一种检测苯丙胺类毒品的分子印迹型SPR传感器的制备方法

一种检测苯丙胺类毒品的分子印迹型spr传感器的制备方法
技术领域
1.本发明涉及苯丙胺类毒品技术领域，具体为一种检测苯丙胺类毒品的分子印迹型spr传感器的制备方法。


背景技术：

2.苯丙胺类兴奋剂(ats)源自β-苯乙胺，是一类广泛滥用的非法合成药物，其中最著名的物质是苯丙胺(a)、甲基苯丙胺(ma或“冰”)，3,4-亚甲二氧基苯丙胺(mda)、3,4-亚甲二氧基甲基苯丙胺(mdma或“摇头丸”)和其他精神兴奋剂。
3.目前，可以用于ats定量测定的技术包括薄层色谱、色谱-质谱联用 (gs-ms、hplc-ms)、拉曼光谱、傅里叶变换红外(ftir)光谱、毛细管电泳(ce)、核磁共振(nmr)和免疫分析等技术。
4.表面等离子体共振(spr)传感器通过测量金属膜表面的折射率变化来监测芯片上分子间的相互作用，具有样品用量小、背景干扰低、分辨率高、无需标记和实时监测等特点，已广泛应用于药学诊断、食品科学和环境监测中。分子印迹聚合物(mips)的出现为丰富spr传感器的识别元件奠定了良好的基础。与天然分子识别产物(即抗体、适配体)相比，mips具有低成本、高耐久性、稳定性、可再生性和选择性。此外，通过选择合适的聚合方法，可以在spr芯片表面制备厚度可控的mips薄膜，然而这些方法多采用操作繁琐、分散性差的沉淀聚合法合成mips，无法在spr传感器表面形成均匀有效的敏感膜，大大限制了传感器的检测稳定性、重现性和灵敏度。


技术实现要素：

5.(一)解决的技术问题
6.针对现有技术的不足，本发明提供一种检测苯丙胺类毒品的分子印迹型 spr传感器的制备方法，采用电化学-spr联用技术，通过电化学聚合方法，一步实现聚合物在芯片表面原位印迹的修饰工作，聚合程度通过spr信号调节，大大简化了实验步骤，形成的聚合物薄膜均匀稳定、厚度可控；采用廉价易得的多巴胺作为聚合单体，聚合条件温和，降低了制作成本，扩大了该传感器的实际应用；同时多巴胺具有较多的氨基和羟基基团，识别位点丰富，有效提高了传感器的检测灵敏度和选择性，采用的spr系统设备简单、无需标记，检测灵敏。
7.(二)技术方案
8.为实现上述简化实验步骤、降低检测成本、提高检测灵敏度和选择性的目的，本发明提供如下技术方案：
9.一种检测苯丙胺类毒品的分子印迹型spr传感器的制备方法，包括以下步骤：
10.s1、实验药品的准备
11.实验所需药品有盖玻片(18
×
18mm)、(
±
)3、4-亚甲二氧基苯丙胺(mda)、 (
±
)3、4-亚甲二氧基甲基苯丙胺(mdma)、(
±
)-甲基苯丙胺(ma)、氯胺酮盐酸盐、吗啡、3,4-亚甲二
氧基苯乙胺盐酸盐(mdea)(化学纯度，》95％)、盐酸多巴胺(da)、蔗糖、甘露醇和抗坏血酸(aa)。
12.s2、spr芯片的制备与组装
13.盖玻片经过充分清洗干燥后使用atc orion连续溅射系统沉积一层5nm 的铬和50nm的金，制成spr芯片；将spr芯片分别在丙酮、乙醇和新鲜食人鱼溶液中浸泡3min，用mill-q水充分洗涤并在氮气下干燥；通过香柏油的黏附作用将spr芯片安装在spr传感系统的棱镜上(注意！芯片和棱镜之间不要有气泡)；当芯片和棱镜都安装在spr仪器上后，固定样品池。
14.s3、spr芯片上mips纳米膜的电化学聚合及表征
15.在以5mm da为功能单体、5mm mdea为模板分子的0.1mol/l pbs中，在
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0.5～0.5v扫描范围内进行循环伏安扫描，合成mips纳米膜，在记录电化学信号的同时记录spr共振角随聚合过程的变化，用于评估聚合程度，然后通过乙醇和醋酸混合溶液(体积比为9：1)洗脱模板分子；为观察spr芯片表面真实的修饰状态，分别用扫描电子显微镜(sem)、原子力显微镜(afm)和水接触角(wca)对裸金膜、mips纳米膜和nips纳米膜修饰的spr芯片形貌进行表征。
16.s4、实验参数优化
17.为获得分子印迹型spr传感器的最佳分析性能，对影响spr响应的主要参数：功能单体的种类、预聚合时间、电化学聚合的扫描圈数、洗脱时间和吸附时间进行优化。
18.s5、分子印迹型spr传感器检测ats中的mda和mdma
19.在检测目标物之前，在mips修饰的spr芯片上加入1ml超纯水，记录共振角(θ1)；然后将100μl溶解在甲醇溶液中不同浓度的mda或mdma滴到 spr芯片上，室温下孵育30min；随后用超纯水反复清洗spr芯片表面，并在 1ml超纯水中记录共振角(θ2)；孵育前后的角度位移变化(δθ＝θ
2-θ1) 即为由mips纳米膜吸附目标物引起的真实角度变化；最后用洗脱液处理芯片表面，以供下一步使用。
20.s6、分子印迹型spr传感器的选择性测试
21.通过测试分子印迹型spr传感器对其它毒品分子(甲基苯丙胺、吗啡、氯胺酮)以及药片辅料(蔗糖、甘露醇、维生素c)等干扰物质对spr共振角度的影响，与检测mda和mdma的信号进行对比，评估该传感器的选择性能，其中毒品分子的浓度与mda和mdma相同，药片辅料的浓度是mda和mdma浓度的5倍；非印迹型spr传感器同样进行以上测试，用于排除非特异性吸附的影响。
22.s7、分子印迹型spr传感器的稳定性和重现性测试
23.通过测试由五个相同制备条件的spr芯片和同一个spr芯片经过5次洗脱重建的分子印迹型spr传感器对含有1μmol/l mda样品的spr响应，评估该传感器的重现性；通过测试不同存储时间下分子印迹型spr传感器对含有1μmol/l mda样品的spr响应评估该传感器检测信号的稳定性。
24.s8、分子印迹型spr传感器在实际样品中的检测
25.选取10倍稀释的人血清蛋白样本和健康成人尿液样本，分别加入50μm、 100μm和500μm的mdma，制得含有ats毒品的实际血清样本和尿液样本，进行加标回收实验，通过测量上述样品的spr响应评估该传感器的实际应用能力。
26.优选的，所述步骤s1中，超纯水(≥18mω/cm)，na2hpo4·
3h2o、nah2po4、 kcl、盐酸、硫酸、过氧化氢、甲醇、乙醇、乙酸等，这些药品均为分析级，使用时无需进一步纯化。
27.优选的，所述步骤s2中，盖玻片在使用前需要浸泡在食人鱼溶液中并在 50℃下加热一小时，以消除所有可能的污染；在沉积金膜前需要先抽真空，然后分别通入氮气和氩气，氮气用于保护喷涂室不被污染，氩气用于产生等离子体来溅射靶材。
28.优选的，所述步骤s3中，在制备分子印迹聚合物薄膜时，使用spr联用系统，在记录电化学信号的同时记录spr共振角随聚合过程的变化，有效控制聚合膜厚度；同时作为对照，在不加模板分子的条件下采用相同的方法制备非印迹聚合物(nips)纳米膜。
29.优选的，所述步骤s3中，扫描电子显微镜由phenomprox桌面扫描电镜进行；afm成像是使用商业氮化硅针尖在dimension icon仪器上完成的；wca 是在光学接触角测量仪器上将2μl纯水滴到spr芯片表面记录接触角完成的，其中每个样品在不同位置至少采集5个数据点。
30.优选的，所述步骤s4中，传感系统中功能单体的种类为多巴胺、预聚合时间4h、电化学聚合的扫描圈数15圈、洗脱时间为15分钟和吸附时间为30 分钟为传感性能最佳的实验条件。
31.优选的，所述步骤s5～s8中，该传感器检测mda和mdma的线性范围均为0.1um～1mm，检测限分别为57nm和59nm；传感器对苯丙胺类毒品mda和 mdma具有较好的选择性，对其它毒品和片剂辅料具有较好的抗干扰能力；该制备方法具有较好的稳定性和重现性，在实际样品检测中具有较好的实用性。
32.(三)有益效果
33.与现有技术相比，本发明提供的检测苯丙胺类毒品的分子印迹型spr传感器的制备方法，具备以下有益效果：
34.1、该检测苯丙胺类毒品的分子印迹型spr传感器的制备方法，通过电化学-spr联用技术，采用电化学聚合方法，一步实现聚合物在芯片表面原位印迹的修饰工作，聚合程度通过spr信号调节，大大简化了实验步骤，形成的聚合物薄膜均匀稳定、厚度可控。
35.2、该检测苯丙胺类毒品的分子印迹型spr传感器的制备方法，采用廉价易得的多巴胺作为聚合单体，聚合条件温和，在一定程度上降低了制作成本，扩大了该传感器的实际应用。
36.3、该检测苯丙胺类毒品的分子印迹型spr传感器的制备方法，功能单体多巴胺具有较多的氨基和羟基基团，能与目标物形成丰富的识别位点，有效提高了传感器的检测灵敏度和选择性，具有良好的应用潜力。
37.4、该检测苯丙胺类毒品的分子印迹型spr传感器的制备方法，采用的spr 系统设备简单、无需标记，检测灵敏。
附图说明
38.图1为本发明采用的spr光谱仪及配套仪器的结构组成示意图；
39.图2a为在spr芯片上电化学聚合mip纳米膜的cv-spr光谱示意图；
40.图2b为在spr芯片上电化学聚合nip纳米膜的cv-spr光谱示意图；
41.图3a为裸金膜、电化学聚合mips纳米膜和nips纳米膜后的sem形貌图；
42.图3b为裸金膜、mips纳米膜和nips纳米膜洗脱模板分子后的afm形貌图；
43.图3c为裸金膜、电化学聚合mips纳米膜和nips纳米膜后的wca图；
44.图4a为本发明优化功能单体类型示意图；
45.图4b为本发明优化预聚合时间示意图；
46.图4c为本发明优化电化学聚合时间示意图；
47.图4d为本发明优化洗脱时间示意图；
48.图4e为本发明优化孵育时间示意图；
49.图5a，b为本发明在0.1um～1mm浓度范围下检测mda的spr响应曲线及校准曲线；
50.图5c，d为本发明在0.1um～1mm浓度范围下检测mdma下的spr响应曲线及校准曲线；
51.图6a为本发明检测其他毒品干扰物质与检测mda和mdma的对比示意图；
52.图6b为本发明检测片剂辅料等干扰物质与检测mda和mdma的对比示意图；
53.图7a、b、c为本发明检测100μm mdma的重现性和稳定性示意图；
54.图8为本发明在实际样品中检测苯丙胺类毒品mdma(n＝3)回收率表。
具体实施方式
55.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
56.请参阅图1-8，本发明提的检测苯丙胺类毒品的分子印迹型spr传感器的制备方法，包括以下步骤：
57.s1、实验药品的准备
58.实验所需药品有盖玻片(18
×
18mm)、(
±
)3、4-亚甲二氧基苯丙胺(mda)、 (
±
)3、4-亚甲二氧基甲基苯丙胺(mdma)、(
±
)-甲基苯丙胺(ma)、氯胺酮盐酸盐、吗啡、3,4-亚甲二氧基苯乙胺盐酸盐(mdea)(化学纯度，》95％)、盐酸多巴胺(da)、蔗糖、甘露醇和抗坏血酸(aa)、超纯水(≥18mω/cm)， na2hpo4·
3h2o、nah2po4、kcl、盐酸、硫酸、过氧化氢、甲醇、乙醇、乙酸等，这些药品均为分析级，使用时无需进一步纯化，实验用水均为millipore超纯水机提供的milli-q水。
59.s2、spr芯片的制备与组装
60.盖玻片经过充分清洗干燥后使用atc orion连续溅射系统(aja国际公司，美国)沉积一层5nm的铬和50nm的金，制成spr芯片，在沉积前，先抽真空，然后分别注入氮气和氩气，氮气用于保护涂层室不被污染，氩气用于产生等离子体来溅射靶材；将spr芯片分别在丙酮、乙醇和新鲜食人鱼溶液中浸泡3min，用mill-q水充分洗涤并在氮气下干燥；通过香柏油的黏附作用将 spr芯片安装在spr传感系统的棱镜上(注意！芯片和棱镜之间不要有气泡)；当芯片和棱镜都安装在spr仪器上后，固定样品池。
61.s3、spr芯片上mips纳米膜的电化学聚合
62.所有实验均采用spr光谱仪(dynechem，长春，中国)进行，检测平台示意图如附图1所示，其中spr系统是一个基于单通道棱镜耦合并配有650nm 的激光器作为光源的仪器，电
化学系统是由spr芯片为工作电极、ag/agcl电极为参比电极、pt线电极为辅助电极组成的经典三电极系统，在以5mm da为功能单体，以5mm mdea为模板分子的0.1mol/l pbs中，在-0.5～0.5v扫描范围内进行循环伏安扫描，合成mips纳米膜，同时记录spr共振角随聚合过程的变化，用于评估聚合程度，然后通过乙醇和醋酸混合溶液(体积比为9：1)洗脱模板分子；作为对照，在不加入模板分子的条件下采用相同的方法制备了非印迹聚合物(nips)纳米膜；附图2显示的是电化学聚合mips纳米膜和 nips纳米膜的cv-spr光谱图，从图中可以看出，随着聚合过程的进行，spr 共振角度逐渐增大并最终达到恒定，该过程恰好可以用于确定电化学聚合的终点，大大节约了反应时间和实验步骤。
63.s4、mips修饰的spr芯片的表征
64.为了观察spr芯片表面真实的修饰状态，分别用扫描电子显微镜(sem)、原子力显微镜(afm)和水接触角(wca)对裸金膜、mips纳米膜和nips纳米膜的形貌进行了表征，扫描电子显微镜由phenomprox桌面扫描电镜(赛默飞，美国)进行；afm成像是使用商业氮化硅针尖(scanasyst-气相针，0.4n/m)在 dimension icon(布鲁克，美国)仪器上完成的；wca是在光学接触角测量仪器(zj-6900，shiaa，深圳，中国)上将2μl纯水滴到spr芯片表面记录接触角完成的，其中每个样品在不同位置至少采集5个数据点；附图3a为spr芯片表面的sem形貌图，与未修饰的spr芯片相比，电化学聚合mips纳米膜和 nips纳米膜后，spr芯片表面都形成了一层致密且粗糙的薄膜；附图3b为洗脱模板分子后的afm形貌图，经过模板分子洗脱后，mips修饰的spr芯片表面能够很明显的看到印迹空穴，深度大约在4～5nm；附图3c为洗脱模板分子后的spr芯片表面水接触角表征图，修饰聚合膜后的表面由于存在较多的氨基和羟基亲水基团，具有较好的亲水性。
65.s5、实验参数优化
66.为了获得分子印迹spr传感器的最佳分析性能，对影响spr响应的主要参数：功能单体的种类、预聚合时间、电化学聚合的扫描圈数、洗脱时间和吸附时间进行研究，通过比较由da、3-tpa和o-pd分别作为功能单体构建的传感器的检测效果，研究了该传感系统中功能单体的选择问题，附图4a为三种功能单体(da、3-tpa和o-pd)构建的分子印迹型spr传感器的检测性能对比图；附图4b为不同预聚合时间下的spr响应对比图；附图4c为5、10、 15和20个cv扫描周期下的spr响应对比图；附图4d为不同洗脱时间下的 spr响应图；附图4e为随孵育时间增加spr共振角度的变化曲线图。
67.s6、分子印迹型spr传感器检测ats中的mda和mdma
68.在检测目标物之前，将在mips修饰的spr芯片上加入1ml超纯水，记录共振角(θ1)，然后将100μl溶解在甲醇溶液中不同浓度的mda和mdma加入 spr芯片上，室温下孵育30min，随后用超纯水反复清洗spr芯片表面，并在 1ml超纯水中记录共振角(θ2)，孵育前后的角度位移(δθ＝θ
2-θ1)即为由mips纳米膜吸附目标引起的真实角度变化；附图5为在0.1um～1mm浓度范围下分子印迹型spr传感器检测mda和mdma的spr光谱以及共振角度变化δθ与mda和mdma浓度之间的相关关系和校准曲线。
69.s7、分子印迹型spr传感器的选择性测试
70.通过测试分子印迹型spr传感器对其它毒品分子(甲基苯丙胺、吗啡、氯胺酮)以及药片辅料(蔗糖、甘露醇、维生素c)等干扰物质对spr共振角度的影响，与检测mda和mdma的信号进行对比，评估该传感器的选择性能，其中毒品分子的浓度与mda和mdma相同，药片辅
料的浓度是mda和mdma浓度的5倍；非印迹型电化学传感器同样进行以上测试，用于排除非特异性吸附的影响；附图6为以上测试结果的spr响应信号对照图。
71.s7、传感器稳定性和重现性测试
72.通过测试由五个相同制备条件的spr芯片和同一个spr芯片经过5次洗脱重建的分子印迹型spr传感器对含有1μmol/l mda样品的spr响应，评估该传感器的重现性；通过测试不同存储时间下分子印迹型spr传感器对含有1μmol/l mda样品的spr响应评估该传感器检测信号的稳定性；附图7a 为五个传感器的spr响应信号图，附图7b为同一个传感器洗脱循环五次的spr 响应信号图，附图7c为传感器存储10天后的spr响应信号图。
73.s8、分子印迹型spr传感器在实际样品中的检测
74.选取10倍稀释的人血清蛋白样本和健康成人尿液样本，分别加入50μm、 100μm和500μm的mdma，制得含有ats毒品的实际血清样本和尿液样本，进行加标回收实验，通过测量上述样品的spr响应评估该传感器的实际应用能力，图8为传感器在上述样品中的回收率统计表。
75.本发明提供的检测苯丙胺类毒品的分子印迹型spr传感器的制备方法，采用电化学-spr联用技术，通过电化学聚合方法，一步实现聚合物在芯片表面原位印迹的修饰工作，聚合程度通过spr信号调节，大大简化了实验步骤，形成的聚合物薄膜均匀稳定、厚度可控；采用廉价易得的多巴胺作为聚合单体，聚合条件温和，降低了制作成本，扩大了该传感器的实际应用；同时多巴胺具有较多的氨基和羟基基团，识别位点丰富，有效提高了传感器的检测灵敏度和选择性，采用的spr系统设备简单、无需标记，检测灵敏。
76.该检测苯丙胺类毒品的分子印迹型spr传感器的制备方法，重点是通过电化学和spr信号协同调节聚合膜厚度和均匀度，有效减少实验步骤；同时多巴胺具有较多的氨基和羟基基团，识别位点丰富，有效提高了传感器的检测灵敏度和选择性；对苯丙胺类毒品mda、mdma具有较好的检测效果，可耐受各种非法药物和其他物质的干扰。
77.需要特别指出的是，在本发明记载的范围内，具体选择不同的组分、工艺参数，所得到的其他技术方案，均可以达到本发明的技术效果，故不再一一将其列出。
78.尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。