c为挑取一处标注部位的胚性组织在高倍显微镜下形态图，可以更明显的看出该组织中有多个小颗粒状直径在0.05-0.1mm的凸起。)
64.将挑取的胚性组织转至30ml液体培养基中，置于27℃暗室150rpm摇床上启动悬浮培养，每14天继代培养一次。
65.继代培养方法为：每次继代时保留1/5旧液体培养基，用移液枪吸取5-10ml含从母体组织中新分离的直径大小约0.2-0.5mm细胞团的悬浮液，转移至新灭菌的三角瓶中，再添加20-40ml新配制的液体培养基，调整细胞团和液体培养基的质量体积比约为2％。继代4次后得到分散均一、大小约0.5-1mm的胚性细胞团纯系，如图3-a所示。
66.所述液体培养基以改良的ms为基础培养基，添加如下含量成分：2,4-d 2mg/l、agno
3 2mg/l、水解酪蛋白0.4g/l、天冬酰胺0.2g/l、椰子水7％、蔗糖45g/l；调培养基的ph至5.8。
67.将实施例1步骤(1)、步骤(2)和步骤(3)获得的初代愈伤组织、胚性愈伤组织和胚性细胞纯系，分别接种至体胚诱导培养基上，每皿接种8块外植体，不同类型外植体各接种40块，试验重复三次，置于27℃暗室中培养60d得到体细胞胚。分别统计不同类型外植体的体胚诱导率和体胚诱导系数。
68.所述体胚诱导培养基以改良的ms为基本培养基，并将改良后的ms基本培养基大量元素含量降至原来的五分之四，同时添加如下含量成分：6-ba 0.5mg/l、kt 3mg/l、naa 0.02mg/l、ga
3 0.5mg/l、椰子水5％、蔗糖70g/l、活性炭1g/l、植物凝胶2.2g/l；调培养基的ph至5.8。
69.实施例1中不同外植体诱导体胚发生结果如表1所示。
70.表1
[0071][0072]
实施例2
[0073]
维持具有高体胚发生能力橡胶树胚性细胞纯系的胚性形态的方法：
[0074]
将实施例1建立的胚性细胞团纯系转入继代培养基中，每20d继代培养1次，每次用镊子挑取0.4cm大小的新鲜胚性组织接种至继代培养基中，置于27℃暗室中，胚性细胞团得到稳定增殖且胚性形态保持一致，如图4-a所示。
[0075]
以继续留在液体培养基中按实施例1步骤(3)的继代培养方法保持的悬浮细胞团为对照组。
[0076]
将在继代培养基和液体培养基中，持续继代培养2年后的细胞团分别转至体胚诱
导培养基中，每皿接种8块外植体，不同继代培养基继代保持的外植体各接种40块，试验重复三次，置于27℃暗室中培养60d得到体细胞胚，分别统计其体胚诱导率和体胚诱导系数。
[0077]
其中，继代培养基成分为：4/5改良ms、aba 0.1mg/l、水解酪蛋白0.5g/l、椰子水5％、蔗糖40g/l、活性炭0.4g/l、植物凝胶2.2g/l；调培养基的ph至5.8。
[0078]
体胚诱导培养基成分与实施例1相同。
[0079]
实施例1制备的胚性细胞在不同继代培养基继代培养2年后的体胚发生结果如表2所示。
[0080]
表2
[0081]
继代培养基成分体胚诱导率(％)体胚诱导总数(个)体胚诱导系数继代培养基60
±
2.5a152.3
±
11.1a3.8
±
0.25a液体培养基0b0b0b
[0082]
对比例1
[0083]
对比常规方法所选取的胚性愈伤组织，经悬浮培养建立胚性悬浮细胞系及继代培养对体胚发生能力的影响：
[0084]
在实施例1步骤(3)中，不选取特定形态的胚性组织，而是按照cn102187812a《利用巴西橡胶树胚性细胞悬浮系建立高效植株再生体系的方法》所述胚性愈伤组织选择方法：直接用镊子取2g新鲜胚性愈伤组织转入30ml液体培养基中，继代培养4次后得到胚性细胞系，如图5-a所示，其余步骤和继代培养方法均与实施例1完全相同。
[0085]
以实施例2中使用继代培养基维持细胞胚性细胞纯系的方法，将上述建立的胚性细胞系持续继代培养2年后，转入体胚诱导培养基中，其体胚发生结果如表3所示。
[0086]
表3
[0087][0088]
根据上述实施例1-2的结果表明，本发明的技术方案可获得具有高达100％体胚诱导率胚性细胞纯系，并且，采用本发明提供的继代培养基对胚性细胞进行继代培养，继代2年后仍具备较高的体胚发生能力，能为橡胶树遗传转化和原生质体培养与融合长期提供优质的受体材料。
[0089]
根据对比例1可以明显看出，常规方法直接选择新鲜胚性愈伤组织而不选取特定形态的组织，其体胚诱导率显著低于本发明的技术方案，那是由于常规方法的胚性愈伤组织中包括大量不同分化时期的组织，其体胚诱导能力差异较大，只有本发明技术方案中，经特定筛选的组织才有较高的体胚发生能力。而且，本发明技术方案提供的继代培养基也可以为特定组织提供所需营养，维持特定形态的胚性细胞稳定增殖，从而达到继代培养两年后仍具有体胚发生能力。
[0090]
前述对本发明的具体示例性实施方案的描述是为了说明和例证的目的。这些描述
并非想将本发明限定为所公开的精确形式，并且很显然，根据上述教导，可以进行很多改变和变化。对示例性实施例进行选择和描述的目的在于解释本发明的特定原理及其实际应用，从而使得本领域的技术人员能够实现并利用本发明的各种不同的示例性实施方案以及各种不同的选择和改变。本发明的范围意在由权利要求书及其等同形式所限定。