NtNAC083基因在负调控烟草冷胁迫应答中的应用

ntnac083基因在负调控烟草冷胁迫应答中的应用
技术领域
1.本发明属于基因调控技术领域，尤其涉及一种ntnac083基因在负调控烟草冷胁迫应答中的应用。


背景技术：

2.温度在限制植物分布区域及影响作物产量中有着重要作用。近年来，在全球气候环境的不断变化下，低温已经成为危害农业生产的主要环境因素之一，低温胁迫主要造成植物的花期发生改变，进而影响作物产量和品质。在中国南部地区，低温胁迫诱导的烟草早花现象严重，严重影响烟叶的产量和品质，给烟农造成巨大的经济损失。目前烟草生产过程中用来降低低温胁迫导致烟叶花芽提前分化所造成的损失主要是一些农艺措施(如打顶留杈)，但在这些措施的实施一般会耗费大量的人力、物力以及财力。因此，开展植物(烟草)低温胁迫应答分子机理研究，通过基因工程方法培育耐低温抗早花新品种是解决这一问题的最有效途径。
3.nac转录因子存在于高等植物中并分布广泛，其生物学功能多种多样，不但普遍参与植物生长发育进程，并且在植物的逆境胁迫应答进程中也发挥着不同的功效。例如：anac072/rd26、ntl4(anac053)和anac055转录因子的过表达增强了拟南芥对干旱、高盐和温度胁迫的耐受性；在拟南芥中过表达mlnac5转录因子提高拟南芥对干旱和低温的抗性；在高盐、干旱和低温胁迫下，小麦tanac2转录因子的表达显著增加，并且通过激活几种胁迫响应基因增强基因敲除材料小麦对盐、干旱和低温胁迫的耐受性；但目前有关烟草nac转录因子的功能研究还很少。


技术实现要素：

4.本发明提供了一种ntnac083基因在负调控烟草冷胁迫应答中的应用，该应用的获得对于研究烟草低温胁迫应答分子机理研究，通过基因工程方法培育耐低温抗早花新品种拓展了有效解决途径。
5.为了达到上述目的，本发明提供了一种ntnac083基因在负调控烟草冷胁迫应答中的应用。
6.作为优选，ntnac083基因通过调节冷胁迫关键基因cbf1或nced3的表达来负调控烟草对冷胁迫的响应。
7.作为优选，ntnac083基因通过影响丙二醇和离子渗透率来负调控烟草对冷胁迫的耐受性。
8.作为优选，所述ntnac083基因的序列如seq id no：1所示。该基因序列为已知序列，其在ncbi上的编号为xm_016602248.1。
9.作为优选，所述冷胁迫的条件为4℃下处理30天。
10.本发明还提供了一种提高烟草冷胁迫应答能力的方法，包括以下步骤：
11.构建烟草基因ntnac083的过表达载体，经农杆菌介导转化到烟草中，获得提高烟
草冷胁迫应答能力的转基因植株。
12.作为优选，构建烟草基因ntnac083的过表达载体的方法为：
13.根据ntnac083全长序列设计以下引物：
14.ntnac083-f：cactgttgatacatatggttgggaaaattagctcgg；ntnac083-r：tgttgattcagaattctcactgaaattgaaaagctgga；
15.以普通烟草k326 cdna为模板，利用primestar hs dna高保真酶进行ntnac083全长序列扩增，使用neb限制性内切酶ndei和ecori-hf将过表达载体pri101-an进行线性化，利用infusion方法将目的基因片段构建到pri101-an中，提取重组质粒进行酶切验证并测序，得到过表达载体。
16.作为优选，构建烟草基因ntnac083的过表达载体后，利用农杆菌介导的叶盘法转化普通烟草k326，通过对所得转基因植株的ntnac083基因表达量分析，得到提高烟草冷胁迫应答能力的转基因植株ntnac083-oe。
17.作为优选，冷胁迫的条件为4℃下处理30天。
18.与现有技术相比，本发明的优点和积极效果在于：
19.本发明发现ntnac083基因可作为一个负调控因子参与植株对低温冷胁迫的响应，通过过表达株系地上部分冷表型发现，其有效降低了烟草植株对低温的耐受性；通过生理数据进一步ntnac083基因可能通过调节冷胁迫关键基因cbf1或nced3的表达来调节植物对低温的响应。该发现的获得对于研究烟草低温胁迫应答分子机理研究，通过基因工程方法培育耐低温抗早花新品种拓展了有效解决途径。
附图说明
20.图1为本发明实施例提供的ntnac083基因表达模式分析及过表达株系鉴定，*，差异显著(p《0.05)；
21.图2为本发明实施例提供的对照k326和ntnac083-oe在低温处理情况以及dat/nbt染色情况*，差异显著(p《0.05)；
22.图3为本发明实施例提供的对照k326和ntnac083-oe在低温处理前后离子渗漏和丙二醛含量，sop、cat的酶活；fw，叶片鲜重。每个实验进行三次生物学重复。*，差异显著(p《0.05)；
23.图4为本发明实施例提供的对照k326和ntnac083-oe在低温处理前后根长表型，*，差异显著(p《0.05)；
24.图5为本发明实施例提供的冷胁迫相关基因表达分析，*，差异显著(p《0.05)。
具体实施方式
25.下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
26.实施例1表达模式
27.为了验证ntnac083是否参与烟草冷胁迫响应，将野生型烟草k326在4℃下分别处
理0、1、3、6、12、24、36、48h，提取不同时间点处理下的rna，利用实时荧光定量pcr技术对其在冷胁迫下的表达量进行分析，结果如图1a所示。
28.ntnac083受冷胁迫强烈诱导，且在1h时表达量达到对照(处理0h)的近500倍，在24-36h时表达量上调也十分明显，分别是对照的173倍及279倍。该结果预示着ntnac083在烟草遭遇冷胁迫时发挥重要的作用。
29.进一步，对ntnac083在烟草植株中的表达模式进行分析，实时荧光定量pcr结果显示，ntnac083基因在根、茎、叶、花中均有表达，且花、根、上部叶片相对表达量较高，下部叶、顶芽中表达量次之，中部叶表达量最低(图1b)。
30.构建ntnac083基因的过表达载体(方法具体为：根据ntnac083全长序列设计引物：
31.ntnac083-f：cactgttgatacatatggttgggaaaattagctcgg；ntnac083-r：tgttgattcagaattctcactgaaattgaaaagctgga；
32.以普通烟草k326 cdna为模板，利用primestar hs dna高保真酶进行ntnac083全长序列扩增，使用neb限制性内切酶ndei和ecori-hf将过表达载体pri101-an进行线性化，利用infusion方法将目的基因片段构建到pri101-an中，提取重组质粒进行酶切验证并测序，得到过表达载体)，利用农杆菌介导的叶盘法转化普通烟草k326，成功筛选获得转基因烟草t0代植株，获得8株阳性苗，对筛选获得的8个株系中ntnac083基因的表达量进行分析，结果如图1c所示，这8个株系的该基因表达均有不同程度的提高，其中oe5和oe8表达量上调最高，分别为对照的19.65倍及17.53倍，挑选这两个株系用于后续表型分析。
33.实施例2过表达株系地上部分冷表型
34.选取并种植过表达及野生型(k326)植株，待植株长到5-6叶期时，进行冷(4℃)胁迫处理。观察冷胁迫处理后ntnac083-oe转基因植株和k326对照植株的表型(图2a)，分析植株的低温耐受性。
35.在冷处理过程中，ntnac083-oe株系与对照相比，叶片出现严重的萎蔫失水症状，仅新叶还保持正常的生长状态；对冷处理早期叶片进行观察发现ntnac083-oe材料出现严重的冻斑(图2a)。进一步，利用二氨基联苯胺法(dab)及氮蓝四唑法(nbt)对冷处理后的叶片进行染色观察其叶片中ros积累变化，结果如图2c/d所示，烟草ntnac083-oe材料叶片ros含量远高于对照。这说明ntnac083基因过表达后降低了烟草植株对低温的耐受性，即ntnac083基因作为一个负调控因子参与了植株对低温冷胁迫的响应。
36.实施例3生理数据
37.外界条件的变化往往引起植物产生一定的生理反应，与其他胁迫因子相同，低温胁迫同样会对植物生理变化造成影响。在植物中，丙二醇(mda)和离子渗漏含量的高低可以看出植物在逆境(冷)条件下膜系统受损程度的大小。
38.对ntnac083过表达植株及对照在低温处理前后的mda及离子渗漏率进行分析，结果如图3a/b所示，过表达株系ntnac083-oe5，ntnac083-oe8和对照k326烟草中mda含量在冷处理前无显著性差异，在冷胁迫后ntnac083-oe5和ntnac083-oe8烟草中mda含量明显升高，变化幅度明显大于对照，说明ntnac083-oe5和ntnac083-oe8植株冷耐受力弱。
39.冷处理后，对照k326和ntnac083-oe5和ntnac083-oe8烟草叶片离子渗漏较处理前相比均有明显升高，并且ntnac083-oe5和ntnac083-oe8植株增加得更多(图3b)；说明ntnac083通过影响mda和离子渗漏率来调节烟草对低温的耐受性。
40.植物体内的sod、cat是生物膜保护酶系统的重要成员，它们协同作用来降低防御活性氧(ros)或其它过氧自由基对膜系统的伤害，抑制膜脂过氧化，减轻低温胁迫对细胞的伤害。在低温胁迫下，ntnac083-oe5和ntnac083-oe8过表达材料中超氧物歧化酶(sod)、过氧化氢酶(cat)的酶活性与比对照相比显著降低，说明过表达材料植株在低温胁迫下防御系统受到严重损害，不能适应或挽救低温对其造成的伤害。
41.实施例4根部表型
42.根作为植物重要的器官，根的生长状态对地上部分有决定性作用，如图4所示，在正常生长条件下，ntnac083-oe5和ntnac083-oe8过表达植株与对照的根长之间没有明显差异，均在9cm左右。在低温胁迫下，ntnac083-oe5和ntnac083-oe8过表达材料幼苗的根长明显受到抑制，降低到5cm，而对照的根长基本不受抑制，同时对幼苗的鲜重进行分析，过表达材料鲜重显著低于对照，以上结果说明ntnac083基因的过表达严重影响了根部的生长发育，从而降低了根部对低温的耐受性。
43.实施例5ntnac083对烟草中冷胁迫相关基因表达的影响
44.已有研究表明，低温胁迫会诱导植物中相关基因的表达，例如：cbf1和nced3，从而影响植物的抗寒或者抗冷性。本研究进一步通过实时荧光定量pcr对低温处理下过表达和对照材料中两个基因的表达量进行分析，结果如图5所示，对照k326中cbf1和nced3基因在低温诱导后表达量显著上调，但是在过表达材料中两基因的表达都受到抑制，说明在过表达材料中由于ntnac083过表达从而抑制了冷胁迫基因cbf1和nced3的表达，导致植物的抗冷性降低。这些结果表明，ntnac083基因可能通过调节冷胁迫关键基因cbf1或nced3的表达来调节植物对低温的响应。