一种羧甲基壳聚糖水凝胶的制备方法及应用

1.本发明涉及水凝胶的制备技术领域，尤其涉及羧甲基壳聚糖水凝胶的制备方法及应用。


背景技术：

2.高分子水凝胶是一种能够在水中溶胀，吸收并保持大量水分而又不溶解于水的三维聚合物溶胀体。水凝胶网络中可以充斥大量的水分，结构上与机体组织相似，具有良好的生物相容性和尺寸可调节的多孔结构，现已被广泛地用于隐形眼镜、组织工程、诊断学、药物控制释放等生物医学领域。
3.羧甲基壳聚糖是一种水溶性的壳聚糖衍生物，具备良好的生物相容性和生物降解性，有很多医学功效，如促进创面愈合、止血和抑菌作用，在愈合创伤类生物材料中广泛应用。化学交联制备羧甲基壳聚糖水凝胶大多数采用自由基聚合和交联剂这两种方法，但是它们有一定的局限性。
4.如一篇公开号为cn 110180017 a的中国发明专利申请公开一种多功能双组份水凝胶组织粘合剂的制备方法，包括以下步骤：1）羧甲基壳聚糖cmc加入去离子水中得到cmc溶液；邻硝基苯甲醇nb加入去离子水得到nb悬浊液；2）在cmc溶液中加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐edc得到cmc混合液，并在nb悬浊液中加入n-羟基琥珀酰亚胺nhs，得到nb混合液；3）将nb混合液加入cmc混合液，搅拌、透析；冷冻干燥、避光保存nb-cmc；4）将nb-cmc与cmc搅拌溶解得到双组份水凝胶粘合剂溶液；5）将双组份水凝胶粘合剂溶液采用紫外光照射制得nb-cmc/cmc双组份水凝胶粘合剂。
5.该发明所制得的水凝胶粘合剂虽然具有良好的生物相容性、生物可降解性，同时具有凝血及抗菌功能；但是，其反应机理是：将nb-cmc与cmc混合在一起进行一种基于席夫碱的动态交联，不仅力学性能差，而且在制备水凝胶时需要另外添加cmc。


技术实现要素：

6.针对现有技术中存在的问题，本发明的目的在于提供一种制备方法更加简单易行，产物力学性能好且无毒性隐患的羧甲基壳聚糖水凝胶的制备方法及应用。
7.为达到以上目的，本发明采用如下技术方案。
8.一种羧甲基壳聚糖水凝胶的制备方法，其包括如下步骤：1）合成4-羟甲基-3-硝基苯甲酸； 2）制备4-羟甲基-3-硝基苯甲酰化羧甲基壳聚糖（nba-cmc）；3）制备水凝胶，将4-羟甲基-3-硝基苯甲酰化羧甲基壳聚糖（nba-cmc）溶于水，然后在紫外灯照射下，使4-羟甲基-3-硝基苯甲酰化羧甲基壳聚糖（nba-cmc）自带的分子间、制得羧甲基壳聚糖水凝胶。
9.其中，4-羟甲基-3-硝基苯甲酸的合成方法为：1）将4-(溴甲基)-3-硝基苯甲酸、碳酸钠和丙酮水混合物混合在一起，2）回流反应、丙酮抽干、加入hcl溶液调节ph值，3）用乙酸乙酯萃取，干燥，浓缩得到固体4-羟甲基-3-硝基苯甲酸。
10.更为优选的是，4-羟甲基-3-硝基苯甲酸的合成方法为：1）向容器中依次加入2.5
份的4-(溴甲基)-3-硝基苯甲酸、4.07份的碳酸钠和80份的丙酮水混合物；2）回流反应5 h，丙酮抽干，加入6 n hcl溶液调节ph值为2；3）用乙酸乙酯萃取，干燥，浓缩得到固体4-羟甲基-3-硝基苯甲酸；4-(溴甲基)-3-硝基苯甲酸和碳酸钠为质量份，单位为g；丙酮水混合物为体积份，单位为ml；丙酮水混合物中，丙酮和水按1:1的体积比混合。
11.更为优选的是，4-羟甲基-3-硝基苯甲酰化羧甲基壳聚糖（nba-cmc）的制备方法为：a）将4-羟甲基-3-硝基苯甲酸、 1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和n,n'-二琥珀酰亚胺基碳酸酯加入到二甲亚砜中，反应两个小时；b）将上述步骤a）所得溶液加入到羧甲基壳聚糖溶液中反应过夜，透析除去小分子，得到4-羟甲基-3-硝基苯甲酰化羧甲基壳聚糖（nba-cmc）。
12.更为优选的是，4-羟甲基-3-硝基苯甲酰化羧甲基壳聚糖（nba-cmc）的制备方法为：a）将54份的4-羟甲基-3-硝基苯甲酸、53份的1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和33份的n,n'-二琥珀酰亚胺基碳酸酯加入到10份的二甲亚砜中，反应两个小时以上；b）将上述步骤a）所得溶液加入到20份的羧甲基壳聚糖溶液中反应过夜，透析除去小分子，得到4-羟甲基-3-硝基苯甲酰化羧甲基壳聚糖；4-羟甲基-3-硝基苯甲酸、1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和n,n'-二琥珀酰亚胺基碳酸酯为质量份，单位为mg；二甲亚砜和羧甲基壳聚糖溶液为体积份，单位为ml；羧甲基壳聚糖溶液的浓度为1-1.5mg/ml。
13.更为优选的是，4-羟甲基-3-硝基苯甲酰化羧甲基壳聚糖（nba-cmc）的制备方法为：a）将75份的4-羟甲基-3-硝基苯甲酸、73份的1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和46份的n,n'-二琥珀酰亚胺基碳酸酯加入到10份的二甲亚砜中，反应两个小时以上；b）将上述步骤a）所得溶液加入到20份的羧甲基壳聚糖溶液中反应过夜，透析除去小分子，得到4-羟甲基-3-硝基苯甲酰化羧甲基壳聚糖；4-羟甲基-3-硝基苯甲酸、1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和n,n'-二琥珀酰亚胺基碳酸酯为质量份，单位为mg；二甲亚砜和羧甲基壳聚糖溶液为体积份，单位为ml；羧甲基壳聚糖溶液的浓度为1-1.5mg/ml。
14.更为优选的是，在制备水凝胶过程中，紫外灯波长为365nm，功率100mw/cm2，照射时长为3分钟。
15.本发明还提供一种如上所述制备方法制得的羧甲基壳聚糖水凝胶在创口敷料上的应用。
16.本发明还提供一种如上所述制备方法制得的羧甲基壳聚糖水凝胶在组织工程支架材料上的应用。
17.本发明还提供一种如上所述制备方法制得的羧甲基壳聚糖水凝胶在药物载体上的应用。
18.本发明的有益效果是：利用羧甲基壳聚糖和4-羟甲基-3-硝基苯甲酸n-羟琥珀酸亚胺酯反应制备水溶性的4-羟甲基-3-硝基苯甲酰化羧甲基壳聚糖，然后在紫外灯照射下，使水溶性的4-羟甲基-3-硝基苯甲酰化羧甲基壳聚糖的自带的分子间发生交联反应形成水凝胶，因此无需另外添加cmc，只需要一种组分产生水凝胶。
19.同时，由于4-羟甲基-3-硝基苯甲酰化羧甲基壳聚糖的自带的分子间发生的是邻硝基苯甲醇和伯胺的环化反应，从而自身交联水凝胶，是一种化学键交联的水凝胶（吲唑酮的交联网络），不是动态的席夫碱键交联，力学性能强，水凝胶应用范围更广。
20.另外，由于在形成水凝胶时，只用4-羟甲基-3-硝基苯甲酰化羧甲基壳聚糖一种反
应原料即可，不需额外添加试剂（如cmc等），制备方法更加简单易行，产物结构更加容易控制。
附图说明
21.图1所示为nba-cmc合成中步骤a）的反应机理图。
22.图2所示为nba-cmc合成中步骤b）的反应机理图。
23.图3所示为水凝胶的反应机理图。
24.图4所示为nba-cmc 1、nba-cmc 2的 核磁氢谱图。
25.图5所示为nba-cmc 1、nba-cmc 2、水凝胶hydrogel 1和hydrogel 2的红外谱图。
26.图6a所示为水凝胶hydrogel 1的扫描电镜图。
27.图6b所示为水凝胶hydrogel 2的扫描电镜图。
28.图7所示为水凝胶hydrogel 1和hydrogel 2在不同形变下（1-10%）的存储模量（ｇ’）以及损耗模量（ｇ”）图。
29.图8a所示为水凝胶hydrogel 1与细胞共培养的定性试验结果。
30.图8b所示为水凝胶 hydrogel 2与细胞共培养的定性试验结果。
31.图9所示为水凝胶与细胞共培养的细胞毒性定量试验结果。
具体实施方式
32.下面结合说明书的附图，对本发明的具体实施方式作进一步的描述，使本发明的技术方案及其有益效果更加清楚、明确。下面通过参考附图描述实施例是示例性的，旨在解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
33.本发明的附加方面和优点将在下面的描述部分中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
34.实施例1。
35.一种羧甲基壳聚糖水凝胶的制备方法，其包括如下步骤。
36.1）合成4-羟甲基-3-硝基苯甲酸：向250 ml烧瓶中依次加入4-(溴甲基)-3-硝基苯甲酸（2.50 g，9.61 mmol）和碳酸钠(4.07 g，38.40 mmol)和80 ml丙酮水混合物（体积比1：1），然后回流反应5 h，丙酮抽干，加入6 n hcl溶液调节ph值为2，用乙酸乙酯萃取，干燥，浓缩得到固体4-羟甲基-3-硝基苯甲酸，产率90%。
37.2）制备4-羟甲基-3-硝基苯甲酰化羧甲基壳聚糖（nba-cmc）。
38.a）54 mg 4-羟甲基-3-硝基苯甲酸（nba），53 mg 1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺（edc），33 mg n,n'-二琥珀酰亚胺基碳酸酯（nhs）加入到10 ml 二甲亚砜中，反应两个小时。反应过程如图1所示。
39.b）将上述步骤a）所得溶液加入到20 ml羧甲基壳聚糖（25 mg）溶液中反应过夜，透析48 h除去小分子，得到4-羟甲基-3-硝基苯甲酰化羧甲基壳聚糖nba-cmc 1，产率80%。反应过程如图2所示。
40.3）水凝胶的制备：将4-羟甲基-3-硝基苯甲酰化羧甲基壳聚糖nba-cmc 1溶于水，浓度均为15 mg/ml，然后在紫外灯（紫外灯波长365nm，功率100mw/cm2）光照3分钟，产生水凝胶hydrogel 1。反应过程如图3所示。
41.实施例2。
42.一种羧甲基壳聚糖水凝胶的制备方法，其包括如下步骤。
43.1）合成4-羟甲基-3-硝基苯甲酸：向250 ml烧瓶中依次加入4-(溴甲基)-3-硝基苯甲酸（2.50 g，9.61 mmol）和碳酸钠(4.07 g，38.40 mmol)和80 ml丙酮水混合物（体积比1：1），然后回流反应5 h，丙酮抽干，加入6 n hcl溶液调节ph值为2，用乙酸乙酯萃取，干燥，浓缩得到固体4-羟甲基-3-硝基苯甲酸，产率90%。
44.2）制备4-羟甲基-3-硝基苯甲酰化羧甲基壳聚糖（nba-cmc）。
45.a）75 mg 4-羟甲基-3-硝基苯甲酸，73 mg 1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺，46 mg n,n'-二琥珀酰亚胺基碳酸酯加入到10 ml 二甲亚砜中，反应两个小时。
46.b）将上述步骤a中所的溶液加入到20 ml羧甲基壳聚糖（25 mg）溶液中反应过夜，透析48 h除去小分子得到4-羟甲基-3-硝基苯甲酰化羧甲基壳聚糖nba-cmc 2，产率78%。
47.3）水凝胶的制备：将4-羟甲基-3-硝基苯甲酰化羧甲基壳聚糖nba-cmc 2溶于水，浓度均为15 mg/ml，然后在紫外灯（紫外灯波长365nm，功率100mw/cm2）光照3分钟，产生水凝胶hydrogel 2。
48.需要说明的是，4-羟甲基-3-硝基苯甲酸的合成可以采用现有已知的或将来能够实现的其他方法，不限于以上举例。
49.在制备制备4-羟甲基-3-硝基苯甲酰化羧甲基壳聚糖时，4-羟甲基-3-硝基苯甲酸、 1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺、 n,n'-二琥珀酰亚胺基碳酸酯、二甲亚砜和羧甲基壳聚糖的用量，以及步骤a）、步骤b）的反应时长等，可以根据实际需要进行适当调整，不限于以上举例。
50.性能分析。
51.1、用核磁氢谱（1h-nmr，400 mhz，d2o）表征nba-cmc 1、nba-cmc 2的结构，如图4所示。图4中，δ8.50ppm、8.10ppm和 7.85 ppm是苯环氢的化学位移，说明4-羟甲基-3-硝基苯甲酰化羧甲基壳聚糖合成成功。根据积分比计算修饰度分别为9.1%和14.5%。
52.2、傅立叶变换红外光谱(ft-ir)测试。
53.分别称取一定量的nba-cmc1、nba-cmc2、水凝胶冻干样品hydrogel 1 和hydrogel 2进行红外检测，红外(ir)测试采用bruker公司傅立叶红外光谱仪，扫描范围4000-5000cm-l
，kbr压片。
54.测试结果如图5所示。从图5可以看出：nba-cmc1、nba-cmc2、hydrogel 1 和hydrogel 2的c=o（酰胺i）伸缩振动峰出现在1641cm-1
处，hydrogel 1 和hydrogel 2在1416cm-1
处的吸收峰归因于c-n伸缩振动产生的。
55.3、扫描电镜测试(sem) 。
56.取2种不同的水凝胶冻干样品，在冷场发射式扫描电镜（zeiss sigma 300）的样品板上，在真空环境下进行表面喷金处理，然后将样品板固定于电镜样品台上，观察并拍摄水凝胶的内部结构。测试结果如图6a和图6b所示。其中，图6a为hydrogel 1的扫描电镜图，图6b为hydrogel 2的扫描电镜图。
57.从图6a和图6b可以看出：hydrogel 1和hydrogel 2 内部均为三维网络结构。hydrogel 1 的孔径比hydrogel 2稍微大一些，原因是修饰度的增加，交联密度增加，孔径变小。
58.4、水凝胶的流变性能测试。
59.两种水凝胶的流变性能测试是在gemini hr nano的动态流变仪上进行的，所用的样品测试锥板(直径2cm，顶角2度，间隙70微米)。先在固定应变下确定其粘弹区域，再分别测定样品的性能。测试出样品的储存模量(g’)和损耗模量(g”) 。测试结果如图7所示。
60.从图7可以看出：hydrogel 1和hydrogel 2的存储模量、损耗模量都非常理想。交联密度越大的水凝胶其储存模量也越大，且损耗模量也呈现这种趋势。
61.5、水凝胶的细胞毒性。
62.1）定性测试。将小鼠成纤维细胞（nih3t3）加入到6孔板中，保证每孔细胞数占板的80%-90%以上，贴壁24h后，换新鲜培养基2 ml并且加入两种水凝胶共培养24 h，然后在倒置显微镜下观察细胞生长活性与存活数量。测试结果如图8a和图8b所示。其中图8a代表水凝胶hydrogel 1与细胞共培养的定性试验结果，图8b所示为和水凝胶hydrogel 2与细胞共培养的定性试验结果。
63.从图8a和图8b可以看出：细胞生长良好。
64.2）定量测试。20μl不同浓度 nba-cmc 1和nba-cmc 2 加入96孔板中，紫外灯光照6分钟，将nih3t3细胞加入到96孔板中，保证每孔浓度在4000个左右，贴壁24 h后，去除培养基，加入180 μl的新鲜培养基和20 μl mtt (5mg/ml)共培养4 h后，去除培养基，加入150 μl的dmso（二甲基亚砜），震荡l0 min后，在570 nm波长下检测，结果如图9所示。mtt为噻唑蓝，又称3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴盐。
65.从图9可以看出：细胞的存活率在90％以上，说明水凝胶对细胞无毒性。
66.通过上述的结构和原理的描述，所属技术领域的技术人员应当理解，本发明不局限于上述的具体实施方式，在本发明基础上采用本领域公知技术的改进和替代均落在本发明的保护范围，本发明的保护范围应由各权利要求项及其等同物限定之。具体实施方式中未阐述的部分均为现有技术或公知常识。