基于调制解调技术的胎盘生长因子免疫荧光层析测定方法与装置与流程

1.本发明涉及体外诊断领域，尤其涉及一种基于调制解调技术的胎盘生长因子免疫荧光层析测定方法与装置。


背景技术：

2.胎盘生长因子是评价孕妇及胎儿健康状况的重要指标之一，免疫荧光层析技术可实现对胎盘生长因子的快速定量检测，具有良好的应用前景。
3.目前的胎盘生长因子免疫荧光层析技术主要采用妊娠期妇女的血清作为样本来进行检测。由于胎盘生长因子的合成与分泌均在胎盘组织中，因此，相比于胎盘组织，血清中的胎盘生长因子水平相对较低，这对免疫荧光层析技术的检测限提出了更高的要求。为了实现血清中胎盘生长因子的准确检出，一般临床上需要在孕中期血清中胎盘生长因子达到一定的水平才开展常规检测，这使得无法在相对早期从胎盘生长因子中获得母体及胎儿的健康状况信息，从而影响在相对早期对临床干预的指导作用。
4.另一方面，采用免疫荧光层析技术进行检测的过程中，由激发光照射基底带来的荧光和激发光本身的光等带来的非特异性噪声是影响检测精度的重要因素之一，特别是在检测低浓度的胎盘生长因子的过程中，有用的特异性荧光信号甚至会被非特异性噪声淹没，从而降低了检测结果的准确率。为了避免非特异性噪声对检测的影响，目前已经提出了基于时间分辨的免疫荧光层析检测技术。该技术采用铕等镧系化学元素的荧光物质进行荧光标记，在脉冲光的激发下，利用镧族荧光物质相对于非特异性光具有的较大的时间延迟特性，从而实现了有用光信号与非特异性光噪声在时间上的分离，从而提高了检测的精度。然而，采用该技术会一定程度上增加检测的成本及试纸条制作工艺的复杂性；同时，自然环境中广泛存在的镧系离子会使这种检测技术受到污染，从而影响最终检测结果。


技术实现要素：

5.为了解决上述技术问题，本发明提出了一种基于调制解调技术的胎盘生长因子免疫荧光层析测定方法与装置，采用从妊娠期妇女胎盘组织提取的胎盘生长因子作为免疫荧光层析测定的样本，结合本发明设计的调制解调技术，将免疫荧光层析试纸的特异性荧光强度信号调制到高频信号上进行检测，抑制了非特异性噪声，提高了检测精度。
6.为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
7.本发明的第一个目的在于提供一种基于调制解调技术的胎盘生长因子免疫荧光层析测定方法，包括以下步骤：
8.步骤1：利用层析试纸卡测试胎盘生长因子样品，在层析试纸卡的测试线处截获带荧光标记物的胎盘生长因子免疫复合物，形成双抗体夹心复合物；
9.步骤2：控制激光器以一定的受到调制的波长照射层析试纸卡的测试线，双抗体夹心复合物中的荧光标记物因受激光激发而发射荧光；
10.步骤3：对荧光进行会聚、滤波后转化为表征荧光标记物浓度的电信号，对电信号进行解调，得到表征胎盘生长因子水平的解调信号。
11.进一步的，所述步骤3在解调时，获取与表征荧光标记物浓度的电信号同步的参考信号，根据参考信号计算解调信号。
12.所述调制信号为方波时，解调信号表示为：
[0013][0014][0015]
其中，d为方波解调信号，ts为方波波长调制周期，fs为方波波长调制频率，n为正整数，pq为表征荧光标记物浓度的方波电信号，sr为方波参考信号，t为时间，aq为方波参考信号幅值。
[0016]
所述调制信号为正弦波时，在解调过程中首先将表征荧光标记物浓度的正弦波电信号与正弦波参考信号相乘：
[0017][0018]
其中，s为解调的中间结果，p为表征荧光标记物浓度的正弦波电信号，为正弦波参考信号，a为正弦波参考信号幅值，f为正弦波参考信号频率，为正弦波参考信号初始相位；
[0019]
之后，将信号s进行低通滤波处理，得到解调信号。
[0020]
本发明的第二个目的在于提供一种基于调制解调技术的胎盘生长因子免疫荧光层析测定装置，用于实现上述的测定方法。
[0021]
与现有技术相比，本发明的优势在于：
[0022]
第一，相比于传统的从妊娠期妇女血清中提取的胎盘生长因子，本发明的样本中的胎盘生长因子水平更高，有利于妊娠期妇女相对早期胎盘生长因子的准确检测。
[0023]
第二，本发明提出一种调制解调技术来实现免疫荧光层析试纸特异性荧光强度信号的检测，一方面，利用荧光物质的吸收谱线特性，对激发光波长进行调制，将特异性荧光强度信号转变为一种高频信号，可以抑制在免疫荧光检测过程中由非特异性荧光噪声以及其他低频噪声等对检测结果带来的干扰，且可采用普通荧光素实现，检测准确性高；另一方面，本发明通过波长工作点扫描得到解调信号与激发光波长的关系曲线，并选取最大解调信号对应的激发光波长作为波长工作点，有利于提升检测过程中解调信号的信噪比，从而改善检测的准确性。
[0024]
第三，本发明可采用方波进行同步调制解调，相对于正弦波调制解调技术更容易实现，信号处理实现更加简单。
附图说明
[0025]
图1是本发明实施例示出的层析试纸条的结构示意图；
[0026]
图2是本发明实施例示出的免疫荧光层析测定装置的结构示意图；
[0027]
图3是常用的异硫氰酸荧光素(fitc)的吸收(abs)和发射(em)光谱；
[0028]
图4是本发明实施例示出的光电探测器接收到的荧光功率与激光器波长的关系曲线，用于示意激发光波长调制技术的原理。
具体实施方式
[0029]
下面结合附图，对本发明做进一步的说明。
[0030]
图1是本发明实施例采用的层析试纸条结构示意图，主要包括样品垫、结合垫、测试线(t线)、质控线(c线)和吸水纸，并固定于塑料底板上。本发明采用双抗体夹心法实现检测，所述的样品垫用于吸收胎盘生长因子样本；所述的结合垫上吸附有标记荧光物质的胎盘生长因子单克隆抗体；所述的t线包被有胎盘生长因子单克隆抗体，用于截获带荧光标记物的胎盘生长因子免疫复合物，形成双抗体夹心复合物；所述的c线包被有胎盘生长因子多克隆抗体，用于截获带荧光标记物的胎盘生长因子单克隆抗体；所述的吸水纸用于促进样品溶液的侧向流动。本发明可采用普通荧光素实现，相对于采用镧系元素制作的层析试纸条，降低了层析试纸条的制作复杂性及成本。
[0031]
本发明在样品垫上采用从妊娠期妇女胎盘组织中提取的胎盘生长因子作为免疫荧光层析测定的样本，相比于传统的从妊娠期妇女血清中提取的胎盘生长因子，本发明样本中的胎盘生长因子水平更高，这是由于胎盘生长因子主要由胎盘组织中的合体滋养层细胞合成，在胎盘组织中的水平相比于血清更高。因此，这种方法可以实现对胎盘生长因子的相对早期的准确检测。本实施例中，妊娠期妇女的胎盘组织可以通过羊水穿刺检查获得，从胎盘组织中提取胎盘生长因子采用目前常规技术。
[0032]
图2是本发明提出的胎盘生长因子免疫荧光层析测定装置的结构示意图，主要包括层析试纸卡、调制信号模块、波长控制模块、激光器、光隔离器、工作点模块、解调模块、光电探测器、滤光片和平凸透镜。
[0033]
所述的层析试纸卡由图1所示的层析试纸条采用常规技术加装塑料外壳后构成。
[0034]
所述的激光器采用波长可调谐窄线宽激光器，如采用半导体激光器或光纤激光器等。本实施例中，所述的激光器输出端加装有光隔离器，用于抑制光路中的反向传输光，避免反向传输光对激光器造成损坏。
[0035]
所述的调制信号模块用于产生高频波长调制电信号，并将高频波长调制电信号分别输出到波长控制模块和解调模块。本实施例中，调制信号可采用正弦波信号或方波信号。
[0036]
所述的工作点模块用于产生激光器波长工作点控制信号，并将该工作点控制信号输出到波长控制模块。
[0037]
所述的波长控制模块的两个输入信号分别为调制信号模块输出的高频波长调制电信号，以及工作点模块输出的激光器波长工作点控制信号。在波长控制模块中，将上述两个输出信号相加后的电信号输出到激光器的波长调谐端，用于控制和调制激光器的波长。
[0038]
所述的平凸透镜位于层析试纸卡的t线上方，用于将由t线发散的荧光进行会聚，会聚后的光经滤光片滤除目标波长以外的光，再由所述的光电探测器接收，将荧光强度转
换为电信号，并将电信号输入到解调模块中。
[0039]
所述的解调模块的两个输入信号分别为光电探测器输出的电信号，以及调制信号模块输出的电信号，该模块采用一定的信号处理方法对光电探测器输出的电信号进行同步解调，并输出解调信号。
[0040]
基于上述各部分的功能，所述的胎盘生长因子免疫荧光层析测定装置的测试方法为：调制信号模块产生高频波长调制电信号，工作点模块产生激光器波长工作点控制信号，波长控制模块接收高频波长调制电信号和激光器波长工作点控制信号，对激光器的波长进行调制。受到波长调制的激光器发出的激光经过光隔离器照射到层析试纸卡t线位置。当样品中存在一定量的胎盘生长因子时，t线处捕获的荧光标记物因受激光激发而发射荧光。发散的荧光通过平凸透镜会聚后，再经过带通滤光片得到一定波长范围的荧光，该部分荧光的荧光强度通过光电探测器转换为电信号。从光电探测器输出的电信号通过解调模块后得到解调信号，该解调信号的大小即反映了胎盘生长因子的浓度，可根据标定法等得到具体的浓度值。
[0041]
图3是常用的异硫氰酸荧光素(fitc)的吸收(abs)和发射(em)光谱(杨步高等，一种基于异硫氰酸荧光素的ph纳米传感器制备，发光学报，41(6):729-733(2020))。吸收光谱反映了不同激发光波长条件下荧光素对激发光的吸光度。同时，在荧光效率一定的条件下，吸收光谱也反映了输出荧光强度随激发波长的变化。可以发现，吸收光谱曲线先随激发光波长的增大而不断上升，当达到最大值后，又随激发光波长的增大而不断下降。因此，相应地，在荧光效率一定的条件下，荧光强度也先随激发光波长的不断增大而增大，当达到最大值后，又随激发光波长的不断增大而减小。
[0042]
根据上述特性，在一定的激发光波长范围内，可以得到一个荧光强度随激发光波长变化的近似线性区，基于该线性区，本发明提出一种通过对激发光波长进行调制的荧光信号检测方法，图4表示了该方法的基本原理。图中，i为光电探测器接收到的荧光功率。如图中所示，当对波长进行正弦波调制时，光电探测器接收到的荧光功率信号为近似正弦波信号。根据比尔朗伯定律，吸光度与样品中荧光素浓度成正比；而在一定荧光效率及激发光功率条件下，荧光功率又与吸光度成正相关。基于上述关系，显然正弦波荧光功率信号的幅度大小反映了荧光素的浓度，最终反映了由荧光素标记的胎盘生长因子的水平。因此，本发明提出对光电探测器输出信号进行同步解调获得探测器信号幅度的方法，从而最终反映胎盘生长因子水平。
[0043]
结合图2所示的免疫荧光层析测定装置，在波长控制模块的调制下，激光器的波长可以表示为：
[0044][0045]
式中，λ0为由工作点模块决定的波长工作点，λa为由调制信号模块决定的波长调制信号幅度，f为由调制信号模块决定的波长调制信号频率，为由调制信号模块决定的波长调制信号初始相位，t为时间，λ为激光器的波长。
[0046]
在荧光效率一定的条件下，光电探测器输出的电信号可以表示为：
[0047]
p＝ai(λ)
ꢀꢀ
(2)
[0048]
式中，a为光电探测器的光电转换系数；i(λ)为激光器波长为λ时，光电探测器接收到的荧光功率。
[0049]
在解调模块中，首先将光电探测器输出信号与由调制信号模块输出的正弦波参考信号相乘，且相乘后的信号可以表示为：
[0050][0051]
式中，为调制信号模块输入到解调模块的正弦波参考信号，a为正弦波参考信号幅值，f为正弦波参考信号频率，为正弦波参考信号初始相位。在解调模块中对上述信号s作进一步的低通滤波后得到最终的解调信号，该解调信号大小即反映了胎盘生长因子的水平。
[0052]
需要说明的是，调制信号模块输入到波长控制模块的波长调制电信号幅度和调制信号模块输入到解调模块的电信号幅度a不需要一致，其频率f一致即可。另外，调制信号模块输入到解调模块的信号是为了作为参考信号使用的，由于从光电探测器输出的电信号与从调制信号模块输出的参考信号之间有可能存在相位延迟，为了提高输出解调信号的信噪比，可进一步将参考信号处理为与光电探测器输出的电信号的相位差接近于0。
[0053]
除了上述采用正弦波信号进行调制解调外，也可采用方波信号实现本发明的调制解调技术。由于方波信号相对于正弦波信号更容易实现，因此，采用方波信号可以降低信号处理的复杂性。当采用方波调制解调技术时，激光器波长可以表示为：
[0054]
λ＝λ0 sq(t) (4)
[0055]
式中，sq(t)为由调制信号模块决定的方波波长调制信号，且可以表示为：
[0056][0057]
式中，λ
as
为方波波长调制幅度，fs为方波波长调制频率，n为整数。
[0058]
在荧光效率一定的条件下，光电探测器输出的电信号可以表示为：
[0059]
pq＝ai(λ) (6)
[0060]
光电探测器输出信号经过解调模块信号处理后得到的解调输出信号可以表示为：
[0061][0062]
式中，ts＝1/fs为方波波长调制周期；sr为从调制信号模块产生并输入到解调模块的同步解调参考信号，且可以表示为：
[0063][0064]
式中，aq为方波参考信号的幅度，同理，aq的取值与调制信号模块输入到波长控制模块的方波波长调制电信号幅度取值也无需一致。
[0065]
为了优化输出解调信号的信噪比，本发明在如图4所示的荧光功率与波长关系曲
线上选取最佳波长工作点。本实施例中，选取最佳波长工作点的方法如下：
[0066]
首先，采用胎盘生长因子水平相对较高的标准液滴加在层析试纸条的样品垫上，并静止放置10-15分钟，使得样品得到充分层析。
[0067]
第二，待层析充分后，将层析试纸条放入图2所示的胎盘生长因子免疫荧光层析测定装置中，并通过装置中的工作点模块随时间线性改变工作波长，从而线性扫描在不同工作波长条件下解调模块的解调输出信号，并记录工作波长与解调信号之间的关系曲线。
[0068]
最后，基于上述工作波长与解调信号之间的关系曲线，得到最大解调信号对应的工作波长，该工作波长即为选取得到的最佳波长工作点。
[0069]
以上列举的仅是本发明的具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。