一种用于FVII基因多态性及甲基化联合检测的检测试剂盒及其检测方法和应用与流程

一种用于fvii基因多态性及甲基化联合检测的检测试剂盒及其检测方法和应用
技术领域
1.本发明涉及一种用于fvii基因多态性及甲基化联合检测的检测试剂盒及其检测方法和应用，属于基因检测领域。


背景技术：

2.冠心病(coronary heart disease，chd)是由遗传和环境因素共同作用于人体所致的复杂疾病，发病过程与多基因之间和基因-环境之间的相互作用等有关。凝血因子vii(fvii)活性与其多态性和甲基化状态密切相关，通过检测fvii-323ins10位点的基因多态性和甲基化状态可以对冠心病风险进行预测。
3.目前甲基化检测常用方法有甲基化特异性pcr(msp)、亚硫酸氢盐测序pcr(bsp)、甲基化敏感性高分辨率熔解曲线分析(ms-hrm)、荧光定量法，基因芯片法等。其中，亚硫酸氢盐测序pcr(bsp)和基因芯片法，往往存在着操作繁琐，检测周期长，假阳性高等不足之处。甲基化敏感性高分辨率熔解曲线分析(ms-hrm)，特异性偏低，且对仪器设备的要求较高；甲基化特异性pcr(msp)进行特异扩增，其引物设计难以最优化，检测位点有限。因此，需要建立一种简单、快速有效、价格低廉、特异性高的检测fvii基因多态性及甲基化联合检测的方法。


技术实现要素：

4.针对现有技术存在的上述问题，本发明的目的是基于rpa扩增获得一种用于fvii基因多态性及甲基化联合检测的检测试剂盒及其检测方法和应用。
5.重组酶聚合酶扩增(rpa)，被称为是可以替代pcr的核酸检测技术。rpa技术主要依赖于三种酶：能结合单链核酸(寡核苷酸引物)的重组酶、单链dna结合蛋白(ssb)和链置换dna聚合酶。这三种酶的混合物在常温下也有活性，最佳反应温度在37℃左右。重组酶与引物结合形成的蛋白-dna复合物，能在双链dna中寻找同源序列。一旦引物定位了同源序列，就会发生链交换反应形成并启动dna合成，对模板上的目标区域进行指数式扩增。被替换的dna链与ssb结合，防止进一步替换。在这个体系中，由两个相对的引物起始一个合成事件。整个过程进行得非常快，一般可在二十分钟之内获得可检出水平的扩增产物。
6.为实现上述发明目的之一，本发明采用的用于fvii基因多态性及甲基化联合检测的检测试剂盒的技术方案如下：
7.本发明的试剂盒针对fvii启动子的甲基化设计特异性扩增引物和多对测序引物，所述试剂盒包括如下组分：裂解液、蛋白酶k、耐热磁珠、转化液、脱硫试剂、漂洗液、洗脱液、fvii-323ins10扩增试剂、fvii甲基化扩增试剂、扩增试剂(干粉)、fvii甲基化测序引物、fvii-323ins10测序引物、阳性对照。
8.优选地，所述设计特异性引物，如下表所示：
[0009][0010][0011]
优选的，所述fvii甲基化扩增试剂为特异性引物组序列，如序列表seq id no:1～seqid no:2所示；fvii-323ins10扩增试剂为特异性引物组序列如序列表seq id no:3～seqid no:4所示；更优选的，所述的扩增引物均为普通扩增引物。
[0012]
优选的，所述的fvii甲基化测序引物、fvii323ins10测序引物分别如序列表seq id no:5～seq id no:6所示。
[0013]
更优选的，所述的测序引物，为核酸类似物，其骨架为肽键而非磷酸二酯键，肽键骨架连有相应的碱基。该结构具有生物学性质稳定，无论蛋白酶还是核酸酶都不易将其降解。
[0014]
更优选的，所述的测序引物，为琼脂糖凝胶颗粒与氨基标记的pna序列的结合物，该结合物与dna结合较dna/dna的结合更为稳定且特异性高于dna/dna的捕获，且不受盐离子浓度的影响。可既充当测序引物又作为捕获探针，与扩增的产物结合以后，经过简单洗涤即可直接用于测序反应。
[0015]
更优选的，所述的测序引物，其制备过程包括将合成氨基标记的测序引物在结合
液的情况下与羧基修饰素琼脂糖凝胶微颗粒混合，洗涤去除游离的测序引物，在保存液中2-8℃保存，该方法可得到中性的肽核酸，无多肽核酸与带负电的dna之间的静电斥力。
[0016]
优选的，fvii甲基化测序引物对应的测序区域为fvii-m待检序列，如序列表seq id no:7所示；fvii-323ins10测序引物对应的测序区域为fvii-323ins10待检序列，如序列表seq id no:8所示。
[0017]
优选的，fvii-m待检序列对应fvii-m分配指令如序列表seq id no:9所示；fvii-323ins10待检序列对应fvii-323ins10分配指令如序列表seq id no:10所示。
[0018]
优选的，所述的扩增缓冲液包括：扩增缓冲液，18mm醋酸镁。
[0019]
优选的，所述的fvii甲基化扩增试剂包括：fvii-m前引物，fvii-m后引物，dntps、链置换dna聚合酶，单链dna结合蛋白，结合单链核酸的重组酶，海藻糖；在恒温条件下进行转化后dna fvii扩增。
[0020]
优选的，所述的fvii-323ins10扩增试剂包括：fvii-323ins10前引物，fvii-323ins10后引物，dntps、链置换dna聚合酶，单链dna结合蛋白，结合单链核酸的重组酶，海藻糖；在恒温条件下进行fvii扩增。
[0021]
更优选的，扩增试剂(干粉)各组分浓度分别为：fvii前引物(0.4um)，fvii后引物(0.4um)，dntps(3mm)、链置换dna聚合酶(1.2ng/μl)，单链dna结合蛋白(3.2ng/μl)，结合单链核酸的重组酶(4.8ng/μl)，海藻糖(0.2％)；
[0022]
优选的，所述的阳性对照，包括浓度为20ng/ul的fvii 2％甲基化、fvii-323ins10杂合子基因组dna。阳性对照对待测样本的甲基化状态判定提供参考，同时对反应液的有效性进行质控。
[0023]
优选的，所述的裂解液，包括盐酸胍6-8m；(w/v)1-3％ctab；0.04-0.1m tris-hcl(ph8.0)；0.04-0.06m edta(ph8.0)；(v/v)3-7％吐温-20；(v/v)3-7％tritonx-100。
[0024]
更优选的，所述的裂解液，盐酸胍7m；(w/v)2％ctab；0.05m tris-hcl(ph8.0)；0.05medta(ph8.0)；(v/v)5％吐温-20；(v/v)5％tritonx-100。
[0025]
优选的，所述的转化液，包括35-82％(w/w)nh4hso3、18-42％(w/w)尿素、6-15％nahso3、0.1-0.6％氢醌；更优选的，转化液各组分为：70％(w/w)nh4hso3、30％(w/w)尿素、12％nahso3、0.5％氢醌。
[0026]
本发明还公开了一种采用上述试剂盒的fvii甲基化检测方法，所述检测方法包括以下步骤：
[0027]
a.裂解液进行样本裂解；
[0028]
b.加入磁珠和乙醇进行结合；
[0029]
c.一部分吸磁，取上清，加入转化液进行20min转化(另一部分直接漂洗)；
[0030]
d.漂洗后，加入脱硫试剂进行脱硫处理；
[0031]
e.漂洗后直接洗脱，获得转化后基因组dna。
[0032]
f.将所述扩增反应液与5ul待测基因组dna，采用rpa进行扩增；
[0033]
g.将10ul反应产物与3ul测序引物分别进行结合；
[0034]
h.焦磷酸测序；
[0035]
i.确定fvii启动子的甲基化状态。
[0036]
优选的，所述的反应体积为25ul，扩增条件为：42℃20min。
[0037]
本发明还公开了一种用于fvii基因多态性及甲基化联合检测的试剂盒及方法的应用，所述检测试剂盒对fvii进行检测，以从基因层面指导替莫唑胺敏感性。
[0038]
与现有技术相比，本发明采用耐高温磁珠将提取转化合并成一步，将提取转换由原来的数小时缩短成45min。在通过重组酶聚合酶扩增20分钟或者扩增反应液。
[0039]
本发明rpa扩增和优化焦磷酸测序技术为组合对替莫唑胺敏感性相关的fvii甲基化进行检测，通过rpa恒温扩增fvii，快速、有效地在恒定温度下产生大量扩增产物。通过直接与羧基修饰素结合的氨基标记单链dna特异捕获单链dna，洗涤后加入测序引物和测序原料，进行焦磷酸测序，简化了提取、转化、扩增、测序处理的流程和时间；试剂盒可检测fvii甲基化状态，为临床替莫唑胺个性化用药给出基因角度的建议。
附图说明
[0040]
图1是本发明提供的fvii实际甲基化率100％焦磷酸测序图；
[0041]
图2是本发明提供的fvii实际甲基化率5％焦磷酸测序图；
[0042]
图3是本发明提供的fvii实际甲基化率0％焦磷酸测序图；
[0043]
图4是本发明提供的fvii
‑‑
323ins10插入型测序图；
[0044]
图5是本发明提供的fvii
‑‑
323ins10缺失型测序图；
[0045]
图6是本发明提供的fvii
‑‑
323ins10杂合型测序图。
具体实施方式
[0046]
下面结合实施例对本发明提供的用于fvii基因多态性及甲基化联合检测的检测试剂盒及其检测方法和应用作进一步详细、完整地说明。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
[0047]
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的实验材料如无特殊说明，均为市场购买得到。
[0048]
实施例1、试剂盒的制备
[0049]
本发明的试剂盒针对fvii设计了特异性扩增引物和测序引物，用于恒温扩增和焦磷酸测序检测。基于重组酶聚合酶扩增技术设计引物是本发明的关键之一，该技术的引物设计无法辅助软件进行，只能依靠人工设计。为保证扩增速度及检测灵敏度，引物长度应控制在30～35bp，引物设计过短易增加非特异性扩增导致假阳性，若设计过长易导致无法进行扩增。fvii序列以genebank内的公开序列为准。
[0050]
(一)本实施例的引物序列如下：
[0051]
[0052][0053]
(二)本实施例的检测试剂盒包括如下组分：
[0054][0055]
(三)本实施例的检测试剂盒扩增缓冲液单人份配置体系如下：
[0056][0057][0058]
(四)本实施例的检测试剂盒扩增试剂单人份配置体系如下：
[0059]
fvii-323ins10扩增试剂各组分浓度分别为：fvii-323ins10前引物(0.4um)，fvii-323ins10后引物(0.4um)，dntps(3mm)、链置换dna聚合酶(1.2ng/μl)，单链dna结合蛋白(3.2ng/μl)，结合单链核酸的重组酶(4.8ng/μl)，海藻糖(0.2％)；
[0060]
fvii甲基化扩增试剂各组分浓度分别为：fvii甲基化前引物(0.4um)，fvii甲基化后引物(0.4um)，dntps(3mm)、链置换dna聚合酶(1.2ng/μl)，单链dna结合蛋白(3.2ng/μl)，结合单链核酸的重组酶(4.8ng/μl)，海藻糖(0.2％)；配置完成后144.1ul/管进行分装、冻干。
[0061]
(五)本实施例的检测试剂盒测序引物制备过程如下：
[0062]
(1)mes溶液配置
[0063]
①
100mmmes,ph4.8(100ml)：
[0064]
②
2.13gmes(2-[n-morpholino]ethanesulfonicacid,mw213.25).
[0065]
③
ph4.8
[0066]
(2)tt buffer(50ml)
[0067]
①
12.5ml of1mtrisbufferph8
[0068]
②
[0069]
(3)封闭液
[0070][0071]
1)取500ul磁珠，吸磁1min，去上清；
[0072]
2)取1000ml 100mes溶液洗涤吸磁1min，去上清，重复洗涤2次；
[0073]
3)取10mg/ml eds和10mg/ml nhs各500ul，加入捕获引物10ul。
[0074]
4)25℃杂家30min
[0075]
5)取1000ml封闭液混合均匀，吸磁1min，去上清；
[0076]
6)取1000ml tt buffer混合均匀，吸磁1min，去上清；重复洗涤3次；
[0077]
7)加入1ml te缓冲液溶解。
[0078]
实施例2、fvii基因焦磷酸检测过程
[0079]
本发明中采用的仪器如下：pcr扩增仪：abi 2720 pcr仪；
[0080]
焦磷酸测序仪：武汉菲思特生物科技有限公司。
[0081]
(一)dna提取转化(样本制备间)：
[0082]
1)取无菌的1.5ml ep管，加入适量250ml全血，依次加入20μl蛋白酶k、500μl裂解液，涡旋振荡10s，65℃水浴15min，期间振荡混匀2-3次；
[0083]
2)加入500μl无水乙醇，涡旋振荡10s，短暂离心5s，加入20ul磁珠，将裂解混合液分成两等份(一份直接进入步骤9)，一份进行转化)；
[0084]
3)将离心管置于磁力架上2min，待磁珠完全吸附时用移液器小心去除液体；
[0085]
4)加入120ul亚硫酸盐转化液，混匀，70℃加热20min；
[0086]
5)转化完成后，将离心管置于磁力架上2min，待磁珠完全吸附时用移液器小心去除液体；
[0087]
6)加入1ml漂洗液，涡旋混匀10s；
[0088]
7)将离心管置于磁力架上1min，待磁珠完全吸附时用移液器小心去除液体；
[0089]
8)加入1ml脱硫缓冲液，涡旋混匀10s，室温放置20min，期间颠倒混匀2-3次让磁珠悬浮；
[0090]
9)将离心管置于磁力架上1min，待磁珠完全吸附时用移液器小心去除液体；
[0091]
10)加入1ml漂洗液，涡旋混匀10s；
[0092]
11)将离心管置于磁力架上1min，待磁珠完全吸附时用移液器小心去除液体；
[0093]
12)重复步骤11-12，再次漂洗一次；
[0094]
13)短暂离心将残余液体收集至管底，再次吸磁尽量去尽液体；
[0095]
14)将离心管置于磁力架上，室温晾干3-5min；
[0096]
15)加入50ul洗脱缓冲液，用移液器吹吸使磁珠重新悬浮，65℃孵育5min，期间每2min轻轻晃动使核酸充分洗脱；
[0097]
16)将离心管放置于磁力架上静置2min，待磁珠完全吸附时小心将核酸溶液转移至新的离心管中，并于-20℃保存。
[0098]
(二)试剂准备(试剂准备室)
[0099]
提前将试剂取出，并将扩增缓冲液涡旋振荡15秒，低速离心待用。直接向扩增试剂(冻干)中加入440ul扩增缓冲液，涡旋振荡15秒充分混匀。确定反应数n，n＝待检样本数(n) 质控品数(1) 空白对照。建议每次pcr实验同时进行阳性对照、空白对照分析。然后将反应液按20μl/管分装至pcr反应管中。
[0100]
(三)加样检测(样本制备间)
[0101]
将样本dna、阳性对照和空白对照按5μl加样量加入到pcr反应管中，盖紧管盖，低速离心15秒将管壁上的液体全部甩至管底，然后立即进行pcr扩增反应。
[0102]
(四)pcr扩增(扩增间)
[0103]
采用pcr仪进行扩增，反应体系为25μl，扩增条件：
[0104]
扩增温度时间循环数42℃20min1
[0105]
(五)焦磷酸测序
[0106]
1)在pcr反应管中加入结合液40μl和琼脂糖凝胶颗粒与dna序列的结合物3ul，再
向其中加入pcr产物10μl，置于台式振荡器上，1100rpm振荡10min，使测序引物和单链pcr产物充分结合；
[0107]
2)7,000
×
g离心1min，弃上清；
[0108]
3)向ep管中加入150ul洗涤缓冲液，7000g离心1min，弃上清；
[0109]
4)测序管中分别加入3ul测序酶和3ul测序底物；
[0110]
5)取一个dntp排管，自圆滑一端向平端依次加入20μldatpαs、20μldttp、20μldgtp、20μldctp；将排管底部轻轻磕碰桌面，使得碱基平铺在排管底部；
[0111]
6)根据仪器使用说明进行测序。
[0112]
(六)结果判读
[0113]
1)有效性判定：
[0114]
本试剂盒空白对照品的不通过，阳性对照品的检出结果为fvii阳性。
[0115]
2)结果判定标准
[0116]
fvii甲基化dna测序峰值图，如图1～3所示：
[0117]
t的频率≥99％，c的频率≦1％，即为阴性；
[0118]
c的频率≧1％，即为阳性；
[0119]
fvii-323ins10不同基因型的测序结果如图4～6所示。
[0120]
实施例3、检测灵敏度性
[0121]
由于fvii前引物3’最后一个碱基与cpg岛的g碱基互补，该处碱基采用了c碱基，让该位点发生甲基化的序列获得优势扩增。如此让甲基化的灵敏度有所提升，不限于测序检测显示的2％或其他数值。
[0122]
104基因组dna背景下，采用100％、50％、10％、1％、0.5％、0.2％、0.1％、0.05％、0％甲基化率样本进行检测，得出该焦磷酸检测试剂盒的灵敏度为0.1％。
[0123][0124]
最后有必要在此说明的是：以上实施例只用于对本发明的技术方案作进一步详细
地说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，本领域的技术人员根据本发明的上述内容作出的一些非本质的改进和调整均属于本发明的保护范围。
[0125]
[0126]
[0127]
[0128]
[0129]