一种检测摇头丸成分的分子印迹型电化学传感器制备方法

1.本发明涉及摇头丸检测技术领域，具体为一种用于检测摇头丸成分的分子印迹型电化学传感器制备方法。


背景技术：

[0002][0003]
目前针对摇头丸常用的分析检测方法主要有化学分析法、气相色谱或液相色谱-质谱联用法、毛细管电泳法、拉曼光谱法和免疫分析法等。尽管这些方法有其独特的优势，但仍有一些不可避免的缺点：例如，化学分析法很难检测微量样品；色谱和光谱方法需要使用大型昂贵仪器，预处理过程繁琐；免疫分析法需要昂贵的生物试剂等。到目前为止，电化学传感器利用目标物直接的氧化还原反应已经检测了多种常见的毒品，如可卡因、海洛因和氯胺酮等。2019年，研究人员利用便携式丝网印刷碳电极与电化学聚合的邻苯二胺结合，成功制备了一种新型的mdma电化学传感器，然而该方法的检测电位较高，灵敏度有限。因此，需要发展更简单、更有效的检测摇头丸的方法，以满足实际检测的需求。


技术实现要素：

[0004]
(一)解决的技术问题
[0005]
针对现有技术的不足，本发明提供的检测摇头丸成分的分子印迹型电化学传感器制备方法，选取廉价易得、聚合简单的多巴胺作为功能单体，大大降低了传感器的构建成本和制备工艺，以不受管控的药物中间体mdea作为模板分子，极大地提高了传感器的应用领域和应用范围，最终在较低的检测电位下实现了合成毒品中滥用广泛的摇头丸主要成分mda和mdma的检测，大大提高了该传感器的实际应用价值，通过以上几个方面，本专利规避了传统毒品检测技术的部分弊病，发展出了一种针对摇头丸主要成分的简便、廉价、高效、高灵敏度、高选择性和高稳定性的分析和检测手段。
[0006]
(二)技术方案
[0007]
为实现解决上述问题，提供一种简便、廉价、高效、高灵敏度、高选择性和高稳定性的分析和检测手段，本发明提供如下技术方案：
[0008]
一种检测摇头丸成分的分子印迹型电化学传感器制备方法，包括以下步骤：
[0009]
s1、实验药品的准备
[0010]
实验所用药品有3,4-亚甲基二氧苯乙胺盐酸盐(mdea)(化学纯度，》95％)、 (
±
)-3,4-亚甲基二氧基苯丙胺(mda)、(
±
)-3,4-亚甲基二氧甲基苯丙胺 (mdma)、(
±
)-甲基苯丙胺(ma)、盐酸氯胺酮(ketamine)和吗啡(morphine)、盐酸多巴胺(da)、蔗糖、甘露醇、维生素c、na2hpo4·
3h2o、nah2po4、k3[fe(cn)6]、 k4[fe(cn)6]
·
3h2o、kcl、盐酸、氢氧化钠、硫酸，这些药品均为分析纯，可以直接使用，无需进一步纯化；支持电解质为含有na2hpo4、nah2po4、nacl的 0.1mol/l的磷酸盐缓冲溶液(pbs，ph7.5)，氧化还原探针为在0.1mol/l kcl 溶液中等比例混合的k3[fe(cn)6]和k4[fe(cn)6]
·
3h2o的5mmol/l [fe(cn)6]
4-/3-；整个
实验过程均采用通过millipore超纯水系统(上海，中国) 处理的超纯水(≥18mω/cm)。
[0011]
s2、仪器设备的准备
[0012]
实验设备采用经典的三电极系统，工作电极为分子印迹聚合物修饰的金盘电极(直径3mm)，参比电极为饱和ag/agcl电极，辅助电极为pt丝。
[0013]
s3、分子印迹聚合物修饰电极的制备
[0014]
在聚合实验前，金电极在麂皮上用不同粒度的氧化铝粉末进行抛光并依次用mill-q水和乙醇超声清洗，在室温下干燥；随后将5mmol/l mdea和 5mmol/l da超声预混后避光孵育一段时间，在溶液中连续通氮气除氧后在金电极表面电化学聚合分子印迹聚合物膜，即mip@pda；电化学聚合过程通过循环伏安扫描完成，电位范围为-0.5～0.5v，共扫描20个循环，最后将mip@pda 修饰的电极浸入0.1mol/l氢氧化钠中，去除模板分子和其他吸附物，最后使用milli-q水反复冲洗电极并在氮气下干燥；作为对比，除不加入模板分子外以相同的合成步骤合成非分子印迹聚合物膜(nip@pda)。
[0015]
s4、分子印迹聚合物修饰电极的表征
[0016]
金电极经过mip@pda修饰后，在含有5mmol/l[fe(cn)6]
4-/3-和0.1mol/l kcl的pbs缓冲液(0.01mol/l，ph7.5)中通过cv、eis和dpv对电极在不同修饰步骤下的电化学行为进行表征，通过sem对mip@pda修饰前后电极表面的形貌进行表征。
[0017]
s5、实验参数优化
[0018]
为获得分析性能最佳的分子印迹型电化学传感器，优化功能单体与模板分子的比例、印迹聚合物薄膜厚度、洗脱剂种类和洗脱时间等实验参数。
[0019]
s6、传感器的分析性能测试
[0020]
将10μl不同浓度的mda和mdma滴到修饰的电极表面，结合30min，用超纯水洗涤三次并在氮气下干燥；然后在含有5mmol/l[fe(cn)6]
4-/3-的pbs缓冲液(0.01mol/l，ph7.5)中分别检测dpv信号。
[0021]
s7、传感器的选择性测试
[0022]
通过电化学测试手段，测试分子印迹型电化学传感器对其它毒品分子(甲基苯丙胺、吗啡、氯胺酮)以及药片辅料(蔗糖、甘露醇、维生素c)等干扰物质的dpv响应，并与检测mda和mdma的信号进行对比；非印迹型电化学传感器同样进行以上测试，用于排除非特异性吸附的影响。
[0023]
s8、传感器的稳定性和重现性测试
[0024]
通过电化学测试手段，测试不同存储时间下分子印迹型电化学传感器对含有1μmol/l mda待测样的电化学dpv响应，用于评估该分子印迹型电化学传感器检测信号的稳定性；测试由五个在相同制备条件下制备的电极组成的分子印迹型电化学传感器对含有1μmol/l mda待测样的电化学dpv响应，评估该分子印迹型电化学传感器检测信号的重现性。
[0025]
s9、传感器的实用性测试
[0026]
选取健康成年志愿者的晨尿，用0.22μm的微孔过滤器去除不溶物后，分别加入0.50μmol/l、1.00μmol/l和5.00μmol/l的mda和mdma，制得含有摇头丸成分的实际尿液样品进行加标回收实验，通过测量分子印迹型传感器对上述样品的电化学响应评估该传感器的实际应用能力。
[0027]
优选的，所述步骤s1中，3,4-亚甲基二氧苯乙胺盐酸盐(mdea)化学纯度大于95％；
(
±
)-3,4-亚甲基二氧基苯丙胺(mda)、(
±
)-3,4-亚甲基二氧甲基苯丙胺(mdma)、(
±
)-甲基苯丙胺(ma)、盐酸氯胺酮(ketamine)和吗啡 (morphine)均溶解在甲醇溶液中；盐酸多巴胺(da)、蔗糖、甘露醇、维生素c均为分析纯，使用前无需纯化。
[0028]
优选的，所述步骤s2中，所有的电化学测试，包括循环伏安测试(cv)、电化学阻抗测试(eis)和差分脉冲伏安测试(dpv)均在chi660e电化学工作站上完成；形貌表征在phenom prox扫描电子显微镜(sem)上完成。
[0029]
优选的，所述步骤s3中，金电极上的分子印迹聚合物薄膜mip@pda是以 mdea为模板分子，da为功能单体，采用电化学聚合方法合成的；作为对比，非印迹聚合物nip@pda也在相同的步骤下合成，除了不加入模板分子。
[0030]
优选的，所述步骤s4中，未修饰的金电极具有典型的cv峰，阻抗值较小，dpv响应高；当电极经过mip@pda修饰后，mip@pda薄膜阻碍[fe(cn)6]
4-/3-探针在电极上的氧化还原反应，cv峰消失，阻抗值增加，dpv响应减小；当电极表面的模板分子洗脱后，在mip@pda薄膜上产生印迹识别孔，促进 [fe(cn)6]
4-/3-探针扩散到电极表面，cv峰恢复，阻抗值减小，dpv响应增加；当mip@pda修饰的电极与目标物孵育时，由于印迹孔特异性吸附目标物， [fe(cn)6]
4-/3-探针的氧化还原通道部分被封闭，cv峰电流降低，阻抗值增加， dpv信号减小。
[0031]
优选的，所述步骤s5中，模板分子与功能单体的浓度比例为1:1、循环伏安扫描20圈、洗脱溶剂为naoh，洗脱时间为90min为最佳优化的实验条件。
[0032]
优选的，所述步骤s6～s9中，检测mda的线性范围为0.05μmol/l～7.50 μmol/l，检测限为37nmol/l；检测mdma的线性范围为0.1μmol/l～7.50 μmol/l，检测限为54nmol/l；对检测摇头丸成分mda和mdma具有较好的选择性，对其它毒品和片剂辅料具有较好的抗干扰能力；该制备方法具有较好的稳定性和重现性，在实际样品检测中具有较好的实用性。
[0033]
(三)有益效果
[0034]
与现有技术相比，本发明提供的检测摇头丸成分的分子印迹型电化学传感器制备方法，具备以下有益效果：
[0035]
1、该检测摇头丸成分的分子印迹型电化学传感器制备方法，选取廉价易得、聚合简单的多巴胺作为功能单体，大大降低了传感器的构建成本和制备工艺；以不受管控的药物中间体mdea作为模板分子，极大地提高了传感器的应用领域和应用范围。
[0036]
2、该检测摇头丸成分的分子印迹型电化学传感器制备方法，在较低的检测电位下实现了合成毒品中滥用广泛的摇头丸主要成分mda和mdma的检测，大大提高了该传感器的实际应用价值。
[0037]
3、该检测摇头丸成分的分子印迹型电化学传感器制备方法，发展出了一种针对摇头丸主要成分的简便、廉价、高效、高灵敏度、高选择性和高稳定性的分析和检测手段。
附图说明
[0038]
图1a为mip@pda在金电极表面电化学聚合的cv图；
[0039]
图1b为nip@pda金电极表面电化学聚合的cv图；
[0040]
图2a为电极在不同修饰步骤下的循环伏安示意图；
[0041]
图2b为电极在不同修饰步骤下的电化学阻抗示意图；
[0042]
图2c为电极在不同修饰步骤下的脉冲伏安示意图；
[0043]
图2d为电极修饰mip@pda前后的扫描电镜示意图；
[0044]
图3a为优化模板分子与单体比例示意图；
[0045]
图3b为优化电化学聚合圈数示意图；
[0046]
图3c为优化洗脱剂种类示意图；
[0047]
图3d为优化洗脱时间示意图；
[0048]
图4a、b、c分别为mip@pda修饰的电极和nip@pda修饰的电极在不同浓度的mda中电流响应曲线(a、b)和校正曲线图(c)；
[0049]
图4d、e、f分别为mip@pda修饰的电极和nip@pda修饰的电极在不同浓度的mdma中电流响应曲线(d、e)和校正曲线图(f)；
[0050]
图5为分子印迹型电化学传感器检测摇头丸成分的选择性示意图；
[0051]
图6为分子印迹型电化学传感器检测摇头丸成分的稳定性(a)和重现性 (b)示意图；
[0052]
图7为分子印迹型电化学传感器在实际尿液样品中检测mda和mdma回收率表。
具体实施方式
[0053]
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0054]
请参阅图1-7，本发明提供的检测摇头丸成分的分子印迹型电化学传感器制备方法，包括以下步骤：
[0055]
s1、实验药品的准备
[0056]
实验所用药品有3,4-亚甲基二氧苯乙胺盐酸盐(mdea)(化学纯度，》95％)、 (
±
)-3,4-亚甲基二氧基苯丙胺(mda)、(
±
)-3,4-亚甲基二氧甲基苯丙胺 (mdma)、(
±
)-甲基苯丙胺(ma)、盐酸氯胺酮(ketamine)和吗啡(morphine)、盐酸多巴胺(da)、蔗糖、甘露醇、维生素c、na2hpo4·
3h2o、nah2po4、k3[fe(cn)6]、 k4[fe(cn)6]
·
3h2o、kcl、盐酸、氢氧化钠、硫酸，这些药品均为分析纯，可以直接使用，无需进一步纯化；支持电解质为含有na2hpo4、nah2po4、nacl的 0.1mol/l的磷酸盐缓冲溶液(pbs，ph7.5)，氧化还原探针为在0.1mol/l kcl 溶液中等比例混合的k3[fe(cn)6]和k4[fe(cn)6]
·
3h2o的5mmol/l [fe(cn)6]
4-/3-；整个实验过程均采用通过millipore超纯水系统(上海，中国) 处理的超纯水(≥18mω/cm)。
[0057]
s2、仪器设备的准备
[0058]
实验设备采用经典的三电极系统，工作电极为分子印迹聚合物修饰的金盘电极(直径3mm)，参比电极为饱和ag/agcl电极，辅助电极为pt丝，所有的电化学测试，包括循环伏安测试(cv)、电化学阻抗测试(eis)和差分脉冲伏安测试(dpv)均在chi660e电化学工作站(上海，中国)上完成；形貌表征在 phenom prox扫描电子显微镜(sem)上(美国赛默飞有限公司)完成。
[0059]
s3、分子印迹聚合物修饰电极的制备
[0060]
在聚合实验前，电极在麂皮上用不同粒度的氧化铝粉末进行抛光并依次用mill-q水和乙醇超声清洗，在室温下干燥，随后将5mmol/l mdea和5mmol/l da超声预混后避光下
孵育一段时间，在溶液中连续通氮气除氧后在金电极表面电化学聚合形成分子印迹聚合物膜，即mip@pda；电化学聚合过程通过循环伏安扫描完成，电位范围为-0.5～0.5v，共扫描20个循环，然后将mip@pda 修饰的电极浸入0.1mol/l氢氧化钠中，去除模板分子和其他吸附物，最后用 milli-q水反复冲洗电极后在氮气下干燥；作为对比，除不加入模板分子外以相同的合成步骤合成非分子印迹聚合物膜(nip@pda)。附图1a显示的是当mdea 存在时金电极上的聚合曲线，从图中可以看出在第一圈扫描过程中，与参比电极ag/agcl相比，在大约0.36v处有一个氧化峰，其峰电流在接下来的扫描过程中逐渐减小；不存在mdea的聚合曲线如附图1b所示，其主要的氧化峰大约位于0.25v，峰值电流也随着cv扫描次数的增加而逐渐减小，这充分证明模板分子的引入对电极表面形成聚合物薄膜没有影响。
[0061]
s4、分子印迹聚合物修饰电极的表征
[0062]
金电极经过分子印迹聚合物修饰后，在含有5mmol/l[fe(cn)6]
4-/3-和 0.1mol/l kcl的pbs缓冲液(0.01mol/l，ph7.5)中通过cv、eis和dpv对其进行电化学表征，通过sem对mip@pda修饰前后电极表面的形貌进行表征。附图2显示的不同修饰步骤下电极的循环伏安(a)、电化学阻抗(b)、脉冲伏安(c)和扫描电镜(d)表征图，其中a为裸金电极；b为mip@pda修饰的金电极；c为nip@pda修饰的金电极；d为去除模板分子后的mip@pda修饰的金电极；e为识别mda后的mip@pda修饰的金电极。从图中可以看出裸金电极具有典型的cv峰，说明其优异的氧化还原行为，阻抗较小，dpv响应高；当电极经过分子印迹聚合物修饰后，无论是mip@pda还是nip@pda，由于不导电的聚多巴胺薄膜的形成，cv峰消失，阻抗也明显增加，dpv响应减小；当电极表面的模板分子洗脱后，cv峰逐渐恢复，阻抗减小，dpv响应增加，这归因于模板分子在聚合物薄膜上产生特异性识别印迹孔，促进[fe(cn)6]
4-/3-探针扩散到电极表面，进行进一步的氧化还原反应；当mip@pda修饰的电极与目标孵育时，由于印迹孔特异性吸附目标物，[fe(cn)6]
4-/3-探针的氧化还原通道部分被封闭，cv峰电流降低，阻抗值增加，dpv信号减小。这些结果清楚地验证了mip@pda修饰的电极特异性识别摇头丸成分的可行性。
[0063]
s5、实验参数优化
[0064]
通过优化功能单体和模板分子的比例、mip的厚度、洗脱剂种类和洗脱时间等实验参数，获得分析性能最佳的分子印迹型电化学传感器。附图3a显示的是功能单体与模板分子的浓度比(5：1、3：1、2：1、1：1、1：2)对响应信号的影响；附图3b显示的是cv聚合圈数即聚合膜厚度对传感器识别性能的影响；附图3c和附图3d分别研究的是去除模板分子的洗脱剂和洗脱时间对传感器识别性能的影响。
[0065]
s6、传感器的分析性能测试
[0066]
将10μl不同浓度的mda和mdma滴到修饰的电极表面，结合30min，用超纯水洗涤三次并在氮气下干燥；然后在含有5mmol/l[fe(cn)6]
4-/3-的pbs缓冲液(0.01mol/l，ph7.5)中分别检测dpv信号。传感器的检测原理是在金电极表面以da为功能单体，mdea为模板分子电化学聚合一层分子印迹聚合物薄膜，然后通过破坏氢键的方式将模板分子从印迹膜中洗脱出来，形成与模板分子形状、大小和化学官能团相匹配的特异性识别位点；此时，电化学探针 [fe(cn)6]
4-/3-通过识别空穴到达电极表面，产生增强的dpv信号；当目标分子与印迹识别位点结合后，电化学探针的电子转移通路被阻断，导致dpv信号降低。mip@pda和nip@pda修饰的电极在不同浓度的mda和mdma下的dpv响应以及校准曲线如附图4所示。
[0067]
s7、传感器的选择性测试
[0068]
通过电化学测试手段，测试分子印迹型电化学传感器对其它毒品分子(甲基苯丙胺、吗啡、氯胺酮)以及药片辅料(蔗糖、甘露醇、维生素c)等干扰物质的dpv响应，并与检测mda和mdma的信号进行对比；非印迹型电化学传感器同样进行以上测试，用于排除非特异性吸附的影响，附图5为以上测试结果的dpv响应对照图。
[0069]
s8、传感器的稳定性和重现性测试
[0070]
通过电化学测试手段，测试不同存储时间下分子印迹型电化学传感器对含有1μmol/l mda待测样的电化学dpv响应，用于评估该分子印迹型电化学传感器检测信号的稳定性，附图6a为传感器存储24h后的dpv响应结果图；通过测试由五个在相同制备条件下制备的电极组成的分子印迹型电化学传感器对含有1μmol/l mda待测样的电化学dpv响应，评估该分子印迹型电化学传感器检测信号的重现性，附图6b为五个传感器的dpv响应结果图。
[0071]
s9、传感器的实用性测试
[0072]
选取健康成年志愿者的晨尿，用0.22μm的微孔过滤器去除不溶物后，分别加入0.50μmol/l、1.00μmol/l和5.00μmol/l的mda和mdma，制得含有摇头丸成分的实际尿液样品进行加标回收实验，通过测量分子印迹型传感器对上述样品的电化学响应评估该传感器的实际应用能力，附图7为传感器在实际尿液样品中的回收率统计表。
[0073]
该检测摇头丸成分的分子印迹型电化学传感器制备方法，选取廉价易得、聚合简单的多巴胺作为功能单体，大大降低了传感器的构建成本和制备工艺；以不受管控的药物中间体mdea作为模板分子，极大地提高了传感器的应用领域和应用范围；最终在较低的检测电位下实现了合成毒品中滥用广泛的摇头丸主要成分mda和mdma的检测，大大提高了该传感器的实际应用价值；通过以上几个方面，本专利规避了传统毒品检测技术的部分弊病，发展出了一种针对摇头丸主要成分的简便、廉价、高效、高灵敏度、高选择性和高稳定性的分析和检测手段。
[0074]
需要特别指出的是，在本发明记载的范围内，具体选择不同的组分、工艺参数，所得到的其他技术方案，均可以达到本发明的技术效果，故不再一一将其列出。
[0075]
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。