一种高通量筛选松材线虫病生防细菌的方法

技术特征：
1.一种高通量筛选松材线虫病生防细菌的方法，其特征在于，包括将松材线虫的虫悬液与待测菌株的菌悬液混合培养后，用无菌水洗涤除去菌液，对松材线虫虫体染色进行生防细菌初筛，再利用樟子松幼苗进行生防细菌防病效果复筛；其中，所述初筛使用的染色溶液为亚甲基蓝溶液和/或4,6-二氨基-2-苯基吲哚溶液。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述初筛包括使用亚甲基蓝溶液进行第一次初筛实验后，将筛选出的菌株与所述松材线虫再次进行共培养，然后使用4,6-二氨基-2-苯基吲哚溶液进行第二次初筛实验。3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述亚甲基蓝溶液的终浓度为0.15～0.25mg/ml，优选0.2mg/ml；所述4,6-二氨基-2-苯基吲哚溶液的终浓度为4～6μg/ml，优选5μg/ml。4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述松材线虫的虫悬液与待测菌株的菌悬液混合培养的条件为：25℃培养18～24小时；优选为24小时。5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述松材线虫的虫悬液的浓度为40～50头松材线虫/20μl；所述待测菌株的菌悬液的活菌数为10
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cfu/ml。6.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述松材线虫的虫悬液与所述待测菌株的菌悬液的添加体积比为1:1.8～2.5；优选为1:2。7.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，当使用所述亚甲基蓝溶液进行染色后，使用扫描仪成像，将图像灰度化处理后，计算死亡率和校正死亡率；当使用所述4,6-二氨基-2-苯基吲哚溶液染色后，使用荧光微镜成像，根据荧光强度，计算死亡率和校正死亡率；优选地，当使用所述亚甲基蓝溶液进行染色，染色的条件为25℃黑暗下染色3.5～4.5小时；优选4小时；优选地，当使用4,6-二氨基-2-苯基吲哚溶液进行染色，染色的条件为25℃黑暗下染色0.5～2小时；优选1小时；更优选地，染色后，用无菌水进行洗涤以除去菌液和染料。8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述初筛中还设置阳性对照组、阴性对照组和校正对照组；其中，所述阳性对照组加入的菌悬液为短小芽胞杆菌(bacillus pumilus)ylt40，阴性对照组加入的菌悬液为多粘类芽孢杆菌(paenibacillus polymyxa)m-1，校正对照组用无菌水代替菌悬液。9.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述生防细菌防病效果复筛包括采用1月龄的樟子松幼苗，喷淋待测菌液并注射松材线虫悬浮液，根据所述幼苗病情指数确定所述生防细菌的防松材线虫病效果；优选地，所述生防细菌防病效果复筛还包括在伤口处注射无菌水作为空白对照以及在伤口处注射松材线虫悬浮液作为阴性对照。10.一种防治松材线虫病的方法，其特征在于，使用权利要求1～9中任一项所述的方法筛选得到的所述生防细菌进行防治。

技术总结
本发明提供了一种高通量筛选松材线虫病生防细菌的方法，涉及生物技术领域。所述方法包括将松材线虫的虫悬液与待测菌株的菌悬液混合培养后，用无菌水洗涤除去菌液，对所述松材线虫虫体染色进行生防细菌初筛；再利用樟子松幼苗进行生防细菌防病效果复筛；其中，所述初筛使用的染色溶液为亚甲基蓝溶液和/或4,6-二氨基-2-苯基吲哚溶液。本发明提供了一种高通量、低成本且高准确度的筛选松材线虫病生防细菌的方法，为松材线虫病生防细菌的筛选与生物防治提供技术支持。物防治提供技术支持。物防治提供技术支持。


技术研发人员：牛犇 赵宇 王爽 吴迪 王传珍 闫合 潘佳亮 张弘弢 王浩宇 王明越
受保护的技术使用者：东北林业大学
技术研发日：2022.03.31
技术公布日：2022/7/5