一种基于电场增强薄膜固相微萃取检测磺胺类抗生素的方法与流程

1.本发明涉及一种基于电场增强薄膜固相微萃取检测磺胺类抗生素的方法，属于分析检测技术领域。


背景技术：

2.磺胺类(sas)是一种具有对氨基苯结构的合成抗生素，由于其生产成本低、抗菌谱广，在临床、动物饲料添加剂等行业被广泛用于抑制细菌生长。由于sas的普遍使用，食品中检测到的残留事件比四环素和恶唑烷酮等其他抗生素发生频率更高。更严重的是，这些残留物可能会引发对人类健康的危害，例如过敏反应、致癌、致畸和致突变作用。因此，许多国家和地区制定了动物源性食品中sas的最大残留限量(mrl)。食品法典委员会(cac)、欧盟(eu)和中国均规定总sas的mrl为100μg/kg。美国食品药品监督管理局(fda)规定磺胺二甲嘧啶在脂肪、肝脏和肾脏中的mrl为100μg/kg，中国规定牛奶中磺胺二甲嘧啶的mrl为25μg/kg。因此，迫切需要一种用于提取和量化复杂食品基质中痕量sas的快速、可用和有效的检测方法。
3.检测sas的方法很多，包括高效液相色谱(hplc)、电化学传感器分析和免疫层析试条。其中，高效液相色谱法具有较高的重现性和高效性，是检测各种sas的可靠方法。高效液相色谱需要几个步骤，但它们都是有效的预处理程序，可以从食品基质中提取sas。近年来出现了几种用于食品样品中sas的预处理方法，包括固相微萃取(spme)、磁分散固相萃取(mspe)和液-液萃取(lle)。此外，薄膜微萃取(tfme)技术也逐渐受到广泛关注。
4.与spme相比，tfme具有相对较大的萃取相面积、较高的灵敏度和较快的萃取速度。与mspe和lle相比，tfme可以直接从萃取相中萃取吸附剂，并且消耗较少的有机溶剂。因此，它已成功地应用于食品和生物样品的前处理。tfme萃取效率的关键在于涂层材料，优良的材料可以获得良好的提取效果，如金属有机骨架(mofs)。mofs是一类具有晶体结构、高度可调的孔隙率和不同功能的杂化材料，被认为是一种很有前途的食品样品制备材料。
5.传统的tfme在很大程度上依赖于分析物在样品基质和涂层之间的被动扩散来实现萃取平衡，这可能导致极性或离子化合物(如质子化胺)的耗时过程。为了解决这个难题，电场辅助技术逐渐被采用，因为它可以导致带电目标的迁移。因此，电场对于增强具有高电导率薄膜的sas的tfme是潜在有用的。碳布(cc)作为一种商业化的自支撑基底，以其导电性、大孔性、强稳定性(耐高温和强酸)和优异的柔韧性而闻名，这为mofs修饰的cc在电化学检测、电催化和超级电容器等领域的广泛应用铺平了道路。
6.考虑到带有两个氨基的sas在一定的ph值和电位下容易去质子化，本发明将它们用作离子分析物的例子。本发明探索了一种将mil-101(cr)改性的cc应用于电场增强tfme(ee-tfme)的新方法。mil-101(cr)通过水热反应在cc表面原位生长以提高电导率，并进一步用作工作电极用于磺胺嘧啶、磺胺噻唑、磺胺甲噁唑、磺胺二甲嘧啶、磺胺甲噁唑和磺胺异噁唑的增强萃取。sas具有相似的物理性质和化学结构，具有几个可修饰的位点和共轭体系，以及在实际生产中经常使用的六种sas，我们以六种sas为典型目标。将ee-tfme与hplc
相结合，成功地应用于动物源性食品(牛奶、蜂蜜、猪肉和鸡肉)中sas的提取和测定。本本发明的目的是探索一种快速提取sas的tfme方法。


技术实现要素：

7.为了解决上述问题，本发明提供了一种对tfme施加电场的萃取方法，基于mil-101(cr)修饰过的cc电极对sas进行富集浓缩，利用mil-101(cr)/cc结合ee-tfme处理的动物性样品进行检测，速度快、准确度高，具有实际应用前景。
8.本发明通过水热反应将mil-101(cr)在cc表面原位生长作为tfme薄膜，进一步研究了其对ee-tfme的性能，开发了ee-tfme结合高效液相色谱法，成功应用于动物源性食品(牛奶、蜂蜜、猪肉和鸡肉)中sas的提取和测定。
9.本发明的旨在提供一种富集萃取磺胺类抗生素的方法，包括如下过程：
10.利用mil-101(cr)修饰的碳布mil-101(cr)/cc作为吸附萃取剂，其与直流稳压电源、样品池、铂丝电极组成电场增强薄膜固相微萃取装置；将mil-101(cr)/cc与铂丝电极浸入到样品溶液中，建立起完整的电路系统，先在mil-101(cr)/cc上施加正极电压进行吸附，吸附结束后，置于洗脱液中，然后将正负电极反转，在mil-101(cr)/cc上施加负极电压进行洗脱解吸，固液分离、收集清液，浓缩干燥，即得磺胺类抗生素。
11.在本发明的一种实施方式中，所述mil-101(cr)/cc的制备过程包括：
12.(1)预处理碳布(cc)；
13.(2)将可溶性铬盐、对苯二甲酸和氢氟酸分散在水中，配制成混合液；将处理后的碳布加入到混合液中，进行水热反应，反应结束后，收集碳布，洗涤，得到mil-101(cr)修饰的碳布mil-101(cr)/cc。
14.在本发明的一种实施方式中，预处理碳布的过程包括：
15.分别用丙酮、无水乙醇和去离子水洗涤碳布，干燥；然后将cc在浓硝酸中浸泡，再用去离子水将碳布清洗至无酸，干燥。
16.在本发明的一种实施方式中，可溶性铬盐可选硝酸铬。
17.在本发明的一种实施方式中，可溶性铬盐的对苯二甲酸质量-比为(4-5)：1。
18.在本发明的一种实施方式中，混合液中可溶性铬盐的浓度为80-90mg/ml。
19.在本发明的一种实施方式中，混合液中氢氟酸与水的体积比为1：(90-100)。
20.在本发明的一种实施方式中，步骤(2)中使用n,n-二甲基甲酰胺、无水乙醇等有机溶剂进行洗涤。
21.在本发明的一种实施方式中，步骤(2)中水热反应是在220℃保温反应8h。
22.在本发明的一种实施方式中，正、负极电压分别独立选自0.1-1.0v。优选0.4-0.6v；进一步优选0.5v。
23.在本发明的一种实施方式中，吸附的时间5-35min；优选15min-30min。
24.在本发明的一种实施方式中，样品溶液的介质为ph 4.0pbs溶液。
25.在本发明的一种实施方式中，洗脱液为5％氨甲醇溶液、乙腈、乙醇、异丙醇中的一种或多种。
26.在本发明的一种实施方式中，洗脱的时间为15min-30min。
27.本发明还提供一种高效液相定量检测磺胺类抗生素的方法，包括如下过程：
28.(1)高效液相样品液的制备：利用上述mil-101(cr)/cc作为吸附萃取剂，其与直流稳压电源、样品池、铂丝电极组成电场增强薄膜固相微萃取装置；将mil-101(cr)/cc与铂丝电极浸入到样品溶液中，建立起完整的电路系统，先在mil-101(cr)/cc上施加正极电压进行吸附，吸附结束后，置于洗脱液中，然后将正负电极反转，在mil-101(cr)/cc上施加负极电压进行洗脱解吸，洗脱后，除去洗脱液、并用乙腈定容，获得高效液相样品液；
29.(2)高效液相检测：按照步骤(1)获得一系列已知浓度的标准样品的液相色谱样品液，并采集相应的高效液相色谱，获得相应目标物的峰面积值；以目标物的峰面积值与浓度进行线性关联，获得定量检测模型。
30.在本发明的一种实施方式中，当使用高效液相色谱串联光电二极管列阵检测器检测时，所述前处理还包括如下步骤：
31.(1)氮气吹干及定容：将分离得到的待测样溶液置于氮气吹干仪吹至近干，乙腈定容，过滤膜待测；
32.(2)标准样品的制备：溶剂稀释不同浓度的待测样，以电场增强薄膜固相萃取法处理后洗脱吹干并定容，作为标准样品备用。
33.在本发明的一种实施方式中，所述高效液相的色谱柱为e clipse plus c
18 5μm 4.6
×
250mm色谱柱。
34.在本发明的一种实施方式中，所述高效液相的具体条件为：
[0035][0036]
本发明的有益效果：
[0037]
本发明的mil-101(cr)/cc电场增强薄膜固相微萃取萃取剂对磺胺类抗生素具有较好的吸附萃取能力。基于电场的辅助作用以及萃取剂中的多种结构的相互作用强度存在的差异，提高了对磺胺类抗生素的吸附量及萃取回收量。利用本发明mil-101(cr)/cc处理的样品进行检测：检测的检测限lod为2.5-4.5ng/ml，定量限loq为8.0-14.5ng/ml，线性范围上限为200ng/ml；通过加标回收率实验并检测其中磺胺类抗生素含量，加标回收率在81.7％～114.2％，匹配良好、准确度高；且检测方法的适应性好，对多种样品的检测均具有非常准确的检测结果，具有较广的实际应用前景。
附图说明
[0038]
图1为mil-101(cr)/cc的冷场发射电镜图。
[0039]
图2为cc和mil-101(cr)/cc的循环伏安对比图。
[0040]
图3为cc和mil-101(cr)/cc的阻抗对比图。
[0041]
图4为cc、mil-101(cr)/cc和mil-101(cr)/cc与ee-tfme提取sas对比图。
[0042]
图5为不同电压施加后的sas回收率对比图。
[0043]
图6为不同萃取时间后sas回收率对比图。
[0044]
图7为不同洗脱液洗脱后sas回收率对比图。
[0045]
图8为2.5μg/ml sdm/st/smz/smd/smx/siz混合标准物高效液相色谱图。
[0046]
图9为基于电场增强固相微萃取检测磺胺类抗生素的过程示意图；a为制备mil-101(cr)/cc的流程示意图；b为萃取检测磺胺类抗生素的流程示意图。
具体实施方式
[0047]
本发明涉及的碳布(碳纤维布，cc)购置于中国的台湾碳能公司。
[0048]
本发明涉及的高效液相的色谱柱为e clipse plus c
18 5μm 4.6
×
250mm色谱柱，具体检测条件为：
[0049][0050]
本发明涉及的m：ee-tfme后得到的磺胺类质量，m：ee-tfme之前加入的磺胺类质量。其中，质量是通过外标法高效液相测得：分别对0.1，0.2，0.5，0.8，1，2.5，5μg/ml的六种sas的甲醇溶液进行高效液相检测，相应的标准曲线如下所示。
[0051]
物质名称线性方程r2sdmy＝29892.06x-97.450.9999sty＝24621.16x-183.020.9997smzy＝28479.30x-171.920.9999smdy＝25298.58x 162.280.9999smxy＝27973.88x-53.650.9999sizy＝26895.27x-94.280.9999
[0052]
实施例1：mil-101(cr)修饰碳布(mil-101(cr)/cc)的制备
[0053]
碳布用丙酮、无水乙醇和去离子水洗涤3次，每次15min，然后在60℃下干燥12h；接下来，cc在浓硝酸中浸泡24h，然后用大量去离子水将碳纤维布清洗至无酸，并在60℃下干燥12h。
[0054]
首先，在室温下，在超声辅助下将800mg硝酸铬、332mg对苯二甲酸和0.1ml氢氟酸均匀溶解在9.6ml去离子水中，形成混合液。然后，将上述混合液和cc(1
×
2cm2)置于衬有聚四氟乙烯的不锈钢高压釜中，220℃保温反应8h，自然冷却至室温后，收集固体，将得到的固体用dmf和乙醇彻底清洗，得到产物mil-101(cr)/cc。所得产物的冷场发射电镜图如图1所示。
[0055]
实施例2：利用mil-101(cr)/cc电场增强固相微萃取富集sas
[0056]
在k3[fe(cn)6]溶液中测定mil-101(cr)/cc和cc的循环伏安电流和阻抗，如图2所示，mil-101(cr)/cc与cc的氧化还原电位相差不大，但mil-101(cr)/cc的响应电流更大，其对应的氧化峰与还原峰电流分别为2.63ma和-3.23ma，相较于cc上的0.41ma和-0.99ma，分别增大了6倍和3倍。如图3所示，裸cc的r
ct
为452.6ω；当cc上负载了mil-101(cr)时，r
ct
降
低至23.28ω，证明了mil-101(cr)有利于电极与溶液之间的电荷转移。
[0057]
此外，在不施加外部电场时分别使用cc和mil-101(cr)萃取sas，如图4所示，对比其回收率，发现经过mil-101(cr)修饰的cc的萃取效果明显好于裸cc的萃取效果，进而在相同时间下，对mil-101(cr)/cc施加外部电场，对比施加外部电场对sas的萃取效果，发现施加电场后sas的回收率有所提高。
[0058]
萃取富集的过程为：
[0059]
电场增强薄膜固相微萃取装置由直流稳压电源、样品池、铂丝电极和mil-101(cr)/cc组成，将mil-101(cr)/cc与铂丝电极浸入到标准溶液或者样品溶液中，建立起完整的电路系统。
[0060]
在mil-101(cr)/cc施加正极电压0.5v，对25ml 0.01μg/ml的磺胺类标准物混合溶液(ph 4.0 pbs溶液)进行吸附，15min后将正负电极反转，保持电压0.5v不变，使用10ml5％氨甲醇溶液洗脱15min，然后氮气吹至近干，定容于1ml乙腈中，使用hplc对定容后萃取样品进行检测，以峰面积为检测信号，获得回收率结果。如表1所示。
[0061]
表1 mil-101(cr)/cc电场增强固相微萃取富集sas的回收率结果
[0062]
sdmstsmzsmdsmxsiz98.1％95.9％96.5％94.0％90.6％95.0％
[0063]
实施例3：萃取/分离条件优化
[0064]
(1)施加外部电压的选择：
[0065]
参照实施例2中的方法，改变电压，其他不变：
[0066]
在mil-101(cr)/cc施加正极电压(0.1-1.0v)，对25ml 0.01μg/ml的磺胺类标准物混合溶液进行吸附，15min后将正负电极反转，将电压设置在0.5v，使用10ml的5％氨甲醇溶液洗脱15min，氮气吹至近干，定容于1ml乙腈中，使用hplc对定容后萃取样品进行检测，以峰面积为检测信号。
[0067]
如表2和图5所示，目标物的萃取效率随着外加电位从0.1到0.5v的增加而增加，这说明在一定范围内随着电压的增加，在电极/溶液界面形成双电层，电荷被迫朝带有相反电荷的电极移动，产生离子的电吸附。然而，当外加电压超过0.5v时，萃取效率却逐渐降低。推测一方面可能由于在较高电压下，sas在mil-101(cr)/cc电极表面直接被氧化，以及电极表面产生
·
oh对磺胺物质进行间接氧化，生成对氨基苯磺酸、对氨基苯酚或苯胺等物质，从而使萃取效率降低；另一方面可能随着电压的增加，会产生压缩双电层效应，导致吸附层变薄，致使吸附效果降低。因此选择0.5v的施加电势作为最佳值。
[0068]
表2 不同电压下的回收率结果
[0069]
[0070][0071]
(2)参照实施例2中的方法，仅在吸附萃取15min后不进行正负电极反转，直接用洗脱液进行解吸：
[0072]
吸附萃取15min后不进行正负电极反转，直接使用不同的洗脱液对其进行解吸，测出结果并与实施了正负电极反转的结果进行对比(如表3所示)，发现在纯有机溶剂中对六种磺胺类物质的洗脱效果几乎没什么影响，但是在水溶液中，不进行正负电极反转的洗脱效果明显弱于实施了正负电极反转的效果，这说明实施正负电极反转有利于增强磺胺类药物在此过程中的洗脱效果。
[0073]
表3 不进行正负电极反转时各洗脱液的回收率结果
[0074][0075]
(3)萃取时间的选择：
[0076]
参照实施例2中的方法，改变萃取时间，其他不变：
[0077]
在mil-101(cr)/cc施加正极电压0.5v，对25ml 0.01μg/ml的磺胺类标准物混合溶液进行吸附，时间在5-35min，萃取后将正负电极反转，将电压设置在0.5v，使用10ml 5％氨甲醇溶液洗脱15min，氮气吹至近干，定容于1ml乙腈中，使用hplc对定容后萃取样品进行检测，以峰面积为检测信号。结果如表4和图6所示，在0.5v外接电压下，分析物的平衡几乎在15min左右，然后回收率变化值在4％-7％之间浮动，其中磺胺噻唑，磺胺甲基嘧啶和磺胺异
恶唑的回收率呈现略微下降趋势，约为4％左右，这可能是由于时间过长导致三种物质发生了电化学氧化，生成了其他物质，但总体来说六种物质的回收率几乎是不变的。因此，最佳吸附时间为15min。
[0078]
表4 不同萃取时间的回收率结果
[0079]
萃取时间sdmstsmzsmdsmxsiz530.4％27.6％29.8％32.6％31.6％29.6％1067.8％42.3％49.6％51.7％58.3％49.9％1598.1％95.9％96.5％94.0％90.6％95.0％2089.5％77.8％76.7％91.8％83.7％80.0％2586.4％84.1％83.7％89.4％90.2％74.9％3088.9％73.4％90.8％89.9％86.2％82.2％3590.1％77.3％84.6％96.0％83.8％82.6％
[0080]
(4)洗脱液的选择
[0081]
在mil-101(cr)/cc施加0.5v正极电压，对25ml 0.01μg/ml的磺胺类标准物混合溶液(ph4.0)进行吸附，15min后将正负电极反转，将电压设置在0.5v，分别使用10ml乙腈、乙醇、丙酮、二氯甲烷、甲醇、5％氨甲醇溶液、pbs溶液(ph 9.0)、异丙醇进行洗脱15min，氮气吹至近干，定容于1ml乙腈中，使用hplc对定容后萃取样品进行检测，以峰面积为检测信号。结果如表5和图7可知，在碱性条件下mil-101(cr)/cc对目标物的萃取能力是最低的，因此可以推测适当的碱性条件会促进分析物从mof脱附并提高其在有机溶剂中的溶解度溶剂。此外，mil-101(cr)/cc暴露在溶剂环境中的开放金属位点对极性溶剂具有更大的亲和力。丙酮在挑选的有机溶剂中极性较低，所以相对有最低的解吸效率，分别为33.7％，13.3％，32.6％，27.3％，4.4％和59.5％。此外，本实验中的洗脱过程使将两极电压反转，同时选用的水为pbs(ph9.0)溶液，因此，电压反转后，目标物与电极之间同性电荷互相排斥，使得在水中也有较好的洗脱效果，但仍不如5％氨甲醇溶液。最终将5％氨甲醇作为解吸溶剂。
[0082]
表5 不同洗脱液的回收率结果
[0083]
[0084][0085]
(5)萃取吸附方式选择：
[0086]
方法一：利用实施例1所得mil-101(cr)/cc或者单纯cc(1
×
2cm2)直接对对25ml 0.01μg/ml的磺胺类标准物混合溶液进行吸附，15min后，使用10ml 5％氨甲醇溶液洗脱15min，氮气吹至近干，定容于1ml乙腈中，使用hplc对定容后萃取样品进行检测，以峰面积为检测信号。
[0087]
方法二：
[0088]
先在mil-101(cr)/cc施加正极电压0.8v，对25ml 0.01μg/ml的磺胺类标准物混合溶液进行吸附，15min后将正负电极反转，并将电压设置在0.5v，使用10ml5％氨甲醇溶液洗脱15min，氮气吹至近干，定容于1ml乙腈中，使用hplc对定容后萃取样品进行检测，以峰面积为检测信号。
[0089]
萃取富集的结果见表6。
[0090]
表6 不同萃取富集方式的回收率结果
[0091][0092]
实施例4：磺胺类抗生素的萃取分离-构建定量模型：
[0093]
(1)标准样品的萃取分离前处理：将2.0-250.0ng/ml一系列不同浓度的sas，待ee-tfme方法处理制成标准曲线，经实施例1中制得萃取剂萃取处理。
[0094]
电场增强薄膜固相微萃取装置由直流稳压电源、样品池、铂丝电极和mil-101(cr)/cc组成。将mil-101(cr)/cc与铂丝电极浸入到标准溶液或者样品溶液中，建立起完整的电路系统，将0.5v正电压施加在mil-101(cr)/cc上，从而促使了在电场中去质子化形成的带负电荷的sas的向其迁移。在ph 4.0的pbs溶液中萃取15min，从小瓶中取出mil-101(cr)/cc，并将正负电源反转、电压不变，在5％氨甲醇溶液中继续解吸15min，氮气吹干用乙
腈定容至1ml，用于hplc分析，获得的峰面积用作磺胺类药物的分析信号。
[0095]
(2)定量检测模型：
[0096]
以峰面积与相应标准样品的浓度进行线性关联，分析基于mil-101(cr)/cc所建立ee-tfme-hplc-pda方法的线性、检出限(lod，s/n＝3)、定量限(loq，s/n＝10)，日内与日间精密度等分析特征参数来验证该方法的有效性，结果如表7所示。此方法的线性范围为10.0-200.0ng/ml，判定系数(r2)在0.9912-0.9967之间，lod在2.5-4.5ng/ml之间，loq在8.0-14.5ng/ml之间，此外还研究了方法的重现性，使用相对标准偏差(rsd)表示其精密度，日内与日间的rsd分别小于7.8％和9.1％，说明该方法具有良好的重现性。
[0097]
表7 定量检测结果
[0098][0099]
其中，y表示峰面积，x表示样品中目标物的浓度。
[0100]
实施例5方法适应性：不同动物食品中磺胺类抗生素的检测
[0101]
猪肉和鸡肉样品均质并储存在-20℃。8g样品与20ml 6％醋酸乙腈和5g na2so4混合，涡旋5min后，4℃8500rpm离心10min。在离心管中将8g蜂蜜样品与16ml na2edta-mcllvaine缓冲溶液混合。在离心管中将8g牛奶样品与10ml乙腈混合。牛奶样品在涡旋1min后，在4℃下以8500rpm的速度离心10min。
[0102]
该方法用于测定六种动物源性食品(蜂蜜、牛奶、猪肉和鸡肉)中的sas，且均加标50和100μg/kg的sas，以评估其实际适用性。在牛奶和猪肉中检测到sdm，而在猪肉中检测到smd，浓度为24.4
±
3.3μg/kg(均低于欧盟的mrl和国标)。样品中六种sas的回收率介于81.7％到114.2％之间，rsds小于8.6％。这也验证了所开发方法的准确性。具体见表8。
[0103]
表8 实际样品中sas的浓度(μg/kg)、rsd(％，n＝3)和加标回收率(％)
[0104]