检测荔枝抗荔枝霜疫霉病的方法及其应用

1.本发明属于植物抗病技术领域，更具体地，本发明涉及一种快速检测荔枝抗荔枝霜疫霉病的方法及其应用。


背景技术：

2.病害是影响植物的生长发育的重要限制因素。在农业生产中，严重的病害可造成农作物大幅度减产或使其品质下降，因此研究植物抗病性对农业生产具有重要的意义。
3.荔枝霜疫霉病，是由荔枝霜疫霉菌侵染所引起的、发生在荔枝上的一种最为严重的病害，其严重危害荔枝产量、品质以及鲜果的贮运，主要为害接近成熟或成熟的果实，有时也为害幼果、花穗和叶片。
4.筛选高抗荔枝霜疫霉病优良材料至关重要。常规的检测方法主要针对荔枝的成熟果实，然而荔枝一年一熟，果实成熟期不一致，在较短的时期内对大量的果实进行抗病筛选工作强度大；此外对尚处在童期未结实的荔枝材料，也无法进行抗病检测。


技术实现要素：

5.基于此，本发明的目的之一在于提供一种检测荔枝抗荔枝霜疫霉病的方法，所述检测方法能在果实成熟之前就检测出是否抗荔枝霜疫霉病，且成本低、耗时短。
6.实现上述发明目的的具体技术方案包括如下：
7.一种检测荔枝抗荔枝霜疫霉病的方法，包括以下步骤：
8.(1)、在荔枝鲜叶上，接种荔枝霜疫霉菌孢子悬液；所述孢子悬液中孢子数为3*104个/ml～5*104个/ml；
9.(2)、将接种好的荔枝鲜叶于25℃～28℃恒温培养3天～5天；
10.(3)、根据霜疫霉菌侵染荔枝鲜叶的病情指数，检测荔枝是否抗荔枝霜疫霉病。
11.在其中一些实施例中，步骤(1)中所述荔枝霜疫霉菌孢子悬液中孢子数为4*104个/ml～5*104个/ml。
12.在其中一些实施例中，步骤(1)中所述荔枝霜疫霉菌孢子悬液的接种量为4ul～10ul。
13.在其中一些实施例中，所述荔枝霜疫霉菌孢子悬液的接种量为5ul～6ul。
14.在其中一些实施例中，步骤(1)中所述荔枝鲜叶为萌发后8天～12天的叶片。
15.在其中一些实施例中，所述荔枝鲜叶为柔软并逐渐转绿的叶片。
16.在其中一些实施例中，步骤(1)中所述荔枝霜疫霉菌孢子悬液通过以下方法制备而得：将荔枝霜疫霉菌接种于胡萝卜琼脂培养基中，于25℃～28℃恒温培养4天～6天，用无菌水把荔枝霜疫霉菌孢子洗脱下来，无菌水稀释，即得。
17.在其中一些实施例中，所述恒温培养温度为27℃～28℃。
18.在其中一些实施例中，所述胡萝卜琼脂培养基通过以下方法制备：将180g～220g去皮胡萝卜榨汁，纱布过滤，取滤液，加入18g～22g琼脂粉，定容到1000ml，灭菌，即得。
19.在其中一些实施例中，步骤(2)中所述培养温度为27℃～28℃。
20.本发明还提供了上述检测荔枝抗荔枝霜疫霉病的方法在荔枝抗病育种中的应用。
21.与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
22.针对传统荔枝抗荔枝霜疫霉病的检测方法只能检测荔枝成熟果实，无法对未能结实的荔枝材料进行检测的缺陷，本发明的发明人综合检测并评估276份荔枝成熟果实和叶片的抗病表型，发现荔枝成熟果实和叶片的抗病表型之间存在显著相关性，在此基础上，提供了一种通过检测荔枝鲜叶即可实现检测荔枝是否抗荔枝霜疫霉病的方法，并明确了最佳的荔枝叶片检测材料(萌发10天左右的鲜叶)和最佳的荔枝霜疫霉菌孢子悬液的浓度(孢子悬液中孢子数为3*104个/ml～5*104个/ml)，该方法准确可靠，且可在一年内多时期、大批量对荔枝材料进行抗荔枝霜疫霉病表型的检测，耗时短，成本低，可以广泛应用于荔枝抗病育种中。
附图说明
23.图1为本发明中荔枝果实和荔枝鲜叶的感病分级标准；其中，a为荔枝成熟果实感染荔枝霜疫霉病的分级标准；b为荔枝鲜叶感染荔枝霜疫霉病的分级标准。
24.图2为本发明试验例1中采用本发明的检测方法，对不同荔枝叶片进行荔枝抗荔枝霜疫霉病的结果，其中，a为不同荔枝叶片感染荔枝霜疫霉病的表型检测结果；b为不同荔枝叶片感染荔枝霜疫霉病的病情指数(*p《0.05；**p《0.01)。
25.图3为本发明试验例2中检测荔枝抗荔枝霜疫霉病最佳侵染孢子悬液孢子数的筛选结果；其中，a为不同孢子悬液浓度下荔枝鲜叶的感病表型；b为不同孢子悬液浓度下荔枝鲜叶的病情指数(*p《0.05；**p《0.01)。
26.图4为本发明试验例3中荔枝成熟果实抗病与鲜叶抗病之间的关系；其中，a为荔枝成熟果实和鲜叶的病情指数核密度分析；b为荔枝成熟果实和鲜叶的病情指数频率分布；c为荔枝成熟果实和鲜叶的病情指数箱线图；d为荔枝成熟果实和鲜叶的病情指数相关性分析。
具体实施方式
27.为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述。本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明公开内容的理解更加透彻全面。
28.除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不用于限制本发明。本发明所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
29.除非另外指明，本发明的实施例中所使用的实验方法，均为植物学、微生物学和植物病理学等传统方法，实施例中所用到的各种试剂耗材，均为市售产品。
30.在本发明中，提供了一种检测荔枝抗荔枝霜疫霉病的方法，其是将荔枝霜疫霉菌的孢子悬液(孢子悬液中孢子数为3*104个/ml～5*104个/ml，最优选4*104个/ml)接种至萌发后8天～12天的荔枝鲜叶(此时叶片柔软并逐渐转绿)，将荔枝鲜叶置于恒温培养箱培养，
培养3天～5天，根据荔枝霜疫霉病侵染荔枝鲜叶的病情指数，来检测荔枝是否抗荔枝霜疫霉病。
31.如图1所示，为本发明中荔枝果实和荔枝鲜叶的感病分级标准；根据病斑面积来评判荔枝成熟果实和荔枝鲜叶的感病等级。其中，图1中的a为荔枝成熟果实感染荔枝霜疫霉病的分级标准；图1中的b为荔枝鲜叶感染荔枝霜疫霉病的分级标准。病斑面积对应的感病等级如下：
32.0级：无病斑；
33.1级：病斑面积占总面积的5％以下；
34.3级：病斑面积占总面积6％～15％；
35.5级：病斑面积占总面积16％～25％；
36.7级：病斑面积占总面积26％～50％；
37.9级：病斑面积占总面积51％以上。
38.病情指数di＝∑(病叶数
×
病级数值)/(总叶数
×
最高级数值)
×
100
39.根据病情指数，来检测荔枝是否抗荔枝霜疫霉病。具体为：
40.di≦20时，荔枝对荔枝霜疫霉病具有抗性；di》20.1时，荔枝对荔枝霜疫霉病不具有抗性。
41.(1)、di＝0，荔枝对荔枝霜疫霉病具有免疫性(immunity,i)；0.1《di≦10，荔枝对荔枝霜疫霉病具有高抗性(high resistance,hr)；10.1《di≦20，荔枝对荔枝霜疫霉病具有中抗性(moderate resistance,mr)。
42.(2)、20.1《di≦40，荔枝对荔枝霜疫霉病具有低抗性(low resistance,lr)，也就是较易感染荔枝霜疫霉病；40.1《di≦60，荔枝对荔枝霜疫霉病具有中感性(moderate susceptible,ms)，也就是容易感染荔枝霜疫霉病；di》60.1，荔枝对荔枝霜疫霉病具有高感性(high susceptible,hs)，也就是非常容易感染荔枝霜疫霉病。
43.在本发明的实施例中，所述荔枝霜疫霉菌的孢子悬液的制备方法如下：将荔枝霜疫霉菌(采用常规方法，从荔枝园染荔枝霜疫霉病果实上分离纯化荔枝霜疫霉菌)接种于胡萝卜琼脂培养基(将200g去皮胡萝卜榨汁，四层纱布过滤，取滤液，加入20g琼脂粉，定容到1000ml，灭菌)中，于27℃恒温培养5天，用无菌水把荔枝霜疫霉菌孢子洗脱下来，用无菌水稀释至所需浓度。
44.以下将结合具体实施例和试验例来详细说明本发明。
45.实施例1一种检测荔枝抗荔枝霜疫霉病的方法
46.本实施例的一种检测荔枝抗荔枝霜疫霉病的方法，包括以下步骤：
47.(1)、采摘30片桂味荔枝鲜叶(萌发10天左右，柔软并逐渐转绿)，平铺于培养皿中，每个培养皿中放入3片荔枝鲜叶，加入10ml无菌水；
48.(2)、将荔枝霜疫霉菌孢子悬液稀释至孢子悬液中孢子数为4*104个/ml；
49.(3)、在步骤(1)的荔枝鲜叶中用移液器接种5ul步骤(2)的霜疫霉菌孢子悬液；
50.(4)、将接种好的荔枝鲜叶于27℃恒温培养箱培养，昼夜时间12h/12h。
51.(5)、接种第4天，观察荔枝鲜叶的病斑面积为9级，并计算荔枝霜疫霉菌侵染荔枝鲜叶的病情指数(di)均大于60.1，说明本实施例的荔枝是一个高感病品种，非常容易感染荔枝霜疫霉病。
52.实施例2一种检测荔枝抗荔枝霜疫霉病的方法
53.本实施例的一种检测荔枝抗荔枝霜疫霉病的方法，包括以下步骤：
54.(1)、采摘30片桂味荔枝鲜叶(萌发10天，柔软并逐渐转绿)，平铺于培养皿中，每个培养皿中放入3片荔枝鲜叶，加入10ml无菌水；
55.(2)、将荔枝霜疫霉菌孢子悬液稀释至孢子悬液中孢子数为3*104个/ml；
56.(3)、在步骤(1)的荔枝鲜叶中用移液枪接种4ul步骤(2)的荔枝霜疫霉菌孢子悬液；
57.(4)、将接种好的荔枝鲜叶于25℃恒温培养箱培养，昼夜时间12h/12h。
58.(5)、接种第4天，观察统计荔枝鲜叶的病斑面积为3-5级，并计算荔枝霜疫霉菌侵染荔枝鲜叶的病情指数(di)在30～40之间，说明本实施例的荔枝是一低抗性品种，较易感染荔枝霜疫霉病。
59.实施例3一种检测荔枝抗荔枝霜疫霉病的方法
60.本实施例的一种检测荔枝抗荔枝霜疫霉病的方法，包括以下步骤：
61.(1)、采摘妃子笑荔枝鲜叶(萌发12天左右，柔软并逐渐转绿)，平铺于培养皿中，每个培养皿中放入3片荔枝鲜叶，加入10ml无菌水；
62.(2)、将荔枝霜疫霉菌孢子悬液稀释至孢子悬液中孢子数为5*104个/ml；
63.(3)、在步骤(1)的荔枝鲜叶中用移液器接种8ul步骤(2)的霜疫霉菌悬液；
64.(4)、将接种好的荔枝于28℃恒温培养箱培养，昼夜时间12h/12h。
65.(5)、接种第4天，观察统计荔枝的病斑面积为9级，并计算霜疫霉菌侵染荔枝的病情指数(di)均大于60.1，说明本实施例的荔枝是一个高感病品种，非常容易感染荔枝霜疫霉病。
66.试验例1检测荔枝抗荔枝霜疫霉病的最佳材料的筛选
67.本试验例所用荔枝材料为桂味品种不同时期的叶片。分别为：荔枝幼叶(刚萌发叶片，一般为暗红色)、鲜叶(萌发10天左右，柔软并逐渐转绿)以及老叶(已经老熟的鲜叶，叶色深绿)。
68.取以上三种鲜叶各30片，分别平铺于10*10cm培养皿中，一个培养皿中3片鲜叶，每个培养皿中加入10ml无菌水，再用移液枪接种5ul荔枝霜疫霉菌孢子悬液(孢子数为4*104个/ml)，将培养皿置于恒温光照培养箱中，昼夜温度27℃，昼夜时间12h/12h。
69.接种荔枝霜疫霉菌孢子悬液后，从第0天开始直至第4天，连续观察染病表型并拍照。结果见图2的a所示，荔枝幼叶第2天就已经发病严重，几乎占满整个叶片，随后几天没有显著变化。荔枝老叶，在接种病原菌后无论培养时间长短，无明显变化。荔枝鲜叶在接种病原菌后，随着时间的延长，叶片病斑呈现逐渐增多趋势。
70.按照如图1所示的叶片感病分级标准，计算病情指数，根据病情指数di＝∑(病叶数
×
病级数值)/(总叶数
×
最高级数值)
×
100，对三种叶片材料病情指数进行统计分析，结果如图2中的b所示，从图2中的b可知，统计结果与表型观察结果一致。
71.试验例1结果说明：荔枝鲜叶是检测荔枝抗荔枝霜疫霉病的最佳材料。试验例2检测荔枝抗荔枝霜疫霉病的最佳侵染孢子数的筛选
72.不同浓度的荔枝霜疫霉菌孢子悬液对荔枝叶片或果实发病程度强弱和快慢有着重要影响。本试验例对最佳侵染菌液孢子数进行了筛选。
73.试验所用荔枝材料为桂味荔枝鲜叶(成熟10天左右，柔软并已经转绿)。使用荔枝霜疫霉孢子悬液中的孢子数为1*104个/ml、4*104个/ml和1*105个/ml(采用血球计数板进行计数)。
74.选取荔枝鲜叶平铺于培养皿中，一个培养皿中三片鲜叶，每个培养皿中加入10ml无菌水。分别用移液枪接种5ul上述三种不同浓度的荔枝霜疫霉菌孢子悬液于荔枝鲜叶后，把接种好后的培养皿置于恒温光照培养箱中培养。培养条件为昼夜温度27℃，昼夜时间12h/12h。
75.接种荔枝霜疫霉菌孢子悬液后，从第0天开始直至第4天，连续观察荔枝鲜叶感病表型并拍照。结果见图3。
76.如图3中的(a)可见，接种孢子数为1*105个/ml的荔枝霜疫霉菌孢子悬液的鲜叶，从接种后第2天开始，病斑几乎布满整个鲜叶，随后几乎没有显著变化。荔枝叶接种孢子数为1*104个/ml的荔枝霜疫霉菌孢子悬液的鲜叶，随着培养时间的长短，所接种鲜叶无明显发病症状。接种孢子数为4*104个/ml的荔枝霜疫霉菌悬液的鲜叶，随着时间的延长，鲜叶病斑呈现逐渐增多趋势。
77.按照如图1所示的叶片感病分级标准，计算病情指数，根据病情指数di＝∑(病叶数
×
病级数值)/(总叶数
×
最高级数值)
×
100，对三种浓度霜疫霉菌孢子悬液处理的叶片材料病情指数进行统计分析，结果如图3中的b所示，从图3中的b可知，统计结果与表型观察结果一致。
78.本试验例结果说明：使用荔枝霜疫霉菌孢子悬液孢子数为4*104个/ml，检测荔枝鲜叶抗荔枝霜疫霉菌病的效果最好。
79.试验例3荔枝成熟果实抗病和叶片抗病表型的相关性
80.本试验例验证了荔枝成熟果实抗荔枝霜疫霉病和鲜叶抗荔枝霜疫霉病表型之间具有显著相关性。
81.由于荔枝霜疫霉病主要为害荔枝成熟果实，且荔枝果实是荔枝最有经济价值的部分。传统的检测荔枝抗霜疫霉病所用材料为荔枝成熟果实。本发明使用荔枝鲜叶进行荔枝抗霜疫霉病的检测就是为了更好更快的间接确定荔枝果实的抗病情况。因此，首先需要确定的是：荔枝鲜叶抗病和荔枝果实抗病之间是否有相关性。
82.试验所用材料为276份荔枝成熟果实、及276份相应品种的鲜叶。
83.分别对荔枝成熟果实和鲜叶接种荔枝霜疫霉孢子悬液。将荔枝成熟果实置于保鲜盒中，接种孢子悬液的孢子数为1*104个/ml，每个果实接种5ul；将荔枝鲜叶置于培养皿中，接种孢子悬液的孢子数为4*104个/ml，每片鲜叶接种5ul。将保鲜盒和培养皿均置于恒温光照培养箱中培养。培养条件为昼夜温度27℃，昼夜时间12h/12h。
84.培养两天后，按照如图1所示的叶片感病分级标准，计算病情指数，根据病情指数di＝∑(病叶数
×
病级数值)/(总叶数
×
最高级数值)
×
100，统计276份果实和276份鲜叶的病情指数。结果如图4所示。
85.从图4可以看出，荔枝果实病情指数和鲜叶病情指数的核密度和频率分布相似，均呈现偏正态分布(图4中的a和图4中的b)。在对荔枝果实病情指数和鲜叶病情指数进行箱线图比较发现，二者间没有显著差异(图4中的c)。
86.随后对果实和鲜叶病情指数进行了相关性分析。结果表明，二者间呈现线性相关
(图4中的d)，相关系数r＝0.62(p＝2.2e-16)，这表明果实和鲜叶病情指数显著正相关。也说明用荔枝鲜叶抗病表型完全能反应荔枝果实对荔枝霜疫霉病的抗性。
87.以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
88.以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。