检测cyp2c19*3基因单核苷酸多态性的试剂、试剂盒及应用的制作方法

1.本发明属于基因检测技术领域，具体涉及检测cyp2c19*3基因单核苷酸多态性的试剂、试剂盒及应用。


背景技术：

2.在多种治疗手段中，相关药品在正常使用及推荐用量下依然会出现相当数量与用药目的无关的不良反应，对用药患者极易造成二次伤害，故具有严重危害性。
3.对于大多数药物而言，其显性副作用已得到广泛重视，但隐性副作用如肝、肾慢性伤害，心、肺功能慢性衰减等尚未引起足够关注。另一方面，由药物引起对身体的隐性损害通常持续较久且其前、中期难以检测出相应症状。因此，当患者出现症状至医院就诊时，其伤害大多已经是不可逆的严重损伤。一项针对上海市17家二甲以上综合医院的调查显示，急性肾功能衰竭病因约1/3为药物使用。
4.研究表明，年龄、性别、体重与伴随疾病等原因均可引起药物反应个体差异。另外，遗传因素，基因突变作为造成药物作用个体差异更加重要的成因却尚未得到足够重视。基于此，自2006年起，用于个体化用药指导的基因检测产品包括cyp2c9，cyp2d6等系列的药物代谢酶基因多态性检测试剂已于多国获批并上市使用。
5.进一步，国家药品监督管理局医疗器械技术审评中心于2019年11月12日发布了《cyp2c19药物代谢酶基因多态性检测试剂注册技术审查指导原则》，其将cyp2c19药物代谢酶基因多态性检测试剂的主要应用范围做出说明，即
①
正在服用或将要服用氯吡格雷进行抗血小板治疗的冠心病患者；
②
主要为急性冠脉综合征(acs)且进行经皮冠状动脉介入治疗(pci)的患者；
③
pci术后血栓高危且计划调整p2y12抑制剂治疗方案的患者；
④
缺血高风险或出血高风险患者等。对于上述需将氯吡格雷作为主要治疗药物的患者，应接受外周静脉全血或口腔拭子等样本基因组dna中cyp2c19基因多态性的体外定性检测用于氯吡格雷的用药指导。
6.除此之外，关于以奥美拉唑为代表的质子泵抑制剂药物，有研究报道，cyp2c19酶弱代谢者、中等代谢者和强代谢者药物的代谢剂量分别为平均剂量的60％、100％和110％。另外，对于抗抑郁药如艾司西酞普兰等，临床药物基因组学实施联盟(cpic)与2016年发布了基于cyp2c19和cyp2d6基因型与三环类抗抑郁药物剂量的指南。指出对于携带cyp2c19基因突变患者服用常规剂量药物时，血药水平易于出现超治疗窗的情况，最终可导致毒性增加或治疗失败。尤其是，cyp2c19酶慢代谢型患者建议起始剂量降低50％，并密切监测患者血药浓度调整剂量。同时，另有研究数据表明，关于抗癫痫药如丙戊酸及苯妥英钠等，cyp2c19野生基因型携带者的血药浓度平均值明显低于cyp2c19基因突变等位基因携带者，cyp2c19酶代谢活性降低导致丙戊酸、苯妥英钠代谢减慢，此时应减少药物剂量，以减少药物不良反应的发生和药物资源的浪费。
7.目前关于cyp2c19基因单核苷酸多态性的检测方法主要包括基因测序法、普通荧光定量 pcr法、基因芯片检测法等等。然而上述方法均具有操作复杂，检测周期长，所需检
测的仪器设备复杂等缺点，且检测结果特异性及灵敏度均较低。


技术实现要素：

8.本发明的第一方面的目的，在于提供一种检测cyp2c19*3基因单核苷酸多态性的试剂。
9.本发明的第二方面的目的，在于提供本发明第一方面的试剂的应用。
10.本发明的第三方面的目的，在于提供一种包含本发明第一方面的检测cyp2c19*3基因单核苷酸多态性的试剂的试剂盒。
11.本发明的第四方面的目的，在于提供本发明第三方面的试剂盒的应用。
12.本发明的第五方面的目的，在于提供一种非疾病诊断治疗目的的检测cyp2c19*3基因单核苷酸多态性的方法。
13.为了实现上述目的，本发明所采取的技术方案是：
14.本发明的第一个方面，提供一种检测cyp2c19*3基因单核苷酸多态性的试剂，包含：检测cyp2c19*3基因的探针和/或用于扩增cyp2c19*3基因的引物对；
15.所述检测cyp2c19*3基因的探针包括野生型探针和突变型探针；
16.所述野生型探针的序列如seq id no.21所示；
17.所述突变型探针的序列如seq id no.22所示；
18.所述野生型探针中的1个或多个位置的碱基被锁核酸修饰；
19.所述突变型探针中的1个或多个位置的碱基被锁核酸修饰；
20.所述用于扩增cyp2c19*3基因的引物对的序列如seq id no.7、8所示。
21.优选地，所述野生型探针的5’端起第3位和第7位中的至少一个碱基被锁核酸修饰；进一步优选地，所述野生型探针的5’端起第3位和第7位的碱基被锁核酸修饰。
22.优选地，所述突变型探针的5’端起第3位和第7位中的至少一个碱基被锁核酸修饰；进一步优选地，所述突变型探针的5’端起第3位和第7位的碱基被锁核酸修饰。
23.优选地，所述野生型探针和突变型探针的5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团。
24.进一步优选地，所述野生型探针的5’端标记的荧光报告基团不同于突变型探针的5’端标记的荧光报告基团。
25.优选地，所述荧光报告基团为fam、hex、vic、rox、texas red和cy5中的至少一种。
26.优选地，所述荧光淬灭基团为bhq1、tamra、bbq-650、bhq2和bhq3中的至少一种。
27.优选地，所述野生型探针的5’端标记有cy5，所述突变型探针的5’端标记有texas red。
28.优选地，所述野生型探针和突变型探针的3’端标记有bhq2。
29.本发明的第二个方面，提供本发明第一方面的试剂在(1)～(2)中任一种中的应用；
30.(1)制备检测cyp2c19*3基因单核苷酸多态性的产品中的应用；
31.(2)非疾病诊断治疗目的的cyp2c19*3基因单核苷酸多态性检测。
32.本发明的第三方面，提供一种包含第一方面的试剂的试剂盒。
33.优选地，所述试剂盒还包含taq酶、dntps、mg
2
和缓冲液中的至少一种。
34.本发明的第四方面，提供第三方面的试剂盒在(1)～(2)中任一种中的应用；
35.(1)制备检测cyp2c19*3基因单核苷酸多态性的产品中的应用；
36.(2)非疾病诊断治疗目的的cyp2c19*3基因单核苷酸多态性检测。
37.本发明的第五方面，提供一种非疾病治疗诊断目的的检测cyp2c19*3基因单核苷酸多态性的方法，包括采用本发明第一方面的试剂或本发明第三方面的试剂盒的步骤。
38.优选地，所述方法包括如下步骤：
39.(1)样本提取：取待测样本，提取基因组；
40.(2)将步骤(1)的基因组与上述用于扩增cyp2c19*3基因的引物对、检测cyp2c19*3 基因的探针、taq酶、dntps、mg
2
和缓冲液混合，进行qpcr反应检测，读取检测信号。
41.优选地，步骤(2)中所述qpcr反应程序为：50℃5min；94℃30s；94℃5s，60℃30s，循环40～50次。
42.本发明的有益效果是：
43.本发明提供了一种检测cyp2c19*3基因单核苷酸多态性的试剂，包含：检测cyp2c19*3 基因的探针和/或用于扩增cyp2c19*3基因的引物对；其中，检测cyp2c19*3基因的探针中的 1个或多个位置的碱基被锁核酸修饰，锁核酸2
’‑
o，4
’‑
c位通过不同的缩水作用构成的亚甲基桥形成了刚性的缩合结构，增加了核酸磷酸骨架的局部结构的稳定性；并且锁核酸作为一种新的修饰后核酸，具有与dna/rna强大的杂交亲和力、反义活性、抗核酸酶能力、水溶性好和体内无毒性等特点；同时，锁核酸修饰的核酸应用于荧光定量pcr(qpcr)探针检测时，可有效提高检测反应退火温度并同时缩短检测所需探针的长度，并且较普通探针具有灵敏度更高，特异性更强等优势。
44.本发明提供的非疾病诊断治疗目的的检测cyp2c19*3基因单核苷酸多态性的方法，采用本发明提供的检测cyp2c19*3基因的探针和用于扩增cyp2c19*3基因的引物对，可检测低至5 拷贝的样品。
附图说明
45.图1是实施例1中cyp2c19*3基因的候选引物对扩增产物的电泳图。
46.图2是实施例3中cyp2c19*3纯合野生型样本检测结果图。
47.图3是实施例3中cyp2c19*3纯合突变型样本检测结果图。
48.图4是实施例3中cyp2c19*3杂合突变型样本检测结果图。
49.图5是实施例3中cyp2c19*3纯合野生型样本扩增循环50次后的检测结果图。
50.图6是实施例3中cyp2c19*3纯合野生型样本扩增循环50次后的检测结果图：其中，a 是实施例3中cyp2c19*3纯合野生型样本用候选探针对no.1扩增循环50次后的检测结果图； b是实施例3中cyp2c19*3纯合野生型样本用普通探针扩增循环50次后的检测结果图。
具体实施方式
51.以下通过具体的实施例对本发明的内容作进一步详细的说明。
52.本实施例中所使用的材料、试剂等，如无特别说明，为从商业途径得到的试剂和材料。
53.术语解释：
54.(1)taqman探针：taqman探针是一种寡核苷酸探针，其5
’‑
末端携带荧光基团，如fam、 tet、vic、hex等，3
’‑
端携带淬灭基团，如tamra、bhq等。pcr扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；pcr扩增时，taq酶的5
’‑3’
外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条dna链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与pcr产物形成完全同步。
55.(2)锁核酸：锁核酸(locked nucleic acid，lna)是一种新型、特殊的双环状寡核苷酸衍生物。其结构中核酸的2
’‑
o，4
’‑
c位通过不同的缩水作用形成的亚甲基桥形成了刚性的缩合结构，增加了核酸磷酸骨架的局部结构的稳定性。
56.(3)cyp2c19基因：cyp2c19药物代谢酶的编码基因为cyp2c19基因，位于人类10号染色体。cyp2c19基因含有42个等位基因，cyp2c19*1为野生型等位基因，其编码的酶具有正常活性。cyp2c19*2(rs4244285，c.681g》a)和cyp2c19*3(rs4986893，c.636g》a)编码的cyp2c19药物代谢酶活性降低，是中国人群中存在的2种主要的等位基因，发生频率分别为23.1-35％及2-7％。cyp2c19基因的遗传变异导致cyp2c19药物代谢酶活性的个体差异，使人群出现超快代谢者(um)、快代谢者(em)、中间代谢者(im)和慢代谢者(pm)4种表型。因此，在针对药物使用时，患者或出现由于药物代谢紊乱导致的副作用增强或药效不足等情况，无法获得正常治疗效果。
57.(4)单核苷酸多态性：单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，snp)主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的dna序列多态性。它是人类可遗传的变异中最常见的一种，占所有已知多态性的90％以上。snp在人类基因组中广泛存在，平均每 300个碱基对中就有1个，估计其总数可达300万个甚至更多。snp是一种二态的标记，由单个碱基的转换或颠换所引起，也可由碱基的插入或缺失所致。snp既可能在基因序列内，也可能在基因以外的非编码序列上。
58.(5)荧光定量pcr：实时荧光定量pcr(quantitative real-time pcr，qpcr)是一种在 dna扩增反应中，以荧光化学物质测每次聚合酶链式反应(pcr)循环后产物总量的方法。通过内参或者外参法对待测样品中的特定dna序列进行定量分析的方法。qpcr在pcr扩增过程中，通过荧光信号，对pcr进程进行实时检测。由于在pcr扩增的指数时期，模板的ct值和该模板的起始拷贝数存在线性关系，所以成为定量的依据。
59.本实施例中采用的cyp2c19*3纯合野生型样品由苏州泓迅生物科技股份有限公司构建：用ndei和xhoi酶切pet-28a( )(seq id no.29)，插入基因序列(seq id no.27)，得到 cyp2c19*3纯合野生型样品。
60.本实施例中采用的cyp2c19*3纯合突变型样品由苏州泓迅生物科技股份有限公司构建：用ndei和xhoi酶切pet-28a( )(seq id no.29)，插入基因序列(seq id no.28)，得到 cyp2c19*3纯合突变型样品。
61.本实施例中采用的cyp2c19*3杂合突变型样品由cyp2c19*3纯合野生型样品和cyp2c19*3 纯合突变型样品按1：1混合得到。
62.实施例1 cyp2c19*3基因引物对的设计与筛选
63.(1)cyp2c19*3基因引物对的设计
64.设计10对候选引物(cyp2c19*3基因的候选引物对为no.1～10，具体如表1所示)。
设计原则一般为：引物序列与模板序列紧密互补，且上下游引物之间不会形成稳定的二聚体或发夹结构；同时，引物不会引发错配反应。
65.表1 cyp2c19*3基因的候选引物对信息
66.[0067][0068]
(2)筛选引物
[0069]
采用thermo fisher powerup
tm sybr
tm green master mix及上述10对候选引物对对 dna样品(cyp2c19*3纯合野生型样品)进行qpcr，qpcr反应体系如下：2x powerup sybrgreen master mix 10μl，正向引物(10μm)0.6μl，反向引物(10μm)0.6μl，dna样品(100ng) 0.4μl，ddh2o 8.4μl；qpcr反应程序如下：酶激活50℃2min；预变性95℃2min；变性95℃ 15s，退火55℃15s，延伸72℃1min，循环40次；得到扩增产物。得到的扩增产物进行核酸电泳检测，结果如图1所示：由右至左第4泳道的候选引物对no.4扩增效果最佳。
[0070]
实施例2 cyp2c19＊3基因探针的设计与筛选
[0071]
(1)探针设计
[0072]
cyp2c19*3基因探针包括野生型探针和突变型探针。设计3对cyp2c19*3基因探针，分别为13bp、15bp与17bp三种不同长度探针，具体如表2所示。
[0073]
表2 cyp2c19*3基因的候选探针对信息
[0074][0075]
注：表中，/lna_a/表示lna修饰a碱基，/lna_g/表示lna修饰g碱基，/lna_c表示lna修饰c 碱基，野生型探针的荧光基团修饰为cy5，突变型探针的荧光基团修饰为texas red，野生型探针和突变型探针的淬灭基团为bhq-2。
[0076]
(2)筛选探针
[0077]
不同cyp2c19*3探针检测效果：采用金斯瑞ii multiplex probe one-stepqrt-pcr supermix udg试剂盒、候选引物对no.4以及候选探针对no.1～3分别检测dna 样品(cyp2c19*3纯合野生型样品、cyp2c19*3纯合突变型样品和cyp2c19*3杂合突变型样品)， qpcr体系如下：反应混合液(perfectstart
tm probe one-step qpcr supermix(2
×
))10μl，酶混合液(ii probe one-step rt/ri enzyme mix)0.8μl，正向引物(10μm)0.8μl，反向引物(10μm)0.8μl，探针(10μm)各0.2μl，dna样品(10ng/μl)0.8μl，ddh2o 6.6μl；反应混合液中包括dntps，mg
2
，以及qpcr反应相关缓冲溶液，酶混合液中包括taq酶及其相关缓冲溶液；反应程序如下：50℃5min；94℃30s；94℃5s，60℃30s(荧光采集)，
循环40次。结果如表3所示；除13bp长度探针(候选探针对no.1)外，15bp及17bp长度探针(候选探针对no.2、3)均存在不同程度的非特异性结合，可见，在lna修饰下，13bp 长度探针(候选探针对no.1)特异性最优。
[0078]
表3 cyp2c19*3基因的候选探针检测结果
[0079][0080]
注：“ ”表示存在非特异性结合荧光信号，
“‑”
表示不存在非特异性结合荧光信号。
[0081]
实施例3 cyp2c19＊3基因引物/探针组合检测效果
[0082]
(1)cyp2c19＊3纯合野生型样品检测
[0083]
采用金斯瑞ii multiplex probe one-step qrt-pcr supermix udg试剂盒、候选引物对no.4以及候选探针对no.1分别检测dna样品(其中，阳性样品为cyp2c19*3纯合野生型样品，阴性对照为cyp2c19*3质粒空载体(pet-28a( ))，空白对照为无菌ddh2o)， qpcr体系如下：反应混合液(perfectstart
tm probe one-step qpcr supermix(2
×
))10μl，酶混合液(ii probe one-step rt/ri enzyme mix)0.8μl，正向引物(10μm)0.8μl，反向引物(10μm)0.8μl，探针(10μm)各0.2μl，dna样品(10ng/μl)0.8μl，ddh2o 6.6μl；反应混合液中包括dntps，mg
2
，以及qpcr反应相关缓冲溶液，酶混合液中包括taq酶及其相关缓冲溶液；反应程序如下：50℃5min；94℃30s；94℃5s，60℃30s(荧光采集)，循环50次。结果如图2所示：阳性样品中，仅有野生型探针于qpcr反应中出现相应荧光信号，而突变型探针不会出现荧光信号(阴性对照与空白对照均无荧光信号，因此，未提供图片)。
[0084]
(2)cyp2c19＊3纯合突变型样品检测
[0085]
采用金斯瑞ii multiplex probe one-step qrt-pcr supermix udg试剂盒、候选引物对no.4以及候选探针对no.1分别检测dna样品(其中，阳性样品为cyp2c19*3纯合突变型样品，阴性对照为cyp2c19*3质粒空载体(pet-28a( ))，空白对照为无菌ddh2o)， qpcr体系如下：反应混合液(perfectstart
tm probe one-step qpcr supermix(2
×
))10μl，酶混合液(ii probe one-step rt/ri enzyme mix)0.8μl，正向引物(10μm)0.8μl，反向引物(10μm)0.8μl，探针(10μm)各0.2μl，dna样品(10ng/μl)0.8μl，ddh2o 6.6μl；反应混合液中包括dntps，mg
2
，以及qpcr反应相关缓冲溶液，酶混合液中包括taq酶及其相关缓冲溶液；反应程序如下：50℃5min；94℃30s；94℃5s，60℃30s(荧光采集)，循环50次。结果如图3所示：阳性样品中，仅有突变型探针于qpcr反应中出现相应荧光信号，同时野生型探针不会出现荧光信号(阴性对照与空白对照均无荧光信号，因此，未
提供图片)。
[0086]
(3)cyp2c19＊3杂合突变型样品检测
[0087]
采用金斯瑞ii multiplex probe one-step qrt-pcr supermix udg试剂盒、候选引物对no.4以及候选探针对no.1分别检测dna样品(其中，阳性样品为cyp2c19*3杂合突变型样品，阴性对照为cyp2c19*3质粒空载体(pet-28a( ))，空白对照为无菌ddh2o)， qpcr体系如下：反应混合液(perfectstart
tm probe one-step qpcr supermix(2
×
))10μl，酶混合液(ii probe one-step rt/ri enzyme mix)0.8μl，正向引物(10μm)0.8μl，反向引物(10μm)0.8μl，探针(10μm)各0.2μl，dna样品(10ng/μl)0.8μl，ddh2o 6.6μl；反应混合液中包括dntps，mg
2
，以及qpcr反应相关缓冲溶液，酶混合液中包括taq酶及其相关缓冲溶液；反应程序如下：50℃5min；94℃30s；94℃5s，60℃30s(荧光采集)，循环50次。结果如图4所示：阳性样品中，野生型与突变型探针于qpcr反应中出现相应荧光信号(阴性对照与空白对照均无荧光信号，因此，未提供图片)。
[0088]
(4)cyp2c19＊3基因引物/探针组合检测灵敏度
[0089]
采用金斯瑞ii multiplex probe one-step qrt-pcr supermix udg试剂盒、候选引物对no.4以及候选探针对no.1/普通探针对(与候选探针对no.1相比，区别仅在于未进行锁核酸修饰)分别检测dna样品(cyp2c19*3纯合野生型样品)，qpcr体系如下：反应混合液(perfectstart
tm probe one-step qpcr supermix(2
×
))10μl，酶混合液(iiprobe one-step rt/ri enzyme mix)0.8μl，正向引物(10μm)0.8μl，反向引物(10μm)0.8μl，探针(10μm)各0.2μl，dna样品(10ag/μl)0.8μl(根据cyp2c19*3纯合野生型样品的浓度及碱基数，折算基因拷贝数为5拷贝)，ddh2o 6.6μl；反应混合液中包括dntps，mg
2
，以及qpcr反应相关缓冲溶液，酶混合液中包括taq酶及其相关缓冲溶液；反应程序如下： 50℃5min；94℃30s；94℃5s，60℃30s(荧光采集)，循环50次。结果如图5、6所示：候选探针对no.1在相同反应体系下荧光值高于普通探针对，并且在反应体系相同，底物拷贝数约为5拷贝时仅有候选探针对no.1出现荧光，而普通探针对未出现荧光。
[0090]
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。