调节免疫细胞的嵌合多肽的制作方法

1.本发明涉及化学调节的嵌合多肽，其能够对t细胞受体和/或nk细胞受体和/或嵌合抗原受体功能进行可逆和剂量依赖性控制。


背景技术：

2.在过去的几年中，已经开发了许多过继性t细胞疗法来治疗血液癌症和实体瘤两者(rosenberg等人，science.2015年4月3日；348(6230)：62-8，june等人，science.2018年3月23日；359(6382)：1361-1365)。具体而言，在异基因造血干细胞移植时发现供体来源的t细胞具有抗肿瘤作用后，已开发出供体淋巴细胞输注(dli)作为利用这种作用的方法(frey等人，best pract res clin haematol.2008年6月；21(2)：205-222)。
3.最近，嵌合抗原受体(car)和t细胞受体(tcr)修饰的t细胞已被用于为患者提供肿瘤反应性t细胞群，cd19 car t细胞在b细胞恶性肿瘤患者中的显著临床活性最近已经导致这些t细胞产品获批用于b-all和dlbcl(boyiadzis等人，j immunother cancer.2018年12月4日；6(1)：137)。
4.重要的是，过继性t细胞疗法在癌症中的更广泛适用性目前受到安全问题的限制。具体来说，当过继转移的t细胞库所靶向的抗原也在健康组织中表达时，通常会观察到脱靶(on target-off)肿瘤毒性(bonifant等人，mol ther oncolytics.2016年4月20日；3：16011)。
5.在过去的几年里，为了发现真正的癌症特异性标志物，已经做出了巨大的努力，以避免这种脱靶肿瘤毒性。然而，由大部分患者的肿瘤表达的严格的癌症特异性标志物已被证明极为罕见。此外，基因修饰的t细胞与在重要组织中显示低水平表达的自身抗原的意外的交叉反应与严重毒性有关(morgan等人，j immunother.2013年2月；36(2)：133-51)。
6.最后，即使可以实现输注细胞的完全肿瘤特异性激活，在t细胞识别大肿瘤块后大量细胞因子释放可能会形成安全问题，调整t细胞活化强度的策略将很有吸引力。
7.过继性t细胞疗法时治疗诱导的毒性的显著风险导致许多研究小组开发了基因编码的自杀开关，例如hsv-tk、icas9和基于cd20的细胞表面标志物自杀开关，这些自杀开关可以在观察到主要毒性时通过药物施用触发(jones等人，front pharmacol.2014年11月27日；5：254)。
8.这种自杀开关主要用于dli的场合，其中移植物抗肿瘤(gvt)效应与移植物抗宿主病(gvhd)相关，并寻求这两种效应之间的平衡。然而，这些开关的二元特性不允许对t细胞功能进行滴定，并且这些系统在tcr/car修饰的t细胞方面的用途有限。
9.在最近的工作中，已经改造出可以可逆地控制嵌合抗原受体(car)t细胞的安全开关技术(wu等人，science.2015年10月16日；350(6258)：aab4077，ma等人，proc natl acad sci u s a.2016年1月26日；113(4)：e450-8，loureiro等人，blood cancer j.2018年9月；8(9)：81)，但这些系统不能用于控制tcr修饰或非修饰的t细胞的活性。
10.在临床试验中也观察到了急性gvhd，其中患者接受了t细胞耗尽的nk细胞疗法，这
表明控制nk细胞活性的安全开关也是需要的(shah等人，blood.2015年1月29日；125(5)：784-92)。
11.有鉴于此，用于控制tcr和car t细胞功能和自然杀伤(nk)细胞功能(即nk细胞受体功能)的产品、组合物、方法和用途，特别是在患者中，将是高度理想的，但还不没有现成的。特别地，本领域明确需要允许控制tcr/car t细胞和nk细胞功能的可靠、有效和可重现的产品、组合物、方法和用途，所述功能例如这种包含t细胞的tcr或car，包含nk细胞的nk细胞受体(nkr)或car和/或通过此类t细胞或nk细胞控制细胞因子分泌的细胞毒活性。因此，本发明的技术问题可以在提供满足上述任何需要的此类产品、组合物、方法和用途中看出。该技术问题通过在权利要求和下文中表征的实施方案来解决。
12.发明详述
附图说明
13.下面结合附图对本发明实施方案作进一步描述，其中：
14.图1：通过zap70 sh2介导的pd1尾招募有效抑制t细胞功能。(a)tcr信号转导通路中早期步骤的示意图，显示在肽mhc接合时zap70向cd3ζ链的招募和pd-l1连接时pd1介导的对tcr信号传导的抑制。(b)zap70 sh2介导的pd1尾招募到活化的tcr复合体并由此抑制tcr信号传导的示意图。(c-d)用hla i类限制性cdk4 tcr和zap70-pd1、zap70 2xsh2结构域、pd1尾或载体对照修饰的原代人类t细胞与负载有cdk4肽的t2细胞共培养。(c，d)数据描述了cdk4 tcr egfp高cd8 (c)和cd4 (d)t细胞的ifnγ、il2、tnfα产生和细胞表面lamp1表达。
15.图2：t细胞功能的控制。在不存在(a)或存在(b)阿舒瑞韦(asunaprevir)的情况下，zap70-pd1-smash融合蛋白的示意图。在不存在阿舒瑞韦的情况下，hcv蛋白酶释放zap70-pd1部分以允许抑制tcr信号传导。在存在阿舒瑞韦的情况下，释放被阻止，融合蛋白被靶向蛋白酶体，从而去除对t细胞功能的抑制。(c-d)用n末端ha标记的zap70-pd1-smash开关或载体对照修饰的原代人类t细胞的细胞内ha染色。对于egfp高cd8 (c)和cd4 (d)t细胞，描述了先前阿舒瑞韦暴露24小时对ha信号的影响。(e-h)用hlai类限制性cdk4 tcr和zap70-pd1-smash开关(e，g)或载体对照(f，h)修饰的原代人类t细胞用10μm阿舒瑞韦或dmso对照进行预处理。数据描述了在阿舒瑞韦持续存在或不存在的情况下，在与负载有cdk4肽的t2细胞共培养时，cdk4 tcr egfp高cd8 (e-f)和cd4 (g-h)t细胞的细胞内ifnγ、il2、tnfα和细胞表面lamp1表达。误差棒代表标准偏差(n＝3)。数据代表两个独立实验。
16.图3：t细胞功能的可滴定双向控制。(a)实验设置示意图。用hla i类限制性cdk4 tcr和zap70-pd1或载体对照修饰的原代人类t细胞用b-d中指示的阿舒瑞韦浓度预处理24小时，然后直接使用(b-c)或在不存在药物的情况下培养72小时(d)。(b-c)在指定阿舒瑞韦浓度的持续存在或不存在下，在与负载有10nm cdk4肽的t2细胞共培养时，阿舒瑞韦处理对cd8 (b)和cd4 (c)t细胞功能输出的影响。(d)在不存在药物的情况下，用2.5μm阿舒瑞韦或dmso对照预处理的t细胞培养72小时，然后用2.5μm阿舒瑞韦或dmso对照处理，并在药物持续存在或不存在的情况下，与负载有10nm cdk4肽的t2细胞共培养。请注意，阿舒瑞韦的第一次处理在不存在药物的情况下，不会通过开关阻止对t细胞功能的后续抑制(比较 /-和-/-)，并且阿舒瑞韦的抑制的释放不受先前抑制释放的影响(比较-/ 和 / )。(b-d)数据
描述了细胞内ifnγ、il2、tnfα和细胞表面lamp1的表达。误差棒代表标准偏差(-n＝3)。数据代表两个独立实验。
17.图4：protac可用于调节crash-it平台中的t细胞活性。在dtag-13 protac不存在(a)或存在(b)的情况下，zap70-pd1-fkbp12
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融合蛋白的示意图。(c-e)用指定浓度的hcv ns3/4a蛋白酶抑制剂阿舒瑞韦(c)或格佐匹韦(grazoprevir)(d)或dtag-13(e)预处理用cdk4 tcr和zap70-pd1-smash、zap70-pd1-fkbp12
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或载体对照修饰的原代人类t细胞。数据描述了在指定浓度的阿舒瑞韦、格佐匹韦或dtag-13的持续存在下与表达cdk4表位的nkirtil006肿瘤细胞共表达时cd8 cdk4 tcr egfp高t细胞的细胞内ifnγ、il2、tnfα和细胞表面lamp1表达。(f-g)用小分子诱导的zap70-pd1-fkbp12
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开关调节t细胞的细胞毒性。用hla i类限制性cdk4 tcr和zap70-pd1-fkbp12
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(f)或载体对照(g)修饰的原代人类t细胞被分选为cd8 和高egfp表达，通过rep扩增并用0.5μm dtag-13或dmso预处理。数据描述了在持续存在或不存在dtag-13的情况下，在与分选的cd8 cdk4 tcr egfp高t细胞共培养时，从标记的nkirtil006肿瘤细胞中释放的
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cr。误差棒代表标准偏差(n＝3)。数据代表两个独立实验。
18.图5：通过crash-it控制car-t细胞功能。(a)第二代抗cd19-cd28-cd3ζcar与zap70-pd1-smash开关相互作用的示意图。(b)k562、daudi和raji肿瘤上的cd19表达。细胞用抗cd19-pe(实线)或同种型对照-pe(虚线)染色。(c-f)用抗cd19-cd28-cd3ζcar和zap70-pd1-smash(c，e)或载体对照(d，f)修饰的原代人类t细胞用10μm阿舒瑞韦或dmso对照进行预处理。数据描述了在持续存在或不存在阿舒瑞韦的情况下，在与cd19阴性k562或cd19阳性daudi或raji肿瘤细胞共培养时，car egfp高cd8 (c-d)和cd4 (e-f)t细胞的细胞内ifnγ、il2、tnfα和细胞表面lamp1的表达。误差棒代表标准偏差(n＝3)。数据代表两个独立实验。
19.图6：通过crash-it控制ny-eso-1 tcr t细胞功能。(a-d)用中等亲和力hla i类限制性ny-eso-1tcr和zap70-pd1-smash开关(a、c)或载体对照(b、d)修饰的原代人类t细胞用10μm阿舒瑞韦或dmso对照进行预处理。数据描述了在持续存在或不存在阿舒瑞韦的情况下，在与负载有ny-eso-1肽的t2细胞共培养时，ny-eso-1tcr egfp高cd8 (a-b)和cd4 (c-d)t细胞的细胞内ifnγ、il2、tnfα和细胞表面lamp1表达。误差线代表标准偏差(n＝3)。数据代表两个独立实验。
20.图7：通过n末端修饰调整抑制开关。(a-b)用hla i类限制性cdk4tcr和zap70-pd1-smash、n末端丙氨酸添加(调整的)tuzap70-pd1-smash或载体对照修饰的原代人类t细胞用10μm阿舒瑞韦或dmso对照进行预处理。数据描述了在持续存在或不存在阿舒瑞韦的情况下，在与nkirtil006肿瘤细胞共培养时，cdk4 tcr egfp高cd8 (a)和cd4 (b)t细胞的细胞内ifnγ、il2、tnfα和细胞表面lamp1表达。请注意，tuzap70-pd1-smash开关在不存在阿舒瑞韦的情况下产生了几乎等效的cd4 t细胞功能抑制，并在阿舒瑞韦存在时显著增加了t细胞功能的恢复。(c-d)用hla ii类限制性cmv tcr和tuzap70-pd1-smash(c)或载体对照(d)修饰的原代人类t细胞用10μm阿舒瑞韦或dmso对照进行预处理。数据描述了在持续存在或不存在阿舒瑞韦的情况下，在与负载有cmv肽的cbh 5477细胞共培养时，cd4 cmv tcr egfp高t细胞的细胞内ifnγ、il2、tnfα和细胞表面lamp1表达。误差棒代表标准偏差(n＝3)。数据代表两个独立实验。
21.图8：在crash-it平台中可以使用不同的含有抑制尾的itim/itsm来控制tcr t细胞的活性。用hla i类限制性cdk4 tcr和含有zap70(2xsh2)-x-smash的crash-it实施方案(其中x可以是无抑制尾，或pd1、btla、sirpa、siglec5、siglec9、siglec11、pecam1或ly9抑制尾(或胞质域/细胞内结构域/胞内域(endodomains))或载体对照修饰的原代人类t细胞用10μm阿舒瑞韦或dmso对照进行预处理。(a)t细胞的egfp中间体和egfp高门控的位置。数据描述了在持续存在或不存在阿舒瑞韦的情况下，在与nkirtil006肿瘤细胞共培养时，cdk4 tcr egfp中间体(b-c)和egfp高(d-e)、cd8 (b，d)和cd4 (c，e)t细胞的细胞内ifnγ、il2、tnfα和细胞表面lamp1表达。误差棒代表标准偏差(n＝3)。数据代表两个独立实验。
22.图9.在crash-it平台中可以使用不同的含有抑制尾的itim]itsm来控制car t细胞的活性。用第二代抗cd19-cd28-cd3ζcar和含有zap70(2xsh2)-x-smash的crash-it实施方案(其中x可以是无抑制尾，或pd1、btla、sirpa、siglec5、siglec9、siglec 11、pecam1或ly9的抑制尾(或胞质域/细胞内结构域/胞内域))或载体对照修饰的原代人类t细胞，用10μm阿舒瑞韦或dmso对照进行预处理。(a)t细胞的egfp中间体和egfp高门控的位置。数据描述了在持续存在或不存在阿舒瑞韦的情况下，在与daudi肿瘤细胞共培养时，cdk4 tcr egfp中间体(b-c)和egfp高(d-e)、cd8 (b，d)和cd4 (c，e)t细胞的细胞内ifnγ、il2、tnfα和细胞表面lamp1表达。误差棒代表标准偏差(n＝3)。数据代表两个独立实验。
23.图10：包含对接结构域(docking domains)的替代sh2可用于crash-it平台。用hlai类限制性cdk4 tcr和zap70(2xsh2)-pd1尾-smash、syk(2xsh2)-pd1尾-smash、lck(sh4-unique-sh3-sh2)-pd1尾-smash或载体对照修饰的原代人类t细胞用10μm阿舒瑞韦或dmso对照进行预处理。数据描述了在持续存在或不存在阿舒瑞韦的情况下，在与nkirtil006肿瘤细胞共培养时，cd8 cdk4 tcr egfp高t细胞的细胞内ifnγ、il2、tnfα和细胞表面lamp1表达。误差棒代表标准偏差(n＝3)。数据代表两个独立实验。
24.图11：pd1、btla、sirpa、siglec5、siglec9、siglec11、pecam1和ly9的胞质域中基于免疫受体酪氨酸的开关基序(itsm，粗体描绘)和基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(itim，下划线描绘)序列的比较。itsm的共有序列是txyxxv/i，而itim的共有序列是s/i/v/lxyxxi/v/l。
25.图12：比较cd3ζ链、cd3ε链、cd3δ链、cd3γ链、免疫球蛋白受体fcεri的γ(γ)链和dap12的基于免疫受体酪氨酸的激活基序(itam，用粗体和下划线描绘)序列。itam的共有序列为yxxi/lx(6-8)yxxi/l。
26.图13：通过crash-it控制nk细胞功能。用zap70-pd1-fkbp12
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开关或载体对照修饰的人类nk细胞系khyg-1用0.5μm dtag-13protac或dmso对照进行预处理。(a)nk细胞的egfp中间体门控的位置。数据描绘了在持续存在或不存在dtag-13的情况下，在与k562肿瘤细胞共培养(b)或在没有k562细胞的情况下(c)，egfp中间体nk细胞的细胞内ifnγ、il2和tnfα表达。误差棒代表标准偏差(n＝3)。数据代表两个独立实验。
27.图14：crash-it开关可以与各种包含itam的car组合使用。用(a)zap70-pd1-fkbp12
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或(b)载体对照和cd19 scfv-cd28(铰链 tm)-cd3ζ链、cd19 scfv-cd28(铰链 tm)-fcer1g、cd19 scfv-cd3ε链(全长)、cd19 scfv-cd28(铰链 tm)-cd3g链或cd19 scfv-cd28(铰链 tm)-dap12 car修饰的原代人类t细胞用0.5μm dtag-13或dmso对照进行预处理。(a-b)数据描述了在持续存在或不存在dtag-13的情况下，在与daudi肿瘤细胞共培养
时，car 、egfp高cd8 t细胞的细胞内ifnγ、il2、tnfα和细胞表面lamp1表达。误差棒代表标准偏差(n＝3)。
28.图15：在imid不存在(a)或存在(b)的情况下，zap70-pd1-锌指降解决定子(degron)开关的示意图(作为根据本发明的实施方案的实例，其采用了crbn多肽底物结构域，该结构域能够响应于药物而结合crbn蛋白，从而促进泛素途径介导的嵌合多肽的降解)。(a)在不存在imid，例如沙利度胺、来那度胺或泊马度胺的情况下，zap70-pd1-锌指融合蛋白是稳定的并抑制t细胞功能。(b)imid的存在通过招募crbn e3连接酶诱导融合蛋白降解，从而导致t细胞活性的恢复。
29.图16：表达cd8细胞的基于锌指降解决定子的crash-it开关的imid滴定揭示了具有不同药物敏感性的设计。(a)使用的锌指降解决定子的氨基酸序列。顶部锌指降解决定子源自ikzf1 zf2-3序列。ikzf1 zf2β转角序列(显示在矩形内)被znf653 zf4、zfp91 zf4、znf276 zf4或znf827 zf1的β转角序列替换，以创建具有改进的imid敏感性的杂合锌指，如下所示。单独的c2h2锌指序列加下划线。用指定浓度的来那度胺(b)、泊马度胺(c)或沙利度胺(d)预处理用cdk4 tcr和指定的zap70-pd1-锌指降解决定子修饰的原代人类t细胞。数据描述了在持续存在指定浓度的来那度胺、泊马度胺或沙利度胺的情况下，在与nkirtil006肿瘤细胞共培养时，cdk4 tcr 、egfp高cd8 t细胞的细胞内ifnγ、il2、tnfα和细胞表面lamp1表达。误差棒代表标准偏差(n＝2)。
30.图17：基于杂合zfp91/ikzf1(双zf)的crash-it开关在存在imid的情况下高效恢复t细胞功能。(a)实验中使用的锌指降解决定子的氨基酸序列。在实验中使用源自ikzf1、ikzf3、zfp91、znf276、znf653、znf692(均为双zf)的野生型锌指降解决定子，或带有或不带有ikzf1 zf3(分别为双zf和单个zf)的杂合zfp91/ikzf1锌指降解决定子。单独的c2h2锌指序列加下划线。用cdk4 tcr和指定的zap70-pd1-锌指降解决定子修饰的原代人类t细胞用0.5μm泊马度胺、0.5μm沙利度胺或dmso对照进行预处理。数据描述了在持续存在或不存在泊马度胺或沙利度胺的情况下，在与nkirtil006肿瘤细胞共培养时，cdk4 tcr 、egfp高cd8 t细胞的细胞内ifnγ、il2、tnfα和细胞表面lamp1表达。误差棒代表标准偏差(n＝2)。
31.对序列表的引用
32.作为本公开的一部分的序列表包括包含本发明的核苷酸和/或氨基酸序列的文本文件。序列表的主题整体纳入本文。以计算机可读形式记录的信息、与书面序列表相同。
33.定义
34.本文使用的章节标题仅用于组织目的，不应解释为限制所描述的主题。
35.本公开的一部分包含受版权保护的材料(例如但不限于图表、设备照片或本提交的任何其他方面，其在任何司法管辖区都可以获得或可能获得版权保护)。版权所有者不反对任何人对专利文件或专利公开内容进行传真复制，因为它出现在专利局专利文件或记录中，但除此之外保留所有版权权利。
36.在整个说明书和权利要求书中使用了与本发明的方法、组合物、用途和其他方面有关的各种术语。除非另有说明，否则这些术语将被赋予其在本发明所属领域中的普通含义。其他具体定义的术语将以与本文提供的定义一致的方式解释。尽管与本文所述的那些方法和材料相似或等效的任何方法和材料都可用于实践来测试本发明，但本文描述了优选的材料和方法。
37.为了本发明的目的，以下术语定义如下。
38.如本文所用，单数形式的术语“一(a)”、“一个(an)”和“该(the)”包括复数指示物，除非内容另有明确规定。因此，例如，提及“细胞”包括两个或更多个细胞的组合等。
39.如本文所用，术语“和/或”是指其中一种或多种所述情况可能单独发生或与至少一种所述情况相结合，直至与所有所述情况一起发生的情况。
40.如本文所用，术语“至少”特定值是指该特定值或更多。例如，“至少2”被理解为与“2或更多”相同，即2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15等。如本文所用，术语“最多”特定值是指该特定值或更少。例如，“最多5”被理解为与“5或更少”相同，即5、4、3、...-10、-11等。
41.如本文所用，术语“包含”被解释为包括的和开放的，而非排他的。具体而言，该术语及其变体意味着包括指定的特征、步骤或组件。这些术语不应被解释为排除其他特征、步骤或组件的存在。它还包括更具限制性的“由......组成”。
42.如本文所用，“常规技术”或“本领域技术人员已知的方法”是指其中本发明方法中使用的实施常规技术的方法对本领域技术人员来说是显而易见的情况。分子生物学、生物化学、细胞培养、基因组学、测序、医学治疗、药理学、免疫学和相关领域的常规技术的实践为本领域技术人员所熟知，并且在各种手册和参考文献中进行了讨论。
43.如本文所用，术语“示例性”表示“用作示例、实例或说明”，并且不应解释为排除本文公开的其他配置。
44.如本文所用，术语“癌症”是指通常以不受调节的细胞生长为特征的哺乳动物的生理状况。
45.术语“癌症”、“赘生物”和“肿瘤”通常可互换使用，用于描述发生恶性转化使它们对宿主生物体具有病理性的细胞。可以通过技术人员已知的技术将原发性癌细胞与非癌细胞区分开来。如本文所用，癌细胞不仅包括原发性癌细胞，还包括源自此类原发性癌细胞的癌细胞，包括转移的癌细胞，以及源自癌细胞的细胞系。实例包括实体瘤和非实体瘤或血液肿瘤。癌症的实例包括但不限于白血病、淋巴瘤、肉瘤和癌(例如结肠癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、肺癌、黑色素瘤、淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、结肠癌、(恶性)黑色素瘤、甲状腺癌、甲状腺乳头状癌、肺癌、非小细胞肺癌和肺腺癌)。众所周知，肿瘤可以从第一个位置转移到一个或多个其他身体组织或部位。提及对患者的“赘生物”、“肿瘤”或“癌症”的治疗包括原发性癌症的治疗，以及在适当情况下转移的治疗。
46.如本文所用，术语“嵌合基因”或“嵌合核酸”是指在自然界中的物种中通常不存在的任何基因或核酸，特别是其中核苷酸序列的一个或多个部分本质上是互不相关的基因或核酸。例如，启动子在本质上不与部分或全部转录区或不与另一个调节区相关，或者转录区的不同部分在本质上不相关。术语“嵌合基因”被理解为包括其中启动子或转录调控序列与一个或多个编码序列可操作地连接的表达构建体。在一些实施方案中，嵌合核酸的嵌合基因可用于制备嵌合蛋白。
47.如本文所用，术语“蛋白质”和“多肽”是指由氨基酸链组成的分子，而不涉及特定的作用方式、大小、三维结构或来源。因此，多肽的“片段”或“一部分”或“部分”仍可称为“多肽”。“分离的蛋白质”或“分离的多肽”用于指不再处于其自然环境中的蛋白质或多肽，例如在体外或在重组宿主细胞中。
48.如本文所用，术语“嵌合多肽”、“嵌合蛋白”或“融合蛋白”是指自然界中的物种通常不存在的任何多肽，特别是其中氨基酸序列的一个或多个部分本质上是互不相关的多肽。例如，嵌合多肽可以包含在本质上彼此不相关和/或在该顺序本质上彼此不相关的n末端部分和c末端部分，所述n末端部分由第一氨基酸序列组成，所述c末端部分由第二氨基酸序列组成。嵌合多肽可以例如从核酸的嵌合基因的转录和翻译中获得。
49.如本文所用，术语“核酸”或“多核苷酸”是指(连续)核苷酸的任何聚合物或低聚物。核酸可以是dna或rna，或其混合物，并且可以以单链或双链形式包括同源双链、异源双链和杂合状态永久或过渡地存在。本发明涵盖任何脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸或肽核酸组分，及其任何化学变体，例如这些碱基的甲基化、羟甲基化或糖基化形式等。聚合物或低聚物在组成上可以是异质的或均质的，并且可以从天然存在的来源中分离或可以人工或合成产生的。因此，术语“分离的”是指从天然存在的来源分离或人工或合成产生的。
50.如本文所用，术语“药物组合物”是指药学上可接受的组合物，其包含与一种或多种药学上可接受的载体(添加剂)和/或稀释剂一起配制的治疗有效量的物质。
51.如本文所用，“疗法”或“治疗”是指用治疗剂(包括生物材料和细胞)或药物治疗肿瘤。治疗可能涉及施用一种以上的药物。药物可以单独施用，也可以与其他治疗联合施用，根据待治疗的病症同时或依次施用。例如，该疗法可以是涉及施用两种药物/试剂的联合疗法，其中一种或多种药物/试剂可用于治疗肿瘤。治疗方案可以是治疗施用的预定时刻表、计划、方案或时间表，其可以由医师或医疗从业者准备并且可以被定制以适合需要治疗的患者。治疗方案可以说明以下一项或多项：施用至患者的治疗的类型；每种药物的剂量；施用之间的时间间隔；每次治疗的长度；任何治疗假期的数量和性质，如果有的话等。对于联合治疗，可以提供单一治疗方案，该方案表明如何施用每种药物/试剂。
52.如本文所用，术语“患者”或“个体”或“受试者”是指哺乳动物。哺乳动物包括但不限于驯养动物(例如牛、羊、猫、狗和马)、灵长类动物(例如人类，和非人类灵长类动物例如猴子)、兔子和啮齿动物(例如小鼠和大鼠)。在某些实施方案中，患者、个体或受试者是人。在一些实施方案中，患者可以是“癌症患者”，即患有或有患上一种或多种癌症症状的风险的人。
53.如本文所用，如本文所用的术语“载体”是指能够增殖与其连接的另一核酸的核酸分子。该术语包括作为自我复制核酸结构的载体，以及掺入宿主细胞基因组中的载体，其中所述载体已被引入宿主细胞基因组。某些载体能够指导与它们可操作地连接的核酸的表达。此类载体在本文中被称为“表达载体”。
54.详细说明
55.预期本文所述的任何方法、用途或组合物可以相对于本文所述的任何其他方法、用途或组合物来实施。在本发明的方法、用途和/或组合物的上下文中讨论的实施方案可以相对于本文所述的任何其他方法、用途或组合物来采用。因此，与一种方法、用途或组合物有关的实施方案也可以应用于本发明的其他方法、用途和组合物。
56.如本文所体现和广泛描述的，本发明涉及令人惊讶的发现，即使用本文所公开的嵌合多肽，现在控制t细胞活性，特别是控制t细胞的细胞毒活性和/或控制细胞因子由此类t细胞例如cd4或cd8阳性t细胞的分泌，并控制自然杀伤细胞活性，特别是控制nk细胞的细胞毒活性和/或控制细胞因子由此类nk细胞的分泌变得可能。
57.更具体地，本发明人已经开发了一种用于调节和/或操纵t细胞和nk细胞中的信号转导途径的创新系统。该系统允许作为通过t细胞受体(tcr)和/或嵌合抗原受体(car)信号传导的结果对t细胞活性进行时间和/或剂量依赖性调节，以及作为通过nk细胞受体(nkr)和/或嵌合抗原受体(car)信号转导的结果对nk细胞活性进行时间和/或剂量依赖性调节。该系统可以适当地用于表达tcr和/或car的任何细胞，包括天然t细胞或被操作以表达特定(修饰的)tcr和/或car的t细胞和/或表达nkr和/或car的任何细胞，包括天然或人工操作的nk细胞。因此，根据本发明的实施方案，根据本发明的细胞是淋巴细胞，特别是t细胞或nk细胞。此类t细胞和/或nk细胞应被理解为包括任何“修饰的”t细胞或nk细胞，例如car t细胞、car nk细胞、多个car t细胞、多个car nk细胞、串联car t细胞、串联car nk细胞、转基因tcr t细胞和转基因tcr nk细胞。
58.由于存在小分子调节的蛋白质稳定性结构域，本公开提供了根据本发明的嵌合多肽对t细胞和nk细胞活性(例如细胞毒活性和/或细胞因子分泌)的严格调节，所述小分子调节的蛋白质稳定性结构域用于以时间和/或剂量依赖性方式调节(例如，减少或增加)根据本发明的嵌合多肽的表达。
59.嵌合多肽被设计为与tcr/cd3复合体和/或car和/或nk细胞受体(nkr)复合体中的磷酸化的基于免疫受体酪氨酸的激活基序(itam)相互作用，tcr/cd3复合体和/或car和/或nk细胞受体(nkr)复合体含有带有itam的信号传导分子，例如dap12、免疫球蛋白受体fcεri的γ(γ)链或cd3ζ链(lanier等人，nat immunol.2008年5月；9(5)：495-502)。
60.这些itam基序中的酪氨酸残基在受体分子与其配体相互作用后被磷酸化，并为参与细胞的信号传导途径的其他蛋白质形成对接位点(docking sites)。通过根据本发明的嵌合多肽与tcr和/或car的相互作用，抑制了t细胞活化(以及随后的细胞毒性作用和/或细胞因子分泌)。类似地，通过本发明的嵌合多肽与nk细胞中的nkr和/或car的相互作用，抑制了nk细胞的nk细胞活化(以及随后的细胞毒性作用和/或细胞因子分泌)。
61.根据优选的实施方案，嵌合多肽还包含紧邻小分子调节的蛋白质稳定性结构域和与磷酸化的itam基序相互作用的结构域之外的基于免疫受体酪氨酸的开关基序(itsm)，优选itsm和基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(itim)。例如，此类基序存在于pd1的抑制尾中，并被认为与pd1的免疫抑制作用有关(boussiotis等人，cancer j.2014年7月-8月；20(4)：265-271)。令人惊讶地发现，在嵌合多肽中存在这样的itsm，优选这样的itsm和这样的itim，允许嵌合多肽有效地抑制通过例如tcr、nkr或car的信号转导(在配体与受体结合时)。在这里，我们示出可以使用这些itsm，优选存在于例如，抑制性免疫受体蛋白如pd1的抑制尾中的itsm和itim，以抑制t细胞中的tcr和/或car信号传导和nk细胞中的nkr信号传导，不需要存在抑制蛋白的细胞外结构域或与其配体相互作用(例如pd1的pd-l1)。与允许嵌合多肽在细胞例如t细胞中剂量依赖性表达的小分子调节的蛋白质稳定性结构域组合，因此该系统提供了一种有效和可靠的方式来精确调节t细胞功能，例如t细胞活化、t细胞细胞毒性和/或t细胞细胞因子分泌。通过这种方式，可以预防/抑制或激活t细胞功能，从而导致在体外和体内(即在治疗癌症或依赖于t细胞(包括表达(修饰的)tcr和/或car./pct的t细胞)的使用的其它病症如自身免疫性疾病等时)保持的、恢复的、安全的和受控的t细胞功能。
62.类似地，可以预防/抑制或激活nk细胞功能，从而导致在体外和体内(即在治疗癌
症或依赖于nk细胞(包括表达(修饰的)nkr和/或car的nk细胞)的使用的其它病症如自身免疫性疾病等时)保持的、恢复的、安全的和受控的nk细胞功能。
63.因此，根据本发明的第一方面，提供了包含嵌合多肽或包含编码所述嵌合多肽的多核苷酸的核酸的细胞，其中所述嵌合多肽包含：
64.a)第一部分，其包含来自结合磷酸化的基于免疫受体酪氨酸的激活基序(itam)的蛋白质的sh2结构域；和
65.b)第二部分，其包含小分子调节的蛋白质稳定性结构域。
66.根据本发明的细胞可以是可以适当地包含如本文所公开的嵌合多肽或编码这种嵌合多肽的核酸的任何细胞。在一些实施方案中，细胞是原核细胞。在一些实施方案中，细胞是真核细胞。优选地，细胞是真核细胞，甚至更优选地哺乳动物细胞，例如人类细胞。细胞可以是特化细胞，例如t细胞或nk细胞，或者是任何其他类型的细胞，包括(未分化的)干细胞。
67.根据本发明的多肽是包含至少第一部分和第二部分的嵌合多肽。其中第一部分和第二部分存在于嵌合肽中的顺序不是关键的。本发明不受嵌合多肽中第一部分、第二部分或在一些实施方案中第三部分的位置的限制。例如，在一些实施方案中，第一部分或第二部分在嵌合多肽的n或c末端融合(例如，基因连接)，或存在于嵌合多肽内部。换言之，在嵌合多肽中，第一部分和/或第二部分可以在c末端、在n末端，或者可以在c末端和/或在n末端通过另外的部分侧接(flank)。第一部分相对于第二部分可以更靠近c末端，或者可以相对于第二部分更靠近n末端。
68.第一部分和第二部分可以彼此直接相邻或者可以通过另外的部分(即另外的(一段)氨基酸残基彼此分开。
69.如本文所公开的嵌合多肽的特征在于存在第一部分，所述第一部分包含来自结合磷酸化的基于免疫受体酪氨酸的激活基序(itam)的蛋白质的sh2结构域。从实例可以看出，sh2结构域可以是来自可以与磷酸化的itam结合的蛋白质的任何sh2结构域。本领域技术人员熟知用于本文公开的嵌合多肽的合适的sh2结构域和/或能够容易地鉴定此类合适的sh2结构域或包含能够结合磷酸化(itam)的此类sh2结构域的蛋白质。如本领域技术人员将理解的，可以鉴于包含在例如tcr/cd3复合体和/或car和/或nk细胞受体(nkr)复合体中的itam来选择合适的sh2结构域，根据本发明的嵌合多肽设计用于该tcr/cd3复合体和/或car和/或nk细胞受体(nkr)复合体。换言之，根据本发明的嵌合蛋白包含来自与磷酸化的基于免疫受体酪氨酸的激活基序(itam)结合的蛋白质的sh2结构域，并且其中所述itam包含在例如在本发明的上下文中所靶向的tcr或car复合体中。
70.如本文所用，术语“sh2结构域”是指src同源性2结构域。sh2结构域是包含在src癌蛋白和许多其他细胞内信号转导蛋白中的结构上保守的蛋白质结构域。sh2结构域允许含有这些结构域的蛋白质与其他蛋白质上的磷酸化酪氨酸残基对接。因此，sh2结构域是模块化蛋白质结构域，可作为衔接子并通过与其各自的蛋白质结合配偶体中的磷酸化肽结合来介导蛋白质-蛋白质相互作用。
71.sh2结构域通常结合靶蛋白内较长肽基序中的磷酸化的酪氨酸残基。sh2结构域本身缺乏任何内在催化活性，但它们用于将多肽中的偶联功能结构域定位到适当的底物、激活剂或抑制剂附近(ngoenkam等人，immunology.2018年1月；153(1)：42-50)。
72.例如，一些sh2结构域可以与具有磷酸化的基于免疫受体酪氨酸的激活基序(itam)的蛋白质相互作用，而其他sh2结构域与具有磷酸化的基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(itim)的蛋白质相互作用。在本发明中，使用来自结合磷酸化的基于免疫受体酪氨酸的激活基序(itam)的蛋白质的sh2结构域。令人惊讶地发现，虽然来自与磷酸化itam结合的蛋白质的sh2结构域对于如本文所公开的嵌合肽调节t细胞活性或nk细胞活性很重要，但与itim相互作用的sh2结构域不是或在较小程度上适用于根据本发明的嵌合多肽。
73.在优选的实施方案中，sh2结构域来自与存在于tcr复合体、nkr复合体和/或car中的磷酸化的基于免疫受体酪氨酸的激活基序(itam)结合的蛋白质。
74.在一些实施方案中，sh2结构域是由liu等人(mol cell.2006；22(6)：851-868.doi：10.1016/j.molcel.2006.06.001)注释为βa-αa-βb-βc-βd-βe-βf-αb-βg的sh2结构域，用于120个已知的人类sh2结构域；β指的是β链，而α指的是α螺旋(另见eck等人.nature.1993；362(6415)：87-91.doi：10.1038/362087a0)。例如，sh2结构域可以在技术人员熟知的各种数据库中找到(参见例如smart.embl.de/smart/do_annotation.pl？domain＝sm00252或www.ebi.ac.uk/interpro/entry/interpro/ipr000980/)。
75.如本文所用，术语“基于免疫受体酪氨酸的激活基序(itam)”是指重复两次并存在于免疫系统某些细胞表面蛋白的胞质尾区(即胞内域)中的四个氨基酸的保守序列。半itam包含由任何两个其他氨基酸与亮氨酸残基(l)或异亮氨酸残基(i)隔开的酪氨酸残基(y)。半itam的共有序列是yxxl/1。两个半itam通常由6到8个氨基酸彼此隔开以形成完整的itam。itam的共有序列是yxxl/lx(6-8)yxxl/1。itam在免疫细胞的信号转导中发挥重要作用，它们存在于t细胞受体复合体(cd3ε链、cd3δ链、cd3γ链和/或cd3ζ链)中细胞信号传导分子的胞质尾区。在nk细胞中，itam存在于包含cd3ζ链、免疫球蛋白受体fcεri的γ(γ)链和dap12的nk细胞受体复合体中(lanier等人，nat immunol.2008年5月；9(5)：495-502)。itam也存在于包含cd3ζ链(abate-daga等人，mol ther oncolytics.2016；3：16014)、cd3ε链(nolan等人，clin cancer res.1999年12月；5(12)：3928-41)，免疫球蛋白受体fcεri的γ(γ)链(ren-heidenreich等人，cancer immunol immunother.2002年10月；51(8)：417-23)和dap12(等人，j immunol.2015年4月1日；194(7)：3201-12)的嵌合抗原受体(car)复合体中。
76.itam基序中的酪氨酸残基在受体分子与其配体相互作用后被磷酸化，并形成参与细胞的信号传导途径的其他蛋白质的对接位点。一旦磷酸化，包含与这种磷酸化itam结合的蛋白质的sh2结构域可以与例如存在于cd3ζ链中的磷酸化itam相互作用。已知几种蛋白质含有具有一个或多个itam基序的胞内域。此类蛋白质的实例包括cd3γ链、cd3δ链和cd3ε链、cd3ζ链、免疫球蛋白受体fcεri的γ(γ)链和dap12。
77.如本文所公开的嵌合多肽的进一步特征在于存在第二部分，所述第二部分包含小分子调节的蛋白质稳定性结构域。小分子调节的蛋白质稳定性结构域也可以被称为可调节的去稳定结构域。本发明的嵌合多肽中的这种小分子调节的蛋白质稳定性结构域或可调节的去稳定结构域用于以时间和/或剂量依赖性方式调节(例如，降低或增加)本发明的嵌合多肽的表达。
78.更详细地，本发明的嵌合多肽中的小分子调节的蛋白质稳定性结构域或可调节的去稳定结构域是可以通过向包含嵌合多肽的细胞提供化合物(例如小分子)来调节的结构
域。通过添加化合物，嵌合多肽中的小分子调节的蛋白质稳定性结构域或可调节的去稳定结构域被修饰以引起嵌合多肽的破坏。
79.换言之，响应于此类化合物，并且通过化合物与嵌合多肽中的小分子调节的蛋白质稳定性结构域或可调节的去稳定结构域的相互作用，根据本发明的嵌合多肽将被降解，导致细胞中嵌合多肽的水平或浓度降低。反过来，通过降低细胞中嵌合多肽的水平或浓度，作为通过tcr和/或car信号传导的结果，t细胞功能，例如t细胞活化、t细胞毒性和/或由t细胞的细胞因子的分泌的抑制被逆转。
80.同样，在nk细胞中，通过降低细胞中嵌合多肽的水平或浓度，作为通过nkr和/或car信号传导的结果，nk细胞功能，例如nk细胞活化、nk细胞毒性和/或由nk细胞的细胞因子的分泌的抑制被逆转。这样，t细胞功能和/或nk细胞功能可以被本发明的嵌合多肽调节。以这种方式，t细胞功能和/或nk细胞功能可以通过向细胞提供与嵌合多肽中的小分子调节的蛋白质稳定性结构域或可调节的去稳定结构域相互作用的化合物来调节，从而导致本发明的嵌合多肽的破坏。
81.令人惊讶地发现，使用本发明的嵌合多肽，t细胞功能或nk细胞功能可以通过嵌合多肽中的小分子调节的蛋白质稳定性结构域或可调节的去稳定结构域以可逆的方式和/或以剂量依赖性方式(参见实例)调节。在不存在与小分子调节的蛋白质稳定性结构域或可调节的去稳定结构域相互作用的化合物(其相互作用导致嵌合多肽的破坏)的情况下，作为嵌合多肽与tcr/cd3复合体和/或car相互作用的结果，本发明的嵌合多肽通过抑制经由tcr和/或car的信号传导抑制t细胞功能。
82.类似地，在不存在与小分子调节的蛋白质稳定性结构域或可调节的去稳定结构域相互作用并且在那种情况下导致嵌合多肽破坏的化合物的情况下，作为嵌合多肽与含有带有itam的信号传导分子(例如cd3ζ链、免疫球蛋白受体fcεri的γ(γ)链和dap12和/或car)的nkr复合体相互作用的结果，本发明的嵌合多肽通过抑制经由nkr和/或car的信号传导来抑制nk细胞功能。在这种化合物的存在下，嵌合多肽将被导向细胞中的蛋白质降解系统，从而释放对t细胞功能和/或nk细胞功能的抑制；t细胞功能和/或nk细胞功能抑制的释放是剂量依赖性的，如从实施例可以证明的。
83.或者，可以使用小分子调节的蛋白质稳定性结构域或可调节的去稳定结构域，其在不存在小分子的情况下指导本发明的嵌合蛋白的降解。在这样的实施方案中，小分子的存在引起嵌合蛋白的稳定化，从而抑制t细胞或nk细胞功能，并且撤除小化合物将恢复t细胞或nk细胞的活性。
84.本发明不限于任何特定的小分子调节的蛋白质稳定性结构域或可调节的去稳定结构域。实际上，赋予嵌合多肽稳定性的任何小分子调节的蛋白质稳定性域或可调节的去稳定结构域(等人，cell mol life sci.2019年7月；76(14)：2761-2777)使得嵌合多肽降解发生在当嵌合多肽中的小分子调节的蛋白质稳定性结构域或可调节的去稳定结构域被修饰以通过可以在本发明中使用的其同源小分子的存在指导嵌合多肽降解时。本领域技术人员熟知此类合适的小分子调节的蛋白质稳定性结构域或可调节的去稳定结构域。小分子调节的蛋白质稳定性结构域或可调节的去稳定结构域的非限制性实例是自切除降解决定子(sed)，其中sed包含可可抑制蛋白酶、同源切割位点和降解决定子序列(chung等人，nat chem biol.2015年9月；11(9)：713-20)或蛋白水解靶向嵌合体(protac)结合结构域。
进而可以与根据本发明的嵌合多肽中的protac结合结构域结合的protac包含e3泛素连接酶结合基团(e3lb)、接头和与嵌合多肽中的protac结合结构域结合的蛋白质结合基团(nabet等人，nat chem biol.2018年5月；14(5)：431-441，an等人，ebiomedicine.2018年10月；36：553-562)。用于本发明的小分子调节的蛋白质稳定性结构域或可调节的去稳定结构域的优选实例被广泛地称为crbn多肽底物结构域，其能够响应药物而结合crbn蛋白，从而促进泛素途径介导的嵌合多肽的降解。这种小分子调节的蛋白质稳定性结构域的典型实例包括所谓的锌指降解决定子。
85.小分子imid，如沙利度胺、来那度胺和泊马度胺，通过将这些含有cys2-his2(c2h2)锌指结构域的蛋白质招募到cereblon(crbn)(crl4crbn e3泛素连接酶的底物受体)来体内诱导转录因子如ikaros(ikzf1)和aiolos(ikzf3)的泛素化和蛋白酶体降解。此类锌指结构域(锌指降解决定子)可用于在离体和体内向包含异源蛋白质的表达此类锌指结构域的细胞提供imid后，以时间和剂量依赖性方式靶向异源蛋白质以进行降解(参见koduri等人pnas(2019)116(7)2539-2544；doi.org/10.1073/pnas.1818109116)。
86.事实上，大量可能的锌指多肽和锌指结构域已被用于介导小分子介导的，例如imid(例如沙利度胺、来那度胺和泊马度胺)介导的靶蛋白的降解(参见例如sievers等人.science.2018年11月2日；362(6414)：eaat0572.doi：10.1126/science.aat0572)。鉴于此，技术人员非常熟悉此类crbn多肽底物结构域的使用和设计，其能够响应药物而结合crbn蛋白，从而促进泛素途径介导的嵌合多肽的降解，特别是其中crbn多肽底物结构域是能够被药物诱导而与crbn多肽结合的c2h2锌指蛋白或其片段，如本文详述的。
87.根据优选的实施方案，提供了本发明的细胞，其中嵌合多肽包含第三部分，所述第三部分包含基于免疫受体酪氨酸的开关基序(itsm)、基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(itim)，或优选地itsm和基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(itim)。
88.在一些可替代的实施方案中，第三部分包含基于免疫受体酪氨酸的开关基序(itsm)和/或基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(itim)，优选地itsm和基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(itim)。
89.优选地，第三部分包含基于免疫受体酪氨酸的开关基序(itsm)，优选地itsm和基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(itim)。
90.其中第一部分、第二部分和第三部分存在于嵌合肽中的顺序不是关键的。本发明通常不受嵌合多肽中第一部分、第二部分或第三部分的位置的限制。例如，在一些实施方案中，第一部分、第二部分或第三部分在嵌合多肽的n或c末端融合(例如，基因连接)，或存在于嵌合多肽内部。换言之，在嵌合多肽中，第一、第二或第三部分可以在c末端、在n末端，或者可以在c末端和/或在n末端通过其他部分侧接。第一部分(p1)、第二部分(p2)和第三部分(p3)的合适顺序的实例通常可以是xp1xp2xp3x、xp1xp3xp2x、xp2xp1xp3x、xp2xp3xp1x、xp3xplxp2x或xp3xp2xp1x，其中在任何位置的x可以独立地指代不存在另外的氨基酸残基或存在不形成p1、p2和/或p3的一部分的一个或多个另外的氨基酸残基。关于第一部分和第二部分的顺序，例如在不存在第三部分的那些实施方案中，与上述实例类似，第一部分(p1)和第二部分(p2)的合适顺序的实例通常可以是xp1xp2x或xp2xp1x，其中在任何位置的x可以独立地指不存在另外的氨基酸残基或存在不形成p1和/或p2的一部分的一个或多个另外的氨基酸残基。
91.同时，技术人员将理解，除了来自结合磷酸化的基于免疫受体酪氨酸的激活基序(itam)的蛋白质的sh2结构域之外，第一部分可以包含另外的结构域或氨基酸，例如，通常位于蛋白质中sh2结构域的侧翼(一侧或两侧)的一种或几种氨基酸，该蛋白质结合磷酸化的基于免疫受体酪氨酸的激活基序(itam)。
92.同时，技术人员将理解，除了小分子调节的蛋白质稳定性结构域外，第二部分还可以在一侧或两侧包含其他结构域或氨基酸。
93.同时，技术人员将理解，除了基于免疫受体酪氨酸的开关基序(itsm)，优选itsm和基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(itim)之外，第三部分可以包含其它结构域或氨基酸，例如通常位于这些基序侧翼(在一侧或两侧)的一个或几个氨基酸。
94.技术人员将理解本发明的嵌合多肽的第一、第二和第三部分可以以任何顺序存在于嵌合多肽中，只要小分子调节的蛋白质稳定性结构域或可调节的去稳定结构域位于嵌合多肽中，使得在与与小分子调节的蛋白质稳定性结构域或可调节的去稳定结构域相互作用的化合物接触时，嵌合多肽被降解，并且由于嵌合多肽的降解，通过嵌合多肽与tcr和/或car相互作用的t细胞功能和/或nk细胞功能的抑制被释放即可。
95.术语“itim”和/或“itsm”是技术人员已知的(liu等人，mol cell proteomics.2015年7月；14(7)：1846-58)。
96.如本文所用，术语“基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(itim)”通常是指在免疫系统的许多抑制受体的胞质尾区中发现的氨基酸的保守序列。itim基序包含丝氨酸残基(s)、异亮氨酸残基(i)、缬氨酸残基(v)或亮氨酸残基(l)，由任何其他氨基酸残基(x)与酪氨酸残基(y)隔开，由任意两个其他氨基酸与异亮氨酸残基(i)、缬氨酸残基(v)或亮氨酸残基(l)隔开。共有标签是s/l/v/lxyxxl/v/l。在体内，具有itim的抑制性受体与其配体相互作用，导致itim基序被src激酶的酶磷酸化，从而使它们能够招募含有sh2的蛋白酪氨酸磷酸酶(ptp)，例如shp-1和shp-2(coxon等人，blood.2017年6月29日；129(26)：3407-3418)，以及脂质磷酸酶，例如ship-1。ptp对抗蛋白酪氨酸激酶(ptk)如lck和zap70的正调节作用，从而负调节t细胞信号传导(lorenz等人，immunol rev.2009年3月；228(1)：342-359)。通过对tcr、car和其他免疫受体中的itam进行去磷酸化，ptp可以逆转itam磷酸化的激活作用。脂质磷酸酶通过改变脂质磷酸盐与其去磷酸化产物的浓度来调节细胞信号传导。
97.如本文所用，术语“基于免疫受体酪氨酸的开关基序(itsm)”是指在胞质尾区(或胞质域或细胞内结构域或胞内域中发现的氨基酸的保守序列；换言之，存在于免疫系统的许多抑制性受体的细胞的细胞质(而不是细胞膜和/或细胞外空间中)的蛋白质的一部分。itsm基序包含苏氨酸残基(t)，由任何其他氨基酸残基与酪氨酸残基(y)隔开，由任何其他两个氨基酸与缬氨酸残基(v)或异亮氨酸残基(i)隔开。共有标签为txyxxv/i。与具有itim的抑制性受体类似，具有itsm的抑制性受体与其配体相互作用，导致itim基序被src激酶的酶磷酸化，从而使它们招募含有磷酸盐例如shp-1和shp-2的sh2(lorenz等人，immunol rev.2009年3月；228(1)：342-359)。一些研究报告了itim和itsm基序均有助于pd1的抑制性信号传导(boussiotis等人，cancer j.2014年7月-8月；20(4)：265-271，peled等人，proc natl acad sci u s a.2018年1月16日；115(3)：e468-e477)。而在其他研究中，itsm基序被证明主要负责pd1的抑制作用，而itim基序仅具有有限的作用(chemnitz等人，j immunol.2004年7月15日；173(2)：945-54，yokosuka等人，j exp med.2012年6月4日；209
(6)：1201-17)。
98.根据本发明，itsm和itim可以源自或获得自相同的蛋白质(例如pd1)或者可以获得自两种不同的蛋白质(例如itim来自pd1和itsm来自ly9)。优选地，itsm和itim源自或获得自相同的蛋白质。优选地，在根据本发明肽的嵌合多肽的第三部分中，itsm和itim通过15-25个氨基酸彼此隔开。在一些实施方案中，分隔itsm和itim的氨基酸与衍生或获得itsm和itim的蛋白质中的氨基酸相同。
99.优选地，在根据本发明的嵌合多肽中，包含来自结合磷酸化的基于免疫受体酪氨酸的激活基序的蛋白质的sh2结构域的第一部分由至少80个相邻氨基酸和/或至多800个相邻氨基酸，优选至少100个相邻氨基酸，和/或至多400个氨基酸，例如150-300个氨基酸组成。
100.优选地，在根据本发明的嵌合多肽中，包含基于免疫受体酪氨酸的开关基序(itsm)，优选itsm和基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(itim)的第三部分由至少30个相邻氨基酸和/或至多600个相邻氨基酸，优选至少80个相邻氨基酸，和/或至多200个氨基酸，例如85-190个氨基酸组成。
101.还提供了根据本发明的细胞，其中所述小分子调节的蛋白质稳定性结构域选自由自切除的降解决定子(sed)和蛋白水解靶向嵌合体(protac)结合结构域，以及crbn多肽底物结构域组成的组，其中sed包含可抑制蛋白酶、同源切割位点、和降解决定子序列；其中protac包含e3泛素连接酶结合基团(e3lb)、接头和与嵌合多肽中的protac结合结构域结合的蛋白结合基团，crbn多肽底物结构域能够响应药物结合crbn蛋白，从而促进泛素途径介导的嵌合多肽降解。例如，protac的蛋白质结合基团可以是ap1867，其与本发明的嵌合多肽中的protac结合结构域结合，其例如可以是fkbp12
f36v
(seq id no 35，nabet等人，nat chem biol.2018年5月；14(5)：431-441)。见see zou等人.current protocols(2019)v37：1：pp 21-30；doi.org/10.1002/cbf.3369，获得对protac技术的最近评论。
102.如技术人员将理解的，小分子调节的蛋白质稳定性结构域(或可调节的去稳定结构域)可以适当地是赋予嵌合多肽稳定性的任何结构域，使得当嵌合多肽中的小分子调节的蛋白质稳定性结构域(或可调节去稳定结构域)被修饰/靶向以通过其同源小分子的存在指导嵌合多肽降解时，发生嵌合多肽的降解。
103.优选地，小分子调节的蛋白质稳定性结构域是crbn多肽底物结构域，其能够响应药物而结合crbn蛋白，从而促进泛素途径介导的嵌合多肽降解，优选地其中crbn多肽底物结构域是能够被药物诱导而与crbn多肽结合的c2h2锌指蛋白或其片段。
104.优选地，小分子调节的蛋白质稳定性结构域是蛋白水解靶向嵌合体(protac)结合结构域。该结构域可以结合同源protac。
105.优选地，小分子调节的蛋白质稳定性结构域是自切除降解决定子(sed)，其中sed包含可抑制蛋白酶、同源切割位点和降解决定子序列。这种自切除的降解决定子是技术人员熟知的(chung等人，nat chem biol.2015年9月；11(9)：713-20)。
106.如本文所用，术语“自切除降解决定子”(sed)是指包含可抑制蛋白酶、同源切割位点和降解决定子序列(或降解序列)的多肽或蛋白质复合体。自切除降解决定子是本发明的嵌合多核苷酸的一部分，使得蛋白酶能够切割本发明的嵌合多肽以将降解决定子序列与嵌合多肽的其他部分分开。
107.在一些实施方案中，蛋白酶对本发明的嵌合多肽的切割将嵌合多肽的至少第一部分与降解决定子序列(即嵌合多肽中第二部分的一部分)分开，所述第一部分包含来自结合磷酸化的免疫受体酪氨酸的激活基序(itam)的蛋白质的sh2结构域。
108.在一些实施方案中，蛋白酶对本发明的嵌合多肽的切割将嵌合多肽的至少第一部分和本发明的嵌合多肽的第三部分与降解决定子序列(其是嵌合多肽中的第二部分的一部分)分开，所述第一部分包含来自结合磷酸化的免疫受体酪氨酸的激活基序(itam)的蛋白质sh2结构域，第三部分包含基于免疫受体酪氨酸的开关基序(itsm)，优选itsm和基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(itim)。
109.蛋白酶本身可以或可以不从与降解决定子序列分开的嵌合多肽的部分中去除。
110.如本文所用，术语“降解决定子”是指在调节蛋白质降解速率中重要的蛋白质或其部分。本领域已知的各种降解决定子，包括但不限于短氨基酸序列、结构基序和暴露的氨基酸，可用于本公开的各种实施方案中。可以使用从多种生物中鉴定的降解决定子。
111.如本文在sed的上下文中使用的术语“降解决定子序列”或“降解序列”是指通过蛋白酶体或自噬-溶酶体途径促进附着的蛋白质降解的序列。许多不同的降解序列/信号(例如，泛素-蛋白酶体系统的)在本领域中是已知的，它们中的任何一个都可以如本文所提供的那样使用。有关降解序列及其在蛋白质降解中的功能的讨论，参见例如kanemaki等人，pflugers arch.2013年3月；465(3)：419-25，erales等人，biochim biophys acta.2014年1月；1843(1)：216-21。
112.如本文所用，术语“同源切割位点”是指被sed中的可抑制蛋白酶识别并切割的特定序列或序列基序。蛋白酶的切割位点包括蛋白酶在蛋白水解切割过程中识别的特定氨基酸序列或基序，通常包括在易断裂键任一侧侧接的1至6个氨基酸，其与蛋白酶的活性位点结合并作为底物用于识别。
113.如本文所用，术语“可抑制蛋白酶”是指可以通过特定试剂或化合物例如小化合物(例如，与蛋白酶结合的化合物)的存在而失活的蛋白酶(leuw等人，gms infect dis.2017；5：doc08，lv等人，hiv aids(auckl).2015；7：95-104)。在一些实施方案中，可抑制蛋白酶在不存在特定试剂时是有活性的(切割同源切割位点)，而在存在特定试剂时是无活性的(不切割同源切割位点)。在一些实施方案中，特定试剂是蛋白酶抑制剂。在一些实施方案中，蛋白酶抑制剂特异性抑制本公开的给定可抑制蛋白酶。
114.在实施方案中，sed是小分子辅助关闭(smash)技术，即小分子辅助关闭标签(smash标签)(chung等人，nat chem biol.2015年9月；11(9)：713-20)。它包括降解信号(即降解决定子序列)和蛋白酶切割位点，所述蛋白酶切割位点将降解决定子从本发明的嵌合多肽的其他部分切割下来。然而，在存在蛋白酶抑制剂的情况下，这种切割可以被阻断并且降解决定子诱导嵌合多肽的快速降解。在一些实施方案中，smash可包含丙型肝炎病毒衍生的ns3/4a蛋白酶(例如，被阿舒瑞韦或格佐匹韦抑制)并且侧翼为诱导蛋白酶体降解的降解决定子结构域。hcv ns3/4a蛋白酶抑制剂包括阿舒瑞韦、格佐匹韦、格卡瑞韦(glecaprevir)、伏西瑞韦(voxilaprevir)、帕利瑞韦(paritaprevir)、西咪匹韦(simeprevir)、波普瑞韦(boceprevir)和特拉匹韦(telaprevir)(majumdar等人，aliment pharmacolther.2016jun；43(12)：1276-92，ahmed等人，world j hepatol.2018年10月27日；10(10)：670-684)。
115.在另一个实施方案中，小分子调节的蛋白质稳定性结构域(或可调节的去稳定结构域)包含蛋白水解靶向嵌合体(protac)结合结构域，其中protac包含e3泛素连接酶结合基团(e3lb)、接头和与嵌合多肽中的protac结合域结合的蛋白质结合基团。
116.细胞的主要降解途径之一是泛素-蛋白酶体系统。在该系统中，蛋白质通过泛素化蛋白质被蛋白酶体标记为降解。蛋白质的泛素化由e3泛素连接酶完成，该连接酶与蛋白质结合并将泛素分子添加到蛋白质中。e3泛素连接酶是包括e1泛素激活酶和e2泛素结合酶(conjugating enzyme)在内的途径的一部分，它们使e3泛素连接酶可以利用泛素以添加到蛋白质中。
117.为了利用这种降解途径，已经开发了protac。protac将e3泛素连接酶与靶向待降解的蛋白质聚在一起。为了促进蛋白质被蛋白酶体降解，protac包含与e3泛素连接酶结合的基团和与希望降解的蛋白质(即多肽中的protac结合结合域)结合的基团。这些基团通常使用接头连接。这种分子构建体可以使e3泛素连接酶靠近靶标蛋白，使其泛素化并标记为降解。
118.如本文所用，术语“protac”是指蛋白水解靶向嵌合分子，其通常具有三个组分，e3泛素连接酶结合基团(e3lb)、接头和蛋白质结合基团。用于根据本发明的嵌合多肽的protac和protac结合结构域是技术人员熟知的(an等人，ebiomedicine.2018年10月；36：553-562)。
119.如本文所用，术语“接头”是指包含将protac的组分共价连接到protac的另一组分的原子链的化学部分。在各种实施方案中，接头的长度通常为8-20个原子(另见cyrus等人，mol biosyst.2011年2月；7(2)：10.1039/c0mb00074d，nabet等人，nat chem biol.2018年5月；14(5)：431-441)。商用接头可以是例如由medchemexpress(www.medchemexpress.com)提供的那些。
120.蛋白质结合基团是与靶蛋白结合的基团，在此与嵌合多肽中存在的protac结合结构域结合。例如，蛋白质结合基团可以是与蛋白质特异性结合(与靶蛋白结合)的任何部分，并且包括小分子靶蛋白部分的以下非限制性实例：在大量其他中，hsp90抑制剂、激酶抑制剂、mdm2抑制剂、靶向人bet含布罗莫结构域蛋白的化合物、hdac抑制剂、人赖氨酸甲基转移酶抑制剂、血管生成抑制剂、免疫抑制化合物和靶向芳烃受体(ahr)的化合物(参见us2014/0356322和us2016/0045607)。
121.在一些实施方案中，protac中的蛋白质结合基团是ap1867(www.medchemexpress.com/ap1867.html)，并且本发明的嵌合多肽中的protac结合结构域是fkbp12
f36v
(nabet等人，nat chem biol.2018年5月；14(5)：431-441)。
122.在另一个实施方案中，小分子调节的蛋白质稳定性结构域(或可调节的去稳定结构域)是crbn多肽底物结构域，其能够响应于药物而结合crbn蛋白，从而促进泛素途径介导的嵌合多肽的降解，优选地其中crbn多肽底物结构域是能够被药物诱导而与crbn多肽结合的c2h2锌指蛋白或其片段(本文也称为“锌指降解决定子”)。还提供了根据本发明的细胞，其包含根据本发明的嵌合蛋白，该嵌合蛋白包含这种小分子调节的蛋白质稳定性结构域。在这样的实施方案中，根据本发明的嵌合蛋白的第二部分包含小分子调节的蛋白稳定性结构域，其能够在药物存在下与crbn蛋白相互作用和结合。例如，各种imid，包括本文所述的那些，已显示与crbn蛋白结合，从而促进crbn蛋白与其靶标之间的相互作用(另见
buhimschi等人.biochemistry 2019，58，861-864；doi：10.1021/acs.biochem.8b01307，获得对该技术的最近评论)，泛素化和随后的靶蛋白降解。
123.crbn(cereblon)是一种442个氨基酸的蛋白质，可与受损的dna结合蛋白1(ddb1)、cullin-4a(cul4a)和cullins 1调节子(roc1；angers等人.nature 443：590-593)形成e3泛素连接酶复合体。这种复合体泛素化了许多其他蛋白质。示出了沙利度胺、来那度胺、泊马度胺、cc-122(avadomide)、cc-220(iberdomide)和cc-885各自与crbn结合(参见例如lopez-girona等人.leukemia 26：2326-2335)。
124.在优选的实施方案中，crbn多肽底物结构域是能够被药物诱导而与crbn多肽结合的c2h2锌指蛋白或其片段。还提供了根据本发明的细胞，其包含根据本发明的嵌合蛋白，该嵌合蛋白包含这种小分子调节的蛋白质稳定性结构域。cys2his2样折叠群(cys2his2-1ike fold group)(c2h2)是一类很好地表征的锌指，其在哺乳动物转录因子中极为常见。这些结构域采用简单的ββα折叠，形成两条短的β链，通过转角(锌关节(zinc knuckle)；β转角)连接，然后是短螺旋，并具有氨基酸序列基序(pabo等人.annual review of biochemistry(2001).70：313-40)。
125.x2-cys-x2，4-cys-x12-his-x3，4，5-his
126.在另一个优选的实施方案中，嵌合蛋白包含crbn多肽底物结构域，所述crbn多肽底物结构域包含一个或多个锌指。还提供了根据本发明的细胞，其包含根据本发明的嵌合蛋白，该嵌合蛋白包含这种小分子调节的蛋白质稳定性结构域。
127.尽管不特别限于特定的crbn多肽底物结构域，特别是c2h2锌指蛋白或其片段(锌指结构域)，其能够响应于药物而结合crbn蛋白，从而促进泛素途径介导的嵌合多肽的降解，在优选的实施方案中，crbn多肽底物结构域选自由ikzf1、ikzf3、zfn654、znf787、znf653、zfp91、znf276、znf827或其片段组成的组，其能够被小分子诱导而与crbn多肽结合，优选地，其中所述片段选自由ikzf1 zf2-3(seq id no：41)、ikzf3 zf2-3(seq id no：42)、zfp91 zf4-5(seq id no：43)、znf276zf4-5(seq id no：44)、znf653 zf4-5(seq id no：45)和znf692 zf4-5(seq id no：46)组成的组(参见实施例)。还提供了根据本发明的细胞，其包含根据本发明的嵌合蛋白，该嵌合蛋白包含这种小分子调节的蛋白质稳定性结构域。
128.在另一个优选的实施方案中，crbn多肽底物结构域包含杂合融合多肽，其中所述杂合融合多肽包含至少第一c2h2锌指蛋白的第一片段和来自第二c2h2锌指蛋白的第二片段，其中所述杂合融合多肽中的第一片段和所述第二片段的组合能够被药物诱导而与crbn多肽结合。例如，在一些实施方案中，来自第一c2h2锌指蛋白的β转角(由两条短β-链形成)可以融合至第二c2h2锌指蛋白的α螺旋。还提供了根据本发明的细胞，其包含根据本发明的嵌合蛋白，该嵌合蛋白包含这种小分子调节的蛋白质稳定性结构域。
129.尽管本发明不特别限于可形成或可包含在crbn多肽底物结构域中的特定杂合融合多肽，但在优选的实施方案中，杂合融合多肽包含第一片段和第二片段以及任何可能的组合，所述第一片段选自zfp91 zf4(lqceicgftcr；seq id no：52)、zfn653 zf4(lqceicgyqcr；seq id no 53)、znf276 zf4(lqcevcgfqcr：seq id no：54)、znf827 zf1(fqcpicglvik；seq id no：55)的β转角，所述第二片段选自ikzf1 zf2(qkgnllrhiklh；seq id no：56)的α螺旋。优选地，杂合融合多肽包含zfp91 zf4的β转角和ikzf1 zf2的α螺旋，优
选地，其中杂合融合多肽包含选自seq id no 47-51的一种。还提供了根据本发明的细胞，其包含根据本发明的嵌合蛋白，该嵌合蛋白包含这种小分子调节的蛋白质稳定性结构域。
130.根据另一个实施方案，用于本发明方法的crbn多肽底物结合结构域包含或进一步包含ikzf1 zf3(fkchlcnyacrrrdaltghlrth；seq id no：57)，优选地，其中crbn多肽底物结合结构域包含zfp91 zf4的β转角，ikzf1 zf2和ikzf1 zf3的α螺旋。优选地，ikzf1zf3位于根据本发明的嵌合蛋白的第二部分的c末端。还提供了根据本发明的细胞，其包含根据本发明的嵌合蛋白，该嵌合蛋白包含这种小分子调节的蛋白质稳定性结构域。
131.如技术人员将理解的，在一些实施方案中，能够响应药物而结合crbn，从而促进本发明嵌合蛋白的泛素途径介导的降解的一种或多种crbn多肽底物结构域包含在本发明的嵌合蛋白中。锌指降解决定子多肽结构域(crbn多肽底物结构域，其能够响应药物而结合crbn，从而促进泛素途径介导的嵌合蛋白降解)可以作为单个降解决定子多肽结构域或作为多个降解决定子多肽结构域被包括，任选地，其中多个降解决定子多肽结构域以串联或阵列连接，任选地使用多肽接头，例如本领域已知的那些。
132.如技术人员还将理解的，在用于本发明方法的crbn多肽底物结合域内，不同部分(例如β转角和α螺旋)可以彼此直接相邻，或者可以，使用多肽接头(包括小段氨基酸)，例如本领域已知的那些连接。
133.适用于调节根据本发明的包含一种或多种此类c2h2锌指蛋白、片段或结构域的嵌合蛋白的降解的药物(例如小分子)包括所谓的免疫调节酰亚胺药物(imid)，包括但不限于沙利度胺、来那度胺、泊马度胺、cc-122(avadomide)、cc-220(iberdomide)和cc-885(参见例如，matyskiela等人.j.med.chem.2018，61，2，535-542；2017；doi.org/10.1021/acs.jmedchem.6b01921和gao等人.biomarker research(2020)8：2；doi.org/10.1186/s40364-020-0182-y)。技术人员了解如何选择合适的药物，例如用于根据本发明的方法的合适的imid。
134.因此，提供根据前述权利要求中任一项所述的细胞，其中允许crbn多肽底物结构域与crbn蛋白结合从而促进泛素途径介导的嵌合多肽降解的药物是imid，优选地，选自由沙利度胺、来那度胺、泊马度胺、cc-122(avadomide)、cc-220(iberdomide)和cc-885组成的组。
135.因此，提供了根据前述权利要求中任一项所述的细胞，其还包含允许crbn多肽底物结构域与crbn蛋白结合从而促进泛素途径介导的嵌合多肽降解的药物，优选地，其中所述药物是imid，优选地选自由沙利度胺、来那度胺、泊马度胺、cc-122(avadomide)、cc-220(iberdomide)和cc-885组成的组，优选地其中所述药物与crbn多肽底物结构域结合。
136.如技术人员将理解的，本发明的嵌合多肽可以不同的形式存在于本发明的细胞中。例如，在小分子调节的蛋白质稳定性结构域(或可调节的去稳定结构域)是sed的情况下，取决于同源小化合物/蛋白酶抑制剂的存在，嵌合多肽可以具有或不具有降解决定子序列存在于细胞中。
137.还提供了根据本发明的细胞，其中itam是包含在t细胞受体(tcr)复合体和/或嵌合抗原受体(car)和/或nkr复合体中的itam，优选地，包含在cd3ζ链、cd3ε链、cd3δ链、cd3γ链、免疫球蛋白受体fcεri的γ链和dap12中的itam。
138.如所讨论的，sh2结构域可能来自与磷酸化的基于免疫受体酪氨酸的激活基序
(itam)结合的蛋白质。
139.itam被发现于细胞信号传导分子的细胞内结构域中，例如t细胞受体复合体和某些fc受体的cd3ζ(ζ)、cd3ε(ε)、cd3γ(γ)和cd3δ(δ)链(love等人，cold spring harb perspect biol.2010年6月；2(6)：a002485)。
140.在nk细胞中，某些激活的nk细胞受体(nkr)与带有itam的信号传导分子形成复合体，例如cd3ζ链、免疫球蛋白受体fcεri的γ(γ)链和dap12。例如，nk细胞受体(nkr)nkp46和nkp30与免疫球蛋白受体fcεri的γ(γ)链和cd3ζ链相结合，而nkp44与信号传导衔接子dap12相结合(barrow等人，front immunol.2019；10：909)。因此，在本发明的一个实施方案中，根据本发明的细胞是nk细胞。
141.带有itam的结构域也用于嵌合抗原受体(car)设计中。cd3ζ链包含三个itam，而cd3ε链、免疫球蛋白受体fcεri的γ(γ)链和dap12信号传导结构域包含一个itam，它们用于各种car设计中(ren-heidenreich等人，cancer immunol immunother.2002年10月；51(8)：417-23，nolan等人，clin cancer res.1999年12月；5(12)：3928-41，等人，j immunol.2015年4月1日；194(7)：3201-12)。
142.itam中的两个酪氨酸残基被src激酶家族成员如lck磷酸化。磷酸化itam充当zap70和syk的sh2结构域的对接平台(long等人，annu rev immunol.2013；31：10.1146/annurev-immunol-020711-075005)。
143.半itam标签可以很容易地识别为通过任何其他两个氨基酸与亮氨酸或异亮氨酸隔开的酪氨酸，从而给出标签yxxl/l。这些标签中的两个被6到8个氨基酸隔开以构成yxxl/lx(6-8)yxxl/l的itam共有序列。在优选的实施方案中，含有itam的结构域可以是或包含cd3ζ链结构域。在另一个优选实施方案中，含有itam的结构域可以是或包含cd3ε链结构域。此外，在另一个优选的实施方案中，含有itam的结构域可以是或包含免疫球蛋白受体fcεri的γ(γ)链。此外，在另一个优选实施例中，含有itam的结构域可以是或包括dap12结构域。
144.还提供了根据本发明的细胞，其中所述细胞还包含t细胞受体(t细胞受体复合体)和/或嵌合抗原受体(car)或nk细胞受体(nk细胞受体复合体)，优选地其中细胞是t细胞、car t细胞、nk细胞和/或car nk细胞。
145.优选地，细胞是表达tcr复合体和/或car复合体的t细胞。优选地，tcr复合体或car复合体包含cd3ζ链结构域，所述cd3ζ链结构域包含itam，或本文公开的任何其他带有itam的结构域。
146.优选地，细胞是表达nkr复合体和/或car复合体的nk细胞。优选地，nkr复合体或car复合体包含cd3ζ链结构域，所述cd3ζ链结构域包含itam，或本文公开的任何其他带有itam的结构域。
147.技术人员熟知t细胞和/或car t细胞。t细胞或t淋巴细胞在细胞介导的免疫中起核心作用。它们可以通过在细胞表面上存在的t细胞受体(tcr)与其他淋巴细胞，例如b细胞和自然杀伤细胞(nk细胞)区分开来。
148.有多种类型的t细胞，包括但不限于辅助性t细胞(th细胞)、溶细胞性(cytolytic)t细胞和调节性t细胞。th细胞在其表面表达cd4，并在抗原呈递细胞(apc)表面呈递肽抗原时被激活。这些细胞可以分化成几种亚型之一，这些亚型分泌不同的细胞因子以促进不同类型的免疫应答。
chem.1998aug 28；273(35)：22719-28)。sirpa是一种i型跨膜蛋白。人sirpa蛋白具有uniprotkb登录号p78324。该序列长504个氨基酸。sirpa的胞质域包含两个itim和一个itsm基序。
171.例如，包含可用于根据本发明的嵌合多肽的基于免疫受体酪氨酸的开关基序(itsm)，优选itsm和基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(itim)的合适的第三部分由seq id no 19(代表sirpa的胞质域)表征。
172.pecam1(也称为pecam-1、cd31)在t细胞、b细胞、血小板、单核细胞、巨噬细胞和嗜中性粒细胞中表达(newton-nash等人，jimmunol.1999年7月15日；163(2)：682-8)。pecam1通过招募ship1、shp-1和shp-2抑制t细胞和b细胞信号传导(marelli-berg等人，j cell sci.2013年6月1日；126(pt 11)：2343-52)。在巨噬细胞中，配体与pecam1的结合导致shp-1和shp2的招募，tnf-α、il-6和ifn-β产生和tlr4信号传导的下调(rui等人，j immunol.2007年12月1日；179(11)：7344-51)。pecam1负调节血小板信号传导途径(jones等人，febs lett.2009年11月19日；583(22)：3618-24)。pecam1是一种i型跨膜蛋白。人pecam1蛋白具有uniprotkb登录号p16284。该序列长738个氨基酸。pecam1的胞质域包含itim和itsm基序。例如，包含可用于根据本发明的嵌合多肽的基于免疫受体酪氨酸的开关基序(itsm)，优选itsm和基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(itim)的合适的第三部分由seq id no 18(代表pecam1的胞质域)表征。
173.唾液酸结合免疫球蛋白型凝集素(siglec)是一组免疫调节受体，主要在造血系统的细胞上表达(等人，dev comp immunol.2018年9月；86：219-231)。siglec5(也称为cd33l2、obbp2)在单核细胞、嗜中性粒细胞和b细胞中表达，siglec9在嗜中性粒细胞、单核细胞、树突细胞和nk细胞中表达，而siglec11在巨噬细胞中表达(macauley等人，nat rev immunol.2014年10月；14(10)：653-666)。大多数siglec具有招募shp1和shp2并充当免疫系统的负调节剂的抑制性itim/itsm基序(crocker等人，nat rev immunol.2007年4月；7(4)：255-66，avril等人，jbiol chem.2005may 20；280(20)：19843-51，haas等人，cancer immunol res.2019年5月；7(5)：707-718，angata等人，j biol chem.2002年7月5日；277(27)：24466-74)。siglec5、siglec9和siglec11是i型跨膜蛋白。它们在其胞质域中包含itim和itsm基序。人siglec5蛋白具有uniprotkb登录号o15389。该序列的长度为551个氨基酸。人siglec9蛋白具有uniprotkb登录号q9y336。该序列的长度为463个氨基酸。人siglec11蛋白具有uniprotkb登录号q96rl6。该序列的长度为698个氨基酸。例如，包含可用于根据本发明的嵌合多肽的基于免疫受体酪氨酸的开关基序(itsm)，优选itsm和基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(itim)的合适的第三部分由seq id no 21、seq id no 22或seq id no 20(分别代表siglec 5、9和11的胞质域)表征。
174.t淋巴细胞表面抗原ly-9(也称为ly9、slamf3、cd229)在胸腺细胞和成熟t和b淋巴细胞中表达(de la fuente等人，blood.2001年6月1日；97(11)：3513-20)。据报道，它与ship-1和shp-2相互作用(-ortiz等人，front immunol.2018年11月16日；9：2661)并通过作为免疫反应的负调节剂促进外周细胞耐受(de salort等人，front immunol.2013；4：225)。ly9是一种i型跨膜蛋白。人ly9蛋白具有uniprotkb登录号q9hbg7。该序列的长度为655个氨基酸。ly9的胞质域含有两个itsm基序。例如，包含可用于根据本发明的嵌合多肽的基于免疫受体酪氨酸的开关基序(itsm)，优选itsm和基于免疫受体酪氨酸的抑制基序
(itim)的合适的第三部分由seq id no 16(代表ly9的胞质尾区)表征。
175.在一些实施方案中，itsm和itim从相同的抑制蛋白获得或衍生，在其他实施方案中，itsm和itim各自衍生自不同的抑制蛋白。
176.还提供了根据本发明的细胞，其中嵌合多肽包含itsm和itim。
177.令人惊讶地发现，在本发明的嵌合多肽中包含的第三部分中同时存在itsm和itim是特别有利的(参见实施例)。
178.还提供了根据本发明的细胞，其中，优选地，第一部分位于嵌合多肽的n末端，并且其中第二部分位于嵌合多肽的c末端，并且优选地，其中第三部分位于位于第一部分和第二部分之间。
179.在本文别处也公开了，第一部分和第三部分可以彼此直接相邻或可以被另外的氨基酸段隔开。如本文别处所公开的，第二部分和第三部分可以彼此直接相邻或可以被另外的氨基酸段隔开。尽管不受任何特定顺序的限制，但发现第一、第二和第三部分的这种特定顺序可能是有利的。
180.还公开了根据本发明的细胞，其进一步包含与可抑制蛋白酶结合的蛋白酶抑制剂，或进一步包含与蛋白水解靶向嵌合体(protac)结合结构域结合的protac，或进一步包含允许crbn多肽底物结构域与crbn蛋白结合，从而促进泛素途径介导的嵌合多肽降解的药物，优选其中药物是imid，优选选自由沙利度胺、来那度胺、泊马度胺、cc-122(avadomide)、cc-220(iberdomide)和cc-885组成的组，如本文别处所公开和讨论的。在优选的实施方案中，蛋白酶抑制剂是如本文公开的蛋白酶抑制剂。在优选实施方案中，protac是如本文所公开的protac。在优选的实施方案中，能够响应药物而结合crbn蛋白从而促进泛素途径介导的嵌合多肽降解的crbn多肽底物结构域是如本文所公开的一种，优选其中药物是imid，优选选自由沙利度胺、来那度胺、泊马度胺、cc-122(avadomide)、cc-220(iberdomide)和cc-885组成的组。
181.还公开了根据本发明的细胞，其中
182.a)sh2结构域包含与根据seq id no 7-11的氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列或由其组成，或包含与根据seq id no 12-14的氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列或由其组成；
183.b)嵌合多肽的第一部分包含与根据seq id no 7-11的氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列或由其组成，或包含与根据seq id no 12-14的氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列或由其组成；
184.c)itam为yxxl/lx(6-8)yxxl/1；
185.d)sh2结构域是与包含在seq id no 1-6中的磷酸化itam结合的sh2结构域，或与与根据seq id no 1-6的氨基酸序列具有80％或更多同一性的氨基酸序列结合的sh2结构域；
186.e)itim是s/i/v/lxyxxi/v/l，和/或itsm是txyxxv/i；
187.f)itsm和/或itim是包含在seq id no 15-22中的itsm和/或itim；
188.g)嵌合多肽的第三部分包含与根据seq id no 15-22的氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列或由其组成；
189.h)嵌合多肽的第二部分包含第二根据seq id no：35或40或seq id no：41-57的氨
基酸或由其组成；和/或
190.i)嵌合多肽包含与根据seq id no 23-34、seq id no 36或seq id no 58-68的氨基酸序列具有80％或更多同一性的氨基酸序列。
191.技术人员将理解，与嵌合多肽的第一部分相关的任何限定的氨基酸序列可以与与嵌合多肽的第三部分和/或嵌合多肽的第二部分相关的任何限定的氨基酸序列组合。换言之，本文公开的任何第一部分、公开的任何第二部分和本文公开的任何第三部分可以组合以分别形成根据本发明的嵌合多肽的第一、第二和第三部分。在优选的实施方案中，嵌合多肽的第一部分包含如a)、b)、c)和/或d)所限定的氨基酸序列，并且嵌合多肽的第三部分包含如e)、f)或g)所限定的氨基酸序列。从本公开可以看出，嵌合蛋白的不同第一部分可以与嵌合多肽的不同第三部分组合。
192.技术人员还将理解，除了如本文限定的嵌合蛋白的第一、第二和第三部分中的氨基酸序列外，根据本发明的嵌合多肽还可以包含另外的部分。换言之，如本文公开的嵌合多肽不仅限于仅由本文限定的第一、第二或第一、第二和第三部分组成的嵌合多肽。根据本发明的嵌合多肽可以包含另外的氨基酸(段)或另外的(功能性)部分。
193.因此，存在于嵌合多肽的第一部分中的sh2结构域在优选的实施方案中可以包含与根据seq id no 7-11的氨基酸序列具有至少80％同一性，优选地至少81、83、87、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％的同一性氨基酸或由其组成，或包含与根据seq id no 12-14的氨基酸序列具有至少80％的同一性，优选地至少81、83、87、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％的同一性的氨基酸序列或由其组成。如技术人员将理解的，还包括以上限定的那些序列并且其中1、2、3、4、5、6、10个氨基酸已被缺失、替换或插入。
194.因此，在优选的实施方案中，嵌合多肽的第一部分可以包含与根据seq id no 7-11的氨基酸序列具有至少80％的同一性，优选地至少81、83、87、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％的同一性的氨基酸序列或由其组成，或包含与根据seq id no 12-14的氨基酸序列具有至少80％同一性，优选地至少81、83、87、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％的同一性的氨基酸序列或由其组成。如技术人员将理解的，还包括以上限定的那些序列并且其中1、2、3、4、5、6、10个氨基酸已被缺失、替换或插入。只要嵌合多肽的第一部分在本发明的上下文中保持功能性，第一部分还可以包含与上述限定的氨基酸相邻的另外的氨基酸(段)。
195.因此，当itam被磷酸化时，嵌合多肽的第一部分的sh2结构域所结合的itam是yxxl/lx(6-8)yxxl/1，如上所解释的。
196.因此，存在于嵌合多肽的第一部分中的sh2结构域在优选的实施方案中可以是与包含在seq id no 1-6中的磷酸化itam结合或与与根据seq id no 1-6的氨基酸序列具有至少80％同一性，优选地至少81、83、87、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％同一性的氨基酸序列结合的sh2结构域。
197.因此，包含itsm，优选itsm和itim的嵌合多肽的第三部分可以包含itsm和/或itim，其中itim是s/i/v/lxyxxi/v/l，和/或itsm是txyxxv/i。
198.因此，包含在嵌合多肽的第三部分中的itsm和/或itim可以是包含在seq id no 15-22中的itsm和/或itim。
199.因此，嵌合多肽的第三部分可以包含与根据seq id no 15-22的氨基酸序列具有
至少80％同一性，优选地至少81、83、87、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％的同一性的氨基酸序列或由其组成。如技术人员将理解的，还包括以上限定的那些序列并且其中1、2、3、4、5、6、10个氨基酸已被缺失、替换或插入。只要嵌合多肽的第三部分在本发明的上下文中保持功能性，第三部分还可以包含与上述限定的氨基酸相邻的另外的氨基酸(段)。
200.因此，根据本发明的嵌合多肽的第二部分可以包含根据seq id no：35或seq id no：40或seq id no：41-57的氨基酸序列或由其组成。如技术人员将理解的，还包括以上限定的那些序列并且其中1、2、3、4、5、6、10个氨基酸已被缺失、替换或插入。只要嵌合多肽的第三部分在本发明的上下文中保持功能性，第三部分还可以包含与上述限定的氨基酸相邻的另外的氨基酸(段)。还考虑了与根据seq id no 35或seq id no：40或seq id no：41-57的氨基酸序列具有至少80％同一性，优选地至少81、83、87、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％同一性的那些氨基酸序列。
201.因此，嵌合多肽包含与根据seq id no 23-34、seq id no 36或seq id no 58-68的氨基酸序列具有至少80％同一性，优选地至少81、83、87、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％同一性的氨基酸序列或由其组成。如技术人员将理解的，还包括以上限定的那些序列并且其中1、2、3、4、5、6、10、15个氨基酸已被缺失、替换或插入。只要根据本发明的嵌合多肽在本发明的上下文中保持功能性，嵌合多肽还可以包含与上述限定的氨基酸相邻的另外的氨基酸(段)。
202.根据本发明的另一方面，还提供了本文限定的嵌合蛋白。嵌合蛋白可以存在于细胞中，或可以任何其他形式存在。
203.根据本发明的另一方面，还提供了包含编码根据本发明的嵌合多肽的多核苷酸的核酸。
204.如将理解的，根据本发明的核酸可以适当地引入细胞，例如t细胞或car t细胞或nk细胞中，并在这种细胞中表达，从而在这样的细胞中表达根据本发明的嵌合多肽。核酸以载体的形式或以质粒的形式引入。在一些实施方案中，本发明的核酸整合在细胞，例如t细胞或car t细胞或nk细胞的基因组中。例如，此类t细胞可用于引入修饰的t细胞受体和/或car。
205.在一些实施方案中，在编码(修饰的)t细胞受体或car的核酸之前、之后或同时将本发明的核酸引入t细胞或nk。根据本发明的核酸和编码(修饰的)t细胞受体或car的核酸可以使用两种单独的载体或使用包含两种核酸的一种载体引入。类似地，在一些实施方案中，在编码(修饰的)nk细胞受体或car的核酸之前、之后或同时将本发明的核酸引入nk细胞。根据本发明的核酸和编码(修饰的)nk细胞受体或car的核酸可以使用两种单独的载体或使用包含两种核酸的一种载体引入。
206.因此还提供了包含根据本发明的核酸的载体。
207.因此还提供了包含根据本发明的核酸的细胞。
208.还提供了包含根据本发明的细胞或根据本发明的核酸的药物组合物。优选地，细胞是t细胞或car t细胞或nk细胞或car nk细胞。t细胞可以来源于待治疗的患者或者可以是同种异体的。
209.涉及转移离体产生的自体抗原特异性t细胞的免疫疗法，是治疗病毒感染和癌症的有前途的策略。用于免疫疗法的t细胞可以通过抗原特异性t细胞的扩增或通过基因工程
重定向t细胞来产生。用于免疫疗法的抗原特异性t细胞已通过t细胞受体或嵌合抗原受体(car)的基因转移成功产生。
210.使用本发明，现在可以通过向患者提供t细胞、car t细胞、nk细胞或car nk细胞来向需要其的患者提供免疫细胞疗法或免疫疗法(例如用t细胞、car t细胞、nk细胞或car nk细胞进行治疗)，并且其中这些细胞的t细胞或nk细胞功能(例如，t细胞或nk细胞的细胞毒活性和/或细胞因子分泌)可以如本文所公开的那样进行调节。技术人员熟知免疫细胞疗法的各种方法，例如使用嵌合抗原受体改造的t细胞或(基因修饰的)t细胞受体，如rosenberg等人，science.2015年4月3日；348(6230)：62-8和june等人，science.2018年3月23日；359(6382)：1361-1365所评论的，和未经修饰或car改造的nk细胞，如hu等人，front immunol.2019；10：1205，kloess等人，transfus med hemother.2019年2月；46(1)：4-13和suen等人，cancer invest.2018；36(8)：431-457所评论的。
211.根据本发明的细胞、根据本发明的嵌合多肽和/或根据本发明的核酸，如技术人员将基于当前公开内容理解的，可以适合用于此类免疫细胞疗法。
212.因此还提供了根据本发明的细胞用作药物。
213.因此还提供了根据本发明的细胞用于治疗受试者的癌症。优选地，癌症是选自由血液学癌症(特别是b细胞癌)、黑色素瘤、乳腺癌、结肠直肠癌、肺癌、肾细胞癌和前列腺癌组成的组的癌症。
214.优选地，用作药物或用于治疗癌症的细胞是t细胞或car t细胞或nk细胞或car nk细胞。
215.还提供了用作药物的细胞，优选用于根据本发明治疗受试者的癌症，其中所述治疗包括：
216.a)向受试者施用根据本发明的细胞群；
217.b)任选地，向受试者施用可抑制蛋白酶的抑制剂或结合靶向蛋白水解嵌合体(protac)结合结构域的protac或药物，所述药物允许crbn多肽底物结构域结合crbn蛋白，从而促进泛素途径介导的嵌合多肽的降解，优选地，其中药物是imid，优选地选自由沙利度胺、来那度胺、泊马度胺、cc-122(avadomide)、cc-220(iberdomide)和cc-885组成的组；
218.c)任选地，如果进行步骤b)，增加或降低可抑制蛋白酶的抑制剂或protac或药物的浓度，所述药物允许crbn多肽底物结构域结合crbn蛋白从而促进泛素途径介导的嵌合多肽的降解，优选地，其中药物是imid，优选地选自由沙利度胺、来那度胺、泊马度胺、cc-122(avadomide)、cc-220(iberdomide)和cc-885组成的组。
219.如本文别处所公开的，根据本发明的细胞的t细胞功能或nk细胞功能可以通过根据本发明的嵌合多肽的表达来调节。在不存在可抑制蛋白酶的抑制剂的情况下(在sed包含在嵌合多肽的第二部分中的情况下)或在不存在与本发明的嵌合多肽的第二部分中的protac结合结构域结合的protac的情况下，或在不存在允许crbn多肽底物结构域与crbn蛋白结合从而促进泛素途径介导的嵌合多肽降解的药物的情况下，优选地，其中药物是imid，优选地选自由沙利度胺、来那度胺、泊马度胺、cc-122(avadomide)、cc-220(iberdomide)和cc-885组成的组，t细胞功能通过根据本发明的嵌合多肽抑制tcr或car信号传导而受到抑制，或者nk功能通过根据本发明的嵌合多肽抑制nkr或car信号传导而受到抑制。在存在这样的抑制剂或这样的protac或存在允许crbn多肽底物结构域结合crbn蛋白从而促进泛素
途径介导的嵌合多肽降解的药物的情况下，优选其中药物是imid，优选地选自由沙利度胺、来那度胺、泊马度胺、cc-122(avadomide)、cc-220(iberdomide)和cc-885组成的组，根据本发明的嵌合多肽将被降解，导致对t细胞或nk细胞功能(细胞因子释放/细胞毒性)抑制的释放。由于t细胞功能或nk功能的调节是可逆的和剂量依赖性的，因此可以调节t细胞功能或nk功能作为受试者治疗的一部分。
220.还提供了提供根据本发明的细胞的方法，其中该方法包括使细胞与根据本发明的核酸接触，优选地其中核酸与离体的细胞接触。
221.还提供了控制嵌合多肽在细胞中表达的方法，其中该方法包括使表达根据本发明的嵌合多肽的细胞与可抑制蛋白酶的抑制剂或与蛋白水解靶向嵌合体(protac)结合结构域结合的protac或药物接触，所述药物允许crbn多肽底物结构域结合crbn蛋白，从而促进泛素途径介导的嵌合多肽的降解，优选地，其中药物是imid，优选地选自由沙利度胺、来那度胺、泊马度胺、cc-122(avadomide)、cc-220(iberdomide)和cc-885组成的组，优选地其中细胞与可抑制蛋白酶的抑制剂或与protac或与药物离体或优选地体内接触，所述药物允许crbn多肽底物结合域结合crbn蛋白，从而促进泛素途径介导的嵌合多肽的降解，优选地，其中药物是imid，优选地选自由沙利度胺、来那度胺、泊马度胺、cc-122(avadomide)、cc-220(iberdomide)和cc-885组成的组。
222.根据本发明的嵌合多肽的表达是通过调节根据本发明的嵌合多肽的水平或浓度来控制的，该水平或浓度通过引导根据本发明的嵌合多肽远离或朝向降解来调节，如本文别处所公开的。
223.还提供了控制t细胞和/或nk细胞的细胞毒活性和/或控制t细胞和/或nk细胞细胞因子分泌的方法，其中该方法包括：
224.a)在t细胞和/或nk细胞中表达根据本发明的嵌合多肽；
225.b)使t细胞和/或nk细胞与可抑制蛋白酶的抑制剂或与靶向蛋白水解嵌合体(protac)结合结构域结合的protac或药物接触，所述药物允许crbn多肽底物结构域与crbn蛋白结合，从而促进泛素途径介导的嵌合多肽的降解，优选地，其中药物是imid，优选地选自由沙利度胺、来那度胺、泊马度胺、cc-122(avadomide)、cc-220(iberdomide)和cc-885组成的组；
226.c)任选地，增加或降低可抑制蛋白酶的抑制剂或protac或药物的浓度，所述药物允许crbn多肽底物结构域结合crbn蛋白，从而促进泛素途径介导的嵌合多肽的降解，优选地，其中药物是imid，优选地选自由沙利度胺、来那度胺、泊马度胺、cc-122(avadomide)、cc-220(iberdomide)和cc-885组成的组。
227.技术人员熟知确定t细胞和nk细胞的细胞毒活性和/或此类t细胞和nk细胞细胞因子分泌的方法，所述t细胞细胞因子例如ifnγ、il-2、tnfα、il-10、il-4，所述nk细胞细胞因子例如ifnγ、il-2、tnfα。t细胞和/或nk细胞可以源自待治疗的患者或者可以是同种异体的。
228.还提供了治疗受试者癌症的方法，其中所述方法包括：
229.a)向受试者提供根据本发明的细胞；
230.b)任选地，向受试者施用可抑制蛋白酶的抑制剂或结合靶向蛋白水解嵌合体(protac)结合域的protac或允许crbn多肽底物结构域结合crbn蛋白，从而促进泛素途径介
导的嵌合多肽的降解的药物，优选地，其中药物是imid，优选地选自由沙利度胺、来那度胺、泊马度胺、cc-122(avadomide)、cc-220(iberdomide)和cc-885组成的组；
231.c)任选地，如果进行步骤b)，增加或降低可抑制蛋白酶的抑制剂或protac或药物的浓度，所述药物允许crbn多肽底物结构域结合crbn蛋白，从而促进泛素途径介导的嵌合多肽的降解，优选地，其中药物是imid，优选地选自由沙利度胺、来那度胺、泊马度胺、cc-122(avadomide)、cc-220(iberdomide)和cc-885组成的组。t细胞和/或nk细胞可以源自待治疗的患者或者可以是同种异体的。
232.还提供了控制受试者中的t细胞和/或nk细胞的细胞毒活性和/或控制受试者中的t细胞和/或nk细胞细胞因子分泌的方法，其中该方法包括：
233.a)向受试者提供根据本发明的细胞；
234.b)向受试者施用可抑制蛋白酶的抑制剂或结合靶向蛋白水解嵌合体(protac)结合结构域的protac或允许crbn多肽底物结构域结合crbn蛋白，从而促进泛素途径介导的嵌合多肽的降解的药物，优选地，其中药物是imid，优选地选自由沙利度胺、来那度胺、泊马度胺、cc-122(avadomide)、cc-220(iberdomide)和cc-885组成的组；
235.c)任选地，增加或降低可抑制蛋白酶的抑制剂或protac或药物的浓度，所述药物允许crbn多肽底物结构域结合crbn蛋白，从而促进泛素途径介导的嵌合多肽的降解，优选地，其中药物是imid，优选地选自由沙利度胺、来那度胺、泊马度胺、cc-122(avadomide)、cc-220(iberdomide)和cc-885组成的组。
236.t细胞和/或nk细胞可以源自待治疗的患者或者可以是同种异体的。
237.应当理解，关于本发明实施方案的一个方面所讨论的所有细节、实施方案和优选性同样适用于本发明的任何其他方面或实施方案，因此不需要分别针对各个方面详述所有这些细节、实施方案和优选性。
238.现在已经对本发明进行了一般性描述，通过参考以下实施例将更容易理解本发明，这些实施例以说明的方式提供，并不旨在限制本发明。对于本领域技术人员来说，其他方面和实施方案将是显而易见的。
实施例
239.总体介绍
240.为了开发一种可以可逆地控制表达任何目标抗原受体的t细胞的活性的系统，我们设计了一种策略，其中以可滴定的方式将抑制信号带到car或tcr信号传导复合体。car和tcr抗原受体的共同特性是通过这些受体的信号传导导致基于免疫受体酪氨酸的激活基序(itam)的磷酸化。激动剂配体与抗原受体的结合激活lck，其然后磷酸化cd3复合体中的itam。在磷酸化cd3ζ链后，zap70蛋白通过其sh2结构域被招募到cd3ζ链中的磷酸化itam。
241.我们意识到，当包含在抑制性受体中的信号传导结构域将通过融合到与itam相互作用的sh2结构域(例如zap70 sh2结构域或结合磷酸化的基于免疫受体酪氨酸的激活基序(itam)的其他蛋白质的sh2结构域，如syk和lck)而穿梭到活化的抗原受体时，这可能导致tcr/car信号传导的衰减。
242.在与其天然配体结合后，多种抑制性受体，包括pd1、btla、sirpα、siglec5、siglec9、siglec11、pecam1和ly9已被证明能够干扰免疫细胞活化。
243.为了为sh2结构域辅助抑制结构域递送的理念提供支持，我们最初决定关注pd1细胞内结构域，因为关于细胞因子产生和细胞毒性的信号传导是可逆的(barber等人，nature.2006年2月9日；439(7077)：682-7)，并且因为pd1与tcr微簇(microclusters)的物理接近性已被证明对t细胞抑制至关重要(yokosuka等人，j exp med.2012年6月4日；209(6)：1201-17)。基于这些观察，我们生成了zap70 2xsh2结构域-pd1尾融合蛋白(以下简称zap70-pd1)，旨在使pd1的抑制结构域靠近tcr复合体(图1a-b)。zap70 2xsh2结构域与磷酸化的cd3ζ链结合并通过磷酸化下游靶标启动tcr信号转导途径(wang等人，cold spring harb perspect biol.2010年5月；2(5)：a002279)。
244.为了评估zap70-pd1对t细胞活化的影响，用高亲和力cdk4新抗原特异性i类限制性tcr(等人，science.2016年6月10日；352(6291)：1337-41)，与zap70-pd1融合、无抑制尾的zap70 sh2结构域(zap70 2xsh2)、pd1细胞内结构域(pd1尾)或载体对照一起转导原代人类t细胞。
245.与负载有cdk4新抗原的t2肿瘤细胞一起孵育后，对t细胞细胞因子产生(ifnγ、il2、tnfα)或t细胞脱粒(lamp-1细胞表面表达)的分析表明，游离pd1尾的表达并没有显著改变t细胞功能。没有pd1尾的zap70 2xsh2结构域的表达导致t细胞功能的适度抑制(图1c-d)，这可以通过与内源性野生型zap70的竞争来解释。
246.值得注意的是，当pd1的细胞内结构域与zap70 sh2结构域连接时，观察到t细胞细胞因子产生和t细胞脱粒的高效抑制(当t细胞与负载有10nm肽的t2肿瘤细胞共培养时，反应细胞百分比降低：ifnγ：104倍；il-2：110倍；tnfα：81倍；细胞表面lamp1：40倍，均相对于载体对照，图1c-d)。
247.在cd8和cd4 t细胞中均观察到t细胞功能性的抑制。此外，比较具有不同egfp报告基因表达水平的基因修饰细胞群中t细胞活性的抑制程度，揭示zap70-pd1表达水平与抑制活性相关，表明调节zap70-pd1蛋白水平可以用于调节t细胞功能。
248.为了实现对zap70-pd1蛋白水平的药理学控制，我们随后生成了具有小分子调节的蛋白稳定性结构域的融合蛋白(例如自切除降解决定子(sed)，其中sed包含可抑制蛋白酶、同源切割位点和降解决定子序列或蛋白水解靶向嵌合体(protac)结合结构域)。磷酸化的itam结合sh2结构域、基于免疫受体酪氨酸的开关基序(itsm)、优选地itsm和基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(itim)和小分子调节的蛋白质稳定性结构域的组合在本文中也称为作为crash-it(化学调节的和sh2递送的抑制尾)。包含作为sed的小分子辅助关闭标签(smash标签，chung等人，nat chem biol.2015年9月；11(9)：713-20)的crash-it实施方案在图2a-b中进行了说明。smash标签由hcv ns3/4a蛋白酶和降解决定子组成，可导致蛋白酶体快速降解蛋白质。在不存在hcv蛋白酶抑制剂的情况下，hcv蛋白酶切割目标蛋白质和降解决定子之间的接头，从而防止蛋白质降解。相反，在存在hcv ns3/4a蛋白酶抑制剂的情况下，整个融合蛋白靶向蛋白酶体并因此被降解。
249.为了测试zap70-pd1融合蛋白的水平是否可以通过这种方式进行控制，我们生成了n末端ha标记的zap70-pd1-smash融合蛋白，并将其引入人类t细胞。通过细胞内染色分析融合蛋白水平显示，hcv ns3/4a蛋白酶抑制剂阿舒瑞韦对蛋白酶活性的抑制导致原代人类cd8和cd4细胞中的融合蛋白水平降低，最大抑制观察为约0.2μm(图2c-d)。
250.重要的是，zap70-pd1-smash融合蛋白保留了zap70-pd1融合蛋白阻止t细胞活化
的能力，现在可以通过为两种原代人类cd8 t细胞(图2e)和cd4 t细胞(图2g)添加阿舒瑞韦来逆转这种对t细胞功能的抑制。
251.具体而言，相对于经dmso处理的细胞，负载有肽的靶细胞(10nm)对cd8 t细胞的活化对ifnγ、il2、tnfα和细胞表面lamp1表达分别增强了8.8x、11.5x、6.3x和6.6x倍。作为对照，zap70-pd1-smash融合蛋白阴性t细胞(载体对照)的效应功能未被蛋白酶抑制剂改变(图2f和图2h)。我们注意到阿舒瑞韦对zap70-pd1-smash修饰的t细胞功能的影响是深远的(图2e)，即使它对融合蛋白水平的影响不大(图2c)，这可能反映了tcr信号传导途径的信号放大特性，使其对信号强度高度敏感。
252.理想情况下，过继性t细胞疗法中使用的安全开关应该是可滴定和可逆的。通过分析在负载有抗原的靶细胞和用zap70-pd1-smash开关修饰的cdk4特异性t细胞的共培养物中增加阿舒瑞韦浓度的影响，证明了t细胞功能性的剂量依赖性恢复(图3a-c)，证明可以调整t细胞以达到所需的抗原敏感性。接下来，为了了解crash-it平台是否可以作为t细胞的可逆调节剂，将它们从活跃状态切换到非活跃状态并返回，洗涤阿舒瑞韦处理的和对照处理的t细胞，并在不存在药物的情况下培养72小时。随后，t细胞再次用阿舒瑞韦处理或不处理，然后暴露于负载有抗原的靶细胞(图3a中的实验方案)。值得注意的是，zap70-pd1-smash修饰的t细胞仅在肿瘤共培养期间暴露于阿舒瑞韦时才显示出显著的活性，无论细胞之前是否曾暴露于阿舒瑞韦。换句话说，之前触发crash-it开关不会改变后续使用过程中的结果，证明了平台的可逆性(图3d)。
253.使用内源性表达突变cdk4新抗原的me1526和nkirtil006黑色素瘤的共培养实验也证明了小分子诱导的t细胞功能恢复，而表达野生型cdk4基因的对照mm90904黑色素瘤细胞不受影响(数据未示出)。
254.为了表征实现可逆t细胞抑制的重要蛋白质结构域，我们比较了zap70 2xsh2和zap70-pd1的smash标记版本以及缺少降解决定子结构域的zap70-pd1的smash标记版本(数据未示出)。正如对缺少smash结构域的蛋白质开关所观察到的那样(图1)，使用的pd1尾的存在对于实现对tcr信号传导的严格控制很重要，并且在触发crash-it开关后恢复t细胞活性需要存在诱导蛋白酶体降解的降解决定子。
255.接下来，我们通过用fkbp12
f36v
结构域替换smash标签来探索protac介导的crash-it平台的激活(图4a-b)。异双功能dtag-13分子的存在通过诱导与crbn e3连接酶复合体的二聚化导致fkbp12
f36v
融合蛋白的快速蛋白酶体降解(nabet等人，nat chem biol.2018年5月；14(5)：431-441)。小分子滴定实验表明，使用dtag-13protac激活crash-it平台的峰值约为0.5μm，而类似的激活水平需要大体更高浓度的hcv ns3/4a抑制剂(图4c-e)。此外，在不存在小分子的情况下，用fkbp12
f36v
结构域替换smash标签降低肿瘤共培养中的基础t细胞活化。提高的严格性的原因可能是更高的转基因表达水平，因为fkbp12
f36v
比smash标签短591bp。通过基于egfp和cd8表达对cdk4 tcr和zap70-pd1-fkbp12
f36v
(egfp)共转导细胞进行分类，然后在dtag-13和含有高il-2的培养基中扩增，我们生成了用于细胞毒性测定的t细胞池。分选的cd8细胞在dtag-13处理后显示出对负载有
51
cr的nkirtil006肿瘤细胞的杀伤增加，而对照载体修饰的t细胞的活性没有改变(图4f-g)。
256.接下来，我们使用经过第二代car修饰的t细胞测试了crash-it开关系统的灵活性。当抗cd19-cd28-cd3ζ链car(图5a)(brentjens等人，clin cancer res.2007年9月15日；
13(18pt 1)：5426-35)修饰的人类t细胞与cd19阳性raji或daudi共培养时(图5b)，这些细胞的细胞因子产生和脱粒被zap70-pd1-smash有效抑制，并且这些t细胞功能在添加阿舒瑞韦后恢复(图5c-f)。
257.出于同样的原因，用ny-eso-1共享的抗原特异性tcr修饰的cd8t细胞的功能活性(linnemann等人，nat med.2013年11月；19(11)：1534-41)被crash-it开关阻止，并通过添加阿舒瑞韦恢复(图6)。
258.最后，当抗cd3或抗cd3/cd28抗体包被的板刺激原代人类t细胞中的内源性tcr复合体时，t细胞功能性再次通过crash-it抑制并通过添加药物恢复(数据未示出)。
259.在cd8细胞中阿舒瑞韦诱导的蛋白质降解效率高于cd4细胞。可能正因为如此，阿舒瑞韦诱导的t细胞功能恢复对cd8 t细胞比对cd4 t细胞更显著。为了开始探索为不同免疫细胞类型创建具有优化动态范围的变体crash-it开关系统的可行性，我们创建了zap70-pd1-smash的修饰版本(图7a)，其在cd8细胞中的不存在阿舒瑞韦的情况下显示出稍微不那么严格的t细胞抑制。调整的tuzap70-pd1-smash开关保留了有效抑制用cdk4 tcr修饰的cd4 t细胞功能的能力，但添加阿舒瑞韦后t细胞功能的恢复得到显著改善(图7b)。为了测试该开关系统是否也可用于通过hla ii类控制cd4 t细胞识别，我们用tuzap70-pd1-smash开关和hla ii类限制性cmv tcr共同转导原代人类cd4 t细胞，并将所得细胞与负载有肽的cbh 5477靶细胞共培养。通过引入tuzap70-pd1-smash开关，抗原敏感性降低了约1000倍，阿舒瑞韦治疗导致cd4 t细胞功能几乎完全恢复(图7c-d)，表明了如何为特定的细胞类型创建优化的crash-it系统。tuzap70-pd1-smash是通过在起始密码子后添加编码dna n末端的丙氨酸残基获得的(还测试了缬氨酸残基并显示了类似的结果)。
260.从理念的角度来看，crash-it含有诱导接近抗原受体、提供抑制信号并提供调节该抑制信号强度的可能性的功能元件。在我们开发的设计中，这些功能元件分别由zap70 sh2结构域、pd1尾和小分子调节的蛋白质稳定性结构域(smash标签或fkbp12
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)组成。
261.此外，包含来自含有itim和itsm的受体的不同抑制结构域提供了改变t细胞抑制水平并将这种抑制导向特定t细胞输出信号的潜力。图8和图9示出实际上包含来自其他抑制尾的不同itsm基序和itim基序的构建体可以提高根据本发明的嵌合多肽和系统的严格性。所有测试的结构域都包含itsm和itim两者，除了ly9，其只包含两个itsm结构域而没有itim结构域(另请参见图11)。此外，图10显示在本发明中可以使用可替代的含有sh2的对接结构域。在本发明的上下文中，所有测试的可替代的sh2结构域都与磷酸化itam(也参见图12)相互作用(katsuyama等人，front immunol.2018；9：1088，ngoenkam等人，immunology.2018年1月；153(1)：42-50，koch等人，trends immunol.2013年4月；34(4)：182-911)。
262.crash-it平台的广泛适用性也在nk细胞中得到进一步证明。nk细胞系khyg-1可以使用其内源性nk细胞活化受体有效识别和杀死hla i类和ii类缺陷型k562肿瘤(suck等人，exp hematol.2005年10月；33(10)：1160-71)。在不存在药物的情况下，zap70-pd1-fkbp12
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开关的表达有效地抑制了与k562肿瘤共培养的nk细胞中ifnγ、il2和tnfα的产生，并且在存在dtag-13protac的情况下抑制被逆转(图13)。
263.虽然目前的car设计经常包含含有itam的cd3ζ链信号传导结构域，但可替代的含有itam的信号传导结构域，例如来自cd3ε链(nolan等人，clin cancer res.1999年12月；5
(12)：3928-41)、免疫球蛋白受体fcεri的γ(γ)链(ren-heidenreich等人，cancer immunol immunother.2002年10月；51(8)：417-23)和dap12(等人，j immunol.2015年4月1日；194(7)：3201-12)的片段也有报道。我们测试了crash-it开关与一组car的兼容性，所述car含有可替代的含有itam的信号传导结构域，并显示在没有药物的情况下抑制t细胞功能，以及在共表达不同的car和crash-it开关的t细胞中添加药物时，药物诱导t细胞功能的恢复(图14)。
264.利用smash结构域的crash-it实施方案含有可能在免疫活性宿主中具有免疫原性的hcv衍生的蛋白序列。基于fkbp12
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结构域，crash-it平台的进一步实施方案，可以由protac分子如dtag-13调节。然而，dtag-13(分子量：1049.18)的大小可能会限制其口服利用度。
265.因此，我们还评估了是否有可能将crash-it开关系统与可替代的蛋白质稳定性控制结构域相结合，该蛋白质稳定性控制结构域可由确实显示口服生物利用度且临床使用的小分子调节。我们发现包含crbn多肽底物结构域的crash-it实施方案可以成功地用于本发明，所述crbn多肽底物结构域可以响应药物而与crbn蛋白结合，从而促进泛素途径介导的嵌合多肽的降解。使用crash-it实施方案示出了这一点，该实施方案紧邻包含来自与磷酸化的基于免疫受体酪氨酸的激活基序结合的蛋白质的sh2结构域的第一部分，包含优选地第三部分和第二部分，其中第三部分包含基于免疫受体酪氨酸的开关基序(itsm)，优选地，itsm和基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(itim)，第二部分(即包含小分子调节的蛋白质稳定性结构域的部分)含有基于锌指的降解决定子。此类crash-it实施方案可以通过免疫调节性酰亚胺药物(imid，也称为cereblon调节剂)成功调节，该药物包括临床批准的口服可用分子，例如沙利度胺、来那度胺和泊马度胺。
266.沙利度胺(分子量：258.23)、来那度胺(分子量：259.26)和泊马度胺(分子量：273.24)是临床上用于治疗多发性骨髓瘤的免疫调节药物(imids)。先前的研究表明，这些化合物的活性依赖于crbn e3连接酶依赖性降解，例如ikzf1蛋白。此外，已经表明，ikzf1序列内的23个氨基酸长的锌指基序(ikzf1锌指2，zf2)构成了沙利度胺、来那度胺和泊马度胺依赖性蛋白质降解的最小降解决定子(或crbn多肽底物结构域)。ikzf1 zf2序列与与crbn-ikzf1 zf2界面相互作用的相邻锌指3(ikzf1 zf3)的组合产生了约57个氨基酸长的改进的ikzf1衍生的降解决定子(sievers等人，science.2018年11月2日；362(6414).pii：eaat0572)。这种改进的降解决定子序列可以像其他能够响应药物结合crbn蛋白的crbn多肽底物结构域一样，例如融合到目标蛋白质上，从而可以通过添加沙利度胺、来那度胺或泊马度胺或任何其他imid来调节所得蛋白质的稳定性(koduri等人，proc natl acad sci u s a.2019年2月12日；116(7)：2539-2544)。
267.泊马度胺和来那度胺是第二代imid，与沙利度胺的不同之处在于c4位溶剂暴露邻苯二甲酰亚胺环中的苯胺基团。由于该苯胺基团的存在，来那度胺和泊马度胺与沙利度胺相比被认为显示出更好的功效。这3种药物的治疗作用和副作用(骨髓抑制、抗炎活性、t细胞共刺激、nk细胞增殖、抗血管生成和致畸作用)在3种药物之间是重叠的，但幅度不同。沙利度胺、来那度胺和泊马度胺的推荐起始剂量分别为200毫克/天、25毫克/天和4毫克/天，反映了它们的效力差异。
268.为了用imid调节t细胞的活性水平，创建了包含zap70 2xsh2结构域、pd1信号传导
结构域和ikzf1 zf2-zf3最佳降解决定子的crash-it开关(图15-16)。当原代t细胞与cdk4新抗原特异性tcr加基于ikzf1的crash-it开关共转导并与内源性表达cdk4新抗原的nkirtil006肿瘤细胞共培养时，在没有imid的情况下，细胞因子产生和细胞表面lamp-1表达受到紧密抑制，但在存在泊马度胺或来那度胺的情况下，活性水平稳定地恢复，但在存在沙利度胺的情况下较低(图16)。
269.在安全开关失活需要高药物浓度的情况下，imid的抗炎作用可能会干扰细胞疗法的活性。出于这个原因，需要创建对imid表现出更高亲和力的改造的降解决定子，以便可以在内源性靶标的降解最小的药物浓度下实现安全开关调节。先前已经报道，与亲本zfp91 zf4和ikzf1 zf2序列相比，包含zfp91 zf4的β转角序列和ikzf1 zf2的α螺旋序列的杂合锌指基序对沙利度胺具有更高的亲和力(sievers等人，science.2018年11月2日；362(6414).pii：eaat0572)。在该分析中，ikzf1 zf3序列不包括在锌指降解决定子中，尽管单独报道了ikzf1 zf2-3序列与ikzf1 zf2序列相比显示出更好的蛋白质降解潜力。
270.为了产生以高亲和力与沙利度胺相互作用的降解决定子，我们将来自ikzf1 zf2-3降解决定子的ikzf1 zf2β转角序列替换为来自各种锌指(znf653 zf4、zfp91 zf4、znf276 zf4、znf827 zf1)的β转角序列。作为药物浓度函数的t细胞活性分析表明，含有znf653、zfp91、znf276和znf827β转角移植物的杂合锌指可以在降低的来那度胺、泊马度胺和沙利度胺浓度下失活，特别是后者的药物敏感性显著改善(图16)。具体而言，对于表达嵌合降解决定子的t细胞，达到相同水平的细胞因子产生(ifnγ、il-2或tnfα)或表面lamp-1表达水平所需的沙利度胺浓度与亲本ikzf1 zf2-3降解决定子相比降低了约1,000倍(图16d)。因此，基于锌指的crash-it开关(如zap70-pd1-zfp91/ikzf1)可用于在沙利度胺与其正常配体的结合最小的沙利度胺浓度下调节t细胞功能。
271.值得注意的是，在这些imid滴定实验中，在高药物浓度下也观察到了有效的t细胞再活化。相反，在基于fkbp12
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/dtag-13的开关中使用高浓度药物会导致t细胞功能的次最优的再活化。先前已经报道了在高protac浓度下蛋白质靶标的次最优的的降解，这归因于所谓的“钩状效应”(an等人，ebiomedicine.2018年10月；36：553-562)，其中e3连接酶-protac和protac靶蛋白(如fkbp12
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)二聚体优于预期的e3-连接酶-protac靶蛋白三聚体。锌指/imid组合中缺乏明显的钩状效应通过允许在cmax和cmin两者下最佳的t细胞再活化促进了imid的临床使用。最后，与例如fkbp12
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结构域(107个氨基酸)相比，小尺寸的基于锌指的降解决定子(约57个氨基酸)可实现紧凑型载体设计，包括设计其中car/tcr的表达和crash-it开关相连接的单个载体系统。
272.最后，我们比较了包含有或没有ikzf1 zf3的zfp91/ikzf1杂合锌指(分别为双zf和单个zf)或源自ikzf1、ikzf3、zfp91、znf276、znf653的zap70-pd1-锌指构建体的效率(图17a)。结果表明，在存在imid的情况下，表达cdk4 tcr和zap70-pd1-zfp91/ikzf1杂合锌指双zf降解决定子的t细胞的活性可以最有效地恢复(图17b-e)。
273.根据本发明的嵌合多肽和系统，crash-it，是一种可滴定和可逆的t细胞和nk细胞安全开关平台，它与活化抗原受体的性质是不可知的，如在cd4 t细胞、cd8 t细胞和nk细胞的情况下其与高和中亲和力i类限制性tcr、ii类限制性tcr和car共同使用所示出的。
274.crash-it的灵活性质在需要对t细胞和nk细胞敏感性进行精细控制的环境中具有价值。此外，crash-it与现有car的组合不需要对car进行结构重新设计，这对于已经在临床
研究中评估的car设计具有特殊价值。
275.材料和方法
276.逆转录病毒dna构建体
277.所有dna构建体均在mp71逆转录病毒表达载体骨架中产生(engels等人，hum gene ther.2003年8月10日；14(12)：1155-68)。简而言之，密码子优化的dna序列通过idt合成为基因片段，并通过gibson组装克隆到mp71载体中(gibson等人，nat methods.2009年5月；6(5)：343-5)。为了生成mp71-zap70 2xsh2-pd1尾ires-egfp载体，将编码人类zap70片段(p43403，1-264aa)，ggs接头，人类pd1细胞内结构域(q15116，192-288aa)的密码子优化的序列，随后是终止密码子和ires-egfp报告基因克隆到mp71中。
278.包含mp71ires-egfp骨架的其他构建体由以下编码序列创建：mp71zap70-2xsh2结构域-ires-egfp：人zap70(p43403，1-264aa)，mp71pd1-尾-ires-egfp：mv编码序列(即起始密码子甲硫氨酸加上另外的缬氨酸以生成kozak序列)和人pd1细胞内结构域(q15116，192-288aa)。mp71-zap70-pd1-smash-ires-egfp：人zap70(p43403，1-264aa)、ggs接头、人pd1细胞内结构域(q15116，192-288aa)、sgggs接头和304aa smash标签(chung等人，nat chem biol.2015年9月；11(9)：713-20)。mp71-zap70 2xsh2-smash-ires-egfp：人zap70(p43403，1-264aa)、sgggs短接头和304aa smash标签。mp71-ires-egfp载体对照：无关的248aa tet-on 3g反式激活剂(clontech)。mp71-ha-zap70-pd1-smash标签-ires-egfp：ha标签(mvypydvpdyagsgv)编码序列，然后是zap70-pd1-smash编码序列。mp71-tuzap70-pd1-smash-ires-egfp在mp71-zap70-pd1-smash-ires-egfp的起始密码子之后添加了另外的丙氨酸残基编码dna。mp71-zap70-pd1-smash-δ-ires-egfp(缺少降解决定子序列)：缺失了编码来自mp71-zap70-pd1-smash-iresegfp构建体的smash标签的最后78个aa的dna。mp71 cd19 scfv-cd28-cd3ζcar-ires-huegfrt：将第二代cd19特异性car以及ires截短的人egfr(huegfrt)报告基因(wang等人.2011)通过gibson组装亚克隆到来自sfg-19-28z载体的mp71骨架中(brentjens等人，clin cancer res.2007年9月15日；13(18 pt 1)：5426-35)。mp71-ires-huegfrt载体对照：mp71 cd19 scfv-cd28-cd3ζcar-ires-huegfrt载体中的car插入片段被不相关的248aa tet-on 3g反式激活蛋白编码序列(clontech)替换。mp71-zap70-pd1-smash-ires-egfp载体内的pd1胞质域(pd1尾)编码序列被编码btla(q7z6a9，179-289aa)、sirpa(p78324，395-504aa)、siglec5(o15389，463-551aa)、siglec9(q9y336，370-463aa)、siglec11(q96rl6，585-698aa)、pecam1(p16284-1，621-738aa)和ly9(q9hbg7，477-655aa)的胞质域的dna序列替换，以构建编码相应抑制性胞质域的crash-it实施方案。mp71-zap70-pd1-smash-ires-egfp载体内的zap70 2xsh2结构域编码序列(p43403，1-264aa)被编码syk 2xsh2(p43405-1，1-287aa)或lck sh4-unique-sh3-sh2(p06239-1，1-254aa)序列的dna序列替换，以构建编码相应sh2结构域的crash-it实施方案。mp71-zap70-pd1-smash-ires-egfp载体内的smash结构域编码序列被编码fkbpf36v的dna序列替换，以构建可由dtag-13 protac控制的crash-it实施方案(nabet等人，nat chem biol.2018年5月；14(5)：431-441)。
279.为了生成编码可替代的含有itam的结构域的car-t组，mp71 cd19 scfv-cd28-cd3ζcar-ires-huegfrt载体中的cd3ζ链被替换为免疫球蛋白受体fcεri的γ链(fcer1g)(p30273，45-86aa)、cd3ε链(p07766，153-207aa)或dap12(o43914，62-113aa)的含有itam的
胞质域。可替代地，缺失cd3ζ链以生成不具有含有itam的结构域的car结构(阴性对照)。将mp71 cd19 scfv-cd28-cd3ζcar-ires-huegfrt载体中的cd28-cd3ζ编码序列被替换为全长cd3ε链序列cd3e(p07766，25-207 aa)以生成mp71 cd19 scfv-cd3e car-ires-huegfrt。
280.使用含有ikzf1 zf2-3降解决定子的序列(q13422、141-197aa)、或含有ikzf3 zf2-3降解决定子的序列(q9ukt9、142-198aa)、或含有zfp91zf4-5降解决定子的序列(q96jp5，396-455aa)、含有znf276 zf4-5降解决定子的序列(q8n554，520-579aa)、含有znf653 zf4-5降解决定子的序列(q96ck0，552-611aa)，或含有znf692 zf4-5降解决定子的序列(q9bu19，413-473aa)。对于编码杂合锌指降解决定子的crash-it开关，将ikzf1 zf2β转角序列(fqcnqcgasft)替换为来自znf653 zf4(lqceicgyqcr)、zfp91 zf4(lqceicgftcr)、znf276 zf4(lqcevcgfqcr)或znf827 zf1(fqcpicglvik)的β转角序列。对于编码没有ikzf1 zf3的zfp91/ikzf1杂合锌指(单个zf)的crash-it开关，从zap70-pd1-zfp91/ikzf1杂合锌指(双zf)构建体缺失含有ikzf1 zf3的序列(q13422，170-197aa)。
281.hla i类限制性cdk4 tcr(tcr 17，等人，science.2016年6月10日；352(6291)：1337-41)和ny-eso-1 tcr(tcr 1，linnemann等人，nat med.2013年11月；19(11)：1534-41)之前已经描述过。hla ii类限制性cmv-pp65 tcr的可变结构域序列(van loenen等人，plos one.2013年5月30日；8(5)：e65212)由m.h.heemskerk(lumc，nl)友情提供，并被克隆到tcr flex mp71载体中(linnemann等人，nat med.2013年11月；19(11)：1534-41)。
282.细胞系和细胞培养
283.flyrd18、t2、mm90904(来自丹麦herlev医院marco donia的礼物)、mel526(等人，science.2016年6月10日；352(6291)：1337-41)、nkirtil006(kvistborg等人，oncoimmunology.2012年7月1日；1(4)：409-418)，k562、daudi、raji和cbh 5477(来自m.h.heemskerk的礼物)细胞在补充有8％fcs(invitrogen，#f7524-500ml)和青霉素-链霉素(100iu/ml青霉素，100μg/ml链霉素，sigma-aldrich，#11074440001)的imdm(invitrogen，#21980065)中培养。flyrd18、mm90904、mel526和nkirtil006细胞每2-3天用胰蛋白酶-edta(invitrogen，#15400054)传代。
284.人nk细胞系khyg-1(dsmz，leibniz，德国)在补充有8％fbs和含有500iu/ml il-2(novartis)的青霉素-链霉素(100iu/ml青霉素、100μg/ml链霉素)的rpmi中培养。使用基于pcr的筛选(young等人，nat protoc.2010may；5(5)：929-34)对所有细胞系进行支原体检测，结果为阴性。
285.逆转录病毒产生
286.逆转录病毒颗粒在flyrd18包装细胞中产生。简而言之，在转染前一天，每10cm培养皿中平板接种了700,000个flyrd18包装细胞。第二天，用补充有8％fcs且不含抗生素的imdm更新细胞培养基。将25μl x-tremegene 9(roche，#6365809001)与800μlopti-mem(invitrogen，#11058-021)混合并孵育5分钟。随后，将optimem-x-tremegene 9混合物添加到溶解在水中的10μg逆转录病毒质粒dna顶部并孵育15分钟，然后将所得转染混合物逐滴添加到包装细胞上。转染48小时后收集含有逆转录病毒的上清液，立即使用或在液氮中速冻。
287.t细胞分离和活化
288.通过ficoll-isopaque密度离心法(linnemann等人，nat med.2013年11月；19
(11)：1534-41)从健康供体(sanquin(amsterdam，nl))的血沉棕黄层中分离外周血单个核细胞(pbmc)，并冷冻保存直至进一步使用。为了产生活化的t细胞群，将pbmc在含有5％fcs的pbs中解冻，计数并与cd3/cd28 dynabeads(cts，#40203d)以1∶1的细胞与珠子比例混合，密度为107个细胞/ml。
289.在玻璃杯上在室温下孵育30分钟后，将混合物放在磁铁上并去除未结合的细胞。随后将珠结合的t细胞重新悬浮在补充有10％人血清(sigma-aldrich，#h3667-100ml)和含有100iu/ml il-2(novartis)和5ng/ml il-15(peprotech，#200-15)的青霉素-链霉素的rpmi中，并以0.75x106个细胞/ml的密度平板接种。
290.t细胞和nk细胞的自旋转导
291.24孔未处理的细胞培养板在4℃下用10μg/ml纤维连接蛋白(retronectin)(takara，#t100b)覆盖过夜。第二天，去除纤维连接蛋白溶液并用pbs中的2％bsa(sigma-aldrich，a9418-500g)封闭孔30分钟。活化的t细胞(0.25x106个细胞/ml，在rpmi/10％人血清/青霉素-链霉素/200iu/ml il-2和10ng/ml il-15中)或khyg-1nk细胞(0.25x106个细胞/ml，在rpmj/8％fcs/青霉素-链霉素/1000iu/ml il-2中)然后在涂覆有纤维连接蛋白的24孔板中以1∶1的比例(体积/体积)与逆转录病毒上清液混合，并在室温下以2,000rpm离心90分钟。
292.肽负载
293.作为t细胞靶点，t2和cbh 5477细胞在imdm中在37℃下用指定浓度的hla-a*02：01限制性突变cdk4肽(alpdhsghfv)、hlaa*02∶01限制性ny-eso-1肽(sllmwitqa)，或hla-dr1限制性cmv肽(kyqeffwdandiyri)负载1小时。然后将细胞洗涤一次并用于共培养实验。
294.细胞因子释放测定和抗体染色
295.在共培养实验前，t细胞和nk细胞分别在t细胞培养基(rpmi/10％人血清/青霉素-链霉素，100iu/ml il2和5ng/ml il15)或nk细胞培养基(rpmi/8％fcs/青霉素-链霉素，500iu/ml il2)中用指定浓度的阿舒瑞韦(medchemexpress，#hy-14434)、格佐匹韦(medchemexpress，#hy-15298)、dtag-13(tocris，#6605)或dmso对照进行预处理24小时。将100,000个t细胞或nk细胞和100,000个指定的肿瘤细胞混合在补充有golgi-plug(1∶1000稀释度，bd，#51-2301kz)和抗lamp1-apc(1∶100稀释度，biolegend，#328620)的t细胞或nk细胞培养基中，在96孔板中存在指定药物或dmso对照的情况下，在37℃下孵育5小时。
296.孵育后，用pbs洗涤细胞一次，并用ir染料(invitrogen，#l34976)以1∶400稀释度在4℃下染色5分钟。随后，用facs缓冲液(pbs加0.5％bsa)洗涤细胞一次，并用抗cd8-percp cy5.5(1∶20稀释度，bd，#341050)、抗cd4 bv711(1∶50稀释度，biolegend，#317440)，抗鼠恒定tcr-pe(在用转导tcr的实验中，1∶200稀释度，bd，#553172)或西妥昔单抗-pe(在用包含截短的人egfr报告基因的转导car构建体的实验中，1∶200稀释度，r&d systems，#fab9577p)在4℃下染色20分钟。然后用facs缓冲液洗涤细胞一次，并用bd固定和透化溶液(#51-2090kz)在4℃下固定20分钟。
297.透化后，细胞用bd透化/洗涤缓冲液(#51-2091kz)洗涤两次，并用在透化/洗涤缓冲液中稀释的抗ifnγ-bv421(1∶100稀释度，bd，#564791)、抗il-2-pe-cy7(1∶100稀释度，bd，#560707)和抗tnfα-bv650(1∶100稀释度，biolegend，#502938)在4℃下染色20分钟。然后将细胞洗涤两次，重悬于100μl facs缓冲液中，并直接在fortessa special order分析
仪上进行分析。使用flowjo和prism 7软件分析数据。
298.类似地，t细胞用抗ha-af647(1∶200稀释度，cell signaling technology，#3444s)进行细胞内染色，k562、raji和daudi肿瘤细胞用抗cd19-pe(1∶200稀释度，bd，#345789)或同种型对照(biolegend，#400111)进行细胞表面染色，如上所述。
299.t细胞的分选和快速扩增
300.zap70-pd1-fkbpf36v表达细胞的培养基在细胞分选前一天开始补充0.5μm dtag-13 protac，直到
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cr测定前4天。用cdk4 tcr加zap70-pd1-fkbpf36v开关或ires-egfp载体对照修饰的原代人t细胞在beckman coulter moflo astrios上使用80μm喷嘴进行分选。在标准t细胞培养条件下，在rpmi/10％人血清/青霉素-链霉素100iu/ml il-2和5ng/ml il-15中培养细胞7天。
301.在此之后，使用快速扩增方案(rep)扩增细胞。简而言之，通过4,000rad(gammacell 40 exactor)照射产生来自3个供体的2x108个饲养细胞的混合物，然后将所得饲养细胞与1x106分选的t细胞和4.5μg okt3(invitrogen，#16-0037-85)，il-2(3000iu/ml终浓度)在150ml补充有青霉素-链霉素(100iu/ml青霉素，100μg/毫升链霉素)的20/80t细胞混合培养基(invitrogen，#041-96658p)中混合。在第6天，用含有3000iu/ml il-2的培养基更新培养基，每3天用含有il-2(3000iu/ml终浓度)的培养基将培养物分成2份。在第12天，将细胞切换到标准t细胞培养条件(rpmi/10％人血清/青霉素-链霉素/100iu/ml il-2和5ng/ml il-15)3天，直到用于
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cr测定.
302.51
cr测定
303.在
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cr测定前一天，在标准t细胞培养条件下，在rpmi/10％人血清/青霉素-链霉素/100iu/ml il-2和5ng/ml il-15中，用0.5μm dtag-13 protac或dmso预处理t细胞。将5x105个肿瘤细胞重悬于100μl培养基中，与100μci 51
cr轻轻混合，然后在37℃下孵育45分钟。同时，将100μl用dtag-13或dmso对照处理的t细胞稀释液等分到96孔板中。仅使用100μl培养基(自发释放)和100μl 1％triton溶液(最大释放)作为对照。
304.标记后，靶细胞用1ml培养基洗涤3次。将标记的靶细胞以50,000个细胞/ml重新悬浮，并将靶细胞以每孔100μl添加到96孔板中。随后，将板以900rpm离心2分钟并在37℃下孵育4小时。孵育后，将50μl上清液添加到lumaplate-96(packard bioscience，#6005164)上，过夜干燥后，使用perkinelmer topcount nxt确定计数。使用自发和最大释放对照对实验值进行归一化。
305.现在已经完全描述了本发明，本领域技术人员将理解，同样可以在宽范围的等效参数、浓度和条件内进行，而不背离本发明的精神和范围并且无需过度实验。
306.本文引用的所有参考文献，包括期刊文章或摘要、已公开的或相应的专利申请、专利或任何其他参考文献，都通过引用全部纳入本文，包括在引用的参考文献中提供的所有数据、表格、图和文本。此外，在本文引用的参考文献中引用的参考文献的全部内容也通过引用全部纳入。
307.提及已知方法步骤、常规方法步骤、已知方法或常规方法绝不是承认本发明的任何方面、描述或实施方案在相关领域中被公开、教导或暗示。
308.具体实施方案的上述描述将如此充分地揭示本发明的一般性质，以至于其他人可以通过应用本领域内的知识(包括本文引用的参考文献的内容)，在不脱离本发明的一般概
念的情况下，无需过度实验即可容易地修改和/或对这样的具体实施方案的各自应用进行适应性调整。因此，基于本文所呈现的教导和指导，此类适应和修改旨在处于所公开实施方案的等效的含义和范围内。
309.应当理解，本文的措辞或术语是出于描述而非限制的目的，使得本说明书的术语或措辞将由本领域技术人员根据本文提出的教导和指导结合本领域普通技术人员的知识来解释。