一种细胞色素P450BM3突变酶及其在生物催化合成对羟基联苯中的应用的制作方法

一种细胞色素p450 bm3突变酶及其在生物催化合成对羟基联苯中的应用
技术领域
1.本发明涉及生物工程技术领域，特别涉及一种细胞色素p450 bm3突变酶及其在生物催化合成对羟基联苯中的应用。


背景技术：

2.对羟基联苯为白色针状或片状固体，分子式为c
12h10
o，分子量为170，cas号为92-69-3，熔点为164.5℃，沸点为306.5℃，几乎不溶于水。可以用作染料；树脂和橡胶的中间体。用它合成的红光增感，绿光增感染料是彩色影片的主要原料之一。也可用作分析试剂，如，比色测定乙醛和乳酸、定量测定胞壁酸。脱氧核糖核酸酶ⅰ的抑制剂。染料、树脂和橡胶的中间体、杀菌剂、水溶性漆的增溶剂。其合成主要以磺化法生产苯酚的副产蒸馏残渣为原料，通过真空蒸馏截取苯基苯酚馏分，再用邻苯基苯酚与对苯基苯酚在三氯乙烯中的溶解度差异，实现异构体分离。也可由对氯联苯在高温下水解而得。该方法存在收率不高、不环保、操作繁琐等问题。
3.细胞色素p450单加氧酶(p450)可以高效率、高选择性地催化各种具有复杂骨架有机化合物进行氧化反应，被誉为自然界的万能催化剂。近年来，利用p450单氧化酶催化c-h键活化的研究越来越多。p450 bm3(cyp102a1)是一种来源于巨大芽胞杆菌(bacillus megaterium)的脂肪酸羟化酶，其独特性在于p450 bm3是一种天然的血红素铁依赖的单氧化酶和能传递电子的nadph依赖的黄素还原酶的融合酶，其拥有自给自足的电子传递系统，仅需添加nadph就能启动反应。p450 bm3单氧化酶的这种优势使其成为近年来的研究热点，特别是针对其对非天然底物的选择性低的问题，通过蛋白质工程对其进行定向进化改造，以控制其选择性，甚至创造原始p450所不能催化的新的反应类型。
4.因此，有必要开发一种具有较高催化效率的细胞色素p450突变体用于生物催化合成对羟基联苯。


技术实现要素：

5.本发明目的是提供一种催化产品及其在生物催化合成对羟基联苯中的应用，筛选出一种细胞色素p450 bm3突变酶，相比与野生型有更高的催化效率。
6.在本发明的第一方面，提供了一种细胞色素p450 bm3突变酶，所述细胞色素p450 bm3突变酶为在野生型细胞色素p450bm3单加氧酶的氨基酸序列的第87位和/或第267位中进行了氨基酸突变，包括：
7.进一步地，所述细胞色素p450 bm3突变酶为单一位点的点突变，所述点突变包括：e267v或者f87g；
8.或者所述细胞色素p450 bm3突变酶为两个位点的突变，为e267v和f87g。
9.进一步地，编码所述细胞色素p450 bm3突变酶的核苷酸序列如seq id no：2或seq id no：3所示。
10.在本发明的第二方面，提供了一种编码所述细胞色素p450 bm3突变酶的核酸分子。
11.在本发明的第三方面，提供了一种细胞色素p450 bm3突变酶表达载体，所述表达载体包含有所述核酸分子。
12.进一步地，所述表达载体包括原核表达载体和病毒载体中的一种。
13.在本发明的第四方面，提供了一种包含所述表达载体的重组菌或工程化细胞系。
14.在本发明的第五方面，提供了一种所述的细胞色素p450 bm3突变酶或所述的核酸分子或所述表达载体或所述的重组菌或工程化细胞系在催化合成对羟基联苯中的应用。
15.在本发明的第六方面，提供了提供了一种催化联苯素合成对羟基联苯的方法，所述方法包括：以联苯为底物，用所述所述细胞色素p450 bm3突变酶催化合成产物对羟基联苯。
16.进一步地，所述方法具体包括：在缓冲反应液中，加入所述细胞色素p450 bm3突变酶，后加入底物联苯和nadph混匀进行生物催化反应，经分离，获得对羟基联苯。
17.在缓冲溶液中加入一定浓度的酶和底物，再加入辅酶nadph来启动反应，实现底物的催化氧化，反应时振动可以加速反应进行。辅酶nadph的终浓度优选为200～300μm。加大酶和辅酶的用量会加快反应速度，有利于合成，酶的用量根据底物浓度进行调整。
18.进一步地，所述催化反应的温度为36～38℃。所述反应结束后加入无水乙醇来焠灭反应，在12000rpm下离心2min，进行高效液相检测产物的生成。
19.作为一种优选的实施方式，以联苯为底物时，用乙醇溶解。在本发明具体实施方式中，反应体系中乙醇含量不应超过总体系的2％。作为一种具体的实施方式，乙醇作为溶剂溶解时，联苯终浓度优选为35～45mm；
20.所述缓冲反应液优选为浓度为45～55mm、ph7.8～8.2的磷酸钾缓冲液。
21.本发明实施例中的一个或多个技术方案，至少具有如下技术效果或优点：
22.本发明提供的一种催化产品及其在生物催化合成对羟基联苯中的应用，本发明提供的细胞色素p450单加氧酶突变体p450 bm3对联苯的羟化活力比野生型cyp活力提高了将近1.5倍，具有较稳定的催化效果。且反应条件温和，无高温高压的环境。
附图说明
23.为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作一简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。
24.图1为prsfduet质粒图谱；
25.图2为p450 bm3(e267v/f87g)蛋白的sds-page结果；
26.图3为酶催化联苯生成对羟基联苯的hplc检测结果；
27.图4为prsfduet-bm3的琼脂糖凝胶电泳结果；
28.图5为标准曲线图；
具体实施方式
29.下文将结合具体实施方式和实施例，具体阐述本发明，本发明的优点和各种效果将由此更加清楚地呈现。本领域技术人员应理解，这些具体实施方式和实施例是用于说明本发明，而非限制本发明。
30.在整个说明书中，除非另有特别说明，本文使用的术语应理解为如本领域中通常所使用的含义。因此，除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员的一般理解相同的含义。若存在矛盾，本说明书优先。
31.除非另有特别说明，本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等，均可通过市场购买获得或者可通过现有方法获得。
32.下面将结合实施例及实验数据对本技术的一种催化产品及其在生物催化合成对羟基联苯中的应用进行详细说明。
33.实施例1、细胞色素p450 bm3突变酶表达载体的构建及工程菌
34.1、p450 bm3基因的获取
35.将实验室前期从菌种保藏中心购买的巨大芽孢杆菌进行传代培养，用基因组提取试剂盒进行基因组提取，提取步骤按产品说明书进行。
36.根据ncbi网站公布的p450 bm3基因序列(如seq id no：1所示)，使用snapgen软件辅助设计pcr扩增引物，引物的合成由上海生工完成，见表1。
37.表1-p450 bm3 pcr引物
[0038][0039][0040]
以提取的基因组为模板，用天根生化科技有限公司生产的2
×
taq plus pcr mastermix试剂盒进行扩增目的基因。pcr反应条件如下：总体积为50μl的pcr反应体系中，加入25μl 2
×
taq plus pcr mastermix，2.5μl浓度为10μm上游引物和下游引物(见表1)，1μl的质粒模板，加灭菌蒸馏水至50μl。pcr反应程序：(1)94℃预变性3min，(2)94℃变性30sec，(3)55℃退火30sec，(4)72℃延伸3.5min，步骤(2)～(4)共进行30个循环。4℃保存pcr产物。
[0041]
pcr结束后，取样进行琼脂糖凝胶电泳检验扩增结果，凝胶浓度为1％。将反应体系用天根生化科技有限公司生产的dp214dna纯化试剂盒处理(过程按说明书进行)，得到pcr扩增产物。-20℃下保存。
[0042]
2、质粒构建
[0043]
获得目的基因和prsfduet表达载体(质粒图谱如图1所示)后，分别在pcr小管中加入双蒸水、内切酶缓冲液、酶切底物、限制性内切酶(购自neb公司的bamhi和ecori，使用规格和方法按说明书进行)，进行双酶切反应，加入顺序从多到少。目的基因和prsfduet置于37℃下进行双酶切，反应体系如下：
[0044]
表2-p450 bm3基因片段双酶切体系：
[0045][0046]
表3-prsfduet双酶切体系：
[0047][0048]
使用bamhi和ecori限制性内切酶在37℃下进行双酶切反应3h后，加入loading buffer终止反应，并根据天根生化科技有限公司生产的dp214dna纯化试剂盒说明书纯化、回收双酶切产物。
[0049]
经过相同的限制性内切酶切割后，双酶切产物具有相同的粘性末端，可以通过dna连接酶连接成完整的质粒。将含有相同粘性末端的p450 bm3基因和prsfduet双酶切产物置于同一个pcr小管中，连接反应采用10μl体系，将目的基因和质粒酶切产物按3：1比例加入，和1μl t4 dna连接酶(购自neb公司)混匀，在16℃下连接过夜。将成功连接的质粒命名为prsfduet-bm3。琼脂糖凝胶电泳结果见图4。由图4可知，构建得到prsfduet-bm3的大小与预期一致。
[0050]
3、转化
[0051]
将连接产物转化到大肠杆菌e.coli dh5α感受态细胞中，转化步骤如下：
[0052]
1)首先调节恒温水浴的温度，将其调至42℃。
[0053]
2)将一管(100μl)感受态菌由-80℃的超低温冰柜中取出，立刻使用手指将其加温融化，然后插入冰中，对其进行10分钟冰浴。
[0054]
3)将10μl连接产物prsfduet-bm3加入，轻轻震荡后放置冰上20分钟。
[0055]
4)将其轻轻摇匀后插入42℃水浴中，进行90s的热休克，然后迅速放回冰中，静置5分钟。
[0056]
5)将900μl不含抗菌素的lb培养基分别加入到上述各管中轻轻混匀，之后再摇床的弹簧架上固定，将其在37摄氏度下震荡50分钟。
[0057]
6)往含合适抗菌素的固体lb平板培养皿中分别滴加从超净工作台中取出的300μl上述转化混合液，使用经过酒精灯灼烧并且冷却后的玻璃涂布棒进行均匀的涂布。
[0058]
7)标记涂好的培养皿，先放置在37摄氏度恒温培养箱中30-60分钟，待表面的液体都渗透到培养基里后，再倒过来放置于37℃恒温培养箱过夜。
[0059]
将长出的单菌落进行重组质粒鉴定：挑取上述lb固体培养基上长出的单菌落，接种于5m l卡那霉素的lb培养基中，于37℃、200r
·
min-1条件下培养过夜，取部分菌液用甘油管保存菌种，各自取适量菌液按质粒抽提试剂盒说明书提取重组质粒。将提取到的重组质粒用bamhi和ecori进行双酶切，与prsfduet双酶切的体系相同，双酶切后的产物用1％的
琼脂糖凝胶电泳分析目标基因片段与载体片段。然后将经过双酶切鉴定为阳性的重组质粒送至上海生工进行序列测定,测定成功的进行下一步实验。
[0060]
4、酶突变
[0061]
为了提高对羟基联苯的合成效率，首先通过pcr方式在质粒prsfduet-bm3中引入e267v&f87g突变(其中，f87g点突变的序列如seq id no.2所示，e267v点突变的序列如seq id no.3所示)，设计引物(引物序列见表4)，使用neb公司生产的q5 pcr mastermix试剂盒进行quikchange诱变，pcr反应条件如下：总体积为50μl的pcr反应体系中，加入25μl 2
×
master mix，2.5μl浓度为10μm上引物和下引物(如表4)，1μl的质粒模板，加灭菌蒸馏水至50μl。pcr反应程序：(1)98℃预变性30sec，(2)98℃变性10sec，(3)55℃退火30sec，(4)72℃延伸3.5min，步骤(2)～(4)共进行30个循环。4℃保存pcr产物。
[0062]
表4-突变位点的引物序列
[0063][0064]
所述pcr产物经琼脂糖凝胶电泳分析验证后，加入限制性内切酶dpni在37℃消化2h。将消化产物转化e.coli bl21(de3)感受态细胞并涂布于含有卡那霉素的平板中，置于37℃培养箱中静置培养约12h。挑取单克隆进行测序，测序正确即获得相应突变菌，即细胞色素p450 bm3突变体f87g和细胞色素p450 bm3突变体e267v。
[0065]
实施例2蛋白表达和纯化
[0066]
本发明实施例提供将实施例1获得的突变菌(细胞色素p450 bm3突变体f87g和细胞色素p450 bm3突变体e267v)在大肠杆菌中表达和纯化，获得细胞色素p450 bm3突变酶(突变型f87g和突变型e267v)，具体包括如下步骤：
[0067]
1、蛋白表达和纯化过程中用到的培养基和缓冲液
[0068]
lb培养基：10g/l胰蛋白胨，10g/l氯化钠，5g/l酵母浸粉；
[0069]
洗涤缓冲液：10mm咪唑，50mm k2hpo
4-kh2po4，300mm nacl，10％甘油，ph 8.0；
[0070]
洗脱缓冲液：200mm咪唑，50mm k2hpo
4-kh2po4，300mm nacl，10％甘油，ph 8.0；
[0071]
保存缓冲液：50mm k2hpo
4-kh2po4，300mm nacl，10％甘油，ph 8.0。
[0072]
2、蛋白表达
[0073]
将含重组质粒的甘油菌接种于6ml lb培养基(含50mg/l硫酸卡那霉素)，37℃220rpm过夜培养14h；
[0074]
按1：100将过夜培养种子转接至500ml lb培养基，37℃150rpm培养至od600＝0.5；
[0075]
用0.7mm的iptg诱导prsfduet载体上基因的表达，诱导后18℃150rpm过夜培养24h；
[0076]
4000g 4℃离心5min收集菌体，用30ml保存缓冲液重悬菌体，然后用超声破碎机(工作3s，间隔7s，时间为10min，超声功率约200w)破碎菌体；
[0077]
破碎后的细胞悬浮液12,000rpm 4℃离心30min，所得上清即为蛋白粗酶液，可进行酶活测试和后续的蛋白纯化实验。
[0078]
3、蛋白纯化
[0079]
目标蛋白在c端融合了his标签，因此可采用亲和层析的方法对蛋白进行纯化。
[0080]
本发明采用上海生工的ni-nta纯化介质对蛋白进行纯化。
[0081]
(1)将6ml ni-nta纯化介质加入到50ml空的层析柱中，让介质自由沉降，并放干储存液；
[0082]
(2)加入4倍柱体积的洗涤缓冲液平衡层析介质；
[0083]
(3)将含his标签蛋白的澄清样品上样至柱中，流速控制为0.5ml/min；
[0084]
(4)以流速为1ml/min的洗涤缓冲液洗涤柱子，10倍柱体积柱体积的流量以去除杂蛋白；
[0085]
(5)用5倍柱体积洗脱缓冲液以0.5-1ml/min的流速洗脱，收集洗脱液；
[0086]
(6)收集洗脱液，用millipore超滤管(15ml 30kda)对纯化后的蛋白进行脱盐浓缩，将10ml洗脱液置于超滤管中，下方为收集管，4℃，3500rpm离心20min，上方超滤管中保留1.5ml左右蛋白，下方为含咪唑的缓冲液。倒掉收集管内溶液，然后重新用保存缓冲液定容至10ml，重复上述步骤，重复3次，用移液枪吸出超滤管内蛋白。用考马斯亮蓝法测定蛋白浓度后分装保存在-80℃备用。考马斯亮蓝测蛋白浓度的方法参照文献(李娟,张耀庭,曾伟,等.应用考马斯亮蓝法测定总蛋白含量[j].中国生物制品学杂志(02):118-120.)进行测定。p450 bm3(e267v/f87g)蛋白的sds-page结果如图2所述。表明，成功纯化获得e267v和f87g蛋白。
[0087]
实施例3、采用生物催化法催化联苯合成对羟基联苯
[0088]
本实施例以联苯为底物经酶催化合成对羟基联苯，本实施例的反应体系的总体积为1ml，其他规格的反应体系可参照此反应体系进行对应调整。
[0089]
1、底物制备
[0090]
用乙醇溶解底物联苯得到终浓度为40mm的母液；
[0091]
2、反应缓冲液制备
[0092]
反应缓冲液为浓度为50mm k2hpo
4-kh2po4的缓冲液，ph 8.0。
[0093]
3、催化反应
[0094]
在缓冲体系中，加入终浓度为0.3mg/ml的酶(突变型f87g或突变型e267v)，然后加入10μl底物联苯(溶解在乙醇中)至终浓度为400μm，加入终浓度250μm的nadph，总体积为1ml。37℃，200rpm反应10min，立刻取出，加入1ml的乙醇来焠灭反应，12000rpm离心2min，以0.22μm膜过滤(津腾生产)用hplc分析检测。
[0095]
4、hplc的分离检测
[0096]
使用安捷伦c18，15cm色谱柱，检测时流动相为甲醇：水＝88：12，柱温30℃，流速1ml/min，在紫外检测器254nm处进行底物与产物检测。产物对羟基联苯出峰时间为3.5min左右，底物联苯出峰时间为6.5min左右。
[0097]
5、标准曲线的绘制
[0098]
将对羟基联苯用乙醇配制成400μm的母液，准备6个10ml的容量瓶，分别稀释到终浓度为5、10、20、40、80、160μm的样品，用0.22μm膜过滤后进行液相检测，每组重复3次，以横坐标为吸光度，纵坐标为浓度绘制标准曲线，标准曲线如图5所示。
[0099]
酶比活力定义：在联苯浓度在400μm时，确定量的突变酶在1min内生成的对羟基联
苯量，单位为μm indigo(mg protein
·
min)
[0100]
由图5可知，野生型p450 bm3比酶活为7.01μm indigo，突变型e267v比酶活为10.36μmindigo，较野生型提高了47％；突变型f87g比酶活为9.31μm indigo，较野生型提高了32％。
[0101]
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
[0102]
最后，还需要说明的是，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。
[0103]
尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。
[0104]
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。