一种由海参内脏提取ACE抑制肽的方法及应用与流程

一种由海参内脏提取ace抑制肽的方法及应用
技术领域
1.本发明属于生物资源综合利用领域，具体涉及一种由海参内脏提取ace抑制肽的方法及应用。


背景技术：

2.海参因其营养和保健价值被人们熟知，而作为海参加工副产物的海参内脏往往被丢弃，一方面造成了资源浪费，另一方面容易造成环境污染。因此探究海参内脏深加工工艺，提取和利用海参内脏中的营养成分具有良好的现实意义。
3.海参皮中含有丰富的胶原蛋白，同时含有海参多糖、皂甙、微量元素等营养物质，而海参内脏中的营养成分组成和含量与海参皮存在明显区别，如胶原蛋白的含量少，多糖、不饱和脂肪酸等物质含量高，并且含有多种具有不同生物活性的酶、功能蛋白等物质。因此深加工工艺存在较大差异。
4.血管紧张素转化酶(ace)又称激肽酶ⅱ，是一种血管内皮细胞膜结合酶，其可将人体中的血管紧张素i转化为血管紧张素ii，导致人体血管收缩，促使血压升高，目前认为ace与高血压症密切相关。
5.现阶段使用最广泛的处方合成类降压药如:阿米洛利、依那普利等，均旨在抑制血管紧张素i转化酶活性。但长期服用处方类降压药，会随之产生副作用。而天然食物来源的ace抑制肽具有安全、易被人体吸收、产生的不良影响少等优势，已成为新药研发和替代治疗的可选择途径。如将食源性蛋白通过不同的酶酶解后，再利用多种分离纯化方法，从动植物中获得天然的ace抑制活性肽片段，其主要来源于牛奶、大豆、鸡蛋、大蒜、玉米，同时，海洋生物来源的ace抑制肽也有陆续报道，已从贝类、甲壳类、以及各种鱼中提取到多种类型的ace抑制肽。
6.ace抑制肽在母体蛋白中没有活性，但能通过酶水解方法从母体蛋白中释放出。由于ace抑制肽氨基酸组成和结构差别很大，没有固定或统一氨基酸组成，且食物中蛋白酶解产物成分相当复杂，大大增加其分离提取难度。
7.虽然申请号为cn 201110384723.2和cn201811214660.4的中国专利均利用海参或其体壁制备ace抑制肽，但制备产量低、成本高，不利于大批量生产，同时目前海参或其内脏中活性多肽的提取多采用商业化蛋白酶或益生菌剂进行生产，蛋白酶和菌剂的种类有限，酶酵解产物较为单一，多为活性较弱的营养类多肽产品，且操作繁琐，生产成本较高，存在物料损失严重、产物活性丧失较大等问题。


技术实现要素：

8.根据上述现有技术，本发明公开一种由海参内脏提取ace抑制肽的方法及应用。
9.为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：一种由海参内脏提取ace抑制肽的方法：(1)将-20
‑‑
10℃冷冻储存的海参内脏置于20-30℃解冻3-5h，而后加入其5-10倍
体积的处理液中浸泡20-40min，匀浆；(2)在步骤（1）得到的匀浆液中添加其质量1-3％的酶，调节温度至30-55℃，ph为4-11，酶解1-5h，80-100℃灭酶10-20min；酶解后冷却至15-25℃，6000—10000 r/min离心10-30 min，过滤收集上清液；(3)将步骤（2）所得的上清液装入截留分子量500-10000da 的透析袋中，置于4-10℃的透析液中透析10-20h，得到粗溶液；(4)将步骤（3）所得的ace抑制肽粗溶液，通过葡聚糖凝胶柱层析进行精细纯化，用含有0 .01-0.05mol/lzn离子的pbs洗脱，测定228nm吸光度的洗脱液，将收集的洗脱液冷冻干燥，得ace抑制肽。
10.步骤（1）所述的处理液为：每100ml处理液中含氯化钠0.9g、土霉素0.05-0.01g、红霉素0.05-0.01g、edta
·
2na 0.05-0.5g、余量为无菌水。
11.步骤（2）所述酶为单环刺螠自溶酶、胰蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶、风味蛋白酶、酸性蛋白酶中的一种或多种。
12.步骤（3）所述的透析液为0.9%的生理盐水、ph7.0的磷酸盐缓冲液、无菌水中的一种或几种。
13.所述上清液装入截留分子量1000-3000da的透析袋透析，得粗溶液。
14.一种所述方法获得的海参内脏ace抑制肽，按所述方法获得分子量为1000-3000da的海参内脏ace抑制肽。
15.一种所述海参内脏ace抑制肽的应用，所述海参内脏ace抑制肽在制备作为调理高血压症的食品中的应用，食品进一步的说可为医学配方食品或保健食品。
16.本发明所具有的优点：本发明通过最优酶解条件由海参内脏中提取获得ace抑制肽，并且进一步优化确定了ace抑制肽活性最强的肽段区间，本发明所得ace抑制肽活性好，纯度高，成本低，易于大量生产。可用于食品的组方生产。同时实现海参内脏的综合高值利用，具有良好的经济和社会效益。
附图说明
17.图1为本发明中制备的单环刺螠自溶酶蛋白电泳图，其中，m为蛋白marker，1为经透析所得的单环刺螠自溶酶，2为层析后所得的单环刺螠自溶酶。
18.图2为本发明中制备ace抑制肽的响应面优化图。
19.图3为本发明制备的ace抑制肽蛋白电泳图，其中，m为蛋白marker，1和2为截留分子量为1-3kda的酶解液两批纯化所得ace抑制肽，3为截留分子量为1-3kda的酶解液纯化前的酶解上清液。
具体实施方式
20.以下结合实例对本发明的具体实施方式做进一步说明，应当指出的是，此处所描述的具体实施方式只是为了说明和解释本发明，并不局限于本发明。
21.本发明解决了海参内脏造成环境污染的问题，提高了海参的高值开发利用率，极大地降低了生产成本，为低成本、大规模生产加工ace抑制肽提供了一种可靠工艺；尤其采
用单环刺螠自溶酶进行酶解，不仅有效实现了单环刺螠废弃内脏的高值利用，也弥补了目前蛋白酶种类较少、生产成本较高的问题，具有非常广阔的市场应用前景。
22.实施例1：单环刺螠自溶酶的获得：1 .单环刺螠自溶酶粗酶溶液的制备：（1）取-20
‑‑
10℃冷冻储存的单环刺螠废弃内脏常温解冻，待彻底解冻后，用无菌水清洗，去除杂质。加入pbs（0.1mol/l ,ph8 .0）进行匀浆，并置于4℃环境下过夜，5000r/min条件离心8min，收集上清液；（2）向上述收集的上清液中加入硫酸铵至20%饱和度，置于4℃环境下4h；8000r/min条件离心10min，收集上清液，向上清液中加入硫酸铵至70%饱和度，置于4℃环境下4h；8000r/min条件离心10min，取沉淀，向沉淀中加入其10倍体积的pbs缓冲液，用截留分子量是8kd-14kd的透析袋透析，得到自溶酶粗酶溶液。
23.2 .柱层析分离纯化自溶酶：（1）透析后得到的自溶酶粗酶溶液进行离心12000r/min，离心10min得到上清；（2）将步骤（1）所得到上清通过sephadex g-100柱层析进行分离纯化，用含有0 .015mol/lzn离子的pbs洗脱，酶标仪在340nm下测定吸光度并收集得到自溶酶溶液；（3）将步骤（2）所得的自溶酶溶液经过sds-page鉴定，显示自溶酶的大小为8-10kd，如图1所示。
24.同时单环刺螠自溶酶的获得还可参见申请号为cn201911388353.2，发明名称为“一种单环刺螠自溶酶的制备及应用”的中国专利文献中记载的方式获得。
25.实施例2：ace抑制肽酶解用复合蛋白酶的筛选与应用：1.1原料的预处理：称取海参内脏冷冻品1kg，静置于20℃解冻3h，而后加入其8倍体积的处理液中浸泡30min，处理液组成为氯化钠7.2g、土霉素0.4g、红霉素0.4g、edta
·
2na 0.8g、无菌水7.91kg，匀浆。
26.1.2原料的离心：匀浆液中添加其质量2％的酶，最适条件下酶解，100℃灭酶15min；酶解后冷却至20℃，8000 r/min离心20 min，过滤收集上清液。
27.1.3蛋白酶筛选：在浆液中分别加入5种蛋白酶，料液比为1:2（g/ml），即，添加浆液2wt%的单环刺螠自溶酶，ph 7.5；2 wt %的中性蛋白酶，ph7；2 wt %的木瓜蛋白酶，ph6.5；2 wt %的碱性蛋白酶，ph10.6；2 wt %的胰蛋白酶，ph8.5。搅拌条件下加入酶使其充分混合。
28.1.4酶解：单环刺螠自溶酶37℃酶解2h后，在95℃条件下，作用15min高温灭酶；中性蛋白酶50℃酶解2h后，在95℃条件下，作用15min高温灭酶；木瓜蛋白酶53℃酶解2h后，在95℃条件下，作用15min高温灭酶；碱性蛋白酶50℃酶解2h后，在95℃条件下，作用15min高温灭酶；胰蛋白酶37℃酶解2h后，在95℃条件下，作用15min高温灭酶。
29.1.5离心：将各酶解液冷却至20℃，8000转/min离心10min，分别收集各酶解液离心后上清液，在0.45 μm的滤膜中过滤上清液。
30.1.6测定ace抑制率：ace抑制率的检测参照文献(cn 113444145 a)中的方法进行。配置hhl溶液和ace溶液：将ace和hhl分别溶解在ph8.3，0.1 mol/l的硼酸钠缓冲溶液（含0.3 mol/l的nacl）中，获得酶活力为0.1 u/ml的ace溶液和浓度为5.82 mmol/l hhl溶液。
31.1.7 ace抑制率检测：取上述获得不同酶解后上清液50 μl于1.5 ml离心管中（对照组加入50 μl的硼酸钠缓冲液），加入5.82 mmol/l hhl溶液100 μl，混匀。在37℃水浴锅
kda-1 kda和1 kda以下的组分，检测其ace抑制率。
44.选取上述由粗酶液截留获得酶解液用g-25葡聚糖凝胶柱，过滤层析，即分别获得纯化的酶解液。
45.分别选取纯化后3kda-1 kda和1 kda以下通过冷冻干燥机进行冻干，将冻干后的1-3 kda组分取出，以50 mg/ml的浓度上样3 ml，洗脱（0.2 ml/min），测吸收值（220 nm），收集样品，每管约3 ml，冻干，配置成50 mg/ml，检测ace抑制率。采用5%浓缩胶和18%分离胶对最佳酶解条件下制备的ace抑制肽的分子量进行测定，上样7μl，跑胶。用考马斯亮蓝蛋白快速染液染色观察（参见图3）。
46.1.5测定ace抑制率：ace抑制率的检测参照实施例2进行。
47.结果由图3可知，所制备的活性最好的ace抑制肽分子量小于4.6kda，且条带较为均一，ace抑制率在1-3 kda分子量区间最强，可达54.352
±
0.72%；同时， 1 kda以下、10 kda以上纯化酶解液冻干后ace抑制率依次为48.419
±
2.01%和36.552
±
0.38%，由此可见在1-3 kda分子量区间抑制效果最好。