一种高通量筛选松材线虫病生防细菌的方法

1.本发明涉及生物技术领域，尤其是涉及一种高通量筛选松材线虫病生防细菌的方法。


背景技术：

2.由松材线虫引发的松材线虫病是一种全球性森林病害，可危害70种针叶树，其中松属树种57种，非松属树种13种。松材线虫病大面积的发生对松林资源、自然景观和生态环境造成了严重破坏。
3.对于松材线虫病的防治，传统方法采用烟熏、焚烧、砍伐、杀虫剂喷洒、树干注射化学农药等。这些方法本就会带来巨大的经济损失和环境负担，同时也会增加松材线虫的耐药性。新型的生物防治方法，即筛选适合的生防菌生产环境友好型微生物制剂是控制松树枯萎病的最佳方法之一。
4.现有技术中，已报道的松材线虫病生防菌的筛选方法，主要为将细菌与松材线虫共培养，通过松材线虫的形态与行动状况判断线虫死活，从而确定该细菌是否具有杀松材线虫的能力。然而，这种方法存在以下缺陷：首先，对于松材线虫死亡情况的判断不够精确，有些僵直不运动的线虫实际上并未死亡，常导致假阳性的细菌被筛选出来；第二，该方法通量低，每个样品均需要在体式显微镜下，人眼观察，浪费精力；第三，该方法筛选出来的细菌，往往得不到很好的实际应用效果，因为松材线虫病的防治，需要从松树、线虫、细菌三方面的共同作用着手，仅仅关注细菌致死松材线虫的能力过于片面。此外，已经报道的松材线虫病防治的温室实验多采用3年或者10年生的松树苗，1到3个月才能显示生防效果，实验周期极长，要花费大量的人力物力，对温室空间和环境也有较高要求，致使松材线虫生防菌筛选效极率低。
5.因此，有必要提供一种新的筛选防治松材线虫病细菌的方法，尤其是高效准确且高通量的筛选方法。
6.鉴于此，特提出本发明。


技术实现要素：

7.本发明的目的在于提供一种筛选松材线虫病生防细菌的方法，本发明的方法通量高、成本低且准确度高，为松材线虫病生防细菌的筛选与生物防治提供了技术支持。
8.本发明提供的技术方案如下：
9.本发明提供了一种高通量筛选松材线虫病生防细菌的方法，包括将松材线虫的虫悬液与待测菌株的菌悬液混合培养后，用无菌水洗涤除去菌液，对所述松材线虫虫体染色进行生防细菌初筛，再利用樟子松幼苗进行生防细菌防病效果复筛；其中，所述初筛使用的染色溶液为亚甲基蓝溶液和/或4,6-二氨基-2-苯基吲哚(dapi)溶液。
10.在松材线虫病生防细菌的筛选过程中，将松材线虫的虫悬液与待测菌株的菌悬液混合培养一段时间后，具有松材线虫病生防功能的细菌将表现出对松材线虫毒杀造成松材
线虫死亡的效果。本发明通过使用亚甲基蓝溶液和/或4,6-二氨基-2-苯基吲哚溶液进行染色，以更加清晰准确的方式来判断线虫死亡的情况，能够显著降低现有技术方法中，在体式镜下人工肉眼观察结果时产生的统计误差(例如将僵直不运动的线虫或者仅仅麻痹的线虫统计为死亡)。
11.此外，本发明也同时结合生防细菌防病效果复筛，对筛选出来的细菌的应用效果进行了筛选和验证，也就是通过评估松树、线虫、细菌三者在实际情况下相互作用的效果，筛选松材线虫病的生防细菌，筛选效率更高，筛选结果能够更准确的评价所测细菌的松材线虫病生防作用。
12.在一个实施方案中，所述初筛包括使用亚甲基蓝溶液进行第一次初筛实验后，将筛选出的菌株与所述松材线虫再次进行共培养，然后使用4,6-二氨基-2-苯基吲哚溶液进行第二次初筛实验。
13.在一个实施方案中，所述亚甲基蓝溶液的终浓度为0.15～0.25mg/ml，优选0.2mg/ml；所述4,6-二氨基-2-苯基吲哚溶液的终浓度为4～6μg/ml，优选5μg/ml。
14.在一个实施方案中，所述松材线虫的虫悬液与待测菌株的菌悬液混合培养的条件为：25℃培养18～24小时；优选为24小时。
15.在一个实施方案中，所述松材线虫的虫悬液的浓度为40～50头松材线虫/20μl；所述待测菌株的菌悬液的活菌数为10
12
cfu/ml。
16.在一个实施方案中，所述松材线虫的虫悬液与所述待测菌株的菌悬液的添加体积比为1:1.8～2.5；优选为1:2。
17.在一个实施方案中，所述松材线虫悬浮液为无菌松材线虫悬浮液；所述菌悬液为单克隆菌株在液体lb培养基中培养后的发酵液。
18.在一个具体的实施方案中，用含有2％硫酸链霉素的无菌水清洗线虫，用无菌水将松材线虫的虫悬液调整至每20μl有40～50头松材线虫，备用。
19.在一个具体的实施方案中，待测菌株用三线平板划法活化，30℃培养16小时，将分离出的单克隆菌株，接种于5ml液体lb培养基，200rpm，30℃摇床培养24小时，收集发酵液，将浓度调为od
600
值为1.0(含菌量10
12
cfu/ml)备用。
20.在一个实施方案中，当使用所述亚甲基蓝溶液进行染色后，使用扫描仪成像，将图像灰度化处理后，计算死亡率和校正死亡率；当使用所述4,6-二氨基-2-苯基吲哚溶液染色后，使用荧光微镜成像，根据荧光强度，计算死亡率和校正死亡率；
21.优选地，当使用所述亚甲基蓝溶液进行染色，染色的条件为25℃黑暗条件，染色3.5～4.5小时；优选4小时；
22.优选地，当使用4,6-二氨基-2-苯基吲哚溶液进行染色，染色的条件为25℃黑暗条件，染色0.5～2小时；优选1小时；
23.更优选地，染色后，用无菌水进行洗涤以除去菌液和染料。
24.本发明通过将亚甲基蓝染色线虫与扫描仪的搭配，一方面可以提高可视化观察的准确性，另一个方面可以借助对扫描仪的扫描图像进行处理，以图像参数(如灰度值)来计算死亡率和校正死亡率。此外，本发明也可以选择通过dapi染色线虫，更加清晰精准的判断线虫死亡情况，大大提升了原有方法的准确度，同时也可将dapi染色结果的荧光强度的区别进行量化，从而更高效地计算死亡率和校正死亡率。本发明也可以结合这2种方式进行一
次初筛和二次初筛以进一步增加筛选的准确性。
25.在一个实施方案中，所述死亡率和校正死亡率按以下公式计算：
[0026][0027][0028]
在一个具体的实施方案中，在进行初筛实验中，在96孔板上设置阳性对照区、目标测试区、阴性对照区和校正对照区，每个处理有五个孔重复。
[0029]
例如，每孔加入40μl菌悬液和20μl虫悬液。阳性对照组加入菌悬液为已知杀松材线虫效果较好的短小芽胞杆菌(bacillus pumilus)ylt40，由河北省农林科学院遗传生理研究所惠赠，阴性对照组加入菌悬液为已知杀松材线虫活性较低的多粘类芽孢杆菌(paenibacillus polymyxa)m-1，由中国农业大学植物病理学系惠赠，校正对照区为40μl无菌水和20μl虫悬液，用于计算校正死亡率。
[0030]
在一个实施方案中，在96孔板于25℃培养24小时后，终止杀线虫反应，然后进行染色；染色前可使用无菌水进行清洗，以除去菌液；染色后可再次用无菌水清洗以除去染料。
[0031]
当使用亚甲基蓝溶液染色时，亚甲基蓝溶液终浓度为0.2mg/ml，25℃黑暗条件，染色4小时；使用扫描仪，对96孔板扫描成像，从扫描图像中可以看出，呈僵直状态的死亡线虫被染成蓝色，而没有弯曲的存活线虫未被染色；灰度化图像，利用灰度值，计算死亡率和校正死亡率。
[0032]
当使用4’6-二氨基-2-苯基吲哚(dapi)染色时，dapi溶液终浓度为5μg/ml，25℃黑暗条件，染色1小时；使用荧光微镜可观察到死亡线虫在488nm激发光波长处，因被染色而产生荧光，而活线虫不被染色，故不产生荧光；根据量化荧光强度，计算死亡率和校正死亡率。
[0033]
在一个实施方案中，所述生防细菌防病效果复筛包括采用1月龄的松树幼苗，喷淋待测菌液并注射松材线虫悬浮液，根据所述幼苗病情指数确定所述生防细菌的防松材线虫病效果。本方法采用1月龄的樟子松幼苗，9天即可观察生防细菌的防病效果。进行生防细菌防病效果筛选实验，可以进一步确定和评估所筛选生防细菌的松材线虫病防治作用。
[0034]
在一个实施方案中，所述初筛中还设置阳性对照组、阴性对照组和校正对照组；其中，所述阳性对照组加入的菌悬液为短小芽胞杆菌ylt40，阴性对照组加入的菌悬液为多粘类芽孢杆菌m-1，校正对照组用无菌水代替菌悬液。
[0035]
在一个实施方案中，所述生防细菌防病效果复筛还包括在伤口处注射无菌水作为空白对照以及在伤口处注射松材线虫悬浮液作为阴性对照。
[0036]
在一个具体的实施方案中，在1月龄的樟子松幼苗，喷淋5ml od
600
＝1.0的待测菌液，并在松树幼苗韧皮部割开伤口，注入100μl 30头/μl的松材线虫悬浮液。
[0037]
在一个具体的实施方案中，在伤口处注射100μl无菌水作为空白对照；在伤口处注射100μl的松材线虫悬浮液作为阴性对照。接种9天后，根据病级分类获得相应病情指数。
[0038]
在一个具体的实施方案中，病情指数按以下公式计算：
[0039]
[0040]
此外，本发明还提供了一种防治松材线虫病的方法，使用前述方法筛选得到的所述生防细菌进行防治。有些情况下，在实验室条件下筛选到的杀松材线虫的菌株在实际应用过程中并不一定能防治松材线虫病，原因可能在于松树、线虫、细菌三者的相互作用，或者线虫与细菌的生存环境等的影响。而本发明通过利用樟子松幼苗生防细菌防病效果复筛可以进一步筛选到真正具有防治松材线虫病的菌株。
[0041]
有益效果：
[0042]
本发明的技术方案通过将染色与统计方法的创新结合(通过亚甲基蓝染色线虫与扫描仪的搭配和/或通过dapi染色结合荧光强度分析)，高度简化了线虫死亡情况的观察和计算方法，并且提高了准确度，增加了筛选松材线虫病生防细菌的效率；
[0043]
本发明采用1月龄的松树幼苗，9天即可观察生防细菌的松材线虫病防病效果，极大的缩短了温室实验周期，降低温室实验成本，提升温室实验效率；
[0044]
本发明的方法从生防细菌、松材线虫、松树三者共同着手，实现防治松材线虫病细菌的高通量筛选，能够高效筛选获得真正具有松材线虫病生防作用的菌株。
[0045]
本发明的方法经过多次重复实验以及多个不同菌株的实际筛选实践，结果表明，本发明方法对松材线虫病生防细菌进行筛选的准确率高、重复性好；并且大大节约了筛选时间，降低了人力成本。
附图说明
[0046]
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0047]
图1为本发明实施例提供的松材线虫病生防细菌初筛流程；
[0048]
图2为松材线虫病生防细菌筛选模型的评价(阳性对照组和阴性对照组的线虫校正死亡率结果)；
[0049]
图3为本发明实施例提供的用亚甲基蓝对细菌处理的松材线虫染色的结果(其中图像处理前，未扫描仪所示结果，死亡线虫为蓝色，将图像灰度处理后，仅显示死亡线虫)，比例尺，2mm；
[0050]
图4为用dapi对细菌处理的松材线虫染色的结果(死亡线虫发出荧光，存活线虫不显荧光)，比例尺，2mm；
[0051]
图5为生防细菌温室幼苗松材线虫病防病效果实验结果，比例尺，5cm；
[0052]
图6为温室幼苗松材线虫病的病级分类，比例尺，5cm；
[0053]
图7为利用所建立的松材线虫病生防细菌筛选模型，对308株细菌进行杀松材线虫活性测试的一次初筛结果；
[0054]
图8为对一次初筛获得30株高效松材线虫病生防菌株的二次初筛结果；
[0055]
图9为30株高效松材线虫病生防菌株杀松材线虫的校正死亡率；
[0056]
图10为30株高效松材线虫病生防菌株温室幼苗松材线虫病防病效果复筛的测试结果；
[0057]
图11为30株高效松材线虫病生防菌株温室幼苗松材线虫病的病情指数；
[0058]
图12为30株高效松材线虫病生防菌株的种属比例。
具体实施方式
[0059]
下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0060]
实施例1.松材线虫病生防细菌的筛选模型建立
[0061]
1.松材线虫的培养
[0062]
本发明的松材线虫来自浙江农林大学林业与生物技术学院郭恺副教授惠赠。
[0063]
(1)将10μl108cfu/ml的灰葡萄孢菌孢子悬浮液(购买自上海菌保中心，as3.3789)接种至pda平板中央，于25℃恒温培养箱中培养4天，待菌丝长满整个pda平板后，备用。
[0064]
(2)将浓度为2500头/ml的松材线虫悬浮液，接到已经长好的真菌平板上，于25℃生长至虫子面积达培养皿2/3(约培养5天)，可以观察到真菌菌丝显著减少，且真菌菌落表面被油状物质覆盖，在体式显微镜4倍镜下能够观察到大量线虫。培养完成后，不可将长有松材线虫的真菌平板放置太久，否则会引起线虫活性降低，甚至大量死亡。
[0065]
(3)向长有线虫的真菌平板中加入10ml无菌水，浸泡1h。将线虫悬浮液转入15ml离心管，静置沉淀，弃上清。加入5ml含有2％硫酸链霉素的无菌水，轻轻混匀，对线虫进行消毒，处理5min后，静置，弃上清，用无菌水重复洗涤3次。
[0066]
(4)取1支50ml酸式滴定管，竖直固定在铁架台上，装入49ml0.3％的羧甲基纤维素钠盐(cmc)溶液，再从管口缓慢加入1ml松材线虫水液(约7000条线虫)，静置12h。取滴定管上端25ml，离心5min(2000r/min)，除去上清液，获得二龄松材线虫幼虫。
[0067]
(5)将二龄松材线虫幼虫滴加到新鲜的真菌平板上，48小时后，获得四龄松材线虫。在平板上加入10ml无菌水，浸泡1h。将四龄松材线虫悬浮液转入15ml离心管，静置沉淀，弃上清。加入5ml含有2％硫酸链霉素的无菌水，轻轻混匀，对四龄松材进行消毒，处理5min后，静置，弃上清，用无菌水重复洗涤3次。用无菌水将四龄松材线虫的虫悬液调整至每20μl有40-50头，备用。
[0068]
2.菌悬液的制备
[0069]
将保存于-80℃的待测菌株用三线平板划法在lb固体平板上活化，30℃培养16小时，将分离出的单克隆菌株，接种于5ml液体lb培养基，200rpm，30℃摇床培养24小时，收集发酵液，将浓度调为od
600
值为1.0(含菌量10
12
cfu/ml)备用。
[0070]
3.松材线虫病生防细菌的筛选与评价
[0071]
在96孔板上设置阳性对照区、目标测试区、阴性对照区和校正对照区，每个处理有五个孔重复；每孔加入40μl菌悬液和20μl虫悬液；
[0072]
阳性对照组加入菌悬液为已知杀松材线虫效果较好的短小芽胞杆菌ylt40，阴性对照组加入菌悬液为已知没有杀松材线虫活性的多粘类芽孢杆菌m-1，校正对照区为40μl无菌水和20μl虫悬液，用于计算校正死亡率；
[0073]
制作好的测试平板，放置于25℃培养20小时。
[0074]
20小时后，将孔板置于洗板仪，用无菌水清洗3遍，除去菌液，终止杀线虫反应。
[0075]
对阳性对照组和阴性对照组的线虫校正死亡率进行统计，利用公式：
[0076][0077]
σp,σn分别为阳性和阴性对照校正死亡率方差；μp,μn，分别为阳性和阴性对照校正死亡率均值，计算模型的z-因子(z-factor)。z-因子的理论值为1，为评估测试方法质量的主要参数。若z-因子在0.5至1之间，则该实验可靠性高；若z-因子小于0.5，则该试验为临界试验，可靠性较低。本筛选模型的z-因子为0.653，说明本实验的筛选条件和测量方法可靠性高，可用于大规模实验。图2为阳性对照组和阴性对照组的线虫校正死亡率。
[0078]
4.松材线虫病生防细菌杀线活性结果的精准可视化
[0079]
4.1.亚甲基蓝染色法
[0080]
初筛阶段，在终止杀线反应后，加入亚甲基蓝溶液终浓度为0.2mg/ml，25℃黑暗条件，染色4小时，将松材线虫进行染色。若线虫死亡，则线虫细胞通透性增加，亚甲基蓝溶液可以进入线虫细胞，将线虫细胞染成蓝色。
[0081]
利用洗板仪，用无菌水重复洗涤三次，除去孔板中多余染料。使用扫描仪，对96孔板扫描成像，从扫描图像中可以看出，呈僵直状态的死亡线虫被染成蓝色，而没有弯曲的存活线虫未被染色(图3，左图)。
[0082]
将扫描图片用photoshop软件打开，将阈值色阶调整到180-190之间，图像这仅显示被染成蓝色的死亡线虫。再用image j软件打开处理好的图片，利用灰度度量功能，选择图中需要分析区域，可以获得灰度值，利用灰度值，计算死亡率和校正死亡率(图3，右图)。灰度总值与单条线虫灰度值的比值即为死亡线虫的数量，死亡线虫数量再加上存活线虫数量即为供试线虫总量。死亡线虫数量与供试线虫数量的比值即为线虫死亡率。
[0083][0084][0085]
此方法方便快捷，可以通过电脑对实验结果进行批量处理，染色结束后，仅需半小时就能获得96孔板的全部实验结果。而之前方法要人工在体式显微镜下进行操作，获得96孔板的全部实验结果需要2-3小时，同时因为人工肉眼计数的差异，会降加大结果的误差。并且通过线虫僵直(死亡)弯曲(存活)判断线虫死亡与存活情况及其不准确。
[0086]
图1示出了松材线虫病生防细菌初筛流程，主要包括松材线虫的培养、菌悬液的制备、96孔板中菌悬液与虫悬液混合培养、亚甲基蓝染色、清洗线虫、扫描线虫，观察统计结果。
[0087]
4.2.dapi染色法
[0088]
为了更准确的检测松材线虫病生防细菌的杀松材线虫活性，对一次初筛效果好的菌株，进行二次初筛。在96孔板中再次与线虫25℃培养24小时，终止杀线反应后，采用4’6-二氨基-2-苯基吲哚(dapi)对与细菌共培养的松材线虫进行染色，dapi溶液最终浓度为5.0
μg/ml。
[0089]
染色1小时后，再用无菌水清洗3次，除去染料。使用激光共聚焦显微镜(zeiss,lsm 800)，激发光波长353nm，吸收光波长465nm处可观察死亡线虫因被染色而产生荧光，而活线虫不被染色，而不产生荧光(图4)。使用激光共聚焦显微镜图片分析软件(zen_lite)，选择图中需要分析区域，可以获得该区域的荧光强度值，根据量化的荧光强度，计算死亡率和校正死亡率。在荧光场下，仅显示死亡线虫，此时荧光场信号总强度值与单条线虫荧光场信号强度值的比值，即为死亡线虫数量；而明场显示所有供试线虫，明场信号总强度值与单条线虫明场信号强度值的比值即为供试线虫数量。死亡线虫数量与所有线虫数量的比值即为线虫死亡率。利用这种方法，更加准确清晰的判断线虫的死亡情况，实现筛选结果的精准可视化。
[0090][0091][0092]
实施例2.松材线虫病生防细菌温室幼苗防病效果测试实验
[0093]
1.樟子松幼苗的培养
[0094]
用5％的高锰酸钾溶液浸泡樟子松种子1小时，对种子进行表面灭菌。用无菌水清洗至无色，除去种子表面的高锰酸钾溶液。将灭菌后的种子用无菌纱布包裹，用无菌水润湿纱布，置于30℃进行催芽。48小时后挑选出芽的种子，载入灭菌土中，25℃温室培养30天，每3天给幼苗浇水一次。
[0095]
2.松材线虫病生防细菌防病效果实验
[0096]
向樟子松幼苗，喷淋5ml od
600
＝1.0的待测菌液。以菌株ylt40为阳性对照，菌株m-1为阴性对照，无菌水作为空白对照(图5)。用注射针头在距离根部2-3厘米处，将松树幼苗主干部位的韧皮部割开伤口，在伤口处安装1ml的注射器针头，用10cm左右的小木棒和封口膜固定针头和包扎伤口，在注射器针头内注入100μl 30头/μl的松材线虫悬浮液。
[0097]
每组处理10棵樟子松幼苗。接种9天周后，根据病级分类(图6)获得相应病情指数。
[0098][0099]
3.樟子松幼苗松材线虫病严重度分级
[0100]
0级，树苗生长正常，茎部饱满呈绿色、浅绿色，分支饱满较舒展呈深绿色，除有针头戳伤外无其他异样。
[0101]
1级，树苗轻微畸形，茎部仍较饱满但开始泛黄，分支失水弯曲，分支尖端变黄，整株树苗失水呈现分支蜷缩现象。
[0102]
2级，树苗畸形，茎部失水轻微干瘪泛黄，分支蜷缩出现干瘪皱缩现象且尖端枯黄，整株树苗失水明显，出现轻微干枯现象。
[0103]
3级，茎部枯黄干瘪，分支弯曲低垂失水严重皱缩现象明显，整株树苗严重失水，濒
临枯萎。
[0104]
4级，茎部枯黄，分支弯曲干瘪枯黄，整株树苗完全失水，树苗枯萎死亡。
[0105]
实施例3. 308株细菌的初筛选结果
[0106]
利用所建立的高通量筛选松材线虫病生防细菌模型，对本实验室采集分离的308株细菌进行杀松材线虫活性测试。通过亚甲基蓝染色一次初筛获得30株高效松材线虫病生防菌株，这些菌株的校正死亡率均超过85％(图7)，利用dapi染色法进行二次初筛(图8)，这些菌株仍具有高效杀线活性(图9)。
[0107]
为进一步验证其松材线虫病防病效果，将这30株菌，与松材线虫共接入樟子松幼苗中，进行松材线虫病防病效果复筛。根据其防病效果(图10)，计算樟子松幼苗的病情指数(图11)，表明它们具有强大的杀死松材线虫的作用，显示出优秀的生防效果。
[0108]
我们进一步对这些菌株进行分类研究，发现它们属于7属21种细菌，包括芽孢杆菌属、类芽孢杆菌属、假单胞菌属、肠杆菌属、金黄杆菌属、寡养单胞菌属、泛菌属(图12)，在已发表的研究中，这些细菌都是具有潜在防松材线虫病的原核生物，此筛选结果为松材线虫病的生物防治提供储备材料，所采用的高通量筛选松材线虫病生防细菌的方法，为松材线虫病生防细菌的筛选与生物防治提供技术支持。
[0109]
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。