一种检测土霉素的光电化学生物传感器的制备方法及其应用

1.本发明属于生物传感器技术领域，具体涉及一种检测土霉素的光电化学生物传感器的制备方法及其应用。


背景技术：

2.土霉素(otc)属于广谱抗菌药物，对阴性菌等有很好的抑制作用，其在人类药物、兽药、水果和蔬菜中被广泛使用。中国农业土壤普遍检出土霉素的质量分数为0～8400μg
·
kg-1
，部分样点土壤中四环素类抗生素的含量超出了兽药国际协调委员会(vich)筹划指导委员会提出的土壤抗生素生态毒害效应的触发值(100μg
·
kg-1
)。现如今有多种技术手段可对土霉素进行检测，例如高效液相色谱串联质谱法、酶联免疫法。高效液相色谱串联质谱法等，具有准确度高、灵敏度高的优势，但因设备昂贵，耗时长且需要专业人员操作等因素而限制了其广泛使用；酶联免疫分析法操作简单、快速但易产生假阳性。因此，开发一种快速、灵敏，选择性强的光电化学传感平台是很有必要的。


技术实现要素：

3.本发明旨在通过bi2s3与cn相结合，实现优缺点互补并构成直接z型异质结，提高可见光利用率，加快电子-空穴分离效率，从而提高光电化学生物传感器检测性能，构建检测特异性强，灵敏度高的光电化学传感检测平台，实现对土霉素的精准检测。
4.通过如下技术方案实现本发明的目的：
5.一种检测土霉素的光电化学生物传感器的制备方法，包括如下步骤：
6.(1)将三聚氰胺研磨后将其放入氧化铝坩埚中，并在一定的温度下加热一段时间，加热后在空气中冷却至室温后得到碳化氮(cn)粉末；
7.(2)将bi(no3)3·
5h2o溶解于乙二醇中，得到bi(no3)3·
5h2o溶液；将na2s
·
9h2o溶解于超纯水中，得到na2s
·
9h2o溶液；然后将na2s
·
9h2o溶液滴加到bi(no3)3·
5h2o溶液中，再加入步骤(1)中所制备的cn粉末，并搅拌一段时间形成混合溶液，搅拌结束后将混合溶液转移到高压反应釜中，进行真空干燥，真空干燥结束后，待高压反应釜自然冷至室温，收集产物经洗涤、干燥后得到bi2s
3-cn异质结；
8.(3)将氧化铟锡玻璃电极(ito)浸入naoh溶液中煮沸一段时间，然后依次在无水乙醇和超纯水中进行超声处理，超声处理后在空气中干燥，得到处理后的氧化铟锡玻璃电极(ito)；
9.(4)将步骤(2)制备的bi2s
3-cn异质结加入超纯水中，得到bi2s
3-cn异质结溶液修饰到步骤(3)处理后的氧化铟锡玻璃电极表面，在室温条件下干燥后，记为bi2s
3-cn/ito；
10.(5)随后将土霉素适配体修饰在步骤(4)得到的bi2s
3-cn/ito电极表面，并在一定温度下孵育一段时间，得到的产品标记为aptamer/bi2s
3-cn/ito，即为高灵敏检测土霉素的光电化学生物传感器。
11.优选的，步骤(1)中，所述三聚氰胺研磨的时间为8～12min；所述加热是在管式炉
中进行，所述一定温度为450～550℃，加热一段时间为3.5～4.5h，升温速率为2～2.3℃/min。
12.优选的，步骤(2)中所述混合溶液中bi(no3)3·
5h2o、乙二醇、na2s
·
9h2o、超纯水和cn粉末的用量关系为1.82g：25ml：1.35g：30ml：12.5～37mg；所述搅拌一端时间为20～40min；所述真空干燥的温度为140～180℃，反应时间为10～14h；
13.所述洗涤具体是分别用超纯水和乙醇交替洗涤三次；所述干燥的温度为60～70℃；时间为8～10h。
14.优选的，步骤(3)中，所述氧化铟锡玻璃电极(ito)的直径为6mm；所述naoh溶液的浓度为1m；所述煮沸一段时间为25～30min，超声处理的时间为10～15min。
15.优选的，步骤(4)中，所述bi2s
3-cn异质结溶液的浓度为5mg/ml，修饰的用量为20μl。
16.优选的，步骤(5)中，所述土霉素适配体的浓度为1.5～3.5μm，修饰的用量为20μl；所述孵育的温度为4℃，孵育一段时间为12h。
17.基于所制备光电化学生物传感器检测土霉素的用途，具体步骤如下：
18.(1)将v1体积不同浓度的土霉素标准溶液修饰在步骤(5)制备的aptamer/bi2s
3-cn/ito传感器表面(一个浓度的溶液对应修饰一个传感器，溶液浓度和传感器呈一一对应关系)，孵育后进行检测；以传感器作为工作电极，饱和ag/agcl电极为参比电极，铂丝电极为对电极，利用pec光电化学测试仪检测土霉素的pec信号强度，以pec信号强度为纵坐标，土霉素标准溶液浓度的log值为横坐标，建立相应标准曲线用于实际样品中土霉素浓度的检测；
19.(2)样品土霉素的检测：首先制备样品液，修饰v2体积的样品液于aptamer/bi2s
3-cn/ito传感器表面，通过pec光电化学测试仪测试得到相应的pec信号强度；将信号强度值代入步骤(1)构建的标准曲线，即可获知样品中土霉素的浓度；实现未知样品中土霉素检测的用途。
20.优选的，步骤(1)中所述土霉素溶液的浓度为0.001～1000nm；所述孵育时间2h；所述由pec光电化学测试仪检测pec信号的具体条件为：在0.1m pbs(ph＝6.0)缓冲溶液中进行测试；偏置电压为0.1v。
21.优选的，步骤(1)-(2)中所述v1、v2体积均为20μl。
22.本发明的有益效果：
23.(1)bi2s3与cn具有合适的价带结构，构成新型直接z型异质结，提高可见光利用率，加快电子-空穴分离效率，从而提高光电化学生物传感器检测性能。
24.(2)本发明首次提出光电化学适配体传感方法检测农田土壤土霉素，引入特异性识别元件土霉素的适配体，提高了光电化学生物传感器的选择性，降低了其它类似结构的抗生素的干扰，实现对土霉素的特异性分析。
25.(3)本发明构建的光电化学生物传感器用于土霉素的检测，灵敏度高、选择性好，线性范围为0.001～1000nm，检测限为0.6pm。
附图说明
26.图1光电化学生物传感器构建过程图。
27.图2光电化学生物传感器检测土霉素的线性曲线图。
具体实施方式：
28.下面结合附图对本发明的实施例作详细说明：实施例在本发明的技术方案为前提下进行，给出了详细实施步骤和具体操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
29.本发明的土霉素适配体购自生工生物工程(上海)股份有限公司，其序列为：5
′‑
gga att cgc tag cac gtt gac gct ggt gcc cgg ttg tgg tgc gag tgt tgt gtg gat ccg agc tcc acg tg-3
′
。
30.实施例1：
31.按照图1所述的制备工艺：
32.(1)cn纳米材料的制备：
33.将三聚氰胺(2g)在玛瑙研钵中研磨10min，随后将其放入氧化铝坩埚中，并在500℃加热4h，升温速率为2.3℃/min。在空气中冷却至室温后，收集所得cn粉末；
34.(2)bi2s
3-cn异质结的制备：
35.将bi(no3)3·
5h2o(1.82g)溶解于乙二醇(25ml)中，随后将na2s
·
9h2o(1.35g)溶解于30ml超纯水中，然后将na2s
·
9h2o溶液滴加到bi(no3)3·
5h2o溶液中。快速加入(1)中所制备的cn(12.5mg)粉末并搅拌30min。搅拌结束后转移到特氟隆内衬的高压反应釜中并将其放入真空干燥箱中在160℃下反应12h，等高压反应釜自然冷却至室温，收集bi2s
3-cn异质结沉淀，分别用超纯水和无水乙醇交替洗涤3次去除杂质并烘干备用；
36.(3)氧化铟锡玻璃(ito)电极的预处理：将ito电极(直径为6mm)在1m naoh溶液中煮沸30min，然后依次在无水乙醇和超纯水中超声15min，最后在空气中干燥。
37.(4)取步骤(2)制备的bi2s
3-cn异质结(5mg/ml)20μl修饰到步骤(3)预处理的ito电极表面在室温中干燥，该产品标记为bi2s
3-cn/ito；
38.(5)将20μl(1.5μm)的土霉素适配体修饰在电极表面，并在4℃下孵育12h，该产品标记为aptamer/bi2s
3-cn/ito，获得高特异性检测土霉素的光电化学生物传感器。
39.实施例2：
40.(1)cn纳米材料的制备：
41.将三聚氰胺(2g)在玛瑙研钵中研磨10min，随后将其放入氧化铝坩埚中，并在500℃加热4h，升温速率为2.3℃/min。在空气中冷却至室温后，收集所得cn粉末；
42.(2)bi2s
3-cn异质结的制备：
43.将bi(no3)3·
5h2o(1.82g)溶解于乙二醇(25ml)中，随后将na2s
·
9h2o(1.35g)溶解于30ml超纯水中，然后将na2s
·
9h2o溶液滴加到bi(no3)3·
5h2o溶液中。快速加入(1)中所制备的cn(20mg)粉末并搅拌30min；搅拌结束后转移到特氟隆内衬的高压反应釜中并将其放入真空干燥箱中在160℃下反应12h，等高压反应釜自然冷却至室温，收集bi2s
3-cn异质结沉淀，分别用超纯水和无水乙醇交替洗涤3次去除杂质并烘干备用；
44.(3)氧化铟锡玻璃(ito)电极的预处理：将ito电极(直径为6mm)在1m naoh溶液中煮沸30min，然后依次在无水乙醇和超纯水中超声15min，最后在空气中干燥。
45.(4)取步骤(2)制备的bi2s
3-cn异质结(5mg/ml)20μl修饰到步骤(3)预处理的ito电极表面在室温中干燥，该产品标记为bi2s
3-cn/ito；
46.(5)将20μl(2μm)的土霉素适配体修饰在电极表面，并在4℃下孵育12h，该产品标记为aptamer/bi2s
3-cn/ito，获得高特异性检测土霉素的光电化学生物传感器。
47.实施例3：
48.(1)cn纳米材料的制备：
49.将三聚氰胺(2g)在玛瑙研钵中研磨10min，随后将其放入氧化铝坩埚中，并在500℃加热4h，升温速率为2.3℃/min。在空气中冷却至室温后，收集所得cn粉末；
50.(2)bi2s
3-cn异质结的制备：
51.将bi(no3)3·
5h2o(1.82g)溶解于乙二醇(25ml)中，随后将na2s
·
9h2o(1.35g)溶解于30ml超纯水中，然后将na2s
·
9h2o溶液滴加到bi(no3)3·
5h2o溶液中。快速加入(1)中所制备的cn(25mg)粉末并搅拌30min。。搅拌结束后转移到特氟隆内衬的高压反应釜中并将其放入真空干燥箱中在160℃下反应12h，等高压反应釜自然冷却至室温，收集bi2s
3-cn异质结沉淀，分别用超纯水和无水乙醇交替洗涤3次去除杂质并烘干备用；
52.(3)氧化铟锡玻璃(ito)电极的预处理：将ito电极(直径为6mm)在1m naoh溶液中煮沸30min，然后依次在无水乙醇和超纯水中超声15min，最后在空气中干燥。
53.(4)取步骤(2)制备的bi2s
3-cn异质结(5mg/ml)20μl修饰到步骤(3)预处理的ito电极表面在室温中干燥，该产品标记为bi2s
3-cn/ito；
54.(5)将20μl(2.5μm)的土霉素适配体修饰在电极表面，并在4℃下孵育12h，该产品标记为aptamer/bi2s
3-cn/ito，获得高特异性检测土霉素的光电化学生物传感器。
55.实施例4：
56.(1)cn纳米材料的制备：
57.将三聚氰胺(2g)在玛瑙研钵中研磨10min，随后将其放入氧化铝坩埚中，并在500℃加热4h，升温速率为2.3℃/min。在空气中冷却至室温后，收集所得cn粉末；
58.(2)bi2s
3-cn异质结的制备：
59.将bi(no3)3·
5h2o(1.82g)溶解于乙二醇(25ml)中，随后将na2s
·
9h2o(1.35g)溶解于30ml超纯水中，然后将na2s
·
9h2o溶液滴加到bi(no3)3·
5h2o溶液中。快速加入(1)中所制备的cn(30mg)粉末并搅拌30min。。搅拌结束后转移到特氟隆内衬的高压反应釜中并将其放入真空干燥箱中在160℃下反应12h，等高压反应釜自然冷却至室温，收集bi2s
3-cn异质结沉淀，分别用超纯水和无水乙醇交替洗涤3次去除杂质并烘干备用；
60.(3)氧化铟锡玻璃(ito)电极的预处理：将ito电极(直径为6mm)在1m naoh溶液中煮沸30min，然后依次在无水乙醇和超纯水中超声15min，最后在空气中干燥。
61.(4)取步骤(2)制备的bi2s
3-cn异质结(5mg/ml)20μl修饰到步骤(3)预处理的ito电极表面在室温中干燥，该产品标记为bi2s
3-cn/ito；
62.(5)将20μl(3μm)的土霉素适配体修饰在电极表面，并在4℃下孵育12h，该产品标记为aptamer/bi2s
3-cn/ito，获得高特异性检测土霉素的光电化学生物传感器。
63.实施例5：
64.(1)cn纳米材料的制备：
65.将三聚氰胺(2g)在玛瑙研钵中研磨10min，随后将其放入氧化铝坩埚中，并在500℃加热4h，升温速率为2.3℃/min。在空气中冷却至室温后，收集所得cn粉末；
66.(2)bi2s
3-cn异质结的制备：
67.将bi(no3)3·
5h2o(1.82g)溶解于乙二醇(25ml)中，随后将na2s
·
9h2o(1.35g)溶解于30ml超纯水中，然后将na2s
·
9h2o溶液滴加到bi(no3)3·
5h2o溶液中。快速加入(1)中所制备的cn(37mg)粉末并搅拌30min。搅拌结束后转移到特氟隆内衬的高压反应釜中并将其放入真空干燥箱中在160℃下反应12h，等高压反应釜自然冷却至室温，收集bi2s
3-cn异质结沉淀，分别用超纯水和无水乙醇交替洗涤3次去除杂质并烘干备用；
68.(3)氧化铟锡玻璃(ito)电极的预处理：将ito电极(直径为6mm)在1m naoh溶液中煮沸30min，然后依次在无水乙醇和超纯水中超声15min，最后在空气中干燥。
69.(4)取步骤(2)制备的bi2s
3-cn异质结(5mg/ml)20μl修饰到步骤(3)预处理的ito电极表面在室温中干燥，该产品标记为bi2s
3-cn/ito；
70.(5)将20μl(3.5μm)的土霉素适配体修饰在电极表面，并在4℃下孵育12h，该产品标记为aptamer/bi2s
3-cn/ito，获得高特异性检测土霉素的光电化学生物传感器。
71.以实施例5制备的高特异性检测土霉素的光电化学生物传感器(aptamer/bi2s
3-cn/ito)进行后续的检测步骤：
72.在上述所制得的生物传感器表面修饰20μl不同浓度的土霉素，室温下绑定时间为2h，土霉素浓度依次为0.001nm，0.01nm，0.1nm，1nm，10nm，100nm，1000nm。本发明制得的传感器作为工作电极，饱和ag/agcl电极为参比电极，铂丝电极为对电极，由pec光电化学测试仪记录与检测光电化学信号。在0.1m pbs(ph＝6.0)缓冲溶液中进行测试，外加偏置电压为0.1v。根据土霉素浓度的对数值(logc
otc
)与光电信号的关系绘制工作曲线，从而实现对土霉素的灵敏检测。
73.计算标准液中土霉素浓度c
otc
与电流强度i的线性回归方程，方程公式为i＝0.15072logc
otc
0.40738作为实际检测中的线性方程。通过图2可以看出本发明提出的传感策略，针对土霉素检测的线性范围为0.001-1000nm，跨越6个数量级。
74.实际样品检测步骤如下：
75.(1)选择江苏省镇江市句容市某葡萄园中土壤为样品，采集表层(5cm)土壤，铝箔纸避光低温保存。
76.(2)土壤样品经真空冷冻干燥(6h)，后经研磨，过筛(100目，200目)，避光冷藏(-20℃)。
77.(3)配置提取液：将1000ml 0.4mol/l磷酸氢二钠溶液与294ml 0.2mol/l柠檬酸溶液混合，随后将0.1mol/l na2edta溶液:磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液:甲醇按＝1:1:2(v/v/v)比例混匀，并用naoh溶液和hcl溶液调节ph＝6.0。
78.(4)取1g土壤样品并加入10ml提取液，震荡10min，超声40min，离心10min(4000r/min)收集上清液。
79.(5)土壤样品按照(4)重复提取2次，合并三次上清液，离心10min(4000r/min)收集上清液，并将上清液通过0.22μm水相滤膜过滤。
80.(6)在制备的生物传感器上修饰20μl不同浓度(5)中过滤后的溶液，在室温下绑定时间为2h，最后经由pec光电化学测试仪进行检测。
81.本发明可用于实际样品检测，通过与超高效液相串联质谱仪(uplc-ms/ms)方法进行对比，说明本发明准确性可信，如表一。
82.表一：本发明所构建传感器以及超高效液相串联质谱检测土壤中的otc的检测结
果
[0083][0084][0085]
说明：以上实施例仅用以说明本发明而并非限制本发明所描述的技术方案；因此，尽管本说明书参照上述的各个实施例对本发明已进行了详细的说明，但是本领域的普通技术人员应当理解，仍然可以对本发明进行修改或等同替换；而一切不脱离本发明的精神和范围的技术方案及其改进，其均应涵盖在本发明的权利要求范围内。