一株唐菖蒲伯克霍尔德菌MEJ03及其应用的制作方法

一株唐菖蒲伯克霍尔德菌mej03及其应用
技术领域
1.本技术涉及微生物技术领域，尤其涉及一株唐菖蒲伯克霍尔德菌mej03及其应用。


背景技术：

2.微生物降解修复土壤是一种快速、有效且经济的土壤修复手段。目前，已经有paes 降解菌株已经从各类环境中分离得到。主要细菌包括：细菌丛毛单胞菌、假单胞菌、鞘氨醇单胞菌、不动杆菌、节细菌、戈登氏菌、红球菌、芽孢杆菌等属。也有一些真菌paes 降解菌被分离鉴定到，例如，真菌胶红酵母、黄孢原毛平革菌和尖孢镰刀菌等属。
3.邻苯二甲酸酯(phthalic acid esters，paes)是包含邻苯二甲酸二甲酯(dmp)、邻苯二甲酸二丁酯(dbp)和邻苯二甲酸二(2-乙基己)酯(dehp)等30多种化合物的一类物质。作为增塑剂，它们普遍应用于化妆品、清洁产品、食品包装材料、医用血袋和胶管、个人护理用品(如指甲油、头发喷雾剂、香皂和洗发液)及玩具等数百种产品中。由于农用地膜、棚膜、工业废气废水的排放，以及常年大量施用化肥，使得全国各地农业土壤的 paes化合物均有超标现象，含量位于0.05～20.0mg/kg之间。paes是一种内分泌刺激物，具有致突变、致癌和致畸性，在自然环境中难以降解，危害生态环境，同时在人体积累后可以干扰内分泌，对人类健康也具有潜在风险。
4.伯克霍尔德氏菌属(burkholderia)的一些细菌具有生物防治、促进植物生长和生物修复等功能。伯克霍尔德菌能产生多种具有抗菌活性的代谢产物如铁载体(pyochenlin， pyoverdine)、吩嗪、硝吡咯菌素、苯基吡咯、单萜生物碱、cepaciamide a、cepacin a等。现已应用于生物防治，分解有毒物质等领域，现有唐菖蒲伯克霍尔德氏菌没有发现具有降解邻苯二甲酸酯的效果。


技术实现要素：

5.本技术提供了一株唐菖蒲伯克霍尔德菌mej03及其应用，唐菖蒲伯克霍尔德菌mej03的可以高效降解邻苯二甲酸酯dehp且解磷促进植物生长。
6.第一方面，本技术提供了一株唐菖蒲伯克霍尔德菌(burkholderia gladioli)mej03，所述唐菖蒲伯克霍尔德菌mej03已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号：cctcc no:m 20211229,保藏日期：2021年09月28日。
7.可选的，所述唐菖蒲伯克霍尔德菌mej03的基因序列如seq id no：1所示。
8.第二方面，本技术提供了一种含唐菖蒲伯克霍尔德菌(burkholderia gladioli)mej03 的微生物菌剂，所述微生物菌剂包括：保藏编号为cctcc no:m20211229的唐菖蒲伯克霍尔德菌mej03和/或所述唐菖蒲伯克霍尔德菌mej03的培养物和/或所述唐菖蒲伯克霍尔德菌mej03 的加工物。
9.第三方面，本技术提供了第一方面所述的唐菖蒲伯克霍尔德菌mej03，或第二方面所述的微生物菌剂在降解邻苯二甲酸酯中的应用。
10.可选的，所述应用包括将所述唐菖蒲伯克霍尔德菌mej03或所述微生物菌剂用于
降解邻苯二甲酸二(2-乙基己)酯中。
11.第四方面，本技术提供了第一方面所述的唐菖蒲伯克霍尔德菌mej03，或第二方面所述的微生物菌剂在溶解难溶性的磷酸盐和/或磷酸钙和/或磷矿粉中的应用。
12.第五方面，本技术提供了第一方面所述的唐菖蒲伯克霍尔德菌mej03，或第二方面所述的微生物菌剂在植株生长中的应用。
13.可选的，所述植株生长包括：提高植株高度，和/或提高植株重量，和/或提高果实重量。
14.第六方面，本技术提供了一种降解邻苯二甲酸酯的方法，所述方法包括：用第一方面所述的唐菖蒲伯克霍尔德菌mej03，或用第二方面所述的微生物菌剂对邻苯二甲酸酯进行降解。
15.第七方面，本技术提供了一种溶解难溶性的磷酸盐和/或磷酸钙和/或磷矿粉的方法，所述方法包括：用第一方面所述的唐菖蒲伯克霍尔德菌mej03，或用第二方面所述的微生物菌剂对难溶性的磷酸盐和/或磷酸钙和/或磷矿粉进行溶解。
16.本技术实施例提供的上述技术方案与现有技术相比具有如下优点：
17.本技术实施例提供的一株唐菖蒲伯克霍尔德菌(burkholderia gladioli)mej03，所述唐菖蒲伯克霍尔德菌mej03已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号：cctcc no:m 20211229,保藏日期：2021年09月28日。所述唐菖蒲伯克霍尔德菌mej03可以作为土壤污染修复菌剂，可以高效降解邻苯二甲酸酯，尤其是邻苯二甲酸二(2-乙基己)酯，具有解磷活性，可以对难溶性磷酸盐磷酸钙和磷矿粉进行溶解，同时还可以促进植物生长。
附图说明
18.此处的附图被并入说明书中并构成本说明书的一部分，示出了符合本发明的实施例，并与说明书一起用于解释本发明的原理。
19.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单的介绍，显而易见地，对于本领域普通技术人员而言，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
20.图1为本技术实施例1提供的菌株mej03的菌落形态；
21.图2为本技术的唐菖蒲伯克霍尔德菌mej03对邻苯二甲酸酯的降解率；
22.图3为本技术唐菖蒲伯克霍尔德菌mej03构建的系统发育树；
23.图4不同温度和不同起始ph对本技术唐菖蒲伯克霍尔德菌mej03降解dehp的结果图；
24.图5为本技术唐菖蒲伯克霍尔德菌mej03降解dehp的结果图；
25.图6为本技术唐菖蒲伯克霍尔德菌mej03对磷酸钙和磷矿粉的解磷活性图。
具体实施方式
26.为使本技术实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本技术实施例中的附图，对本技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本技术的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本技术保护的范围。
27.唐菖蒲伯克霍尔德菌(burkholderia gladioli)mej03的保藏编号为：cctcc no: m20211229；分类命名为：唐菖蒲伯克霍尔德菌(burkholderia gladioli)mej03；已保藏于中国典型培养物保藏中心，中国.武汉.武汉大学,邮编为430072，保藏编号：cctcc no: m 20211229,保藏日期：2021年09月28日。
28.实施例1唐菖蒲伯克霍尔德菌(burkholderia gladioli)菌株mej03的分离和鉴定
29.培养基的配置如下：lb培养基：酵母提取物5.0g，胰蛋白胨10.0g，nacl 10.0g，加去离子水至1.0l，121℃、20min，ph 7.0-7.2。msm培养基：kh2po
4 0.5 g，k2hpo
4 0.5 g，cacl
2 0.01 g，fe2(so4)
·
3h2o 0.001 g，(nh4)2so
4 1.0g，mgso4·
7h2o 0.2g，蒸馏水定容至1000ml，ph7.0-7.2，121℃灭菌30min。
30.dehp降解菌的生物富集：将称量5g的稻麦轮作区田间根际土壤放入装有50ml的以500mg/l dehp为唯一碳源的msm培养基的250ml锥形瓶中，28℃，180rpm培养5 天。
31.初筛：上述培养后的土壤溶液经过在lb固体培养基上梯度稀释涂布，28℃培养5天后，从平板中挑选菌落形态、颜色等有明显不同的单菌落。经过多次划线得到纯化的单菌落进一步复筛。
32.复筛：将上述单菌落分别挑选至lb培养基中，28℃过夜活化后，以2％接种量接种至100ml含有500mg/l dehp的msm y培养基中，28℃培养5天后，测定菌株的dehp 降解率。
33.通过上述筛选，获得1株能高效降解dehp的菌株，标号为mej03即本专利菌株。菌株的再lb固体培养基上培养5天后的菌落形态如图1所示。菌落呈表面凸起褶皱，边缘不规整。此外，发现该菌株可以在含100mg/l cd
2
的lb培养基中生长。
34.本试验获得的唐菖蒲伯克霍尔德菌mej03菌株在不同培养基上的基本特征如下：菌落呈表面凸起褶皱，边缘不规整，菌落呈淡黄色。
35.进行生理生化特性分析，分析结果为：菌株mej03的碳源利用及生理生化特征与唐菖蒲伯克霍尔德菌(burkholderia gladioli)吻合。
36.16srdna分子鉴定：使用通用引物27f和1492r对mej03菌液进行扩增。pcr反应扩增体系为50μl：上下游引物各1μl，模板1μl，easy taq dna polymerase(5u/μl)1 μl，10
×
easy taq buffer 5μl，dntp(2.5mm)4μl，ddh2o 37μl。95℃ 10min；94℃ 30s， 57℃45 s，72℃ 1min45 s，30个循环；72℃ 10min。将pcr扩增产物连上pclone007 载体，经pcr阳性克隆检测后，送至武汉擎科生物科技公司进行序列分析，测序结果(seqid no：1)在ncbi上进行blast在线比对，并采用mega6.0软件，构建系统进化树，如图3，结合系统进化树，鉴定mej03为唐菖蒲伯克霍尔德菌(burkholderia gladioli)。
37.综合，根据16s rdna序列分析结果及形态、生理生化特征，将菌株mej03鉴定为唐菖蒲伯克霍尔德菌。
38.实施例2不同温度和不同起始ph对mej03降解dehp的影响
39.挑取mej03单菌落，28℃过夜活化后，以2％接种量接种至100ml含有500mg/ldehp的msm y培养基中，msm y培养基包括：在msm培养基中加1％(w/v)酵母提取物。
40.在不同温度和起始ph条件下，28℃培养5天后，使用二氯甲烷萃取，旋蒸后甲醇溶解样品，最后使用高效液相色谱分别测定dehp的降解率，结果如图4所示，mej03降解 500mg/l dehp在24℃-36℃和起始ph5.0-9.0均具有较高的降解率(》50％)，最适降解温度为28℃，最适降解起始ph为7.0。
41.经试验，发现该菌株对500mg/l邻苯二甲酸酯的降解率如图2所示，mej03对500 mg/ldmp、dbp和dehp的降解率分别达到了35.79％，79.4％和92.35％。
42.实施例3最适降解条件下mej03对dehp降解动力学
43.挑取mej03单菌落，28℃过夜活化后，以2％接种量接种至100ml含有500mg/l dehp 的msm y培养基中。在最适降解条件下，mej03对500mg/l dehp降解动力学如图5所示，随着培养时间的增加，mej03对500mg/l dehp降解率不断增加，培养4天后mej03 对500mg/ldehp的降解率即可达到94％以上。
44.实施例4 mej03对难溶性磷酸盐磷酸钙和磷矿粉解磷效果
45.挑取mej03单菌落，28℃过夜活化后，以2％接种量接种至pikovskaya液体培养基和磷矿粉培养基中。于28℃、150rpm条件下震荡培养。24h后取4ml样品，8000rpm离心10min，采用国标gb 11893-89-钼酸铵分光光度法测定上清液中可溶性磷含量。以不接种mej03菌液的培养基作为空白对照。每个样品重复三次。如图6所示，mej03对ca3(po4)2和磷矿粉均显示出解磷活性，pikovskaya液体培养基和磷矿粉培养基中最大可溶性磷酸盐含量分别达到了382.35mg/l和116.87mg/l。表明了mej03是一株高效的溶磷菌。
46.培养基的配置如下：
47.pikovskaya液体培养基：10.0g葡萄糖，5.0g ca3(po4)2，0.5g(nh4)2so4，0.2g nacl， 0.1g mgso4
·
7h2o，0.2g kcl，0.5g酵母粉，0.002g mnso4
·
h2o,0.002g feso4
·
7h2o,ph7.0
–
7.4。
48.磷矿粉培养基：磷矿粉替换pikovskaya液体培养基中的ca3(po4)2。
49.实施例5 mej03菌剂对番茄植株的促生作用和降解土壤中dehp
50.挑取mej03单菌落，28℃过夜活化后，以2％接种量接种至500ml的lb培养基中。8000 rpm，10min离心收集菌体，最后使用500ml无菌水重悬菌液。盆栽实验地点选择在湖北荆门某地，花盆直径23厘米，灌土深度约18.0cm，装载约6.0kg的20mg/kg的dehp污染的土壤。每盆mej03施用达到～1.0
×
108cfu/g。施用菌剂后，使用清水完全浸润土壤。一周后，每盆种植3颗发芽的番茄种子。每盆施用肥料(n-p2o
5-k2o，15-5-20)1.0g。以不施加菌剂的盆栽作为对照。每个处理组设置4个重复。待番茄成熟后，测定番茄植株高度和重量，果实重量和dehp含量。如表1所示。
51.表1 mej03菌剂对番茄植株的促生作用和降解土壤中dehp。
[0052][0053]
[0054]
由表1可知，添加mej03菌剂后，植株重量增加了23.2％，植株高度增加了15.4％，果实重量增加了16.3％，表明了mej03菌剂对番茄植株具有明显的促生增产作用。此外，添加 mej03菌剂，还可以明显降低dehp在番茄果实部分的含量。
[0055]
本技术的唐菖蒲伯克霍尔德菌mej03对邻苯二甲酸酯(dmp，dbp和dehp)具有降解效果，可在4天内将500mg/ldehp降解率达到94％以上；本技术的唐菖蒲伯克霍尔德菌 mej03在24℃-36℃和起始ph5.0-9.0对dehp均具有较高的降解率。最适温度为28℃，最适起始ph为7.0；本技术的唐菖蒲伯克霍尔德菌mej03还是一株高效的溶磷菌，对难溶性磷酸盐磷酸钙和磷矿粉均具有解磷活性，最大可溶性磷酸盐含量分别达到了382.35mg/l和116.87 mg/l；在番茄盆栽实验中，灌施mej03后，植株重量增加了23.2％，植株高度增加了15.4％，果实重量增加了16.3％，还可以明显降低dehp在番茄果实部分的含量。
[0056]
综上，本技术的唐菖蒲伯克霍尔德菌mej03既可以降解dehp达到消减有毒物质向植株特别是果实中富集，又可以解磷促生增产，显示出该菌具有良好的应用前景。
[0057]
需要说明的是，在本文中，诸如“第一”和“第二”等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者任何其他变体意在涵盖非排他性地包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个
……”
限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同要素。
[0058]
以上所述仅是本发明的具体实施方式，使本领域技术人员能够理解或实现本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其他实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所申请的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
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[0060]