可进行多模态示踪的干细胞系、其制备方法与应用

1.本发明涉及生物医学领域，特别涉及一种可进行多模态示踪的干细胞系、其制备方法与应用。


背景技术：

2.近40年来，脑卒中在发展中国家的发病率日益增高[1]，其中脑梗死占80％～85％。脑梗死(brain infarction，缺血性卒中)是临床上常见的急性脑血管病，是危害人类健康的三大死亡原因之一。急性脑梗死可致缺血部位供血量急剧减少，导致神经元、神经胶质细胞及血管内皮细胞等坏死，随后产生炎症反应，血脑屏障破坏，炎性介质浸润，造成不可逆损伤。脑卒中治疗上多遵循传统的思路和方法，如急性期溶栓、经皮血管介入、拜阿司匹林抗凝药物及恢复期的针灸康复理疗等，而溶栓及介入治疗都有各自的适应症及局限性，同时脑梗死常规治疗后的存活者中多数遗留有瘫痪、言语不清等严重的功能障碍，进一步恢复及其困难。
[0003]
静脉注射重组组织型纤溶酶原激活剂(recombinant tissueplasminogen activator，rtpa)是目前公认唯一可用于治疗缺血性脑卒中的方法，但它具有严格的时间窗限制，也不能刺激神经修复和再生。动物实验表明，脑缺血缺氧可刺激内源性神经干细胞增殖，并向缺血损伤迁移分化，进行神经修复[2,3]，但这种自发修复作用非常有限[4]。因此如能应用外源性干细胞植入治疗脑梗死，有可能获得更好的疗效。近年来的干细胞移植在治疗脑梗死的基础与临床研究中取得了较好效果，给脑梗死治疗带来了突破性的进展。
[0004]
干细胞治疗脑梗死的机制包括促进神经再生和抑制炎症反应。实验证明干细胞移植治疗可改善脑梗死小鼠的神经功能，主要是通过减少神经变性、抑制胶质瘢痕形成、促进内源性神经再生、稳定血脑屏障等来实现的[5,6]。hassani等[7]发现正常情况下内源性神经元可少量再生，脑梗死使这一作用有所增强，移植神经干细胞可使这种增殖活动持续增强。移植的干细胞还可适应梗死后微环境，分泌多种组织营养因子、调节免疫反应，促进内环境的稳定[8]。干细胞影响内源性神经再生的机制目前仍尚未阐明，但可能与生长因子、炎性介质的相互作用有关。生长因子如粒细胞集落刺激因子、血管内皮生长因子、转化生长因子α、睫状神经营养因子等已证明与脑梗死后神经再生有关[9-12]。干细胞移植可提高脑源性神经营养因子、成纤维细胞生长因子、血管内皮生长因子等的浓度[6]，促进组织重塑和功能恢复。
[0005]
同时有研究表明，干细胞治疗可以抑制脑内的炎症反应。tobin等[13]发现，脑梗死后的炎症反应对脑组织的损害不仅发生在急性期，还可造成缺血半暗带的长期损伤。bacigaluppi等[5]证明，神经干细胞可通过抑制炎症反应来减少迟发性神经元变性。干细胞分泌的神经因子也可调节梗死后炎症反应[14]。利用干细胞移植来治疗脑梗死，有可能促进内源性神经再生、脑组织自身修复。研究表明，应用干细胞移植治疗脑梗死后48h的大鼠，可促进室管膜下区(subventricular zone，svz)的细胞增殖、迁移及新生神经元的成熟，抑制小胶质细胞及巨噬细胞的炎性反应，改善小鼠的行为功能，这些作用将持续至梗死
后14周[15]。peruzzotti-jametti等[16]指出，炎性介质对梗死后神经再生的影响结果是可变的，这可能与炎性介质的表型、产生作用的细胞分子途径差异有关。
[0006]
干细胞治疗已经在脑梗死方面显示出越来越高的应用价值。然而，目前国内除将造血干细胞用于治疗血液疾病外.绝大部分干细胞治疗尚处于基础研究或实验性临床研究阶段，干细胞治疗应用于临床还有很长的路要走。干细胞体内示踪技术在不损伤移植细胞和靶器官的前提下，在体内以高空间分辨率观察移植干细胞，示踪移植细胞发挥的功能及存活情况[17-19]。干细胞体内示踪技术是以非侵入性方式在活体内示踪干细胞的存活、分布和功能等.其中主要包括光学成像、放射性核素显像和mri等。多模态成像技术集合2种及以上成像技术的优点，可有效检测移植细胞的动向、分化，探索其作用机制[20]，使基础研究更为精准，有利于推动干细胞治疗应用于临床，最终使患者受益。
[0007]
多模态报告基因成像是将报告基因转入干细胞内，表达相关酶或蛋白，通过影像设备进行干细胞示踪[21]。这种成像方式的信号强度不会随着细胞分裂或扩散降低.故可用于长期示踪干细胞。目前常用的报告基因有绿色荧光蛋白(green fluorescent protein，gfp)、萤火虫荧光素酶(firefly luc，fluc)和nis等，荧光蛋白可有助于组织切片观察荧光。干细胞磁共振成像示踪技术(mri)作为最早监测体内移植干细胞的非侵入性成像手段之一，具有很高的时空分辨率。目前常用于干细胞示踪的mri报告基因主要为铁蛋白报告基因[22]。铁蛋白是一种450kd的球状蛋白，由多种重、轻蛋白亚基组成，重链升高，或与轻链结合，可使细胞内铁储备增加。huang等[23]将含有铁蛋白重链1(fth1)基因穿梭质粒(pcdh-cmv-mcs-ef1-copgfp)的慢病毒转染骨髓间充质干细胞，以及超顺磁性氧化铁纳米粒子标记骨髓间充质干细胞，二者分别植入脑缺血再灌注损伤sd大鼠，观察到超顺磁性氧化铁纳米粒子标记骨髓间充质干细胞的mri信号强度随时间逐渐减弱，fth1标记的细胞在10-60天内却表现出相同的信号强度，fth1标记比超顺磁性氧化铁纳米粒子标记更稳定、更适合长期跟踪。但是mri的灵敏度相对较低，需要的对比剂剂量大，造成细胞标记方面困难。干细胞核医学示踪技术是采用正电子发射断层显像(pet)和单光子发射计算机体层摄影术(spect)，通过检测放射性示踪剂在活体中显示被标记细胞的分布及状态的细胞追踪技术。目前常用于核素显像的报告基因有1型单纯疱疹病毒胸苷激酶(hsv1-tk)或其突变株sr39tk[24]、多巴胺d2受体[25]、人钠碘转运体等[26]。pet的灵敏度非常高，但空间分辨率有限，可以通过与mri结合得到部分补偿。与mri相比，pet成像选择合适的核素，能够做到长时间检测细胞并且能够评估它们的生存能力。mri和pet可以高度互补，临床mri-pet扫描器最近已成为现实。pet-mri为将来人体细胞分布、靶向递送、活力和治疗功效的组合成像提供了强大的多模式方法。
[0008]
多模态成像因其独特的优势越来越广泛地运用于干细胞异体移植的相关研究中。在目前新医疗模式的背景下，干细胞多模态成像的研究热点在于成像仪器的不断完善、新的干细胞特异分子靶点和报告基因的发现以及多模态探针的构建。因此，对于现代甚至未来的疾病治疗，特别是干细胞治疗和免疫治疗，结合多模态技术和集成智能探针的活体细胞示踪将具有巨大的潜力。
[0009]
参考文献：
[0010]
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技术实现要素：

[0036]
本发明所要解决的技术问题在于针对上述现有技术中的不足，提供一种可进行多模态示踪的干细胞系、其制备方法与应用。
[0037]
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种可进行多模态示踪的干细胞系，包括：均过表达fth1、sr39tk和egfp三种蛋白的脐带间充质干细胞、脂肪间充质干细胞、人诱导多能干细胞以及血管内皮祖细胞。
[0038]
本发明还提供一种如上所述的可进行多模态示踪的干细胞系的制备方法，包括以下步骤：
[0039]
1)提供脐带间充质干细胞、脂肪间充质干细胞、人诱导多能干细胞和血管内皮祖细胞；
[0040]
2)将目的基因fth1、sr39tk和egfp克隆到plvx载体上，构建得到慢病毒表达载体plvx-fth1-sr39tk-egfp；
[0041]
3)慢病毒包装，获得含有fth1、sr39tk和egfp基因的重组慢病毒；
[0042]
4)用含有fth1、sr39tk和egfp基因的重组慢病毒分别感染脐带间充质干细胞、脂肪间充质干细胞、人诱导多能干细胞以及血管内皮祖细胞，得到均过表达fth1、sr39tk和egfp三种蛋白的四种干细胞，即所述可进行多模态示踪的干细胞系。
[0043]
优选的是，所述步骤1)中提供脐带间充质干细胞的步骤具体包括：
[0044]
1-1-1)将脐带清洗，剪成组织块后置于培养瓶中培养；
[0045]
1-1-2)当瓶中有40％-50％的组织爬出细胞后，进行细胞的传代，使用pbs清洗掉瓶中掉落的组织块和多余杂质；
[0046]
1-1-3)加入胰蛋白酶消化细胞，然后放入co2培养箱37℃下孵育；
[0047]
1-1-4)在倒置显微镜下观察消化后的细胞，细胞有轻微脱落且没掉落的细胞边缘呈圆形时，加入完全培养基中和消化，用移液枪吹打使细胞全部掉落；
[0048]
1-1-5)将细胞悬液离心，弃掉上清，用完全培养基重悬细胞沉淀，吹打成细胞悬液，按所需细胞量进行传代，加入培养基，放入37℃的co2培养箱继续培养。
[0049]
优选的是，所述步骤1)中提供脂肪间充质干细胞的步骤具体包括：
[0050]
1-2-1)将脂肪组织洗净，然后剪成组织块，再去除血管及结缔组织；
[0051]
1-2-1)将脂肪组织转入离心管中，加入等体积的i型胶原酶，37℃水浴锅中震荡消化；
[0052]
1-2-3)加入等体积的pbs终止消化，吹打混匀后将悬液进行离心；
[0053]
1-2-4)离心后的悬液分为三层，上层为脂肪层，中层是液体层，下层是细胞层；用吸管去掉上中层和下层液体，取脂肪层；
[0054]
1-2-5)用pbs重悬脂肪层，过300目细胞筛网，离心；
[0055]
1-2-6)将细胞沉淀重悬于培养基中，培养；
[0056]
1-2-7)弃掉含漂浮细胞的旧培养基，换新培养基；
[0057]
1-2-8)在细胞融合度达到80％以上时进行传代，弃掉原培养基，加入pbs清洗细胞，弃掉pbs；
[0058]
1-2-9)加入胰蛋白酶消化细胞，使胰蛋白酶均匀铺满细胞，然后将细胞培养皿放入co2培养箱37℃下孵育；
[0059]
1-2-10)在倒置显微镜下观察消化后的细胞，细胞有轻微脱落且没掉落的细胞边缘呈圆形时，加入完全培养基中和消化，用移液枪吹打使细胞全部掉落；
[0060]
1-2-11)将细胞悬液离心，弃掉上清，用完全培养基重悬细胞沉淀，吹打成细胞悬液，按所需细胞量进行传代，加入培养基，放入37℃的co2培养箱继续培养。
[0061]
优选的是，所述步骤1)中提供人诱导多能干细胞的步骤具体包括：
[0062]
1-3-1)在离心管中加入e8培养基，然后将人诱导多能干细胞液加入离心管中，混
匀；
[0063]
1-3-2)离心，弃上清，向离心管中再加入e8培养基吹打重悬；
[0064]
1-3-3)将细胞悬液接种于事先用基质胶包被的孔板中，置于37℃培养箱中培养；
[0065]
1-3-4)每天更换培养基，待细胞融合度达80％以上时进行细胞的传代扩增；
[0066]
1-3-5)传代时，吸弃旧的细胞培养基，加入pbs清洗孔板，弃掉pbs；
[0067]
1-3-6)加入消化液，培养箱中孵育；
[0068]
1-3-7)吸弃消化液，加入含有y27632抑制剂的e8培养基，将细胞吹打下来加入新的离心管内，离心；
[0069]
1-3-8)使用e8培养基重悬细胞沉淀，传至新的经过基质胶包被的孔板中。
[0070]
优选的是，所述步骤1)中提供血管内皮祖细胞的步骤具体包括：
[0071]
1-4-1)取脐带血倒入离心管1中，取淋巴细胞分离液倒入离心管2中，将离心管1中的脐带血加入到离心管2中，加入要求为：将离心管2倾斜60度，用巴氏吸管吸取离心管1中的脐带血，并在离心管2的管壁的上方划出“s”弯样的引流带，让脐带血有足够缓慢流入淋巴细胞分离液的路径，加至最后将离心管2放竖直；
[0072]
1-4-2)脐带血加入到淋巴细胞分离液中后，离心，离心完成后，出现四种分层：血浆、白细胞、淋巴细胞分离液和红细胞；将血浆层和白细胞层取出加入到2个新的离心管中，每管补加pbs，进行离心；
[0073]
1-4-3)离心后管底有肉眼可见的红色细胞团，弃掉pbs弃掉，接着每管再补加pbs，离心；
[0074]
1-4-4)离心后弃掉上清，用培养基重悬细胞沉淀，然后将细胞铺入培养瓶进行培养；
[0075]
1-4-5)向培养瓶中加入完全培养基，放入37℃的co2培养箱继续培养；
[0076]
1-4-6)静置，洗去未贴壁的细胞，将贴壁细胞继续培养，培养出血管内皮祖细胞；
[0077]
1-4-7)待细胞融合度达80％以上时进行细胞的传代扩增；
[0078]
1-4-8)传代时，吸弃旧的细胞培养基，加入pbs清洗孔板，弃掉pbs；
[0079]
1-4-9)加入消化液，培养箱中孵育；
[0080]
1-4-10)吸弃消化液，加入含有y27632抑制剂的e8培养基，将细胞吹打下来加入新的离心管内，离心；
[0081]
1-4-11)使用e8培养基重悬细胞沉淀，传至新的经过基质胶包被的孔板中。
[0082]
优选的是，所述步骤3)具体包括：
[0083]
3-1)预先培养293t细胞；
[0084]
3-2)配置质粒转染体系a和b：
[0085]
质粒转染体系a包括opti-mem和pei，质粒转染体系b包括步骤2)得到的慢病毒表达载体质粒plvx-fth1-sr39tk-egfp、opti-mem和三种包装质粒：vsv-g、pmdl、prsv；
[0086]
3-3)将质粒转染体系a加入到质粒转染体系b中，混匀后室温下静置；
[0087]
3-4)将步骤3-3)得到的混合物加入到opti-mem中，混匀；
[0088]
3-5)取培养好的293t细胞，弃去293t细胞中原培养基，将步骤3-4)得到的混合物加入到293t细胞中，并没过293t细胞；
[0089]
3-6)在co2培养箱培养；
[0090]
3-7)取过293t细胞上清液，在冷冻离心机进行离心；
[0091]
3-8)离心后取上清进行再次离心；
[0092]
3-9)离心后，弃上清，留下病毒沉淀，用pbs将沉淀重悬，得到重组慢病毒。
[0093]
优选的是，所述步骤4)具体包括：
[0094]
4-1)预先将四种目的细胞：脐带间充质干细胞、脂肪间充质干细胞、人诱导多能干细胞、血管内皮祖细胞进行培养，然后分别按照以下步骤进行慢病毒感染；
[0095]
4-2)将步骤3)得到的重组慢病毒和聚凝胺加入到无血清培养基中，吹打均匀；
[0096]
4-3)去掉目的细胞中的旧培养基，将步骤4-2)得到的重组慢病毒混合液加入到目的细胞中，并使重组慢病毒混合液没过目的细胞；
[0097]
4-4)进行慢病毒感染，中间补充新鲜的完全培养基；
[0098]
4-5)最终得到均过表达fth1、sr39tk和egfp三种蛋白的脐带间充质干细胞、脂肪间充质干细胞、人诱导多能干细胞以及血管内皮祖细胞，即所述可进行多模态示踪的干细胞系。
[0099]
优选的是，其中，fth1的基因序列如seq id no.1所示，sr39tk的基因序列如seq id no.2所示，egfp的基因序列如seq id no.3所示，慢病毒表达载体plvx-fth1-sr39tk-egfp的基因序列如seq id no.4所示。
[0100]
本发明还提供根据以上所述的可进行多模态示踪的干细胞系或所述的方法制得的可进行多模态示踪的干细胞系作为mri-pet多模态成像的示踪剂的应用。
[0101]
本发明的有益效果是：本发明提供了一种可进行多模态示踪的干细胞系、其制备方法与应用，该干细胞系能够用于mri与pet结合的多模态成像的活体细胞示踪，可有效检测移植细胞的动向、分化，探索其作用机制，有利于推动干细胞治疗应用于临床，能够为制备治疗人脑梗死的活体示踪干细胞试剂提供新的思路和方案。
附图说明
[0102]
图1为本发明的实施例中构建的plvx-fth1-sr39tk-egfp和plvx-egfp的质粒图谱；
[0103]
图2为本发明的实施例中构建的plvx-fth1-sr39tk-egfp和plvx-egfp重组载体的琼脂糖凝胶电泳酶切图；
[0104]
图3为本发明的实施例中构建的两种重组载体转染293t细胞24h后的结果；
[0105]
图4-7为本发明的实施例中构建的四种干细胞的荧光定量pcr和western blot分析结果。
具体实施方式
[0106]
下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
[0107]
应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不排除一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。
[0108]
本发明提供了一种可进行多模态示踪的干细胞系，包括：均过表达fth1、sr39tk和egfp三种蛋白的脐带间充质干细胞、脂肪间充质干细胞、人诱导多能干细胞以及血管内皮
祖细胞。
[0109]
本发明进一步提供了一种如上所述的可进行多模态示踪的干细胞系的制备方法，包括以下步骤：
[0110]
1)提供脐带间充质干细胞、脂肪间充质干细胞、人诱导多能干细胞和血管内皮祖细胞；
[0111]
2)将目的基因fth1、sr39tk和egfp克隆到plvx载体上，构建得到慢病毒表达载体plvx-fth1-sr39tk-egfp；
[0112]
3)慢病毒包装，获得含有fth1、sr39tk和egfp基因的重组慢病毒；
[0113]
4)用含有fth1、sr39tk和egfp基因的重组慢病毒分别感染脐带间充质干细胞、脂肪间充质干细胞、人诱导多能干细胞以及血管内皮祖细胞，得到均过表达fth1、sr39tk和egfp三种蛋白的四种干细胞，即所述可进行多模态示踪的干细胞系。
[0114]
本发明进一步提供了以上所述的可进行多模态示踪的干细胞系或所述的方法制得的可进行多模态示踪的干细胞系作为mri-pet多模态成像的示踪剂的应用。
[0115]
以下据此提供更为详细的实施例。
[0116]
实施例1脐带间充质干细胞、脂肪间充质干细胞、人诱导多能干细胞以及血管内皮祖细胞分离培养
[0117]
1.脐带间充质干细胞(uc-mscs)分离培养
[0118]
1.1取材
[0119]
选择足月妊娠剖宫产孕妇，孕妇及新生胎儿身体健康。在手术后取不短于25cm长的脐带，生理盐水冲洗后放入脐带保护液中，4℃环境下运输，48h内完成原代细胞的分离。需要理解的是，产妇产后的脐带组织，通常情况下是作为医疗废物丢弃的，从脐带组织中分离提取干细胞不存在伦理道德争议，脐带还可以通过科研来源或其他来源获得。
[0120]
1.2脐带间充质干细胞的原代分离提取
[0121]
1.2.1首先在50ml离心管中倒入75％酒精，使用长镊从采集瓶中将整根脐带夹出，放入酒精中，反复振荡清洗，清洗2-3min；
[0122]
1.2.2清洗后，将脐带放入烧杯中，倒入pbs(1％双抗)，反复清洗3遍。倾倒洗液时用长镊抵住脐带，不要掉落出脐带组织；
[0123]
1.2.3将脐带夹入肾性盘中，左手持镊右手持剪刀，将脐带剪成2-3cm的长段；
[0124]
1.2.4用剪刀反复刮脐带段的两端，尽量刮出凝血，边刮边捋直脐带；
[0125]
1.2.5着将脐带段放入新烧杯中，用pbs(1％双抗)反复清洗3次。倾倒洗液时用长镊抵住脐带，不要掉落出脐带组织；
[0126]
1.2.6把清洗后的脐带段放入新的肾性盘中，开始一段一段处理脐带；
[0127]
1.2.7将剪刀沿着脐静脉(最粗的血管)剪开脐带，用镊子将血管内皮一层撕掉，撕掉后脐带自然不卷曲，去掉两条脐动脉；
[0128]
1.2.8接着慢慢撕华通氏胶，尽量撕干净；将撕完的胶放入50ml离心管的底部，用大长镊将胶剪碎，越碎越好；
[0129]
1.2.9碎后用小药勺刮取碎胶进行铺板，铺入t75培养瓶中；
[0130]
1.3细胞的传代扩增
[0131]
1.3.1当一瓶中有40％-50％的组织爬出细胞后，进行细胞的传代；使用pbs清洗掉
瓶中掉落的组织块和多余杂质，pbs清洗2遍；
[0132]
1.3.2加入2ml胰蛋白酶消化细胞，轻晃培养皿使胰蛋白酶均匀铺满细胞，然后将细胞培养皿放入co2培养箱37℃孵育1min；
[0133]
1.3.3在倒置显微镜下观察消化后的细胞，细胞有轻微脱落且没掉落的细胞边缘呈圆形时，尽快加入完全培养基中和消化，防止细胞被过度消化而受损，用移液枪轻轻吹打培养皿底部使细胞全部掉落；
[0134]
1.3.4将细胞悬液加入15ml离心管中，1000rpm离心3min，弃掉上清，用1ml完全培养基重悬细胞沉淀，轻轻吹打成细胞悬液，按所需细胞量进行传代，10cm2细胞培养皿加入10ml培养基，放入37℃的co2培养箱继续培养。
[0135]
2.脂肪间充质干细胞(ad-mscs)分离培养
[0136]
2.1取材
[0137]
脂肪组织来自于做吸脂手术患者的脂肪抽提物(来源是作为医疗垃圾的废物，不存在伦理道德争议)，采集后将脂肪置于保存液中，4℃环境下运输，48h内完成原代细胞的分离。
[0138]
2.2脂肪间充质干细胞的原代分离提取
[0139]
2.2.1将脂肪组织在超净台中转入10cm培养皿中，pbs加双抗洗涤三次。用剪刀及镊子将脂肪组织剪成小块，并在解剖显微镜下去除血管及结缔组织；
[0140]
2.2.2将分离的脂肪组织块转入50ml离心管中(离心管中预加好pbs)，称量后记下体积数，加入等体积的i型胶原酶，37℃水浴锅中震荡消化30min；
[0141]
2.2.3加入等体积的pbs终止消化，吹打混匀后将进行悬液离心，500g 10min；
[0142]
2.2.4离心后的悬液分为三层，上层为脂肪层，中层是液体层，下层是细胞层。用吸管去掉下两层液体，尽量吸掉脂肪层；
[0143]
2.2.5用pbs重悬细胞层，过300目细胞筛网，进行离心350g 5min；
[0144]
2.2.6将细胞沉淀重悬于dmem 10％fbs培养基中并进行计数，按8
×
104/cm2的密度接种；
[0145]
2.2.7 48小时后，弃掉含漂浮细胞的旧培养基，换新培养基。
[0146]
2.3细胞的传代扩增
[0147]
2.3.1在确定细胞生长状态良好且融合度达到80％以上即可进行传代，弃掉原培养基，加入2ml 1
×
pbs清洗细胞，弃掉pbs；
[0148]
2.3.2加入2ml胰蛋白酶消化细胞，轻晃培养皿使胰蛋白酶均匀铺满细胞，然后将细胞培养皿放入co2培养箱37℃孵育1min；
[0149]
2.3.3在倒置显微镜下观察消化后的细胞，细胞有轻微脱落且没掉落的细胞边缘呈圆形时，尽快加入完全培养基中和消化，防止细胞被过度消化而受损，用移液枪轻轻吹打培养皿底部使细胞全部掉落；
[0150]
2.3.4将细胞悬液加入15ml离心管中，1000rpm离心4min，弃掉上清，用1ml完全培养基重悬细胞沉淀，轻轻吹打成细胞悬液，按所需细胞量进行传代，10cm2细胞培养皿加入10ml培养基，放入37℃的co2培养箱继续培养。
[0151]
3.人诱导多能干细胞(ipscs)的传代培养
[0152]
3.1细胞来源
[0153]
人诱导多能干细胞系(ipscs)购买自公司，是表皮来源的人诱导多能干细胞系。
[0154]
3.2细胞的复苏与传代扩增
[0155]
3.2.1首先将冻存管中的细胞迅速放入37℃水浴锅中，轻轻摇晃，待管中冰状物融化完全时，将冻存管拿进生物安全柜，进行后续操作；
[0156]
3.2.2先将15ml离心管中加入3ml的e8培养基，小心打开冻存管，将融化的细胞液缓慢滴加进培养基中，轻轻混匀；
[0157]
3.2.3 200g离心3min，吸弃上清，加入适量的e8培养基，轻柔吹打重悬。
[0158]
3.2.4将细胞悬液接种于事先用基质胶包被的孔板中，置于37℃培养箱中培养；
[0159]
3.2.5每天更换培养基，待细胞融合度达80％以上时进行细胞的传代扩增；
[0160]
3.2.6传代时，吸弃旧的细胞培养基，每孔加入1mlpbs清洗孔板，弃掉pbs；
[0161]
3.2.7加入0.5ml消化液(含0.5mm edta和0.22％nacl的pbs)，培养箱中孵育5min；
[0162]
3.2.8吸弃消化液，加入1ml含有10μm的y27632抑制剂的e8培养基，将细胞轻轻吹打下来加入15ml离心管内；
[0163]
3.2.9细胞悬液进行离心，200g离心3min；
[0164]
3.2.10使用e8培养基重悬细胞沉淀，传至新的经过基质胶包被的孔板中。
[0165]
4.血管内皮祖细胞(epcs)分离培养
[0166]
4.1细胞来源：epcs来源于人脐带血分离出的单个核细胞。
[0167]
4.1.1无菌条件下健康产妇分娩后，立即用止血钳夹住胎儿侧脐带，选择母体端脐带血管暴起处作为穿刺部位，消毒采集，所用200ml容量的采血袋含有枸橼酸钠抗凝剂，4℃环境下运输，4h内完成原代细胞的分离；需要理解的是，产妇产后的脐带组织，通常情况下是作为医疗废物丢弃的，从脐带组织中采集脐带血不存在伦理道德争议，当然脐带血还可以通过商业来源、科研来源或其他来源获得；
[0168]
4.1.2将采血袋消毒后拿进生物安全柜，将出样口剪开，血样倒进50ml离心管中；
[0169]
4.1.3将淋巴细胞分离液倒入两个50ml离心管中，每管15ml。将每管25ml的血样缓慢加入淋巴细胞分离液中，加入要求：将装有分离液的离心管倾斜60度，用巴氏吸管吸取血样后，在分离液管壁的上方划出“s”弯样的引流带，让血样有足够缓慢流入分离液的路径，加至最后将离心管缓慢放竖直；
[0170]
4.1.4血样全部加入分离液后，进行离心，800g下离心25min，20℃，升速1降速0；
[0171]
4.1.5离心完成后，出现四种分层：血浆、白细胞、淋巴细胞分离液和红细胞。小心将血浆层和白细胞层取出加入2个新50ml离心管中，每管补加pbs至40ml，进行离心，600g下离心10min，升速5降速5；
[0172]
4.1.6离心后管底有肉眼可见的红色细胞团，将大部分pbs弃掉，仅留1-2ml上清用来重悬细胞，接着每管再补加pbs至40ml，按上述速度进行离心；
[0173]
4.1.7离心后弃掉上清，用培养基重悬细胞沉淀，按照2
×
106/ml细胞铺入t25培养瓶，进行培养。
[0174]
4.2细胞的传代培养
[0175]
4.2.1分离后的单个核细胞铺入t25瓶中，加入完全培养基(fbss培养基，含10ng/ml vegf、20ng/ml bfgf和egf)，放入37℃的co2培养箱继续培养。
[0176]
4.2.2细胞静置3h后，洗去未贴壁的细胞，将贴壁细胞继续培养4周，每3天换全液，
培养出epcs。
[0177]
4.3细胞的传代扩增
[0178]
4.3.1在确定细胞生长状态良好且融合度达到80％以上即可进行传代，弃掉原培养基，加入2ml 1
×
pbs清洗细胞，弃掉pbs；
[0179]
4.3.2加入2ml胰蛋白酶消化细胞，轻晃培养皿使胰蛋白酶均匀铺满细胞，然后将细胞培养皿放入co2培养箱37℃孵育1min；
[0180]
4.3.3在倒置显微镜下观察消化后的细胞，细胞有轻微脱落且没掉落的细胞边缘呈圆形时，尽快加入完全培养基中和消化，防止细胞被过度消化而受损，用移液枪轻轻吹打培养皿底部使细胞全部掉落；
[0181]
4.3.4将细胞悬液加入15ml离心管中，1000rpm离心4min，弃掉上清，用1ml完全培养基重悬细胞沉淀，轻轻吹打成细胞悬液，按所需细胞量进行传代，10cm2细胞培养皿加入10ml培养基，放入37℃的co2培养箱继续培养。
[0182]
实施例2构建慢病毒表达载体plvx-fth1-sr39tk-egfp
[0183]
本实施例中，通过pcr、酶切、酶连的方法将目的基因fth1、sr39tk和egfp克隆到了plvx载体上，同时为了能够方便之后对病毒的表达效率的判断，同时在载体上融合表达了egfp报告基因，得到了慢病毒表达载体plvx-fth1-sr39tk-egfp。参照图1为本实施例中构建的plvx-fth1-sr39tk-egfp和plvx-egfp的质粒图谱。
[0184]
随后又通过pcr对plvx-fth1-sr39tk-egfp载体进行目的基因的体外扩增，琼脂糖凝胶电泳条带结果正确。参照图2为plvx-fth1-sr39tk-egfp(a)和plvx-egfp(b)重组载体的琼脂糖凝胶电泳酶切图，其中，m:10000bp marker，1：fth1片段，2：sr39tk片段，3：egfp片段，4：egfp片段。
[0185]
随后又用相同的方法构建了plvx-egfp慢病毒载体，该载体是只含有egfp基因的plvx载体，可作为实验中的对照载体。
[0186]
本实施例中，fth1的基因序列如seq id no.1所示，sr39tk的基因序列如seq id no.2所示，egfp的基因序列如seq id no.3所示，慢病毒表达载体plvx-fth1-sr39tk-egfp的基因序列如seq id no.4所示。
[0187]
实施例3构建重组慢病毒
[0188]
1、慢病毒包装
[0189]
1.1提前将293t细胞铺入10cm2大皿中，用完全培养基培养细胞，当细胞融合量在70％-80％时进行后续实验；
[0190]
1.2取2个2ml的ep管，第一管中加入400μl opti-mem和三种包装质粒与目的质粒(plvx-fth1-sr39tk-egfp)，第二管中加入400μl opti-mem和50μl pei，三种包装质粒的质量分别为：vsv-g 2.5μg、pmdl 6.5μg、prsv3.5μg，目的质粒质量为：10μg；根据质粒浓度算出加入体积，四种质粒依次加入培养基中；
[0191]
1.3将两管培养基进行混匀，需将加入pei的培养基加入带质粒的培养基中，顺序不能颠倒，轻轻吹打混匀后室温静置10min；
[0192]
1.4将混合好的1ml培养基加入3ml opti-mem中，混匀；
[0193]
1.5从co2培养箱中拿出培养好的293t细胞，弃掉细胞中原培养基，加入混合好的4ml培养基，确保培养基能够没过细胞；
[0194]
1.6在co2培养箱培养6-8h后补足培养基至10ml，接着培养48h；
[0195]
2慢病毒浓缩
[0196]
2.1从大皿中取出10ml的293t细胞上清液，放入50ml离心管；
[0197]
2.2放入冷冻离心机进行离心，4℃，1000g，10min；
[0198]
2.3离心后将上清放入灭菌好的高速离心管中，称量重量后，用相同的高速离心管进行配平，重量精确到小数点后3位相同；
[0199]
2.4高速离心机进行离心，4℃，50000g，3h；
[0200]
2.5离心后，离心管底部可见灰白色颗粒沉淀，弃上清，上清一定充分吸干，注意不要吸走沉淀；
[0201]
2.6使用冰pbs轻轻地将沉淀重悬，得到病毒，将其进行分装，置于-80℃冰箱长期保存。
[0202]
将这两种重组载体分别转染293t细胞，24h后观察质粒转染效率；并收取了48h后的病毒悬液。参照图3，为两种重组载体转染293t细胞24h后的结果。
[0203]
实施例4构建可进行多模态示踪的干细胞系
[0204]
1.首先将四种细胞(脐带间充质干细胞、脂肪间充质干细胞、人诱导多能干细胞、血管内皮祖细胞)从培养皿中消化下来，离心重悬成细胞悬液后以每孔1
×
106个细胞的密度铺入六孔板中，在完全培养基中进行培养，将孔板置于37℃co2培养箱中培养24h后进行慢病毒感染实验；
[0205]
2.感染实验前，准备无菌ep管配制病毒液；以每孔500μl的体积将无血清培养基加入ep管，管中同时加入重组病毒和聚凝胺(polybrene)，病毒以感染复数(moi)＝1的体积加入培养基中，moi的计算公式＝病毒滴度tu/ml
×
(病毒体积/细胞个数)，根据病毒滴度和细胞个数计算出病毒体积，将得到的体积量加入无血清培养基中，同时加入polybrene(2.5μg/ml)以提高病毒的感染效率，将培养基轻轻吹打均匀；
[0206]
3.感染时，弃掉细胞中旧培养基，以每孔500μl的体积加入混合好的病毒液，轻轻晃动孔板，使病毒液充分铺过细胞；
[0207]
4.在感染6-8h后每孔补充1.5ml新鲜的完全培养基；
[0208]
5.继续培养48h后弃掉原培养基，加入新鲜培养基培养后24h，进行荧光定量pcr和western blot实验(免疫印迹试验)，验证重组病毒是否在四种细胞内开始表达。
[0209]
实施例5荧光定量pcr
[0210]
1.提取细胞rna
[0211]
1.1将铺好板的细胞拿出，弃培养基，加入pbs洗，弃pbs，放于冰上15min；
[0212]
1.2配置裂解液：350ul trk lysls buffer 7ulβ-巯基乙醇，每孔加入350ul，吹打细胞完全掉落；
[0213]
1.3加入至1.5ml的ep管中，14000rpm离心5min，取上清进新的1.5ml的ep管中，加入等体积350ul 70％酒精，混匀后加入至纯化柱中；
[0214]
1.4离心14000r 1min，弃收集管内的液体；
[0215]
1.5加300ul rna wash bufferⅰ，14000r离心30s，弃收集管内的液体；
[0216]
1.6加500ul rna wash bufferⅰ，14000r离心30s，弃收集管内的液体；
[0217]
1.7加500ul rna wash bufferⅱ，14000r离心30s，弃收集管内的液体；
[0218]
1.8加500ul rna wash bufferⅱ，14000r离心30s，弃收集管内的液体；
[0219]
1.9空转，14000r离心1min，弃收集管，置于新的ep管中；
[0220]
1.10加30ul depc water，14000r离心1min，弃掉纯化柱；
[0221]
1.11管内的液体即为纯化后的rna，检测提取的rna浓度。
[0222]
2.反转录
[0223]
2.1反转录体系为：
[0224][0225]
2.2体系混匀后，进行瞬时离心。上pcr仪，程序为：
[0226][0227]
2.3rna反转录为cdna，置于-80℃进行保存。
[0228]
3pcr
[0229]
3.1pcr反应体系为：(引物见下表1)
[0230][0231]
3.2体系混匀后，进行瞬时离心。上pcr仪，程序为：
[0232][0233]
表1 pcr引物序列
[0234]
[0235][0236]
实施例6免疫印迹试验
[0237]
1.蛋白样品的制备
[0238]
1.1每组样本至少需要六孔板的2个孔，拿出培养板，不弃培养基，用细胞刮刀刮干净孔底的细胞层；
[0239]
1.2刮下来后放入ep管中，及时插入冰上。进行离心，3000rpm，5min，4℃；
[0240]
1.3裂解蛋白：样品 蛋白裂解液(ripa，1:1) 蛋白酶抑制剂(100:1)。用裂解液反复吹打细胞沉淀，在冰上或者4℃放置15min；
[0241]
1.4超声：超声5-6次。超声前，用冰水清洗探头，起降温作用，每超声完一个样品都要用冰水清洗并用无纺布擦拭干净；
[0242]
1.5加入sds上样缓冲液，样品：sds上样缓冲液＝4:1；
[0243]
1.6 100℃水煮10min，-20℃保存一个月。再次拿出使用需再水煮5min。
[0244]
2制胶
[0245]
2.1玻璃板和梳子用1.0mm的，在槽上卡住，检查是否漏水，加入无菌水，水与板面齐平；
[0246]
2.2配制分离胶：用50ml离心管配制，加入分离胶后，加入1ml异丙醇压平胶面，去除气泡，凝固40-50min；
[0247]
2.3配制浓缩胶：用50ml离心管配制，倒掉异丙醇，并用无纺布擦干净。加入浓缩胶，立刻插入1.0mm梳子，凝固20min。
[0248]
3上样
[0249]
3.1拿下胶板，拔出梳子，拔歪的胶可以用注射器针头铺平；
[0250]
3.2把胶板放入电泳仪内，外层加入回收1
×
running buffer的，中间加入新的1
×
running buffer；
[0251]
3.3样品上样前混匀一下，一孔上10μl的样品，每个样上3个复孔，样品两边加上蛋白marker；
[0252]
3.4上样完毕后，红线接正极黑线接负极，先120v跑15min，让样品充分跑完浓缩胶后，再调电压，使样品在分离胶中更好的分开，电压调为150v50min。
[0253]
4转膜
[0254]
4.1剪跟胶一样大小的pvdf膜，把膜放入甲醇中进行激活；
[0255]
4.2拿出夹胶板，用绿色板撬开玻璃板，去掉多余的胶，不要浓缩胶和条带以外的胶；
[0256]
4.3在白盘上倒1
×
transfer buffer，把胶和黑红板放在buffer中，充分浸湿，三明治结构为黑板 海绵 滤纸 胶 膜 滤纸 海绵 红板，注意正反，每层间不能有气泡；
[0257]
4.4放入电泳仪，正极对正极，负极对负极，倒上1
×
transfer buffer，要没过膜板。放冰中进行转膜，150v 240ma，转膜2h。
[0258]
5封闭与抗体孵育
[0259]
5.1封闭液的配制：脱脂奶粉(5％) tbst，膜在摇床上进行封闭，封闭30min；
[0260]
5.2用tbst清洗3次，每次5min；
[0261]
5.3敷一抗，根据抗体说明书进行稀释，4
°
过夜或者室温3h孵育；
[0262]
5.4用tbst清洗3次，每次5min；
[0263]
5.5敷二抗，根据抗体说明书进行稀释，室温1h；
[0264]
5.6用tbst清洗3次，每次5min。
[0265]
6显影
[0266]
显影工作液配制后，镊子夹出pvdf膜在无纺布上蘸干，在western blot盒里加上显影液，膜的正反都蘸上显影液，把膜放在仪器的板子中间，上机检测。
[0267]
两种重组慢病毒载体分别感染uc-mscs、ad-mscs、ipscs和epcs后，为了证明重组载体上的外源基因正常表达，本发明按照实施例5和6使用荧光定量pcr技术和western blot进行了基因的检测和定量分析。由图4-图7中，所有图a的western blot结果可见，plvx-fth1-sr39tk-egfp重组载体感染后不同基因的蛋白水平均正常表达。由所有图b可知，两种重组载体的外源基因mrna的相对表达量具有显著性差异。图4为脐带间充质干细胞表达重组载体的分析结果，图5为脂肪间充质干细胞表达重组载体的分析结果，图6为人诱导多能干细胞表达重组载体的分析结果，图7为血管内皮祖细胞表达重组载体的分析结果。
[0268]
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节。