具有减少的宿主细胞蛋白和提高的聚山梨醇酯-80稳定性的包含抗CTLA4单克隆抗体的方法和组合物与流程

具有减少的宿主细胞蛋白和提高的聚山梨醇酯-80稳定性的包含抗ctla4单克隆抗体的方法和组合物
i.技术领域
1.本文提供了在色谱方法中从生产蛋白(例如，单克隆抗体)分离宿主细胞蛋白(hcp)(例如，脂肪酶)的方法。本文还提供了通过使用色谱方法从生产蛋白(例如，单克隆抗体)分离hcp(例如，脂肪酶)来改善生产蛋白制剂(例如，药物物质制剂或药品制剂)中的聚山梨醇酯-80(ps-80)稳定性的方法。本文还提供了包含结合细胞毒性t淋巴细胞相关抗原4(ctla4)的抗体或其抗原结合片段的组合物。在另一个方面中，此类组合物还包含降低的宿主细胞蛋白水平并具有提高的ps-80稳定性水平。
ii.

背景技术：

2.在生产蛋白(例如，单克隆抗体)的生物加工和制造中，hcp(例如，脂肪酶)构成通常难以从生产蛋白除去的杂质的一部分。此类杂质可在生物药剂的安全性和功效方面引起各种问题。全世界的监管机构要求生物制药产品满足某些验收标准，包括杂质水平以及用于检测和定量杂质的测试。因此，期望开发高效且有效的从生产蛋白(例如，单克隆抗体)除去hcp(例如，脂肪酶)的方法。
3.ctla4 mab或ctla4配体可以阻止ctla4与其天然配体结合，从而阻断ctla4对t细胞负调节信号的转导并增强t细胞对各种抗原的响应性。在这个方面中，来自体内和体外研究的结果基本上一致。在fda批准用于人类使用的伊匹单抗(作为用于黑素瘤的单一疗法，或作为具有微卫星不稳定性的黑素瘤、肾癌、结肠直肠癌中与抗pd-1抗体纳武单抗的组合疗法的一部分)后，验证了ctla-4为免疫治疗靶标。(zhang，p.等，mechanism and immune landscape based ranking of therapeutic responsiveness of 22major human cancers to next generation anti-ctla-4antibodies，cancers，12(2)，284)。有一些ctla4 mab正在临床试验中测试用于治疗前列腺癌、膀胱癌、结肠直肠癌、胃肠道癌、肝癌、恶性黑素瘤等。(grosso等，ctla-4blockade in tumor models:an overview of preclinical and translational research.cancer immun.13:5(2013))。
iii.

技术实现要素：

4.本公开提供了在色谱方法中从生产蛋白(例如，单克隆抗体)分离hcp(例如，脂肪酶)的方法，以及通过使用色谱方法从生产蛋白(例如，单克隆抗体)分离hcp(例如，脂肪酶)来改善生产蛋白制剂(例如，药物物质制剂或药品制剂)中的ps-80稳定性的方法。本公开至少部分基于以下发现：在其中两种蛋白质之间的分离因子(α)和/或hcp(例如，脂肪酶)的分配系数(k
p
)达到一定数值范围的操作条件下，hcp(例如，脂肪酶)和生产蛋白(例如，单克隆抗体)可以充分分离。
5.在一个方面中，生产蛋白是抗-ctla4抗体。
6.在一个方面中，本文提供了一种通过色谱方法将宿主细胞脂肪酶与抗-ctla4抗体或其抗原结合片段分离的方法，包括：
7.(a)在加样操作条件下使包含脂肪酶和抗-ctla4抗体或其抗原结合片段的加样流体通过色谱树脂；和
8.(b)收集流过物中的抗-ctla4抗体或其抗原结合片段；
9.其中分离因子(α)是脂肪酶的分配系数(k
p
)与抗-ctla4抗体或其抗原结合片段的k
p
的比率，并且其中在加样操作条件下logα大于0.5。
10.在某些实施方式中，在加样操作条件下，logα大于1.0。
11.在一些实施方式中，脂肪酶的log k
p
在加样操作条件下大于1.0。在其他实施方式中，脂肪酶的log k
p
在加样操作条件下大于1.5。
12.在某些实施方式中，在加样操作条件下，logα大于0.5并且脂肪酶的log k
p
大于1.0。在一些实施方式中，在加样操作条件下，logα大于0.5并且脂肪酶的log k
p
大于1.5。在其他实施方式中，在加样操作条件下，logα大于1.0，并且脂肪酶的log k
p
大于1.0。再在其他实施方式中，在加样操作条件下，logα大于1.0，并且脂肪酶的log k
p
大于1.5。
13.在另一个方面中，本文提供了一种通过色谱方法将宿主细胞脂肪酶与抗-ctla4抗体或其抗原结合片段分离的方法，包括：
14.(a)使包含脂肪酶和抗-ctla4抗体或其抗原结合片段的加样流体通过色谱树脂；和
15.(b)在洗脱操作条件下用洗脱溶液从色谱树脂洗脱抗-ctla4抗体或其抗原结合片段；
16.其中α是脂肪酶的k
p
与抗-ctla4抗体或其抗原结合片段的k
p
的比率，并且其中在洗脱操作条件下logα大于0.5。
17.在某些实施方式中，在洗脱操作条件下，logα大于1.0。
18.在一些实施方式中，脂肪酶的log k
p
在洗脱操作条件下大于1.0。在其他实施方式中，脂肪酶的log k
p
在洗脱操作条件下大于1.5。
19.在某些实施方式中，在洗脱操作条件下，logα大于0.5并且脂肪酶的log k
p
大于1.0。在一些实施方式中，在洗脱操作条件下，logα大于0.5并且脂肪酶的log k
p
大于1.5。在其他实施方式中，在洗脱操作条件下，logα大于1.0，并且脂肪酶的log k
p
大于1.0。再在其他实施方式中，在洗脱操作条件下，logα大于1.0并且脂肪酶的log k
p
大于1.5。
20.在本文提供的各种方法的一些实施方式中，脂肪酶是中国仓鼠卵巢(cho)细胞脂肪酶。
21.在某些实施方式中，脂肪酶选自磷脂酶b-样2(plbl2)、脂蛋白脂酶(lpl)、溶酶体磷脂酶a2(lpla2)、磷脂酶a2 vii(lp-pla2)和溶酶体酸性脂肪酶a(lal)。在一个实施方式中，脂肪酶是plbl2。在另一个实施方式中，脂肪酶是lpl。在再一个实施方式中，脂肪酶是lpla2。在一个实施方式中，脂肪酶是lp-pla2。在另一个实施方式中，脂肪酶是lal。在再一个实施方式中，脂肪酶包括两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种、十种或更多种不同的脂肪酶。在再另一个实施方式中，脂肪酶包括选自plbl2、lpl、lpla2、lp-pla2和lal的两种、三种、四种或五种不同的脂肪酶。在一个实施方式中，脂肪酶包括plbl2和lpl。在另一个实施方式中，脂肪酶包括plbl2和lpla2。在再一个实施方式中，脂肪酶包括plbl2和lp-pla2。在又一个实施方式中，脂肪酶包括plbl2和lal。在一个实施方式中，脂肪酶包括lpl和lpla2。在另一个实施方式中，脂肪酶包括lpl和lp-pla2。在又一个实施方式中，脂肪酶包括
lpl和lal。在再另一个实施方式中，脂肪酶包括lpla2和lp-pla2。在一个实施方式中，脂肪酶包括lpla2和lal。在另一个实施方式中，脂肪酶包括lp-pla2和lal。在又一个实施方式中，脂肪酶包括plbl2、lpl和lpla2。在再另一个实施方式中，脂肪酶包括plbl2、lpl和lp-pla2。在一个实施方式中，脂肪酶包括plbl2、lpl和lal。在另一个实施方式中，脂肪酶包括plbl2、lpla2和lp-pla2。在又一个实施方式中，脂肪酶包括plbl2、lpla2和lal。在又一个实施方式中，脂肪酶包括plbl2、lp-pla2和lal。在一个实施方式中，脂肪酶包括lpl、lpla2和lp-pla2。在另一个实施方式中，脂肪酶包括lpl、lpla2和lal。在又一个实施方式中，脂肪酶包括lpl、lp-pla2和lal。在又一个实施方式中，脂肪酶包括lpla2、lp-pla2和lal。在一个实施方式中，脂肪酶包括plbl2、lpl、lpla2和lp-pla2。在另一个实施方式中，脂肪酶包括plbl2、lpl、lpla2和lal。在又一个实施方式中，脂肪酶包括plbl2、lpl、lp-pla2和lal。在又一个实施方式中，脂肪酶包括plbl2、lpla2、lp-pla2和lal。在又一个实施方式中，脂肪酶包括plbl2、lpl、lpla2、lp-pla2和lal。
22.在某些实施方式中，cho细胞脂肪酶选自plbl2、lpl、lpla2、lp-pla2和lal。在一个实施方式中，cho细胞脂肪酶是plbl2。在另一个实施方式中，cho细胞脂肪酶是lpl。在又一个实施方式中，cho细胞脂肪酶是lpla2。在一个实施方式中，cho细胞脂肪酶是lp-pla2。在另一个实施方式中，cho细胞脂肪酶是lal。在又一个实施方式中，cho细胞脂肪酶包括两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种、十种或更多种不同的cho细胞脂肪酶。在又另一个实施方式中，cho细胞脂肪酶包括选自plbl2、lpl、lpla2、lp-pla2和lal的两种、三种、四种或五种不同的cho细胞脂肪酶。在一个实施方式中，cho细胞脂肪酶包括plbl2和lpl。在另一个实施方式中，cho细胞脂肪酶包括plbl2和lpla2。在又一个实施方式中，cho细胞脂肪酶包括plbl2和lp-pla2。在又一个实施方式中，cho细胞脂肪酶包括plbl2和lal。在一个实施方式中，cho细胞脂肪酶包括lpl和lpla2。在另一个实施方式中，cho细胞脂肪酶包括lpl和lp-pla2。在又一个实施方式中，cho细胞脂肪酶包括lpl和lal。在另一个实施方式中，cho细胞脂肪酶包括lpla2和lp-pla2。在一个实施方式中，cho细胞脂肪酶包括lpla2和lal。在另一个实施方式中，cho细胞脂肪酶包括lp-pla2和lal。在又一个实施方式中，cho细胞脂肪酶包括plbl2、lpl和lpla2。在另一个实施方式中，cho细胞脂肪酶包括plbl2、lpl和lp-pla2。在一个实施方式中，cho细胞脂肪酶包括plbl2、lpl和lal。在另一个实施方式中，cho细胞脂肪酶包括plbl2、lpla2和lp-pla2。在又一个实施方式中，cho细胞脂肪酶包括plbl2、lpla2和lal。在又一个实施方式中，cho细胞脂肪酶包括plbl2、lp-pla2和lal。在一个实施方式中，cho细胞脂肪酶包括lpl、lpla2和lp-pla2。在另一个实施方式中，cho细胞脂肪酶包括lpl、lpla2和lal。在又一个实施方式中，cho细胞脂肪酶包括lpl、lp-pla2和lal。在又一个实施方式中，cho细胞脂肪酶包括lpla2、lp-pla2和lal。在一个实施方式中，cho细胞脂肪酶包括plbl2、lpl、lpla2和lp-pla2。在另一个实施方式中，cho细胞脂肪酶包括plbl2、lpl、lpla2和lal。在又一个实施方式中，cho细胞脂肪酶包括plbl2、lpl、lp-pla2和lal。在又一个实施方式中，cho细胞脂肪酶包括plbl2、lpla2、lp-pla2和lal。在又一个实施方式中，cho细胞脂肪酶包括plbl2、lpl、lpla2、lp-pla2和lal。
23.在本文提供的各种方法的一些实施方式中，色谱树脂是离子交换(iex)树脂。在其他实施方式中，色谱树脂是疏水性相互作用(hic)树脂。在一个实施方式中，iex树脂是阳离子交换(cex)树脂。在另一个实施方式中，cex树脂是混合模式cex树脂。在又一个实施方式
中，iex树脂是阴离子交换(aex)树脂。在又一个实施方式中，aex树脂是混合模式aex树脂。
24.在使用cex树脂或混合模式cex树脂的各种方法的某些实施方式中，操作条件的ph低于约6.0。在使用cex树脂或混合模式cex树脂的各种方法的一些实施方式中，操作条件的ph低于约5.5。在使用cex树脂或混合模式cex树脂的各种方法的其他实施方式中，操作条件的ph低于约5.0。还在使用cex树脂或混合模式cex树脂的各种方法的其它实施方式中，操作条件的ph为约4.5至约5.5。在使用cex树脂或混合模式cex树脂的各种方法的再其它实施方式中，操作条件的ph为约4.5至约5.0。在使用cex树脂或混合模式cex树脂的各种方法的某些实施方式中，操作条件的ph为约5.0至约5.5。在使用cex树脂或混合模式cex树脂的各种方法的一些实施方式中，操作条件的ph为约4.9至约5.3。
25.在使用aex树脂或混合模式aex树脂的各种方法的某些实施方式中，操作条件的ph高于约6.5。在使用aex树脂或混合模式aex树脂的各种方法的某些实施方式中，操作条件的ph高于约6.9。在使用aex树脂或混合模式aex树脂的各种方法的其它实施方式中，操作条件的ph高于约7.2。还在使用aex树脂或混合模式aex树脂的各种方法的其它实施方式中，操作条件的ph为约6.9至约7.9。在使用aex树脂或混合模式aex树脂的各种方法的再其它实施方式中，操作条件的ph为约7.2至约7.5。在使用aex树脂或混合模式aex树脂的各种方法的某些实施方式中，操作条件的ph为约7.5至约7.8。
26.在本文提供的各种方法的某些实施方式中，操作条件还包括通过添加盐来调节操作溶液的离子强度和/或电导率。在一个实施方式中，操作条件还包括通过添加盐来调节操作溶液的离子强度。在另一个实施方式中，操作条件还包括通过添加盐来调节操作溶液的电导率。在又一个实施方式中，操作条件还包括通过添加盐来调节操作溶液的离子强度和电导率。在一些实施方式中，加入盐的效果是达到期望的logα。在其它实施方式中，加入盐的效果是达到对于脂肪酶期望的log k
p
。还在其他实施方式中，添加盐的效果是达到期望的logα和对于脂肪酶期望的log k
p
。
27.在一些实施方式中，操作溶液中的盐选自氯化钠、乙酸钠、磷酸钠、硫酸铵、硫酸钠和tris-hcl。在一个实施方式中，盐是氯化钠。在另一个实施方式中，盐是乙酸钠。在又一个实施方式中，盐是磷酸钠。在另一个实施方式中，盐是硫酸铵。在一个实施方式中，盐是硫酸钠。在另一个实施方式中，盐是tris-hcl。
28.在一个具体实施方式中，操作溶液中氯化钠的浓度为约100mm至约225mm，色谱树脂为cex，并且操作条件的ph为约5.0至约6.0。
29.在另一个具体实施方式中，操作溶液中氯化钠的浓度为约150mm至约180mm，色谱树脂为cex，并且操作条件的ph为约5.0至约6.0。
30.在又一个具体实施方式中，操作溶液中乙酸钠的浓度为约100mm至约200mm，色谱树脂为aex；操作条件的ph为约6.9至约7.8。
31.在又一个具体实施方式中，操作溶液中硫酸钠的浓度为约500mm至约620mm，色谱树脂为hic，并且操作条件的ph为约7。
32.还在又一个具体实施方式中，操作溶液中硫酸钠的浓度为约510mm至约560mm，色谱树脂为hic，并且操作条件的ph为约7。
33.在又一个方面，本文中提供了一种通过混合模式aex色谱方法从抗-ctla4抗体或其抗原结合片段分离plbl2并改善ps-80稳定性的方法，其包括：
34.(a)使包含plbl2和抗-ctla4抗体或其抗原结合片段的加样流体通过混合模式aex树脂；和
35.(b)收集流过物中的抗-ctla4抗体或其抗原结合片段；
36.其中加样流体的ph为约ph 7.2至约ph 7.6，并且其中加样流体不包含盐。
37.在另一个方面中，本文提供了一种通过cex色谱方法从抗-ctla4抗体或其抗原结合片段分离plbl2并改善ps-80稳定性的方法，包括：
38.(a)使包含plbl2和抗-ctla4抗体或其抗原结合片段的加样流体通过cex树脂；和
39.(b)用洗脱溶液从cex树脂洗脱抗-ctla4抗体或其抗原结合片段；
40.其中洗脱溶液的ph为约ph 4.9至约ph 5.3，并且其中洗脱溶液还包含约120mm至约175mm氯化钠。
41.在一个实施方式中，通过cex色谱方法从抗-ctla4抗体或其抗原结合片段分离plbl2和改善ps-80稳定性的方法包括：
42.(a)使包含plbl2和抗-ctla4抗体或其抗原结合片段的加样流体通过cex树脂；和
43.(b)用洗脱溶液从cex树脂洗脱抗-ctla4抗体或其抗原结合片段；
44.其中洗脱溶液的ph为约ph 5.1，并且其中洗脱溶液还包含约150mm氯化钠。
45.在另一个实施方式中，通过cex色谱方法从抗-ctla4抗体或其抗原结合片段分离plbl2和改善ps-80稳定性的方法包括：
46.(a)使包含plbl2和抗-ctla4抗体或其抗原结合片段的加样流体通过cex树脂；和
47.(b)用洗脱溶液从cex树脂洗脱抗-ctla4抗体或其抗原结合片段；
48.其中洗脱溶液的ph为约ph 5.1，并且其中洗脱溶液还包含约165mm氯化钠。
49.在再另一个方面中，本文提供了一种通过cex色谱方法从抗-ctla4抗体或其抗原结合片段分离lpla2并改善ps-80稳定性的方法，其包括：
50.(a)使包含lpla2和抗-ctla4抗体或其抗原结合片段的加样流体通过cex树脂；和
51.(b)用洗脱溶液从cex树脂洗脱抗-ctla4抗体或其抗原结合片段；
52.其中洗脱溶液的ph为约ph5.0至约ph5.4，并且其中洗脱溶液还包含约150mm至约275mm氯化钠。
53.在一个实施方式中，通过cex色谱方法从抗-ctla4抗体或其抗原结合片段分离lpla2并改善ps-80稳定性的方法包括：
54.(a)使包含lpla2和抗-ctla4抗体或其抗原结合片段的加样流体通过cex树脂；和
55.(b)用洗脱溶液从cex树脂洗脱抗-ctla4抗体或其抗原结合片段；
56.其中洗脱溶液的ph为约ph 5.1，并且其中洗脱溶液还包含约150mm氯化钠。
57.在另一个实施方式中，通过cex色谱方法从抗-ctla4抗体或其抗原结合片段分离lpla2并改善ps-80稳定性的方法包括：
58.(a)使包含lpla2和抗-ctla4抗体或其抗原结合片段的加样流体通过cex树脂；和
59.(b)用洗脱溶液从cex树脂洗脱抗-ctla4抗体或其抗原结合片段；
60.其中洗脱溶液的ph为约ph 5.1，并且其中洗脱溶液还包含约200mm氯化钠。
61.在又一个实施方式中，通过cex色谱方法从抗-ctla4抗体或其抗原结合片段分离lpla2并改善ps-80稳定性的方法包括：
62.(a)使包含lpla2和抗ctla4抗体或其抗原结合片段的加样流体通过cex树脂；和
63.(b)用洗脱溶液从cex树脂洗脱抗ctla4抗体或其抗原结合片段；
64.其中洗脱溶液的ph为约ph 5.1，并且其中洗脱溶液还包含约250mm氯化钠。
65.在本文提供的各种方法的更多实施方式中，加样流体是来自先前色谱方法的洗脱液。在一个实施方式中，先前的色谱方法包括亲和色谱。在另一个实施方式中，先前的色谱方法包括亲和色谱，然后是非亲和色谱。在又一个实施方式中，亲和色谱是蛋白a色谱。在再另一个实施方式中，非亲和色谱是aex色谱。在又另一个实施方式中，先前的色谱方法包括蛋白a色谱，然后是aex色谱。
66.在又另一个方面中，本文提供了一种改善抗-ctla4抗体或其抗原结合片段制剂中ps-80稳定性的方法，其包括：
67.(a)在加样操作条件下使包含宿主细胞脂肪酶和抗-ctla4抗体或其抗原结合片段的加样流体通过色谱树脂；
68.(b)收集流过产物中的抗-ctla4抗体或其抗原结合片段；
69.(c)另外，使包含宿主细胞脂肪酶的流过产物通过另外的色谱树脂；
70.(d)收集抗-ctla4抗体或其抗原结合片段，和
71.(e)配制抗-ctla4抗体或其抗原结合片段，使得抗-ctla4抗体或其抗原结合片段制剂包含ps-80；
72.其中分离因子(α)是脂肪酶的分配系数(k
p
)与抗-ctla4抗体或其抗原结合片段的k
p
的比率，并且其中在加样操作条件下logα大于0.5。
73.在又另一个方面中，本文提供了一种改善抗-ctla4抗体或其抗原结合片段制剂中ps-80稳定性的方法，其包括：
74.(f)使包含plbl2和抗-ctla4抗体或其抗原结合片段的加样流体在加样操作条件下通过色谱树脂；
75.(g)收集流过产物中的抗-ctla4抗体或其抗原结合片段；
76.(h)另外，使包含plbl2的流过产物通过另外的色谱树脂；
77.(i)收集抗-ctla4抗体或其抗原结合片段，和
78.(j)配制抗-ctla4抗体或其抗原结合片段，使得抗-ctla4抗体或其抗原结合片段制剂包含ps-80；
79.其中分离因子(α)是脂肪酶的分配系数(k
p
)与抗-ctla4抗体或其抗原结合片段的k
p
的比率，并且其中在加样操作条件下logα大于0.5。
80.在另一个方面中，本文提供了一种降低抗-ctla4抗体或其抗原结合片段组合物中ps-80降解的方法，包括：
81.(a)在加样操作条件下使包含宿主细胞脂肪酶和抗-ctla4抗体或其抗原结合片段的加样流体通过色谱树脂；
82.(b)收集流过物中的抗-ctla4抗体或其抗原结合片段；
83.(c)使包含宿主细胞脂肪酶的流过产物通过另外的色谱树脂；
84.(d)收集抗-ctla4抗体或其抗原结合片段，和
85.(e)配制抗-ctla4抗体或其抗原结合片段，使得抗-ctla4抗体或其抗原结合片段制剂包含ps-80；
86.在某些实施方式中，在加样操作条件下，logα大于1.0。
87.在一些实施方式中，脂肪酶的log k
p
在加样操作条件下大于1.0。在其他实施方式中，脂肪酶的log k
p
在加样操作条件下大于1.5。
88.在某些实施方式中，在加样操作条件下，logα大于0.5并且脂肪酶的log k
p
大于1.0。在一些实施方式中，在加样操作条件下，logα大于0.5并且脂肪酶的log k
p
大于1.5。在其他实施方式中，在加样操作条件下，logα大于1.0，并且脂肪酶的log k
p
大于1.0。再在其他实施方式中，在加样操作条件下，logα大于1.0，并且脂肪酶的log k
p
大于1.5。
89.在另一个方面，本文提供了一种改善抗-ctla4抗体或其抗原结合片段制剂中ps-80稳定性的方法，其包括：
90.(a)使包含宿主细胞脂肪酶和抗-ctla4抗体或其抗原结合片段的加样流体通过色谱树脂；
91.(b)在洗脱操作条件下用洗脱溶液从色谱树脂洗脱抗-ctla4抗体或其抗原结合片段；和
92.(c)配制抗-ctla4抗体或其抗原结合片段，使得抗-ctla4抗体或其抗原结合片段制剂是含有ps-80的溶液；
93.其中α是脂肪酶的k
p
与抗-ctla4抗体或其抗原结合片段的k
p
的比率，并且其中在洗脱操作条件下logα大于0.5。
94.在某些实施方式中，在洗脱操作条件下，logα大于1.0。
95.在一些实施方式中，在洗脱操作条件下，脂肪酶的log k
p
大于1.0。在其他实施方式中，在洗脱操作条件下，脂肪酶的log k
p
大于1.5。
96.在某些实施方式中，在洗脱操作条件下，logα大于0.5并且脂肪酶的log k
p
大于1.0。在一些实施方式中，在洗脱操作条件下，logα大于0.5并且脂肪酶的log k
p
大于1.5。在其他实施方式中，在洗脱操作条件下，logα大于1.0并且脂肪酶的log k
p
大于1.0。再在其他实施方式中，在洗脱操作条件下，logα大于1.0并且脂肪酶的log k
p
大于1.5。
97.在本文提供的各种方法的一些实施方式中，脂肪酶是中国仓鼠卵巢(cho)细胞脂肪酶。
98.在某些实施方式中，脂肪酶选自plbl2、lpl、lpla2、lp-pla2和lal。在一个实施方式中，脂肪酶是plbl2。在另一个实施方式中，脂肪酶是lpl。在又一个实施方式中，脂肪酶是lpla2。在一个实施方式中，脂肪酶是lp-pla2。在另一个实施方式中，脂肪酶是lal。在又一个实施方式中，脂肪酶包括两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种、十种或更多种不同的脂肪酶。在又一个实施方式中，脂肪酶包括选自plbl2、lpl、lpla2、lp-pla2和lal的两种、三种、四种或五种不同的脂肪酶。在一个实施方式中，脂肪酶包括plbl2和lpl。在另一个实施方式中，脂肪酶包括plbl2和lpla2。在又一个实施方式中，脂肪酶包括plbl2和lp-pla2。在又一个实施方式中，脂肪酶包括plbl2和lal。在一个实施方式中，脂肪酶包括lpl和lpla2。在另一个实施方式中，脂肪酶包括lpl和lp-pla2。在又一个实施方式中，脂肪酶包括lpl和lal。在另一个实施方式中，脂肪酶包括lpla2和lp-pla2。在一个实施方式中，脂肪酶包括lpla2和lal。在另一个实施方式中，脂肪酶包括lp-pla2和lal。在又一个实施方式中，脂肪酶包括plbl2、lpl和lpla2。在另一个实施方式中，脂肪酶包括plbl2、lpl和lp-pla2。在一个实施方式中，脂肪酶包括plbl2、lpl和lal。在另一个实施方式中，脂肪酶包括plbl2、lpla2和lp-pla2。在又一个实施方式中，脂肪酶包括plbl2、lpla2和lal。在又一个实施方式
中，脂肪酶包括plbl2、lp-pla2和lal。在一个实施方式中，脂肪酶包括lpl、lpla2和lp-pla2。在另一个实施方式中，脂肪酶包括lpl、lpla2和lal。在又一个实施方式中，脂肪酶包括lpl、lp-pla2和lal。在又一个实施方式中，脂肪酶包括lpla2、lp-pla2和lal。在一个实施方式中，脂肪酶包括plbl2、lpl、lpla2和lp-pla2。在另一个实施方式中，脂肪酶包括plbl2、lpl、lpla2和lal。在又一个实施方式中，脂肪酶包括plbl2、lpl、lp-pla2和lal。在又一个实施方式中，脂肪酶包括plbl2、lpla2、lp-pla2和lal。在又一个实施方式中，脂肪酶包括plbl2、lpl、lpla2、lp-pla2和lal。
99.在某些实施方式中，cho细胞脂肪酶选自plbl2、lpl、lpla2、lp-pla2和lal。在一个实施方式中，cho细胞脂肪酶是plbl2。在另一个实施方式中，cho细胞脂肪酶是lpl。在又一个实施方式中，cho细胞脂肪酶是lpla2。在一个实施方式中，cho细胞脂肪酶是lp-pla2。在另一个实施方式中，cho细胞脂肪酶是lal。在又一个实施方式中，cho细胞脂肪酶包括两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种、十种或更多种不同的cho细胞脂肪酶。在再另一个实施方式中，cho细胞脂肪酶包括选自plbl2、lpl、lpla2、lp-pla2和lal的两种、三种、四种或五种不同的cho细胞脂肪酶。在一个实施方式中，cho细胞脂肪酶包括plbl2和lpl。在另一个实施方式中，cho细胞脂肪酶包括plbl2和lpla2。在又一个实施方式中，cho细胞脂肪酶包括plbl2和lp-pla2。在又一个实施方式中，cho细胞脂肪酶包括plbl2和lal。在一个实施方式中，cho细胞脂肪酶包括lpl和lpla2。在另一个实施方式中，cho细胞脂肪酶包括lpl和lp-pla2。在又一个实施方式中，cho细胞脂肪酶包括lpl和lal。在另一个实施方式中，cho细胞脂肪酶包括lpla2和lp-pla2。在一个实施方式中，cho细胞脂肪酶包括lpla2和lal。在另一个实施方式中，cho细胞脂肪酶包括lp-pla2和lal。在又一个实施方式中，cho细胞脂肪酶包括plbl2、lpl和lpla2。在另一个实施方式中，cho细胞脂肪酶包括plbl2、lpl和lp-pla2。在一个实施方式中，cho细胞脂肪酶包括plbl2、lpl和lal。在另一个实施方式中，cho细胞脂肪酶包括plbl2、lpla2和lp-pla2。在又一个实施方式中，cho细胞脂肪酶包括plbl2、lpla2和lal。在又一个实施方式中，cho细胞脂肪酶包括plbl2、lp-pla2和lal。在一个实施方式中，cho细胞脂肪酶包括lpl、lpla2和lp-pla2。在另一个实施方式中，cho细胞脂肪酶包括lpl、lpla2和lal。在又一个实施方式中，cho细胞脂肪酶包括lpl、lp-pla2和lal。在又一个实施方式中，cho细胞脂肪酶包括lpla2、lp-pla2和lal。在一个实施方式中，cho细胞脂肪酶包括plbl2、lpl、lpla2和lp-pla2。在另一个实施方式中，cho细胞脂肪酶包括plbl2、lpl、lpla2和lal。在又一个实施方式中，cho细胞脂肪酶包括plbl2、lpl、lp-pla2和lal。在又一个实施方式中，cho细胞脂肪酶包括plbl2、lpla2、lp-pla2和lal。在又一个实施方式中，cho细胞脂肪酶包括plbl2、lpl、lpla2、lp-pla2和lal。
100.在本文提供的各种方法的一些实施方式中，色谱树脂是iex树脂。在其他实施方式中，色谱树脂是hic树脂。在一个实施方式中，iex树脂是cex树脂。在另一个实施方式中，cex树脂是混合模式cex树脂。在又一个实施方式中，iex树脂是aex树脂。在又一个实施方式中，aex树脂是混合模式aex树脂。
101.在使用cex树脂或混合模式cex树脂的各种方法的某些实施方式中，操作条件的ph低于约6.0。在使用cex树脂或混合模式cex树脂的各种方法的一些实施方式中，操作条件的ph低于约5.5。在使用cex树脂或混合模式cex树脂的各种方法的其他实施方式中，操作条件的ph低于约5.0。在使用cex树脂或混合模式cex树脂的各种方法的其它实施方式，操作条件
的ph为约4.5至约5.5。还在使用cex树脂或混合模式cex树脂的各种方法的其它实施方式中，操作条件的ph为约4.5至约5.0。在使用cex树脂或混合模式cex树脂的各种方法的某些实施方式中，操作条件的ph为约5.0至约5.5。在使用cex树脂或混合模式cex树脂的各种方法的一些实施方式中，操作条件的ph为约4.9至约5.3。
102.在使用aex树脂或混合模式aex树脂的各种方法的某些实施方式中，操作条件的ph高于约6.5。在使用aex树脂或混合模式aex树脂的各种方法的一些实施方式中，操作条件的ph高于约6.9。在使用aex树脂或混合模式aex树脂的各种方法的其它实施方式中，操作条件的ph高于约7.2。还在使用aex树脂或混合模式aex树脂的各种方法的其它实施方式中，操作条件的ph为约6.9至约7.9。仍然在使用aex树脂或混合模式aex树脂的各种方法的其它实施方式中，操作条件的ph为约7.2至约7.5。在使用aex树脂或混合模式aex树脂的各种方法的某些实施方式中，操作条件的ph为约7.5至约7.8。
103.在本文提供的各种方法的某些实施方式中，操作条件还包括通过添加盐来调节操作溶液的离子强度和/或电导率。在一个实施方式中，操作条件还包括通过添加盐来调节操作溶液的离子强度。在另一个实施方式中，操作条件还包括通过添加盐来调节操作溶液的电导率。在又一个实施方式中，操作条件还包括通过添加盐来调节操作溶液的离子强度和电导率。在一些实施方式中，加入盐的效果是达到期望的logα。在其它实施方式中，加入盐的效果是达到期望的脂肪酶log k
p
。再在其他实施方式中，添加盐的效果是达到所需logα和脂肪酶的所需log k
p
。
104.在一些实施方式中，操作溶液中的盐选自氯化钠、乙酸钠、磷酸钠、硫酸铵、硫酸钠和tris-hcl。在一个实施方式中，盐是氯化钠。在另一个实施方式中，盐是乙酸钠。在又一个实施方式中，盐是磷酸钠。在另一个实施方式中，盐是硫酸铵。在一个实施方式中，盐是硫酸钠。在另一个实施方式中，盐是tris-hcl。
105.在具体实施方式中，操作溶液中氯化钠的浓度为约100mm至约225mm，色谱树脂为cex，并且操作条件的ph为约5.0至约6.0。
106.在另一个具体实施方式中，操作溶液中氯化钠的浓度为约150mm至约180mm，色谱树脂为cex，并且操作条件的ph为约5.0至约6.0。
107.在又一个具体实施方式中，操作溶液中乙酸钠的浓度为约100mm至约200mm，色谱树脂为aex；操作条件的ph为约6.9至约7.8。
108.仍然在另一个具体实施方式中，操作溶液中硫酸钠的浓度为约500mm至约620mm，色谱树脂为hic，并且操作条件的ph为约7。
109.再在另一个具体实施方式中，操作溶液中硫酸钠的浓度为约510mm至约560mm，色谱树脂为hic，并且操作条件的ph为约7。
110.再在另一个方面中，本文提供了一种改善抗-ctla4抗体或其抗原结合片段制剂中ps-80稳定性的方法，其包括：
111.(a)使包含抗-ctla4抗体或其抗原结合片段的加样流体通过混合模式aex树脂；
112.(b)收集流过物中的抗-ctla4抗体或其抗原结合片段；和
113.(c)配制抗-ctla4抗体或其抗原结合片段，使得抗-ctla4抗体或其抗原结合片段制剂是含ps-80的溶液；
114.其中加样流体的ph为约ph 7.2至约ph 7.6，并且其中加样流体不包含盐。
115.再在另一个方面中，本文提供了一种改善抗-ctla4抗体或其抗原结合片段制剂中ps-80稳定性的方法，其包括：
116.(a)使包含抗-ctla4抗体或其抗原结合片段的加样流体通过cex树脂；
117.(b)用洗脱溶液从cex树脂洗脱抗-ctla4抗体或其抗原结合片段；和
118.(c)配制抗-ctla4抗体或其抗原结合片段，使得抗-ctla4抗体或其抗原结合片段制剂是含ps-80的溶液；
119.其中洗脱溶液的ph为约ph 4.9至约ph 5.3，并且其中洗脱溶液还包含约120mm至约175mm氯化钠。
120.在一个实施方式中，改善抗-ctla4抗体或其抗原结合片段制剂中ps-80稳定性的方法包括：
121.(a)使包含抗-ctla4抗体或其抗原结合片段的加样流体通过cex树脂；
122.(b)用洗脱溶液从cex树脂洗脱抗-ctla4抗体或其抗原结合片段；和
123.(c)配制抗-ctla4抗体或其抗原结合片段，使得抗-ctla4抗体或其抗原结合片段制剂是含ps-80的溶液；
124.其中洗脱溶液的ph为约ph 5.1，并且其中洗脱溶液还包含约150mm氯化钠。
125.在另一个实施方式中，改善抗-ctla4抗体或其抗原结合片段制剂中ps-80稳定性的方法包括：
126.(a)使包含抗-ctla4抗体或其抗原结合片段的加样流体通过cex树脂；
127.(b)用洗脱溶液从cex树脂洗脱抗-ctla4抗体或其抗原结合片段；和
128.(c)配制抗-ctla4抗体或其抗原结合片段，使得抗-ctla4抗体或其抗原结合片段制剂是含ps-80的溶液；
129.其中洗脱溶液的ph为约ph 5.1，并且其中洗脱溶液还包含约165mm氯化钠。
130.在另一个方面中，本文提供了一种改善抗-ctla4抗体或其抗原结合片段制剂中ps-80稳定性的方法，其包括：
131.(a)使包含抗-ctla4抗体或其抗原结合片段的加样流体通过cex树脂；
132.(b)用洗脱溶液从cex树脂洗脱抗-ctla4抗体或其抗原结合片段；和
133.(c)配制抗-ctla4抗体，使得抗-ctla4抗体或其抗原结合片段制剂是含ps-80的溶液；
134.其中洗脱溶液的ph为约ph 5.0至约ph 5.4，并且其中洗脱溶液还包含约150mm至约275mm氯化钠。
135.在一个实施方式中，改善抗-ctla4抗体或其抗原结合片段制剂中ps-80稳定性的方法包括：
136.(a)使包含抗-ctla4抗体或其抗原结合片段的加样流体通过cex树脂；
137.(b)用洗脱溶液从cex树脂洗脱抗-ctla4抗体或其抗原结合片段；和
138.(c)配制抗-ctla4抗体或其抗原结合片段，使得抗-ctla4抗体或其抗原结合片段制剂是含ps-80的溶液；
139.其中洗脱溶液的ph为约ph 5.1，并且其中洗脱溶液还包含约200mm氯化钠。
140.在另一个实施方式中，改善抗-ctla4抗体或其抗原结合片段制剂中ps-80稳定性的方法包括：
141.(a)使包含抗-ctla4抗体或其抗原结合片段的加样流体通过cex树脂；
142.(b)用洗脱溶液从cex树脂洗脱抗-ctla4抗体或其抗原结合片段；和
143.(c)配制抗-ctla4抗体或其抗原结合片段，使得抗-ctla4抗体或其抗原结合片段制剂是含ps-80的溶液；
144.其中洗脱溶液的ph为约ph 5.1，并且其中洗脱溶液还包含约250mm氯化钠。
145.在本文提供的各种方法的更多实施方式中，加样流体是来自先前色谱方法的洗脱液。在一个实施方式中，先前的色谱方法包括亲和色谱。在另一个实施方式中，先前的色谱方法包括亲和色谱，然后是非亲和色谱。在另一个实施方式中，亲和色谱是蛋白a色谱。在另一个实施方式中，非亲和色谱是aex色谱。在再另一个实施方式中，先前的色谱方法包括蛋白a色谱，然后是aex色谱。
146.再在另一个方面中，本文提供了一种通过cex色谱方法将宿主细胞脂肪酶与抗-ctla4抗体或其抗原结合片段分离的方法，其包括：
147.(a)使包含宿主细胞脂肪酶和所述抗-ctla4抗体或其抗原结合片段的加样流体通过cex树脂；和
148.(b)用洗脱溶液从cex树脂洗脱抗-ctla4抗体或其抗原结合片段；
149.其中洗脱溶液的ph为约ph 4.9至约ph 5.4，并且其中洗脱溶液的电导率为约15ms/cm至约21ms/cm。
150.在另一个方面中，本文提供了一种改善抗-ctla4抗体或其抗原结合片段制剂中ps-80稳定性的方法，其包括：
151.(a)使包含抗-ctla4抗体或其抗原结合片段的加样流体通过cex树脂；
152.(b)用洗脱溶液从cex树脂洗脱抗-ctla4抗体或其抗原结合片段；和
153.(c)配制抗-ctla4抗体或其抗原结合片段，使得抗-ctla4抗体或其抗原结合片段制剂包含ps-80；
154.其中洗脱溶液的ph为约ph 4.9至约ph 5.4，并且其中洗脱溶液的电导率为约15ms/cm至约21ms/cm。
155.再在另一个方面中，本文提供了一种通过cex色谱方法将宿主细胞脂肪酶与抗-ctla4抗体或其抗原结合片段分离的方法，其包括：
156.(a)使包含宿主细胞脂肪酶和抗-ctla4抗体或其抗原结合片段的加样流体通过cex树脂；和
157.(b)用洗脱溶液从cex树脂洗脱抗-ctla4抗体或其抗原结合片段；
158.其中洗脱溶液的ph为约ph 4.9至约ph 5.4，并且其中洗脱溶液还包含约135mm至约195mm氯化钠。
159.在另一个方面中，本文提供了一种改善抗-ctla4抗体或其抗原结合片段制剂中ps-80稳定性的方法，其包括：
160.(a)使包含抗-ctla4抗体或其抗原结合片段的加样流体通过cex树脂；
161.(b)用洗脱溶液从cex树脂洗脱抗-ctla4抗体或其抗原结合片段；和
162.(c)配制抗-ctla4抗体或其抗原结合片段，使得抗-ctla4抗体或其抗原结合片段制剂包含ps-80；
163.其中洗脱溶液的ph为约ph 4.9至约ph 5.4，并且其中洗脱溶液还包含约135mm至
约195mm氯化钠。
164.在本文所述的各种方法的某些实施方式中，抗-ctla4抗体或其抗原结合片段是治疗性蛋白。
165.在本文所述的各种方法的一些实施方式中，抗-ctla4抗体是单克隆抗体。
166.在另一个方面中，本文提供了药物组合物，其包含治疗性蛋白和小于1ppm的宿主细胞脂肪酶。在一些实施方式中，药物组合物包含治疗性蛋白和小于0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8或0.9ppm的宿主细胞脂肪酶。在一个实施方式中，药物组合物包含治疗性蛋白和小于0.1ppm的宿主细胞脂肪酶。在另一个实施例中，该药物组合物包含治疗性蛋白和小于0.2ppm的宿主细胞脂肪酶。再在另一个实施方式中，药物组合物包含治疗性蛋白和小于0.3ppm的宿主细胞脂肪酶。仍然在另一个实施方式中，药物组合物包含治疗性蛋白和小于0.4ppm的宿主细胞脂肪酶。仍然在另一个实施方式中，药物组合物包含治疗性蛋白和小于0.5ppm的宿主细胞脂肪酶。在一个实施方式中，药物组合物包含治疗性蛋白和小于0.6ppm的宿主细胞脂肪酶。在另一个实施方式中，药物组合物包含治疗性蛋白和小于0.7ppm的宿主细胞脂肪酶。再在另一个实施方式中，药物组合物包含治疗性蛋白和小于0.8ppm的宿主细胞脂肪酶。再在另一个实施方式中，药物组合物包含治疗性蛋白和小于0.9ppm的宿主细胞脂肪酶。
167.在本文所述药物组合物的各个实施方式中，通过液相色谱-质谱(lc-ms)测量宿主细胞脂肪酶的水平。
168.在另一个方面中，本文提供了ps-80稳定性增加的包含治疗性蛋白的药物组合物，其中药物组合物的ps-80降解减少。
169.在某些实施方式中，药物组合物是来自使用选自以下的洗脱溶液的cex色谱的包含抗-ctla4抗体或其抗原结合片段的洗脱液：
170.(a)ph为约4.9至约5.3的洗脱溶液，其包含约120mm至约175mm氯化钠；
171.(b)ph为约5.1的洗脱溶液，其包含约150mm氯化钠；
172.(c)ph为约5.1的洗脱溶液，其包含约165mm氯化钠；
173.(d)ph为约4.9至约5.4且电导率为约15ms/cm至约21ms/cm的洗脱溶液；
174.(e)ph为约4.9至约5.4的洗脱溶液，其包含约135mm至约195mm氯化钠；
175.(f)ph为约ph 5.0至约ph 5.4的洗脱溶液，其包含约150mm至约275mm氯化钠；
176.(g)ph为约5.1的洗脱溶液，其包含约200mm氯化钠；和
177.(h)ph为约5.1的洗脱溶液，其包含约250mm氯化钠。
178.在一个实施方式中，药物组合物是来自使用ph为约4.9至约5.3的洗脱溶液的cex色谱的洗脱液，其包含约120mm至约175mm氯化钠和抗-ctla4抗体或其抗原结合片段。
179.在另一个实施方式中，药物组合物是来自使用ph为约5.1的洗脱溶液的cex色谱的洗脱液，其包含约150mm氯化钠和抗-ctla4抗体或其抗原结合片段。
180.再在另一个实施方式中，药物组合物是来自使用ph为约5.1的洗脱溶液的cex色谱的洗脱液，其包含约165mm氯化钠和抗-ctla4抗体或其抗原结合片段。
181.在再另一个实施方式中，药物组合物是来自使用ph为约4.9至约5.4且电导率为约15ms/cm至约21ms/cm的洗脱溶液的cex色谱，且包含抗-ctla4抗体或其抗原结合片段的洗脱液。
182.在一个实施方式中，药物组合物是来自使用ph为约4.9至约5.4的洗脱液的cex色谱的洗脱液，其包含约135mm至约195mm氯化钠和抗-ctla4抗体或其抗原结合片段。
183.在另一个实施方式中，药物组合物是来自使用ph为约ph 5.0至约ph 5.4的洗脱液的cex色谱的洗脱液，其包含约150mm至约275mm氯化钠和抗-ctla4抗体或其抗原结合片段。
184.在又一个实施方式中，药物组合物是来自使用ph为约5.1的洗脱溶液的cex色谱的洗脱液，其包含约200mm氯化钠和抗-ctla4抗体或其抗原结合片段。
185.在又另一个实施方式中，药物组合物是来自使用ph为约5.1的洗脱溶液的cex色谱的洗脱液，其包含约250mm氯化钠和抗-ctla4抗体或其抗原结合片段。
186.在药物组合物的一些实施方式中，cex色谱之前是以流出物模式操作的aex色谱。
187.在药物组合物的某些实施方式中，脂肪酶选自plbl2、lpl、lpla2、lp-pla2和lal。在一个实施方式中，脂肪酶是plbl2。在另一个实施方式中，脂肪酶是lpl。在又一个实施方式中，脂肪酶是lpla2。在一个实施方式中，脂肪酶是lp-pla2。在另一个实施例中，脂肪酶是lal。在又一个实施方式中，脂肪酶包括两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种、十种或更多种不同的脂肪酶。在又一个实施方式中，脂肪酶包括选自plbl2、lpl、lpla2、lp-pla2和lal的两种、三种、四种或五种不同的脂肪酶。在一个实施方式中，脂肪酶包括plbl2和lpl。在另一个实施方式中，脂肪酶包括plbl2和lpla2。在又一个实施方式中，脂肪酶包括plbl2和lp-pla2。在又一个实施方式中，脂肪酶包括plbl2和lal。在一个实施方式中，脂肪酶包括lpl和lpla2。在另一个实施方式中，脂肪酶包括lpl和lp-pla2。在又一个实施方式中，脂肪酶包括lpl和lal。在另一个实施方式中，脂肪酶包括lpla2和lp-pla2。在一个实施方式中，脂肪酶包括lpla2和lal。在另一个实施方式中，脂肪酶包括lp-pla2和lal。在又一个实施方式中，脂肪酶包括plbl2、lpl和lpla2。在另一个实施方式中，脂肪酶包括plbl2、lpl和lp-pla2。在一个实施方式中，脂肪酶包括plbl2、lpl和lal。在另一个实施方式中，脂肪酶包括plbl2、lpla2和lp-pla2。在又一个实施方式中，脂肪酶包括plbl2、lpla2和lal。在又一个实施方式中，脂肪酶包括plbl2、lp-pla2和lal。在一个实施方式中，脂肪酶包括lpl、lpla2和lp-pla2。在另一个实施方式中，脂肪酶包括lpl、lpla2和lal。在又一个实施方式中，脂肪酶包括lpl、lp-pla2和lal。在又一个实施方式中，脂肪酶包括lpla2、lp-pla2和lal。在一个实施方式中，脂肪酶包括plbl2、lpl、lpla2和lp-pla2。在另一个实施方式中，脂肪酶包括plbl2、lpl、lpla2和lal。在又一个实施方式中，脂肪酶包括plbl2、lpl、lp-pla2和lal。在又一个实施方式中，脂肪酶包括plbl2、lpla2、lp-pla2和lal。在又一个实施方式中，脂肪酶包括plbl2、lpl、lpla2、lp-pla2和lal。
188.在药物组合物的其他实施方式中，治疗性蛋白是抗-ctla4抗体或其抗原结合片段。
189.可用于本发明的抗-ctla4抗体和抗原结合片段
190.本文还提供了包含10-200mg抗-ctla4抗体或其抗原结合片段的组合物。
191.本文还提供了包含10-100mg抗-ctla4抗体或其抗原结合片段的组合物。
192.本文还提供了包含抗-ctla4抗体或其抗原结合片段的组合物，所述抗-ctla4抗体或其抗原结合片段选自:(1)10mg的抗-ctla4抗体或其抗原结合片段；(2)25mg的抗-ctla4抗体或其抗原结合片段；(3)50mg抗-ctla4抗体或其抗原结合片段；(4)75mg的抗-ctla4抗体或其抗原结合片段；或(5)100mg抗-ctla4抗体或其抗原结合片段。
193.本文还提供了包含25mg抗-ctla4抗体或其抗原结合片段的组合物。
194.在本发明的纯化方法、治疗方法、组合物、试剂盒和用途的一个实施方式中，抗-ctla-4抗体是人单克隆抗体10d1，现在称为伊匹单抗，并且作为yervoy
tm
销售，其公开于美国专利no.6,984,720和who drug information 19(4)：61(2005)中。在另一个实施方式中，抗-ctla-4抗体是曲美木单抗，也称为cp-675,206，其是igg2单克隆抗体，其描述于美国专利申请公开no.2012/263677或pct国际申请公开no.wo 2012/122444或wo 2007/113648 a2中。
195.在本发明的纯化方法、治疗方法、组合物、试剂盒和用途的更多实施方式中，抗-ctla4抗体或其抗原结合片段包含：包含如seq id no:1、2和3所示的氨基酸序列的轻链cdr和包含如seq id no:4、5和6所示的氨基酸序列的重链cdr。
196.在本发明的纯化方法、治疗方法、组合物、试剂盒和用途的其他实施方式中，抗-ctla4抗体是单克隆抗体或其抗原结合片段，其结合人ctla4并且包含(a)包含如seq id no:7所示的氨基酸序列的重链可变区和(b)包含如seq id no:8所示的氨基酸序列的轻链可变区。
[0197][0198][0199]
在本发明的纯化方法、治疗方法、组合物、试剂盒和用途的一个实施方式中，抗ctla-4抗体是单克隆抗体，其包含具有seq id no:9中所示的氨基酸序列的重链和包含seq id no:10中所示的氨基酸序列的轻链。在一些实施方式中，该抗-ctla4抗体是seq id no:9和/或seq id no:10的抗原结合片段，其中该抗原结合片段特异性地结合ctla4。
[0200]
在本发明的纯化方法、治疗方法、组合物、试剂盒和用途的一个实施方式中，抗ctla-4抗体是国际申请公开no.wo 2016/015675 al中公开的任一种抗ctla-4抗体或其抗原结合片段。在一个实施方式中，抗-ctla4抗体是包含以下cdr的单克隆抗体：
[0201]
cdrh1，其包含氨基酸序列gftfsdnw(seq id no:11)；
[0202]
cdrh2，其包含氨基酸序列irnkpynyet(seq id no:12)；
[0203]
cdrh3，其包含氨基酸序列taqfay(seq id no:13)；和/或
[0204]
cdrl1，其包含氨基酸序列eniygg(seq id no:14)；
[0205]
cdrl2，其包含氨基酸序列gat(seq id no:15)；和
[0206]
cdrl3，其包含选自以下的氨基酸序列：qnvlrspft(seq id no:16)；qnvlsrhpg(seq id no:17)；或qnvlssrpg(seq id no:18)。
[0207]
在本发明的纯化方法、治疗方法、组合物、试剂盒和用途的一个实施方式中，抗-ctla4抗体是8d2/8d2(re)或其变体、8d2h1l1或其变体、8d2h2l2或其变体、8d3h3l3或其变体、8d2h2l15或其变体或者8d2h2l17或其变体。
[0208]
[0209][0210]
在本发明的纯化方法、治疗方法、组合物、试剂盒和用途的另一个实施方式中，抗-ctla4抗体是8d2/8d2(re)的变体、8d2h1l1的变体、8d2h2l2的变体、8d2h2l15的变体或8d2h2l17的变体，其中vh链氨基酸序列中的第18位的甲硫氨酸(met)独立地被选自亮氨酸(leu)、缬氨酸(val)、异亮氨酸(ile)或丙氨酸(ala)的氨基酸置换。在本发明的实施方式中，抗-ctla4抗体包含如上表中所示的8d2h2l2变体1的序列。
[0211]
在本发明的纯化方法、治疗方法、组合物、试剂盒和用途的另一个实施方式中，抗ctla4抗体是8d2h2l2变体1，其具有seq id no:32所示的完整重链氨基酸序列和seq id no:33所示的完整轻链序列。
[0212][0213]
在本发明的纯化方法、治疗方法、组合物、试剂盒和用途的一个实施方式中，抗-ctla4抗体是如2018年3月1日公开的国际申请公开no.wo 2018/035710 al中公开的任一种抗-ctla4抗体或其抗原结合片段。
[0214]
在本发明的纯化方法、治疗方法、组合物、试剂盒和用途的另一个实施方式中，抗ctla-4抗体是抗体或其抗原结合片段，其与上述抗体中的任一种交叉竞争与人ctla-4的结合，或与上述抗体中的任一种结合人ctla-4的相同表位区域，上述抗体包括8d2/8d2(re)或其变体、8d2h1l1或其变体、8d2h2l2或其变体、8d3h3l3或其变体、8d2h2l15或其变体、8d2h2l17。
[0215]
在一个实施方式中，组合物包含：(i)约10mg/ml至约200mg/ml的抗-ctla4抗体或其抗原结合片段；约5mm至约20mm缓冲剂；约6％至8％重量/体积(w/v)的非还原糖；约
0.01％至约0.10％的非离子表面活性剂；和约1mm至约20mm抗氧化剂，且其中plbl2、lpla2和lpl的水平是≤1ng/ml ctla4抗体。
[0216]
在另一个实施方式中，组合物包含：(i)约10mg/ml至约200mg/ml的抗-ctla4抗体或其抗原结合片段；约5mm至约20mm缓冲剂；约6％至8％重量/体积(w/v)的非还原糖；约0.01％至约0.10％的非离子表面活性剂；和约1mm至约20mm抗氧化剂；残留量的宿主细胞脂肪酶，其中残留量的宿主细胞脂肪酶小于2ppm。
[0217]
在一个实施方式中，组合物包含(i)约10mg/ml至约200mg/ml的抗-ctla4抗体或其抗原结合片段；(ii)约5mm至约20mm缓冲剂；(iii)约6％至8％重量/体积(w/v)非还原糖；(iv)约0.01％至约0.10％的非离子表面活性剂；和(v)约1mm至约20mm抗氧化剂，其中plbl2、lpla2和lpl的水平≤1ng/mg。
[0218]
在另一个实施方式中，非离子表面活性剂是ps-80。
[0219]
在另一个实施方式中，组合物包含(i)约10mg/ml至约200mg/ml的抗-ctla4抗体或其抗原结合片段；(ii)约5mm至约20mm缓冲剂；(iii)约6％至8％重量/体积(w/v)非还原糖；(iv)约0.01％至约0.10％聚山梨醇酯80(ps80)；和(v)约1mm至约20mm抗氧化剂，其中plbl2、lpla2和lpl的水平≤1ng/mg且6个月后平均ps80降解小于或等于10％。在另一个实施方式中，ps-80降解是指ps-80在常用储存条件下保持物理、化学和/或生物学稳定的状态。
[0220]
在另一个实施方式中，可以使用各种方法通过完整ps-80分子的量和/或降解产物的量来测量ps-80降解，所述方法包括但不限于质谱(ms)、液相色谱-质谱(lcms)或在具有带电气溶胶检测器(cad)的hplc系统上的固相萃取(spe)。
[0221]
在一个实施方式中，组合物包含(i)约10mg/ml至约200mg/ml的抗-ctla4抗体或其抗原结合片段；(ii)约5mm至约20mm缓冲剂；(iii)约6％至8％重量/体积(w/v)非还原糖；(iv)约0.01％至约0.10％的非离子表面活性剂；和(v)约1mm至约20mm抗氧化剂，其中plbl2的水平≤1ng/mg。
[0222]
在一个实施方式中，组合物包含(i)约10mg/ml至约200mg/ml的抗-ctla4抗体或其抗原结合片段；(ii)约5mm至约20mm缓冲剂；(iii)约6％至8％重量/体积(w/v)非还原糖；(iv)约0.01％至约0.10％ps80；和(v)约1mm至约20mm抗氧化剂，其中plbl2的水平≤1ng/mg并且6个月后平均ps80降解小于或等于10％。在一个实施方式中，组合物包含(i)约10mg/ml至约200mg/ml的抗-ctla4抗体或其抗原结合片段；(ii)约5mm至约20mm缓冲剂；(iii)约6％至8％重量/体积(w/v)非还原糖；(iv)约0.01％至约0.10％ps80；和(v)约1mm至约20mm抗氧化剂，其中plbl2的水平≤1ng/mg且6个月后平均ps80降解等于或小于10％，且其中使用各种方法通过完整ps-80分子的量和/或降解产物的量来测量ps80降解，所述方法包括但不限于质谱(ms)、液相色谱-质谱(lcms)或在具有带电气溶胶检测器(cad)的hplc系统上的固相萃取(spe)。
[0223]
在一个实施方式中，组合物包含(i)约50mg/ml的抗-ctla4抗体或其抗原结合片段；(ii)约10mm缓冲剂；(iii)约7％重量/体积(w/v)非还原糖；(iv)约0.02％的非离子表面活性剂；和(v)约1mm至约20mm抗氧化剂，其中plbl2的水平≤1ng/mg。
[0224]
在一个实施方式中，组合物包含(i)约50mg/ml的抗-ctla4抗体或其抗原结合片段；(ii)约10mm缓冲剂；(iii)约7％重量/体积(w/v)非还原糖；(iv)约0.02％ps80；和(v)约
1mm至约20mm抗氧化剂，其中plbl2的水平≤1ng/mg且6个月后平均ps80降解小于或等于10％。
[0225]
在一个实施方式中，制剂的ph为4.5-6.5。在特定实施方式中，制剂的ph为约ph 5.0至约ph 6.0。在另一个实施方式中，制剂的ph为约ph 5.3至约ph 5.8。在另一个实施方式中，ph为5.3。在另一个实施方式中，ph为5.4。在一个实施方式中，ph为5.5。在一个实施方式中，ph为5.6。在另一个实施方式中，ph为5.7。在一个实施方式中，ph为5.8。
[0226]
在制剂的一个实施方式中，缓冲剂是l-组氨酸缓冲剂或乙酸钠缓冲剂，非还原糖是蔗糖，非离子表面活性剂是聚山梨醇酯80，并且抗氧化剂是甲硫氨酸或其药学上可接受的盐。在一个实施方式中，抗氧化剂是l-甲硫氨酸。在另一个实施方式中，抗氧化剂是l-甲硫氨酸的药学上可接受的盐，如，例如甲硫氨酸hcl。
[0227]
在一个实施方式中，与时间零结果相比，组合物中的ps-80浓度保持
±
0.02mg/ml。
[0228]
在另一个实施方式中，根据上述任何方法的组合物，其中将组合物施用于患者。
[0229]
iv.附图简述
[0230]
图1a-1f显示典型的aex条件范围内的plbl2(图1a-1c)或lpla2(图1d-1f)log k
p
值。图1a和图id显示了在tris和乙酸盐缓冲剂中加样的典型情况。图1b和图1e显示了用tris缓冲剂平衡或洗涤的典型情况。图1c和图1f显示了用磷酸盐缓冲剂平衡或洗涤的情况。
[0231]
图2a-2c显示了典型的cex条件范围内的plbl2(图2a和2b)或lpla2(图2c)log k
p
值。图2a和图2c显示了主要通过改变盐来调节结合的情况。图2b显示了主要通过改变ph来调节结合的情况。
[0232]
图3显示了对于通过盐浓度调节结合典型的hic条件范围内的plbl2或lpla2 log k
p
值。
[0233]
图4a和4b显示了对于多模式色谱树脂典型的ph和盐条件范围内的plbl2 log k
p
值。图4a示出了多模式阴离子交换剂capto adhere的情况。图4b示出了多模式阳离子交换剂capto mmc的情况。
[0234]
图5显示了在指定条件下以流出物模式操作的aex方法的色谱图，表明非常少的与aex树脂结合的mab3。
[0235]
图6a-6c显示了在cex色谱典型的ph和盐条件范围内mab3和plbl2(图6a和6b)或mab3和lpla2(图6c)的logα分离因子值。图6a和6c证明了优化分离条件，其中主要通过改变盐浓度来调节结合。图6b证明了优化条件，其中主要通过改变ph来调节结合。黑框表示其中分离最大化的区域。
[0236]
图7显示了plbl2、lpla2和两种不同mab(mab2和mab3)在hic树脂上的log k
p
值的比较。mab3与plbl2和lpla2的结合非常相似，但mab2比mab3更弱地结合plbl2和lpla2，提供了plbl2和lpla2与mab2分离比mab3更大的分离潜力。
[0237]
图8a和8b显示了在多模式色谱树脂的典型操作条件下mab3和plbl2的logα值。图8a证明了多模式阴离子交换剂capto adhere的优化分离条件。图8b证明了多模式阳离子交换剂capto mmc的优化分离条件。黑框表示其中分离最大化的区域。
[0238]
图9显示了pareto图，其总结了残留hcp(ng/mg)的模型参数(因子)的排序统计显著性。
[0239]
图10a-10c显示了在5℃(图10a)、25℃(图10b)和40℃(图10c)下26周内安慰剂、mab4阴离子交换色谱(aex)池药物物质(aexp ds)和mab4阳离子交换色谱(cex)池药物物质(cexp ds)的ps-80浓度。
[0240]
图11a和11b显示了通过双柱色谱(蛋白a和aex，图11a)或三柱色谱(蛋白a、aex和cex，图11b)纯化的含有mab4的制剂中ps80降解的百分比。
[0241]
图12证明了三柱色谱对于从mab4完全除去残留脂肪酶是必需的。
[0242]
图13显示了在5
±
3℃和25
±
3℃下对组合的cexp运行进行24周和16周的ps-80稳定性研究。
[0243]
图14显示了aex的plbl2掺加(spiking)结果。
[0244]
图15显示了cex的plbl2掺加结果。
[0245]
图16显示了aex的lpl掺加结果。
[0246]
图17显示了cex的lpl掺加结果。
[0247]
图18显示了cex的基础变体掺加结果。
[0248]
图19显示了cex的总高分子量物质掺加结果。cex的总hmw容量为约10.8％。
v.具体实施方式
[0249]
1.定义
[0250]
下面具体定义了某些技术和科学术语。除非在本文件中其他地方具体定义，否则本文使用的所有其他技术和科学术语具有本公开所涉及领域的普通技术人员通常理解的含义。在冲突的情况下，以本说明书(包括定义)为准。
[0251]
术语“操作(operating)条件”、“运行(operation)条件”、“加工(processing)条件”或“工艺(process)条件”是可交换的并且如本文所用的，是指用于操作色谱方法的条件。操作条件可以是平衡条件、加样条件、洗涤条件和/或洗脱条件等。操作条件包括但不限于色谱树脂的类型、树脂骨架、树脂配体、操作溶液的ph、操作溶液的组成、操作溶液的每种成分的浓度、操作溶液的电导率、操作溶液的离子强度、操作溶液的阳离子强度、操作溶液的阴离子强度或两种或更多种上述因素的组合。
[0252]
术语“操作溶液”是指用于操作色谱方法的溶液。操作溶液可以是平衡溶液、加样或进料溶液、洗涤溶液和/或洗脱溶液等。
[0253]
如本文所用，术语“分配系数”或“k
p”是指在特定操作条件下平衡时与色谱树脂结合的蛋白质的浓度(q)与保留在溶液中的蛋白质的浓度(c)的比率。特定蛋白质的分配系数可以如下计算：k
p
＝q/c。
[0254]
如本文所用，术语“分离因子”或“α”是指第一蛋白质的分配系数(k
p，蛋白质1
)与第二蛋白质的分配系数(k
p，蛋白质2
)的比率。分离因子量化了在特定操作条件下两种蛋白质之间色谱树脂的选择性。它可用于预测在操作条件下两种蛋白质通过色谱树脂的分离程度。两种蛋白质之间的分离因子可以如下计算：α＝k
p，蛋白质1
/k
p，蛋白质2
；或logα＝log k
p，蛋白质1
/log k
p，蛋白质2
。
[0255]
如本文所用的，“生产蛋白”是指作为生物过程的预期产物的任何蛋白质。生产蛋白的非限制性实例包括治疗性蛋白、抗体(例如，单克隆抗体、双特异性抗体或其抗原结合片段等)、激素、细胞因子、酶、生长因子、凝血因子或者其免疫缀合物、其融合蛋白或其片
段。生产蛋白的一个实例包括但不限于抗ctla4抗体。
[0256]
如本文所用的，“治疗性蛋白”是指在动物(例如人、牛、马、狗等)中具有治疗效果的任何蛋白质。治疗性蛋白的非限制性实例包括抗体(例如，单克隆抗体、双特异性抗体或其抗原结合片段等)、激素、细胞因子、酶、生长因子、凝血因子或者其免疫缀合物、其融合蛋白或其片段。
[0257]
如本文所用的，“脂肪酶”通常是指宿主细胞脂肪酶和相关的蛋白质/酶，包括(对于中国仓鼠卵巢(cho)表达系统)：plbl2、lpl、lpla2、lp-pla2和lal。
[0258]
如本文所用的，“洗脱液”是指通过色谱的液体。在一些实施方式中，洗脱液是加样溶液的流过物。在其他实施方式中，洗脱液包含通过色谱的洗脱溶液和从色谱洗脱的任何另外的组分。
[0259]
与色谱树脂一起使用时，“混合模式”或“多模式”意指树脂可以通过多于一种模式、功能或机制分离分子，例如离子交换和疏水相互作用。在一些实施方式中，混合模式或多模式色谱树脂可以通过阳离子交换和疏水相互作用分离分子。在其他实施方式中，混合模式或多模式色谱树脂可以通过阴离子交换和疏水相互作用分离分子。
[0260]
如本文所用的，“聚山梨醇酯-80稳定性”或“ps-80稳定性”是指ps-80在常规储存条件(例如，5℃
±
3℃、25℃
±
3℃、60％
±
5％相对湿度(rh)、40℃
±
2℃、75％
±
5％相对湿度(rh))下在一段时间(例如，1周、1个月、6个月、1年、2年等)内保持物理、化学和/或生物学稳定的状态。可以使用各种方法通过完整ps-80分子的量和/或降解产物的量来测量ps-80稳定性，所述方法包括但不限于质谱(ms)、液相色谱-质谱(lcms)或在具有带电气溶胶检测器(cad)的hplc系统上的固相萃取(spe)。
[0261]
如本文所用的，“单克隆抗体”或“mab”或“mab”是指基本上同质的抗体群，即除了可能少量存在的可能天然存在的突变外，构成该群的抗体分子在氨基酸序列上是相同的。修饰语“单克隆”指示抗体的特征为从基本上同质的抗体群获得，并且不应解释为需要通过任何特定方法产生抗体。例如，根据本公开使用的单克隆抗体可以通过kohler等(1975)nature 256:495首次描述的杂交瘤方法制备，或者可以通过重组dna方法制备(参见例如美国专利号4,816,567)。“单克隆抗体”也可以使用clackson等(1991)nature 352：624-628和marks等(1991)j.mol.biol.222：581-597中描述的技术从噬菌体抗体文库中分离，例如，还参见presta(2005)j.allergy clin.immunol.116:731。
[0262]
通常，基本抗体结构单元包含四聚体。每个四聚体包括两对相同的多肽链，每对具有一条“轻”链(约25kda)和一条“重”链(约50-70kda)。每条链的氨基末端部分包括主要负责抗原识别的约100至110个或更多个氨基酸的可变区。重链的羧基末端部分可以限定主要负责效应子功能的恒定区。通常，人轻链被分类为κ和λ轻链。此外，人重链通常分类为μ、δ、γ、α或ε，并将抗体的同种型分别定义为igm、igd、igg、iga和ige。在轻链和重链内，可变区和恒定区通过约12个或更多个氨基酸的“j”区连接，其中重链还包括约10个或更多个氨基酸的“d”区。一般参见fundamental immunology ch.7(paul，w.，编辑，第二版，raven press，n.y.(1989)。
[0263]
每个轻链/重链对的可变区形成抗体结合位点。因此，通常，完整抗体具有两个结合位点。除了在双功能或双特异性抗体中，两个结合位点通常是相同的。通常，重链和轻链两者的可变结构域包含三个高变区，也称为互补决定区(cdr)，其位于相对保守的框架区
(fr)内。cdr通常通过框架区对齐，使得能够结合特定表位。通常，从n末端到c末端，轻链和重链可变结构域均包含fr1、cdr1、fr2、cdr2、fr3、cdr3和fr4。对每个结构域的氨基酸分配通常根据sequences of proteins of immunological interest，kabat等，national institutes of health，bethesda，md.；第5版；nih publ.no.91-3242(1991)；kabat(1978)adv.prot.chem.32:1-75；kabat等，(1977)j.biol.chem.252：6609-6616；chothia等，(1987)j.mol.biol.196:901-917或chothia等(1989)nature 342:878-883的定义。
[0264]“抗ctla-4抗体”意指结合人ctla-4以破坏ctla-4与人b7受体的相互作用的抗体或其抗原结合片段。与b7结合后，ctla4可抑制小鼠和人t细胞的激活，从而在t细胞的激活中起负调节作用。如本文所用的，除非特别说明，所述b7是指b7-1和/或b7-2且特定的蛋白质序列参考本领域已知的序列。可以参考文献或genbank中公开的序列，例如b7-1(cd80，ncbi基因id:941)、b7-2(cd86，ncbi基因id:942)。抗-ctla4抗体可以是人抗体、人源化抗体或嵌合抗体，并且可以包括人恒定区。在一些实施方式中，人恒定区选自iggl、igg2、igg3和igg4恒定区，并且在优选的实施方式中，人恒定区是iggl或igg4恒定区。在一些实施方式中，抗原结合片段选自fab、fab'-sh、f(ab')2、scfv和fv片段。
[0265]
除非另有说明，否则“cdr”或“cdrs”意指免疫球蛋白可变区中的互补决定区，使用kabat编号系统定义。
[0266]“包含(comprising)”或变体，如“含有(comprise)”、“包括(comprises)”或“包括有(comprised of)”，在整个说明书和权利要求书中以包括性的含义使用，即，指定所述特征的存在，但不排除可以实质上增强本发明的任何实施方式的操作或效用的其他特征的存在或添加，除非上下文由于明确的语言或必要的暗示而另有要求。
[0267]
用于修饰数值定义的参数(例如，ph、浓度等)时，“约”意指该参数在该参数的所述数值或范围的20％以内、15％以内、10％以内、9％以内、8％以内、7％以内、6％以内、5％以内、4％以内、3％以内、2％以内、1％以内或更少；在适当的情况下，所述参数可以四舍五入到最接近的整数。
[0268]
如本文(包括所附权利要求书)所用的，除非上下文另有明确规定，否则词语的单数形式，如“一(a)”、“一个(an)”和“该”包括其相应的复数指代。除非上下文另有要求，否则单数术语应包括复数，并且复数术语应包括单数。
[0269]
如本文所用的，术语“至少一个”项目或“一个或多个”项目各自包括选自列表的单个项目以及选自列表的两个或更多个项目的混合。
[0270]
术语“如(e.g.)”或“例如(for example)”之后的任何示例并不意味着穷举或限制。
[0271]
除非有相反的明确说明，否则本文引用的所有范围都是包括性的；即，该范围包括该范围的上限和下限的值以及其间的所有值。作为示例，本文所述的温度范围、百分比、等同物范围等包括该范围的上限和下限以及其间的连续统中的任何值。所有范围也旨在包括所有包括的子范围，尽管不一定明确阐述。例如，ph 4.0-5.0的范围旨在包括ph 4.0、4.1、4.13、4.2、4.1-4.6、4.3-4.4和5.0。另外，如本文所用的术语“或”表示在适当的情况下可以组合的替代方案；也就是说，术语“或”包括单独列出的每个替代方案及其组合。
[0272]
术语“患者”(在本文中可替代地称为“受试者”或“个体”)是指能够用本发明的组合物治疗的哺乳动物(例如，大鼠、小鼠、狗、猫、兔)，最优选人。在一些实施方式中，患者是
成年患者。在其他实施方式中，患者是儿科患者。
[0273]
在根据马库什组或其他替代分组描述本公开的方面或实施方式的情况下，本公开不仅包括作为整体列出的整个组，而且单独地包括组的每个成员和主组的所有可能的亚组，而且还包括缺少一个或多个组成员的主组。本公开还设想明确排除权利要求中的任何组成员中的一个或多个。
[0274]
本文描述了示例性方法和材料，虽然与本文描述的那些类似或等同的方法和材料也可以用于本公开的实践或测试。材料、方法和实施例仅是说明性的而不是限制性的。
[0275]
2.色谱方法
[0276]
本文提供的各种方法可以与本文公开的或本领域普通技术人员理解的任何色谱方法一起使用，用于将抗-ctla4抗体或其抗原结合片段与杂质分离。色谱方法的非限制性实例包括iex、aex、cex、hic、混合模式aex、混合模式cex、亲和和羟基磷灰石色谱(hac)方法等。在一个实施方式中，色谱方法是iex色谱方法。在另一个实施方式中，色谱方法是aex色谱方法。在另一个实施方式中，色谱方法是cex色谱方法。在再另一个实施方式中，色谱方法是hic色谱方法。在一个实施方式中，色谱方法是混合模式iex色谱方法。在另一个实施方式中，色谱方法是混合模式aex色谱方法。在再另一个实施方式中，色谱方法是混合模式cex色谱方法。在另一个实施方式中，色谱方法是亲和色谱方法。在一个实施方式中，色谱方法是蛋白a色谱方法。在另一个实施方式中，色谱方法是蛋白g亲和色谱方法。在再另一个实施方式中，色谱方法是固定化金属亲和色谱(imac)过程。在再另一个实施方式中，色谱方法是hac方法。
[0277]
iex色谱基于分子的净电荷分离分子。分离作为目标带电分子与抗衡离子之间竞争iex色谱树脂上的带相反电荷的配体基团的结果而发生。分子与iex树脂的结合强度取决于分子的净电荷，其受操作条件(如ph和离子强度)的影响。iex树脂包括aex树脂和cex树脂。aex树脂可含有取代基，如二乙基氨基乙基(deae)、三甲叉氨基乙基(tmae)、季氨基乙基(qae)和季胺(qa)基团。cex树脂可含有取代基，如羧甲基(cm)、磺乙基(se)、磺丙基(sp)、磷酸酯(p)和磺酸酯(s)。纤维素iex树脂，如de23、de32、de52、cm-23、cm-32和cm-52，可购自whatman ltd.maidstone，kent，u.k.。基于sephadex的和交联的iex树脂也是已知的。例如，deae-、qae-、cm-和sp-sephadex，以及deae-、q-、cm-和s-sepharose，以及sepharose均可从ge healthcare，piscataway，nj获得。此外，deae和cm衍生的乙二醇-甲基丙烯酸酯共聚物，如toyopearl
tm deae-650s或m和toyopearl
tm cm-650s或m可获自toso haas co.，philadelphia，pa。poros
tm hs、poros
tm hq、poros
tm xs可获自thermo fisher scientific，waltham，ma。
[0278]
hic色谱基于分子的疏水性分离分子。目标分子中的疏水区通过疏水相互作用与hic树脂结合。相互作用的强度取决于操作条件，如ph、离子强度和盐浓度。通常，hic树脂含有与疏水性配体(例如烷基或芳基)偶联的基础基质(例如交联的琼脂糖或合成的共聚物材料)。hic树脂的非限制性实例包括苯基sepharose
tm 6fast flow
tm
(pharmacia lkb biotechnology，ab，瑞典)；苯基sepharose
tm high performance(pharmacia lkb biotechnology，ab，瑞典)；辛基sepharose
tm high performance(pharmacia lkb biotechnology，ab，瑞典)；fractogel
tm emd丙基或fractogel
tm emd苯基(e.merck，德国)；macro-prep
tm
甲基或macro-prep
tm
叔丁基载体(bio-rad，ca)；wp hi-propyl(c3)
tm
(j.t.baker，nj)；苯基或丁基toyopearl
tm
醚(tosohaas，pa)；和tosoh-butyl-650m(tosoh corp.，tokyo，日本)。
[0279]
hac色谱使用式[ca
10
(po4)6(oh)2]的不溶性羟基化磷酸钙作为基质和配体。hac树脂的官能团包括带正电荷的钙离子(c-位点)和带负电荷的磷酸根离子(p-位点)对。c-位点可以与蛋白质表面上的羧酸残基相互作用，而p-位点可以与碱性蛋白质残基相互作用。蛋白质和hac树脂之间的结合强度取决于操作条件，包括ph、离子强度、溶液组成、组合物中每种组分的浓度、ph梯度、组分浓度梯度等。各种hac树脂，例如cht
tm
陶瓷羟基磷灰石和cft
tm
陶瓷氟磷灰石，是可商购的。
[0280]
亲和色谱基于目标分子与树脂的官能团之间的高度特异性相互作用来分离分子，例如抗原与抗体、酶与底物、受体与配体或蛋白质与核酸等之间的相互作用。一些常用的亲和色谱树脂包括用于纯化抗体的蛋白a或蛋白g树脂、用于纯化生物素/亲和素及其衍生物的亲和素生物素树脂、用于纯化gst标记的重组蛋白的谷胱甘肽树脂、用于分离血浆凝固蛋白的肝素树脂、用于纯化与金属离子特异性相互作用的蛋白质的imac树脂等。每种亲和色谱的操作条件取决于相互作用的机制和影响相互作用的因素。商业亲和色谱树脂包括但不限于mabselect sure、unosphere supra
tm
、和
[0281]
在某些实施方式中，本文使用的色谱树脂可以基于多于一种功能或机制，即以混合模式来分离分子。混合模式可以是以上描述或本领域普通技术人员理解的任何两种或更多种功能或机制的组合，如iex和hic的组合(例如aex/hic或cex/hic)、aex和cex的组合(aex/cex)、或hic、aex和cex的组合(hic/aex/cex)等。示例性混合模式色谱树脂包括但不限于ominpac pcx-500、primesep、obelisc r、oblisc n、acclaim trinity p1、acclaim trinity p2、capto adhere、capto adhere impres、capto mmc、capto mmc impres、capto core 700、ppa hypercel、hea hypercel、mep hypercel、eshmuno hcx、toyopearl mx-trp-650m、nuvia c prime、i型cht和ii型cht
[0282]
3.分配系数(k
p
)和分离因子(α)
[0283]
分配系数(k
p
)和分离因子(α)是色谱方法的操作条件特定的两个热力学参数，其可用于量化可在操作条件下通过所述方法实现的分离。
[0284]
通过将已知液体浓度的蛋白质(或其他目标分子)与已知体积的色谱树脂混合并计算平衡时与树脂结合的蛋白质和保留在液体中的蛋白质的比率来确定分配系数k
p
:k
p
＝q/c＝[结合的]/[游离的]。
[0285]
分配通常以log k
p
报告，其可以使用本文所述的uv方法从约0至2精确定量。log k
p
筛选的一般规则如下：
[0286]
log k
p
≥1.5，与树脂强结合；
[0287]
log k
p
《1，预期洗脱将用于结合-洗脱模式的条件；
[0288]
0.5《log k
p
《1，将显示一些结合的弱相互作用条件；
[0289]
log k
p
《0.5，非常少或没有结合。
[0290]
不同物质之间的log k
p
值的差异可用于通过计算分离因子α来预测物质的分离，如下：α＝k
p,蛋白质1
/k
p,蛋白质2
；logα＝log k
p,蛋白质1-log k
p,蛋白质2
，其中logα远离0表示更好的分离。在某些实施方式中，logα的绝对值大于0.2指示两种物质之间的良好分离。在一些实施方式中，logα的绝对值大于0.3指示两种物质之间的良好分离。在其他实施方式中，logα的
绝对值大于0.5指示两种物质之间的良好分离。在其他实施方式中，logα的绝对值大于1.0指示两种物质之间的良好分离。
[0291]
4.hcp和生产蛋白
[0292]
本文提供的各种方法适用于多种hcp以及多种生产蛋白。
[0293]
hcp可以是在宿主细胞中表达的生产蛋白的生物加工期间源自宿主细胞(例如cho细胞)的任何内源蛋白。hcp的非限制性实例包括结构蛋白、功能蛋白、分泌蛋白、酶(如脂肪酶、蛋白酶和激酶等)。在一些实施方式中，hcp是结构蛋白。在某些实施方式中，hcp是功能性蛋白。在其他实施方式中，hcp是分泌蛋白。在另一个实施方式中，hcp是酶。在一个实施方式中，hcp是脂肪酶。在另一个实施方式中，hcp是蛋白酶。在另一个实施方式中，hcp是激酶。
[0294]
在某些实施方式中，脂肪酶选自plbl2、lpl、lpla2、lp-pla2和lal。在一个实施方式中，脂肪酶是plbl2。在另一个实施方式中，脂肪酶是lpl。在又一个实施方式中，脂肪酶是lpla2。在一个实施方式中，脂肪酶是lp-pla2。在另一个实施方式中，脂肪酶是lal。在又一个实施方式中，脂肪酶包括两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种、十种或更多种不同的脂肪酶。在又一个实施方式中，脂肪酶包括选自plbl2、lpl、lpla2、lp-pla2和lal的两种、三种、四种或五种不同的脂肪酶。在一个实施方式中，脂肪酶包括plbl2和lpl。在另一个实施方式中，脂肪酶包括plbl2和lpla2。在又一个实施方式中，脂肪酶包括plbl2和lp-pla2。在又一个实施方式中，脂肪酶包括plbl2和lal。在一个实施方式中，脂肪酶包括lpl和lpla2。在另一个实施方式中，脂肪酶包括lpl和lp-pla2。在又一个实施方式中，脂肪酶包括lpl和lal。在另一个实施方式中，脂肪酶包括lpla2和lp-pla2。在一个实施方式中，脂肪酶包括lpla2和lal。在另一个实施方式中，脂肪酶包括lp-pla2和lal。在又一个实施方式中，脂肪酶包括plbl2、lpl和lpla2。在又一个实施方式中，脂肪酶包括plbl2、lpl和lp-pla2。在一个实施方式中，脂肪酶包括plbl2、lpl和lal。在另一个实施方式中，脂肪酶包括plbl2、lpla2和lp-pla2。在又一个实施方式中，脂肪酶包括plbl2、lpla2和lal。在又一个实施方式中，脂肪酶包括plbl2、lp-pla2和lal。在一个实施方式中，脂肪酶包括lpl、lpla2和lp-pla2。在另一个实施方式中，脂肪酶包括lpl、lpla2和lal。在又一个实施方式中，脂肪酶包括lpl、lp-pla2和lal。在又一个实施方式中，脂肪酶包括lpla2、lp-pla2和lal。在一个实施方式中，脂肪酶包括plbl2、lpl、lpla2和lp-pla2。在另一个实施方式中，脂肪酶包括plbl2、lpl、lpla2和lal。在又一个实施方式中，脂肪酶包括plbl2、lpl、lp-pla2和lal。在又一个实施方式中，脂肪酶包括plbl2、lpla2、lp-pla2和lal。在又一个实施方式中，脂肪酶包括plbl2、lpl、lpla2、lp-pla2和lal。
[0295]
宿主细胞可以是用于表达外源蛋白的任何细胞。用于制造生物药物的常见宿主细胞包括但不限于cho细胞、幼仓鼠肾(bhk21)细胞、鼠骨髓瘤ns0细胞、鼠骨髓瘤sp2/0细胞、人胚肾293(hek293)细胞、纤维肉瘤ht-1080细胞、per.c6细胞、hkb-11细胞、cap细胞、huh-7细胞、鼠c127细胞及其天然产生或遗传修饰的变体。
[0296]
在某些实施方式中，宿主细胞是cho细胞。在一些实施方式中，宿主细胞是幼仓鼠肾(bhk21)细胞。在其他实施方式中，宿主细胞是鼠骨髓瘤ns0细胞。在其他实施方式中，宿主细胞是鼠骨髓瘤sp2/0细胞。在其他实施方式中，宿主细胞是人胚肾293(hek293)细胞。在某些实施方式中，宿主细胞是纤维肉瘤ht-1080细胞。在一些实施方式中，宿主细胞是per.c6细胞。在其他实施方式中，宿主细胞是hkb-11细胞。再在其他实施方式中，宿主细胞
是cap细胞。其他实施方式中，宿主细胞是huh-7细胞。在某些实施方式中，宿主细胞是鼠c127细胞。在一些实施方式中，宿主细胞是上述宿主细胞的天然产生的变体。在其他实施方式中，宿主细胞是上述宿主细胞的遗传修饰变体。
[0297]
在某些实施方式中，cho细胞脂肪酶选自plbl2、lpl、lpla2、lp-pla2和lal。在一个实施方式中，cho细胞脂肪酶是plbl2。在另一个实施方式中，cho细胞脂肪酶是lpl。在又一个实施方式中，cho细胞脂肪酶是lpla2。在一个实施方式中，cho细胞脂肪酶是lp-pla2。在另一个实施方式中，cho细胞脂肪酶是lal。在又一个实施方式中，cho细胞脂肪酶包括两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种、十种或更多种不同的cho细胞脂肪酶。再在另一个实施方式中，cho细胞脂肪酶包括选自plbl2、lpl、lpla2、lp-pla2和lal的两种、三种、四种或五种不同的cho细胞脂肪酶。在一个实施方式中，cho细胞脂肪酶包括plbl2和lpl。在另一个实施方式中，cho细胞脂肪酶包括plbl2和lpla2。在又一个实施方式中，cho细胞脂肪酶包括plbl2和lp-pla2。在又一个实施方式中，cho细胞脂肪酶包括plbl2和lal。在一个实施方式中，cho细胞脂肪酶包括lpl和lpla2。在另一个实施方式中，cho细胞脂肪酶包括lpl和lp-pla2。在又一个实施方式中，cho细胞脂肪酶包括lpl和lal。在另一个实施方式中，cho细胞脂肪酶包括lpla2和lp-pla2。在一个实施方式中，cho细胞脂肪酶包括lpla2和lal。在另一个实施方式中，cho细胞脂肪酶包括lp-pla2和lal。在又一个实施方式中，cho细胞脂肪酶包括plbl2、lpl和lpla2。在另一个实施方式中，cho细胞脂肪酶包括plbl2、lpl和lp-pla2。在一个实施方式中，cho细胞脂肪酶包括plbl2、lpl和lal。在另一个实施方式中，cho细胞脂肪酶包括plbl2、lpla2和lp-pla2。在又一个实施方式中，cho细胞脂肪酶包括plbl2、lpla2和lal。在又一个实施方式中，cho细胞脂肪酶包括plbl2、lp-pla2和lal。在一个实施方式中，cho细胞脂肪酶包括lpl、lpla2和lp-pla2。在另一个实施方式中，cho细胞脂肪酶包括lpl、lpla2和lal。在又一个实施方式中，cho细胞脂肪酶包括lpl、lp-pla2和lal。在又一个实施方式中，cho细胞脂肪酶包括lpla2、lp-pla2和lal。在一个实施方式中，cho细胞脂肪酶包括plbl2、lpl、lpla2和lp-pla2。在另一个实施方式中，cho细胞脂肪酶包括plbl2、lpl、lpla2和lal。在又一个实施方式中，cho细胞脂肪酶包括plbl2、lpl、lp-pla2和lal。在又一个实施方式中，cho细胞脂肪酶包括plbl2、lpla2、lp-pla2和lal。在又一个实施方式中，cho细胞脂肪酶包括plbl2、lpl、lpla2、lp-pla2和lal。
[0298]
生产蛋白可以是为了生产生物药品的目的而在宿主细胞中表达的任何目的蛋白。生产蛋白的非限制性实例包括治疗性蛋白、单克隆抗体、激素、细胞因子、生长因子、凝血因子、酶、其融合蛋白、其免疫缀合物及其片段。在某些实施方式中，生产蛋白是治疗性蛋白。在一些实施方式中，生产蛋白是单克隆抗体。在其他实施方式中，生产蛋白是激素。在其他实施方式中，生产蛋白是细胞因子。在其他实施方式中，生产蛋白是生长因子。在某些实施方式中，生产蛋白是凝血因子。在一些实施方式中，生产蛋白是酶。在其他实施方式中，生产蛋白是上述生产蛋白的融合蛋白。在其他实施方式中，生产蛋白是上述生产蛋白的免疫缀合物。在其他实施方式中，生产蛋白是上述生产蛋白的片段。
[0299]
在一些实施方式中，生产蛋白是抗原特异性的单克隆抗体，所述抗原包括但不限于pd-1、pd-l1、ctla-4、lag3、tim3、tigit、gitr、tnf-α、her2、gpiib/iiia、cd52、pcsk9、il-2ra、blys、vegf、艰难梭菌毒素b、cd19、cd30、il-1b、il17rα、psma、egfr、il-2r、il-2rβγ、cd38、rankl、gd2、il-4rα、补体成分5、cd20、slamf7、dabigatran、il-5、α-4整联蛋白、pdgfr
α、vegfr1、vegfr2、rsv的f蛋白、il-6、il-6r、il-12、il-23和cd33。在一个实施方式中，生产蛋白是抗pd-1单克隆抗体。在另一个实施方式中，生产蛋白是抗ctla-4单克隆抗体。在另一个实施方式中，生产蛋白是抗ctla-4单克隆抗体或其抗原结合片段。在另一个实施方式中，生产蛋白是抗lag3单克隆抗体。在另一个实施方式中，生产蛋白是抗tigit单克隆抗体。在一个实施方式中，生产蛋白是抗gitr单克隆抗体。
[0300]
在具体实施方式中，抗pd-1单克隆抗体是派姆单抗。在另一个实施方式中，抗pd-1单克隆抗体是纳武单抗。在另一个实施方式中，抗pd-1单克隆抗体是匹地利珠单抗(美国专利no.7,332,582)。在另一个实施方式中，抗pd-1单克隆抗体是amp-514(medimmune llc，gaithersburg，md)。在另一个实施方式中，抗pd-1单克隆抗体是pdr001(美国专利no.9,683,048)。在另一个实施方式中，抗pd-1单克隆抗体是bgb-a317(美国专利no.8,735,553)。在另一个实施方式中，抗pd-1单克隆抗体是mga012(macrogenics，rockville，md)。
[0301]
在一个实施方式中，抗lag3单克隆抗体是bms-986016(bristol-myers squibb，new york，ny)。在另一个实施方式中，抗lag3单克隆抗体是regn3767(regeneron，tarrytown，ny)。在又一个实施方式中，抗lag3单克隆抗体是lag525(novartis，basel，瑞士)。在另一个实施方式中，抗lag3单克隆抗体是gsk2813781(glaxosmithkline，brentford，uk)。
[0302]
在一个实施方式中，抗tigit单克隆抗体是bms-986207(bristol-myers squibb，new york，ny)。在另一个实施方式中，抗tigit单克隆抗体为omp-313m32(oncomed pharmaceuticals，redwood city，ca)。在又一个实施方式中，抗tigit单克隆抗体是mtig7192a(也称为rg6058，美国公开号2017/0088613)。在又一个实施方式中，抗tigit单克隆抗体是ptz-201(potenza therapeutics，cambridge，ma；也称为asp8374，astellas pharma，东京，日本)。
[0303]
5.筛选用于从生产蛋白中分离宿主细胞脂肪酶的操作条件的方法
[0304]
本公开提供了筛选用于通过色谱方法从生产蛋白(例如，单克隆抗体)分离hcp(例如，脂肪酶)的操作条件的方法。
[0305]
筛选可以通过批量结合研究、微柱结合研究或本领域普通技术人员将理解的任何其他方法进行。对于hcp(例如，脂肪酶)或生产蛋白(例如，单克隆抗体)，可以设计和检查色谱树脂和操作条件((包括ph、有或没有盐、盐类型、盐浓度、溶液中的其他组分(例如，抗衡离子)、每种组分的浓度或负载蛋白浓度等)的众多组合。hcp(例如，脂肪酶)和生产蛋白(例如，单克隆抗体)的k
p
值通过本文公开的或本领域普通技术人员通常理解的方法测定。使用本文所述的方法计算hcp(例如，脂肪酶)和生产蛋白(例如，单克隆抗体)之间的logα值。通常，logα的绝对值大于0.5对于hcp(例如，脂肪酶)和生产蛋白(例如，单克隆抗体)之间的良好分离是期望的。
[0306]
待筛选的色谱树脂可以是可以基于hcp(例如，脂肪酶)和生产蛋白(例如，单克隆抗体)的特征将hcp(例如，脂肪酶)与生产蛋白(例如，单克隆抗体)分离的任何色谱树脂。待筛选的操作条件可以是所选择的每种树脂的常用工艺条件，例如平衡条件、加样条件、洗涤条件、洗脱条件或洗提条件等。
[0307]
在一个实施方式中，使用树脂浆料平板法进行筛选，如welsh等，biotechnol prog.30(3)：626-635(2014)中公开的。例如，将不同组合的ph、盐和进料的混合物加入96孔
过滤板(例如，p/nmsbvn1250，millipore sigma，burlington，ma)中。色谱树脂体积为2～50μl，并且液体进料体积为200μl。在一些实施方式中，对每种树脂测试16-32个条件。在其他实施方式中，对每种树脂测试24-96个条件。通过真空过滤完成树脂和液体的分离。首先，将树脂与平衡缓冲剂一起温育10分钟，并将平衡步骤重复三次。接下来，将树脂与进料一起温育60分钟。然后，将树脂在洗提条件下温育10分钟并重复两次。平衡步骤允许从初始树脂浆料缓冲剂交换缓冲剂。进料混合的60分钟时间允许在给定的一组条件下树脂配体和蛋白质之间的假平衡。通过280-320nm处的uv吸光度测量来自进料步骤的滤液，以确定蛋白质的最终液体浓度，c。蛋白质的结合浓度q由c和已知进料浓度c0的质量平衡来确定。
[0308]
在另一个实施方式中，使用微柱方法进行筛选，如welsh等，biotechnol prog.30(3)：626-635(2014)或petroff等，biotech bioeng.2013；113(6)：1273-1283(2015)。例如，将不同组合的ph、盐和进料的混合物在具有3cm床高的0.6ml柱形式中筛选。平行筛选多达8个柱。通过将线性流速从典型柱的约300cm/h降低至微型柱形式的约45cm/h，在微型柱中保持约4min的典型停留时间。保留用于色谱筛选的所有其他典型参数。通过收集在96孔板中以产生类似于实验室规模研究的色谱图，可以将洗脱液部分收集为池或级分。
[0309]
一旦确定了用于将hcp(例如，脂肪酶)与生产蛋白(例如，单克隆抗体)分离的操作条件，就可以相应地调节加样流体和/或树脂的条件。例如，可以通过用将使其达到必要操作条件的溶液洗涤树脂来平衡树脂。
[0310]
6.从生产蛋白分离宿主细胞脂肪酶的方法
[0311]
本公开还提供了通过色谱方法从生产蛋白(例如，单克隆抗体)分离hcp(例如，脂肪酶)的方法。
[0312]
在一个方面中，本文提供了一种通过色谱方法将宿主细胞脂肪酶与抗-ctla4抗体或其抗原结合片段分离的方法，其包括：
[0313]
(a)在加样操作条件下使包含脂肪酶和抗-ctla4抗体或其抗原结合片段的加样流体通过色谱树脂；和
[0314]
(b)收集流过物的抗-ctla4抗体或其抗原结合片段；
[0315]
其中分离因子(α)是脂肪酶的分配系数(k
p
)与抗-ctla4抗体或其抗原结合片段的k
p
的比率，并且其中在加样操作条件下logα大于0.5。
[0316]
在某些实施方式中，在加样操作条件下，logα大于1.0。
[0317]
在一些实施方式中，在加样操作条件下，脂肪酶的log k
p
大于1.0。在其他实施方式中，在加样操作条件下，脂肪酶的log k
p
大于1.5。
[0318]
在某些实施方式中，在加样操作条件下，logα大于0.5并且脂肪酶的log k
p
大于1.0。在一些实施方式中，在加样操作条件下，logα大于0.5并且脂肪酶的log k
p
大于1.5。在其他实施方式中，在加样操作条件下，logα大于1.0，并且脂肪酶的log k
p
大于1.0。再在其他实施方式中，在加样操作条件下，logα大于1.0，并且脂肪酶的log k
p
大于1.5。
[0319]
在另一个方面中，本文提供了一种通过色谱方法将宿主细胞脂肪酶与抗-ctla4抗体或其抗原结合片段分离的方法，其包括：
[0320]
(a)使包含脂肪酶和抗-ctla4抗体或其抗原结合片段的加样流体通过色谱树脂；和
[0321]
(b)在洗脱操作条件下用洗脱溶液从色谱树脂洗脱抗-ctla4抗体或其抗原结合片
段；
[0322]
其中α是脂肪酶的k
p
与抗-ctla4抗体或其抗原结合片段的k
p
的比率，并且其中在洗脱操作条件下，logα大于0.5。
[0323]
在某些实施方式中，在洗脱操作条件下，logα大于1.0。
[0324]
在一些实施方式中，脂肪酶的log kp在洗脱操作条件下大于1.0。在其他实施方式中，在洗脱操作条件下，脂肪酶的log k
p
大于1.5。
[0325]
在某些实施方式中，在洗脱操作条件下，log a大于0.5并且脂肪酶的log kp大于1.0。在一些实施方式中，在洗脱操作条件下，logα大于0.5并且脂肪酶的log k
p
大于1.5。在其他实施方式中，在洗脱操作条件下，logα大于1.0，并且脂肪酶的log k
p
大于1.0。再在其他实施方式中，在洗脱操作条件下，logα大于1.0并且脂肪酶的log k
p
大于1.5。
[0326]
在本文提供的各种方法的一些实施方式中，脂肪酶是cho细胞脂肪酶。
[0327]
在某些实施方式中，脂肪酶选自plbl2、lpl、lpla2、lp-pla2和lal。在一个实施方式中，脂肪酶是plbl2。在另一个实施方式中，脂肪酶是lpl。在又一个实施方式中，脂肪酶是lpla2。在一个实施方式中，脂肪酶是lp-pla2。在另一个实施方式中，脂肪酶是lal。在又一个实施方式中，脂肪酶包括两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种、十种或更多种不同的脂肪酶。在又一个实施方式中，脂肪酶包括选自plbl2、lpl、lpla2、lp-pla2和lal的两种、三种、四种或五种不同的脂肪酶。在一个实施方式中，脂肪酶包括plbl2和lpl。在另一个实施方式中，脂肪酶包括plbl2和lpla2。在又一个实施方式中，脂肪酶包括plbl2和lp-pla2。在又一个实施方式中，脂肪酶包括plbl2和lal。在一个实施方式中，脂肪酶包括lpl和lpla2。在另一个实施方式中，脂肪酶包括lpl和lp-pla2。在又一个实施方式中，脂肪酶包括lpl和lal。在另一个实施方式中，脂肪酶包括lpla2和lp-pla2。在一个实施方式中，脂肪酶包括lpla2和lal。在另一个实施方式中，脂肪酶包括lp-pla2和lal。在又一个实施方式中，脂肪酶包括plbl2、lpl和lpla2。在另一个实施方式中，脂肪酶包括plbl2、lpl和lp-pla2。在一个实施方式中，脂肪酶包括plbl2、lpl和lal。在另一个实施方式中，脂肪酶包括plbl2、lpla2和lp-pla2。在又一个实施方式中，脂肪酶包括plbl2、lpla2和lal。在又一个实施方式中，脂肪酶包括plbl2、lp-pla2和lal。在一个实施方式中，脂肪酶包括lpl、lpla2和lp-pla2。在另一个实施方式中，脂肪酶包括lpl、lpla2和lal。在又一个实施方式中，脂肪酶包括lpl、lp-pla2和lal。在又一个实施方式中，脂肪酶包括lpla2、lp-pla2和lal。在一个实施方式中，脂肪酶包括plbl2、lpl、lpla2和lp-pla2。在另一个实施方式中，脂肪酶包括plbl2、lpl、lpla2和lal。在又一个实施方式中，脂肪酶包括plbl2、lpl、lp-pla2和lal。在又一个实施方式中，脂肪酶包括plbl2、lpla2、lp-pla2和lal。在又一个实施方式中，脂肪酶包括plbl2、lpl、lpla2、lp-pla2和lal。
[0328]
在某些实施方式中，cho细胞脂肪酶选自plbl2、lpl、lpla2、lp-pla2和lal。在一个实施方式中，cho细胞脂肪酶是plbl2。在另一个实施方式中，cho细胞脂肪酶是lpl。在又一个实施方式中，cho细胞脂肪酶是lpla2。在一个实施方式中，cho细胞脂肪酶是lp-pla2。在另一个实施方式中，cho细胞脂肪酶是lal。在又一个实施方式中，cho细胞脂肪酶包括两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种、十种或更多种不同的cho细胞脂肪酶。在又另一个实施方式中，cho细胞脂肪酶包括选自plbl2、lpl、lpla2、lp-pla2和lal的两种、三种、四种或五种不同的cho细胞脂肪酶。在一个实施方式中，cho细胞脂肪酶包括plbl2和lpl。在另一
个实施方式中，cho细胞脂肪酶包括plbl2和lpla2。在又一个实施方式中，cho细胞脂肪酶包括plbl2和lp-pla2。在又一个实施方式中，cho细胞脂肪酶包括plbl2和lal。在一个实施方式中，cho细胞脂肪酶包括lpl和lpla2。在另一个实施方式中，cho细胞脂肪酶包括lpl和lp-pla2。在又一个实施方式中，cho细胞脂肪酶包括lpl和lal。在另一个实施方式中，cho细胞脂肪酶包括lpla2和lp-pla2。在一个实施方式中，cho细胞脂肪酶包括lpla2和lal。在另一个实施方式中，cho细胞脂肪酶包括lp-pla2和lal。在又一个实施方式中，cho细胞脂肪酶包括plbl2、lpl和lpla2。在另一个实施方式中，cho细胞脂肪酶包括plbl2、lpl和lp-pla2。在一个实施方式中，cho细胞脂肪酶包括plbl2、lpl和lal。在另一个实施方式中，cho细胞脂肪酶包括plbl2、lpla2和lp-pla2。在又一个实施方式中，cho细胞脂肪酶包括plbl2、lpla2和lal。在又一个实施方式中，cho细胞脂肪酶包括plbl2、lp-pla2和lal。在一个实施方式中，cho细胞脂肪酶包括lpl、lpla2和lp-pla2。在另一个实施方式中，cho细胞脂肪酶包括lpl、lpla2和lal。在又一个实施方式中，cho细胞脂肪酶包括lpl、lp-pla2和lal。在又一个实施方式中，cho细胞脂肪酶包括lpla2、lp-pla2和lal。在一个实施方式中，cho细胞脂肪酶包括plbl2、lpl、lpla2和lp-pla2。在另一个实施方式中，cho细胞脂肪酶包括plbl2、lpl、lpla2和lal。在又一个实施方式中，cho细胞脂肪酶包括plbl2、lpl、lp-pla2和lal。在又一个实施方式中，cho细胞脂肪酶包括plbl2、lpla2、lp-pla2和lal。在又一个实施方式中，cho细胞脂肪酶包括plbl2、lpl、lpla2、lp-pla2和lal。
[0329]
在本文提供的各种方法的一些实施方式中，色谱树脂是iex树脂。在其他实施方式中，色谱树脂是hic树脂。在一个实施方式中，iex树脂是cex树脂。在另一个实施方式中，cex树脂是混合模式cex树脂。在又一个实施方式中，iex树脂是aex树脂。在又一个实施方式中，aex树脂是混合模式aex树脂。
[0330]
在使用cex树脂的各种方法的某些实施方式中，操作条件的ph低于约6.0。在一些实施方式中，操作条件的ph低于约5.5。在其他实施方式中，操作条件的ph低于约5.0。再在其他实施方式中，操作条件的ph为约4.5至约5.5。在其他实施方式中，操作条件的ph为约4.5至约5.0。在某些实施方式中，操作条件的ph为约5.0至约5.5。在一些实施方式中，操作条件的ph为约4.9至约5.3。
[0331]
在使用混合模式cex树脂的各种方法的某些实施方式中，操作条件的ph低于约6.0。在一些实施方式中，操作条件的ph低于约5.5。在其他实施方式中，操作条件的ph低于约5.0。在其他实施方式中，操作条件的ph为约4.5至约5.5。仍然在其他实施方式中，操作条件的ph为约4.5至约5.0。在某些实施方式中，操作条件的ph为约5.0至约5.5。在一些实施方式中，操作条件的ph为约4.9至约5.3。
[0332]
在使用aex树脂的各种方法的某些实施方式中，操作条件的ph高于约6.5。在一些实施方式中，操作条件的ph高于约6.9。在其他实施方式中，操作条件的ph高于约7.2。在其他实施方式中，操作条件的ph为约6.9至约7.9。在其他实施方式中，操作条件的ph为约7.2至约7.5。在某些实施方式中，操作条件的ph为约7.5至约7.8。
[0333]
在使用混合模式aex树脂的各种方法的某些实施方式中，操作条件的ph高于约6.5。在一些实施方式中，操作条件的ph高于约6.9。在其他实施方式中，操作条件的ph高于约7.2。在其他实施方式中，操作条件的ph为约6.9至约7.9。在其他实施方式中，操作条件的ph为约7.2至约7.5。在某些实施方式中，操作条件的ph为约7.5至约7.8。
[0334]
在本文提供的各种方法的某些实施方式中，操作条件还包括通过添加盐来调节离子强度和/或电导率。在一个实施方式中，操作条件还包括通过添加盐来调节离子强度。在另一个实施方式中，操作条件还包括通过添加盐来调节电导率。在又一个实施方式中，操作条件还包括通过添加盐来调节离子强度和电导率。在一些实施方式中，加入盐的效果是达到期望的log k
p
。在其它实施方式中，加入盐的效果是达到期望的脂肪酶log k
p
。在其他实施方式中，添加盐的效果是达到期望的logα和脂肪酶期望log k
p
。因此，在一个实施方式中，操作条件还包括通过添加盐来达到期望的logα。在另一个实施方式中，操作条件还包括通过添加盐来达到脂肪酶期望的log k
p
。在又另一个实施方式中，操作条件进一步包括通过添加盐来达到期望的logα和脂肪酶期望的log k
p
。
[0335]
在一些实施方式中，操作溶液中的盐选自氯化钠、乙酸钠、磷酸钠、硫酸铵、硫酸钠和tris-hcl。在一个实施方式中，盐是氯化钠。在另一个实施方式中，盐是乙酸钠。在又一个实施方式中，盐是磷酸钠。在另一个实施方式中，盐是硫酸铵。在一个实施方式中，盐是硫酸钠。在另一个实施方式中，盐是tris-hcl。
[0336]
在具体实施方式中，操作溶液中氯化钠的浓度为约100mm至约225mm，色谱树脂为cex，并且操作条件的ph为约5.0至约6.0。
[0337]
在另一个具体实施方式中，操作溶液中氯化钠的浓度为约150mm至约180mm，色谱树脂为cex，并且操作条件的ph为约5.0至约6.0。
[0338]
在又一个具体实施方式中，操作溶液中乙酸钠的浓度为约100mm至约200mm，色谱树脂为aex，并且操作条件的ph为约6.9至约7.8。
[0339]
在又一个具体实施方式中，操作溶液中硫酸钠的浓度为约500mm至约620mm，色谱树脂为hic，并且操作条件的ph为约7。
[0340]
在又一个具体实施方式中，操作溶液中硫酸钠的浓度为约510mm至约560mm，色谱树脂为hic，并且操作条件的ph为约7。
[0341]
在又另一个方面中，本文中提供了一种通过混合模式aex色谱方法将plbl2与抗-ctla4抗体或其抗原结合片段分离的方法，其包括：
[0342]
(a)使包含plbl2和抗-ctla4抗体或其抗原结合片段的加样流体通过混合模式aex树脂；和
[0343]
(b)收集流过物中的抗-ctla4抗体或其抗原结合片段；
[0344]
其中加样流体的ph为约ph 7.2至约ph 7.6，并且其中加样流体不包含盐。
[0345]
在此类方法的某些实施方式中，抗-ctla4抗体或其抗原结合片段是治疗性蛋白。
[0346]
在此类方法的一些实施方式中，抗-ctla4抗体或其抗原结合片段是单克隆抗体。
[0347]
再在另一个方面中，本文提供了一种通过cex色谱方法将plbl2与抗-ctla4抗体或其抗原结合片段分离的方法，其包括：
[0348]
(a)使包含plbl2和抗-ctla4抗体或其抗原结合片段的加样流体通过cex树脂；和
[0349]
(b)用洗脱溶液从cex树脂洗脱抗-ctla4抗体或其抗原结合片段；
[0350]
其中洗脱溶液的ph为约ph 4.9至约ph 5.3，并且其中洗脱溶液还包含约120mm至约175mm氯化钠。
[0351]
在一个实施方式中，通过cex色谱方法将plbl2与抗-ctla4抗体或其抗原结合片段分离的方法包括：
[0352]
(a)使包含plbl2和抗-ctla4抗体或其抗原结合片段的加样流体通过cex树脂；和
[0353]
(b)用洗脱溶液从cex树脂洗脱抗-ctla4抗体或其抗原结合片段；
[0354]
其中洗脱溶液的ph为约ph 5.1，并且其中洗脱溶液还包含约150mm氯化钠。
[0355]
在另一个实施方式中，通过cex色谱方法将plbl2与抗-ctla4抗体或其抗原结合片段分离的方法包括：
[0356]
(a)使包含plbl2和抗-ctla4抗体或其抗原结合片段的加样流体通过cex树脂；
[0357]
(b)用洗脱溶液从cex树脂洗脱抗-ctla4抗体或其抗原结合片段；
[0358]
其中洗脱溶液的ph为约ph 5.1，并且其中洗脱溶液还包含约165mm氯化钠。
[0359]
再在另一个方面中，本文提供了一种通过cex色谱方法将lpla2与抗-ctla4抗体或其抗原结合片段分离的方法，其包括：
[0360]
(a)使包含lpla2和抗-ctla4抗体或其抗原结合片段的加样流体通过cex树脂；和
[0361]
(b)用洗脱溶液从cex树脂洗脱抗-ctla4抗体或其抗原结合片段；
[0362]
其中洗脱溶液的ph为约ph 5.0至约ph 5.4，并且其中洗脱溶液还包含约150mm至约275mm氯化钠。
[0363]
在一个实施方式中，通过cex色谱方法将lpla2与抗-ctla4抗体或其抗原结合片段分离的方法包括：
[0364]
(a)使包含lpla2和抗-ctla4抗体或其抗原结合片段的加样流体通过cex树脂；和
[0365]
(b)用洗脱溶液从cex树脂洗脱抗-ctla4抗体或其抗原结合片段；
[0366]
其中洗脱溶液的ph为约ph 5.1，并且其中洗脱溶液还包含约150mm氯化钠。
[0367]
在另一个实施方式中，通过cex色谱方法将lpla2与抗-ctla4抗体或其抗原结合片段分离的方法包括：
[0368]
(a)使包含lpla2和抗-ctla4抗体或其抗原结合片段的加样流体通过cex树脂；和
[0369]
(b)用洗脱溶液从cex树脂洗脱抗-ctla4抗体或其抗原结合片段；
[0370]
其中洗脱溶液的ph为约ph 5.1，并且其中洗脱溶液还包含约200mm氯化钠。
[0371]
再在另一个实施方式中，通过cex色谱方法将lpla2与抗-ctla4抗体或其抗原结合片段分离的方法包括：
[0372]
(a)使包含lpla2和抗-ctla4抗体或其抗原结合片段的加样流体通过cex树脂；和
[0373]
(b)用洗脱溶液从cex树脂洗脱抗-ctla4抗体或其抗原结合片段；
[0374]
其中洗脱溶液的ph为约ph 5.1，并且其中洗脱溶液还包含约250mm氯化钠。
[0375]
本文提供的分离方法可以与本文所述或本领域常用的一个或多个分离步骤组合使用。在一个实施方式中，一个或多个分离步骤在本文所述的方法之前。在另一个实施方式中，一个或多个分离步骤在本文所述的方法之后。再在另一个实施方式中，在本文所述的两种方法之间进行一个或多个分离步骤。仍然在其他实施方式中，在本文所述的方法之前、之后和/或之间进行一个或多个分离步骤。对于可以组合多少个分离步骤或方法或者待组合的分离步骤或方法的顺序没有限制。
[0376]
在本文提供的各种方法的更多实施方式中，加样流体是来自先前色谱方法的洗脱液。在一个实施方式中，先前的色谱方法包括亲和色谱。在另一个实施方式中，先前的色谱方法包括亲和色谱，然后是非亲和色谱。在另一个实施方式中，亲和色谱是蛋白a色谱。在另一个实施方式中，非亲和色谱是aex色谱。在仍然另一个实施方式中，先前的色谱方法包括
蛋白a色谱，然后是aex色谱。
[0377]
在又另一个方面中，本文提供了一种通过cex色谱方法将宿主细胞脂肪酶与抗-ctla4抗体或其抗原结合片段分离的方法，其包括：
[0378]
(a)使包含宿主细胞脂肪酶和抗-ctla4抗体或其抗原结合片段的加样流体通过cex树脂；和
[0379]
(b)用洗脱溶液从cex树脂洗脱抗-ctla4抗体或其抗原结合片段；
[0380]
其中洗脱溶液的ph为约ph 4.9至约ph 5.4，并且其中洗脱溶液的电导率为约15ms/cm至约21ms/cm。
[0381]
在这种方法的某些实施方式中，抗-ctla4抗体或其抗原结合片段是治疗性蛋白。
[0382]
在这种方法的其他实施方式中，抗-ctla4抗体或其抗原结合片段是单克隆抗体。
[0383]
在又一个方面中，本文提供了一种通过cex色谱方法将宿主细胞脂肪酶与抗-ctla4抗体或其抗原结合片段分离的方法，其包括：
[0384]
(a)使包含宿主细胞脂肪酶和抗-ctla4抗体或其抗原结合片段的加样流体通过cex树脂；和
[0385]
(b)用洗脱溶液从cex树脂洗脱抗-ctla4抗体或其抗原结合片段；
[0386]
其中洗脱溶液的ph为约ph 4.9至约ph 5.4，并且其中洗脱溶液还包含约135mm至约195mm氯化钠。
[0387]
7.改善生产蛋白制剂中ps-80稳定性的方法
[0388]
本公开还提供了通过使用色谱方法从生产蛋白(例如，单克隆抗体)分离hcp(例如，脂肪酶)来改善生产蛋白制剂(例如，药物物质制剂或药品制剂)中ps-80稳定性的方法。
[0389]
再在另一个方面中，本文提供了一种改善抗-ctla4抗体或其抗原结合片段制剂中ps-80稳定性的方法，其包括：
[0390]
(a)在加样操作条件下使包含宿主细胞脂肪酶和抗-ctla4抗体或其抗原结合片段的加样流体通过色谱树脂；
[0391]
(b)收集流过物中的抗-ctla4抗体或其抗原结合片段；和
[0392]
(c)配制抗-ctla4抗体或其抗原结合片段，使得抗-ctla4抗体或其抗原结合片段制剂包含ps-80；其中
[0393]
分离因子(α)是脂肪酶的分配系数(k
p
)与抗-ctla4抗体或其抗原结合片段的k
p
的比率，并且其中在加样操作条件下，logα大于0.5。
[0394]
在某些实施方式中，在加样操作条件下，logα大于1.0。
[0395]
在一些实施方式中，在加样操作条件下，脂肪酶的log k
p
大于1.0。在其他实施方式中，在加样操作条件下，脂肪酶的log k
p
大于1.5。
[0396]
在某些实施方式中，在加样操作条件下，logα大于0.5并且脂肪酶的log k
p
大于1.0。在一些实施方式中，在加样操作条件下，logα大于0.5并且脂肪酶的log k
p
大于1.5。在其他实施方式中，在加样操作条件下，logα大于1.0并且脂肪酶的log k
p
大于1.0。再在其他实施方式中，在加样操作条件下，logα大于1.0，并且脂肪酶的log k
p
大于1.5。
[0397]
在另一个方面中，本文提供了一种改善抗-ctla4抗体或其抗原结合片段制剂中ps-80稳定性的方法，其包括：
[0398]
(a)使包含宿主细胞脂肪酶和抗-ctla4抗体或其抗原结合片段的加样流体通过色
谱树脂；
[0399]
(b)在洗脱操作条件下用洗脱溶液从色谱树脂洗脱抗-ctla4抗体或其抗原结合片段；和
[0400]
(c)配制抗-ctla4抗体或其抗原结合片段，使得抗-ctla4抗体或其抗原结合片段处于含ps-80的溶液中；
[0401]
其中α是脂肪酶的k
p
与抗-ctla4抗体或其抗原结合片段的k
p
的比率，并且其中在洗脱操作条件下logα大于0.5。
[0402]
在某些实施方式中，在洗脱操作条件下，logα大于1.0。
[0403]
在一些实施方式中，脂肪酶的log k
p
在洗脱操作条件下大于1.0。在其他实施方式中，脂肪酶的log k
p
在洗脱操作条件下大于1.5。
[0404]
在某些实施方式中，在洗脱操作条件下，logα大于0.5并且脂肪酶的log k
p
大于1.0。在一些实施方式中，在洗脱操作条件下，logα大于0.5并且脂肪酶的log k
p
大于1.5。在其他实施方式中，在洗脱操作条件下，logα大于1.0，并且脂肪酶的log k
p
大于1.0。再在其他实施方式中，在洗脱操作条件下，logα大于1.0并且脂肪酶的log k
p
大于1.5。
[0405]
在本文提供的各种方法的一些实施方式中，脂肪酶是中国仓鼠卵巢(cho)细胞脂肪酶。
[0406]
在某些实施方式中，脂肪酶选自plbl2、lpl、lpla2、lp-pla2和lal。在一个实施方式中，脂肪酶是plbl2。在另一个实施方式中，脂肪酶是lpl。在又一个实施方式中，脂肪酶是lpla2。在一个实施方式中，脂肪酶是lp-pla2。在另一个实施方式中，脂肪酶是lal。在又一个实施方式中，脂肪酶包括两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种、十种或更多种不同的脂肪酶。在又一个实施方式中，脂肪酶包括选自plbl2、lpl、lpla2、lp-pla2和lal的两种、三种、四种或五种不同的脂肪酶。在一个实施方式中，脂肪酶包括plbl2和lpl。在另一个实施方式中，脂肪酶包括plbl2和lpla2。在又一个实施方式中，脂肪酶包括plbl2和lp-pla2。在又一个实施方式中，脂肪酶包括plbl2和lal。在一个实施方式中，脂肪酶包括lpl和lpla2。在另一个实施方式中，脂肪酶包括lpl和lp-pla2。在又一个实施方式中，脂肪酶包括lpl和lal。在另一个实施方式中，脂肪酶包括lpla2和lp-pla2。在一个实施方式中，脂肪酶包括lpla2和lal。在另一个实施方式中，脂肪酶包括lp-pla2和lal。在又一个实施方式中，脂肪酶包括plbl2、lpl和lpla2。在又一个实施方式中，脂肪酶包括plbl2、lpl和lp-pla2。在一个实施方式中，脂肪酶包括plbl2、lpl和lal。在另一个实施方式中，脂肪酶包括plbl2、lpla2和lp-pla2。在又一个实施方式中，脂肪酶包括plbl2、lpla2和lal。在又一个实施方式中，脂肪酶包括plbl2、lp-pla2和lal。在一个实施方式中，脂肪酶包括lpl、lpla2和lp-pla2。在另一个实施方式中，脂肪酶包括lpl、lpla2和lal。在又一个实施方式中，脂肪酶包括lpl、lp-pla2和lal。在又一个实施方式中，脂肪酶包括lpla2、lp-pla2和lal。在一个实施方式中，脂肪酶包括plbl2、lpl、lpla2和lp-pla2。在另一个实施方式中，脂肪酶包括plbl2、lpl、lpla2和lal。在又一个实施方式中，脂肪酶包括plbl2、lpl、lp-pla2和lal。在又一个实施方式中，脂肪酶包括plbl2、lpla2、lp-pla2和lal。在又一个实施方式中，脂肪酶包括plbl2、lpl、lpla2、lp-pla2和lal。
[0407]
在某些实施方式中，cho细胞脂肪酶选自plbl2、lpl、lpla2、lp-pla2和lal。在一个实施方式中，cho细胞脂肪酶是plbl2。在另一个实施方式中，cho细胞脂肪酶是lpl。在又一
个实施方式中，cho细胞脂肪酶是lpla2。在一个实施方式中，cho细胞脂肪酶是lp-pla2。在另一个实施方式中，cho细胞脂肪酶是lal。在又一个实施方式中，cho细胞脂肪酶包括两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种、十种或更多种不同的cho细胞脂肪酶。在又另一个实施方式中，cho细胞脂肪酶包括选自plbl2、lpl、lpla2、lp-pla2和lal的两种、三种、四种或五种不同的cho细胞脂肪酶。在一个实施方式中，cho细胞脂肪酶包括plbl2和lpl。在另一个实施方式中，cho细胞脂肪酶包括plbl2和lpla2。在又一个实施方式中，cho细胞脂肪酶包括plbl2和lp-pla2。在又一个实施方式中，cho细胞脂肪酶包括plbl2和lal。在一个实施方式中，cho细胞脂肪酶包括lpl和lpla2。在另一个实施方式中，cho细胞脂肪酶包括lpl和lp-pla2。在又一个实施方式中，cho细胞脂肪酶包括lpl和lal。在另一个实施方式中，cho细胞脂肪酶包括lpla2和lp-pla2。在一个实施方式中，cho细胞脂肪酶包括lpla2和lal。在另一个实施方式中，cho细胞脂肪酶包括lp-pla2和lal。在又一个实施方式中，cho细胞脂肪酶包括plbl2、lpl和lpla2。在另一个实施方式中，cho细胞脂肪酶包括plbl2、lpl和lp-pla2。在一个实施方式中，cho细胞脂肪酶包括plbl2、lpl和lal。在另一个实施方式中，cho细胞脂肪酶包括plbl2、lpla2和lp-pla2。在又一个实施方式中，cho细胞脂肪酶包括plbl2、lpla2和lal。在又一个实施方式中，cho细胞脂肪酶包括plbl2、lp-pla2和lal。在一个实施方式中，cho细胞脂肪酶包括lpl、lpla2和lp-pla2。在另一个实施方式中，cho细胞脂肪酶包括lpl、lpla2和lal。在又一个实施方式中，cho细胞脂肪酶包括lpl、lp-pla2和lal。在又一个实施方式中，cho细胞脂肪酶包括lpla2、lp-pla2和lal。在一个实施方式中，cho细胞脂肪酶包括plbl2、lpl、lpla2和lp-pla2。在另一个实施方式中，cho细胞脂肪酶包括plbl2、lpl、lpla2和lal。在又一个实施方式中，cho细胞脂肪酶包括plbl2、lpl、lp-pla2和lal。在又一个实施方式中，cho细胞脂肪酶包括plbl2、lpla2、lp-pla2和lal。在又一个实施方式中，cho细胞脂肪酶包括plbl2、lpl、lpla2、lp-pla2和lal。
[0408]
在本文提供的各种方法的一些实施方式中，色谱树脂是离子交换(iex)树脂。在其他实施方式中，色谱树脂是疏水相互作用(hic)树脂。在一个实施方式中，iex树脂是阳离子交换(cex)树脂。在另一个实施方式中，cex树脂是混合模式cex树脂。在又一个实施方式中，iex树脂是阴离子交换(aex)树脂。在又一个实施方式中，aex树脂是混合模式aex树脂。
[0409]
在使用cex树脂或混合模式cex树脂的各种方法的某些实施方式中，操作条件的ph低于约6.0。在使用cex树脂或混合模式cex树脂的各种方法的一些实施方式中，操作条件的ph低于约5.5。在使用cex树脂或混合模式cex树脂的各种方法的其他实施方式中，操作条件的ph低于约5.0。在使用cex树脂或混合模式cex树脂的各种方法的其它实施方式中，操作条件的ph为约4.5至约5.5。在使用cex树脂或混合模式cex树脂的各种方法的其它实施方式中，操作条件的ph为约4.5至约5.0。在使用cex树脂或混合模式cex树脂的各种方法的某些实施方式中，操作条件的ph为约5.0至约5.5。在使用cex树脂或混合模式cex树脂的各种方法的一些实施方式中，操作条件的ph为约4.9至约5.3。
[0410]
在使用aex树脂或混合模式aex树脂的各种方法的某些实施方式中，操作条件的ph高于约6.5。在使用aex树脂或混合模式aex树脂的各种方法的一些实施方式中，操作条件的ph高于约6.9。在使用aex树脂或混合模式aex树脂的各种方法的其它实施方式中，操作条件的ph高于约7.2。在使用aex树脂或混合模式aex树脂的各种方法的其它实施方式中，操作条件的ph为约6.9至约7.9。在使用aex树脂或混合模式aex树脂的各种方法的其它实施方式
中，操作条件的ph为约7.2至约7.5。在使用aex树脂或混合模式aex树脂的各种方法的某些实施方式中，操作条件的ph为约7.5至约7.8。
[0411]
在本文提供的各种方法的某些实施方式中，操作条件还包括通过添加盐来调节操作溶液的离子强度和/或电导率。在一个实施方式中，操作条件还包括通过添加盐来调节操作溶液的离子强度。在另一个实施方式中，操作条件还包括通过添加盐来调节操作溶液的电导率。在又一个实施方式中，操作条件还包括通过添加盐来调节操作溶液的离子强度和电导率。在一些实施方式中，加入盐的效果是达到期望的logα。在其它实施方式中，加入盐的效果是达到期望的脂肪酶log k
p
。在其他实施方式中，添加盐的效果是达到期望的logα和脂肪酶期望的log k
p
。
[0412]
在一些实施方式中，操作溶液中的盐选自氯化钠、乙酸钠、磷酸钠、硫酸铵、硫酸钠和tris-hcl。在一个实施方式中，盐是氯化钠。在另一个实施方式中，盐是乙酸钠。在又一个实施方式中，盐是磷酸钠。在另一个实施方式中，盐是硫酸铵。在一个实施方式中，盐是硫酸钠。在另一个实施方式中，盐是tris-hcl。
[0413]
在一个具体实施方式中，操作溶液中氯化钠的浓度为约100mm至约225mm，色谱树脂为cex，并且操作条件的ph为约5.0至约6.0。
[0414]
在另一个具体实施方式中，操作溶液中氯化钠的浓度为约150mm至约180mm，色谱树脂为cex，并且操作条件的ph为约5.0至约6.0。
[0415]
在又一个具体实施方式中，操作溶液中乙酸钠的浓度为约100mm至约200mm，色谱树脂为aex；操作条件的ph为约6.9至约7.8。
[0416]
在又一个具体实施方式中，操作溶液中硫酸钠的浓度为约500mm至约620mm，色谱树脂为hic，并且操作条件的ph为约7。
[0417]
在又一个具体实施方式中，操作溶液中硫酸钠的浓度为约510mm至约560mm，色谱树脂为hic，并且操作条件的ph为约7。
[0418]
再在另一个方面中，本文提供了一种改善抗-ctla4抗体或其抗原结合片段制剂中ps-80稳定性的方法，其包括：
[0419]
(a)使包含抗-ctla4抗体或其抗原结合片段的加样流体通过混合模式aex树脂；
[0420]
(b)收集流过物中的抗-ctla4抗体或其抗原结合片段；和
[0421]
(c)配制抗-ctla4抗体或其抗原结合片段，使得抗-ctla4抗体或其抗原结合片段制剂是含ps-80的溶液；
[0422]
其中加样流体的ph为约ph 7.2至约ph 7.6，并且其中加样流体不包含盐。
[0423]
在另一个方面中，本文提供了制备抗-ctla4抗体或其抗原结合片段制剂的方法，其包括：
[0424]
(a)使包含抗-ctla4抗体或其抗原结合片段的加样流体通过混合模式aex树脂；
[0425]
(b)收集流过物中的抗-ctla4抗体或其抗原结合片段；和
[0426]
(c)在包含ps-80的溶液中配制从步骤(b)获得的抗-ctla4抗体或其抗原结合片段，其中6个月后平均ps80降解小于或等于10％。
[0427]
在又一个实施方式中，使用各种方法通过完整ps-80分子的量和/或降解产物的量来测量ps80降解，所述方法包括但不限于质谱(ms)、液相色谱-质谱(lcms)或在具有带电气溶胶检测器(cad)的hplc系统上的固相萃取(spe)。
[0428]
在另一个方面中，本文提供了一种改善抗-ctla4抗体或其抗原结合片段制剂中ps-80稳定性的方法，其包括：
[0429]
(a)使包含抗-ctla4抗体或其抗原结合片段的加样流体通过cex树脂；
[0430]
(b)用洗脱溶液从cex树脂洗脱抗-ctla4抗体或其抗原结合片段；和
[0431]
(c)配制抗-ctla4抗体或其抗原结合片段，使得抗-ctla4抗体或其抗原结合片段制剂是包含ps-80的溶液；
[0432]
其中洗脱溶液的ph为约ph 4.9至约ph 5.3，并且其中洗脱溶液还包含约120mm至约175mm氯化钠。
[0433]
在一个实施方式中，改善抗-ctla4抗体或其抗原结合片段制剂中ps-80稳定性的方法包括：
[0434]
(a)使包含抗-ctla4抗体或其抗原结合片段的加样流体通过cex树脂；
[0435]
(b)用洗脱溶液从cex树脂洗脱抗-ctla4抗体或其抗原结合片段；和
[0436]
(c)配制抗-ctla4抗体或其抗原结合片段，使得抗-ctla4抗体或其抗原结合片段制剂是包含ps-80的溶液；
[0437]
其中洗脱溶液的ph为约ph 5.1，并且其中洗脱溶液还包含约150mm氯化钠。
[0438]
在另一个实施方式中，改善抗-ctla4抗体或其抗原结合片段制剂中ps-80稳定性的方法包括：
[0439]
(a)使包含抗-ctla4抗体或其抗原结合片段的加样流体通过cex树脂；
[0440]
(b)用洗脱溶液从cex树脂洗脱抗-ctla4抗体或其抗原结合片段；和
[0441]
(c)配制抗-ctla4抗体或其抗原结合片段，使得抗-ctla4抗体或其抗原结合片段制剂是包含ps-80的溶液；
[0442]
其中洗脱溶液的ph为约ph 5.1，并且其中洗脱溶液还包含约165mm氯化钠。
[0443]
仍然在另一个方面中，本文提供了一种改善抗-ctla4抗体或其抗原结合片段制剂中ps-80稳定性的方法，其包括：
[0444]
(a)使包含抗-ctla4抗体或其抗原结合片段的加样流体通过cex树脂；
[0445]
(b)用洗脱溶液从cex树脂洗脱抗-ctla4抗体或其抗原结合片段；和
[0446]
(c)配制抗-ctla4抗体或其抗原结合片段，使得抗-ctla4抗体或其抗原结合片段制剂是包含ps-80的溶液；
[0447]
其中洗脱溶液的ph为约ph 5.0至约ph 5.4，并且其中洗脱溶液还包含约150mm至约275mm氯化钠。
[0448]
在一个实施方式中，改善抗-ctla4抗体或其抗原结合片段制剂中ps-80稳定性的方法包括：
[0449]
(a)使包含抗-ctla4抗体或其抗原结合片段的加样流体通过cex树脂；
[0450]
(b)用洗脱溶液从cex树脂洗脱抗-ctla4抗体或其抗原结合片段；和
[0451]
(c)配制抗-ctla4抗体或其抗原结合片段，使得抗-ctla4抗体或其抗原结合片段制剂是包含ps-80的溶液；
[0452]
其中洗脱溶液的ph为约ph 5.1，并且其中洗脱溶液还包含约200mm氯化钠。
[0453]
在另一个实施方式中，改善抗-ctla4抗体或其抗原结合片段制剂中ps-80稳定性的方法包括：
[0454]
(a)使包含抗-ctla4抗体或其抗原结合片段的加样流体通过cex树脂；
[0455]
(b)用洗脱溶液从cex树脂洗脱抗-ctla4抗体或其抗原结合片段；和
[0456]
(c)配制抗-ctla4抗体或其抗原结合片段，使得抗-ctla4抗体或其抗原结合片段制剂是包含ps-80的溶液；
[0457]
其中洗脱溶液的ph为约ph 5.1，并且其中洗脱溶液还包含约250mm氯化钠。
[0458]
在本文提供的各种方法的更多实施方式中，加样流体是来自先前色谱方法的洗脱液。在一个实施方式中，先前的色谱方法包括亲和色谱。在另一个实施方式中，先前的色谱方法包括亲和色谱，然后是非亲和色谱。在另一个实施方式中，亲和色谱是蛋白a色谱。在另一个实施方式中，非亲和色谱是aex色谱。在又另一个实施方式中，先前的色谱方法包括蛋白a色谱，然后是aex色谱。
[0459]
在另一个方面中，本文提供了一种改善抗-ctla4抗体或其抗原结合片段制剂中ps-80稳定性的方法，其包括：
[0460]
(a)使包含抗-ctla4抗体或其抗原结合片段的加样流体通过cex树脂；
[0461]
(b)用洗脱溶液从cex树脂洗脱抗-ctla4抗体或其抗原结合片段；和
[0462]
(c)配制抗-ctla4抗体或其抗原结合片段，使得抗-ctla4抗体或其抗原结合片段制剂是包含ps-80的溶液；
[0463]
其中洗脱溶液的ph为约ph 4.9至约ph 5.4，并且其中洗脱溶液的电导率为约15ms/cm至约21ms/cm。
[0464]
在另一个方面中，本文提供了一种改善抗-ctla4抗体或其抗原结合片段制剂中ps-80稳定性的方法，其包括：
[0465]
(a)使包含抗-ctla4抗体或其抗原结合片段的加样流体通过cex树脂；
[0466]
(b)用洗脱溶液从cex树脂洗脱抗-ctla4抗体或其抗原结合片段；和
[0467]
(c)配制抗-ctla4抗体或其抗原结合片段，使得抗-ctla4抗体或其抗原结合片段制剂是包含ps-80的溶液；
[0468]
其中洗脱溶液的ph为约ph 4.9至约ph 5.4，并且其中洗脱溶液还包含约135mm至约195mm氯化钠。
[0469]
8.药物组合物
[0470]
本公开还提供了包含治疗性蛋白(例如，单克隆抗体)和少量hcp(例如，脂肪酶)的药物组合物(例如，药物物质或药品)。
[0471]
在某些实施方式中，药物组合物包含治疗性蛋白和小于1ppm的宿主细胞脂肪酶。在其他实施方式中，药物组合物包含治疗性蛋白和小于0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8或0.9ppm的宿主细胞脂肪酶。在一个实施方式中，药物组合物包含治疗性蛋白和小于0.1ppm的宿主细胞脂肪酶。在另一个实施方式中，药物组合物包含治疗性蛋白和小于0.2ppm的宿主细胞脂肪酶。在又另一个实施方式中，药物组合物包含治疗性蛋白和小于0.3ppm的宿主细胞脂肪酶。仍然在另一个实施方式中，药物组合物包含治疗性蛋白和小于0.4ppm的宿主细胞脂肪酶。仍在另一个实施方式中，药物组合物包含治疗性蛋白和小于0.5ppm的宿主细胞脂肪酶。在一个实施方式中，药物组合物包含以及小于0.6ppm的宿主细胞脂肪酶。在另一个实施方式中，所述药物组合物包含治疗性蛋白和小于0.7ppm的宿主细胞脂肪酶。在又另一个实施方式中，所述药物组合物包含治疗性蛋白和小于0.8ppm的宿主
细胞脂肪酶。再在另一个实施方式中，药物组合物包含治疗性蛋白和小于0.9ppm的宿主细胞脂肪酶。
[0472]
在本文所述药物组合物的各个实施方式中，通过液相色谱-质谱(lc-ms)测量宿主细胞脂肪酶的水平。
[0473]
在某些实施方式中，药物组合物是来自使用选自以下的洗脱溶液的cex色谱的洗脱液：
[0474]
(a)ph为约4.9至约5.3的洗脱溶液，其包含约120mm至约175mm氯化钠；
[0475]
(b)ph为约5.1的洗脱溶液，其包含约150mm氯化钠；
[0476]
(c)ph为约5.1的洗脱溶液，其包含约165mm氯化钠；
[0477]
(d)ph为约4.9至约5.4且电导率为约15ms/cm至约21ms/cm的洗脱溶液；
[0478]
(e)ph为约4.9至约5.4的洗脱溶液，其包含约135mm至约195mm氯化钠；
[0479]
(f)ph为约ph 5.0至约ph 5.4的洗脱溶液，其包含约150mm至约275mm氯化钠；
[0480]
(g)ph为约5.1的洗脱溶液，其包含约200mm氯化钠；和
[0481]
(h)ph为约5.1的洗脱溶液，其包含约250mm氯化钠。
[0482]
在一个实施方式中，药物组合物是来自cex色谱的洗脱液，其使用ph为约4.9至约5.3，包含约120mm至约175mm氯化钠的洗脱溶液。
[0483]
在另一个实施方式中，药物组合物是来自cex色谱的洗脱液，其使用ph为约5.1，包含约150mm氯化钠的洗脱溶液。
[0484]
在又一个实施方式中，药物组合物是来自cex色谱的洗脱液，其使用ph为约5.1，包含约165mm氯化钠的洗脱溶液。
[0485]
在又一个实施方式中，药物组合物是来自cex色谱的洗脱液，其使用ph为约4.9至约5.4且电导率为约15ms/cm至约21ms/cm的洗脱溶液。
[0486]
在一个实施方式中，药物组合物是来自cex色谱的洗脱液，其使用ph为约4.9至约5.4，包含约135mm至约195mm氯化钠的洗脱溶液。
[0487]
在另一个实施方式中，药物组合物是来自cex色谱的洗脱液，其使用ph为约ph 5.0至约ph 5.4，包含约150mm至约275mm氯化钠的洗脱溶液。
[0488]
在又一个实施方式中，药物组合物是来自cex色谱的洗脱液，其使用ph为约5.1，包含约200mm氯化钠的洗脱溶液。
[0489]
在又另一个实施方式中，药物组合物是来自cex色谱的洗脱液，其使用ph为约5.1，包含约250mm氯化钠的洗脱溶液。
[0490]
在药物组合物的一些实施方式中，cex色谱之前是以流出物模式操作的aex色谱。
[0491]
在药物组合物的某些实施方式中，脂肪酶选自plbl2、lpl、lpla2、lp-pla2和lal。在一个实施方式中，脂肪酶是plbl2。在另一个实施方式中，脂肪酶是lpl。在又一个实施方式中，脂肪酶是lpla2。在一个实施方式中，脂肪酶是lp-pla2。在另一个实施方式中，脂肪酶是lal。在又一个实施方式中，脂肪酶包括两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种、十种或更多种不同的脂肪酶。在又一个实施方式中，脂肪酶包括选自plbl2、lpl、lpla2、lp-pla2和lal的两种、三种、四种或五种不同的脂肪酶。在一个实施方式中，脂肪酶包括plbl2和lpl。在另一个实施方式中，脂肪酶包括plbl2和lpla2。在又一个实施方式中，脂肪酶包括plbl2和lp-pla2。在又一个实施方式中，脂肪酶包括plbl2和lal。在一个实施方式中，脂肪
酶包括lpl和lpla2。在另一个实施方式中，脂肪酶包括lpl和lp-pla2。在又一个实施方式中，脂肪酶包括lpl和lal。在另一个实施方式中，脂肪酶包括lpla2和lp-pla2。在一个实施方式中，脂肪酶包括lpla2和lal。在另一个实施方式中，脂肪酶包括lp-pla2和lal。在又一个实施方式中，脂肪酶包括plbl2、lpl和lpla2。在另一个实施方式中，脂肪酶包括plbl2、lpl和lp-pla2。在一个实施方式中，脂肪酶包括plbl2、lpl和lal。在另一个实施方式中，脂肪酶包括plbl2、lpla2和lp-pla2。在又一个实施方式中，脂肪酶包括plbl2、lpla2和lal。在又一个实施方式中，脂肪酶包括plbl2、lp-pla2和lal。在一个实施方式中，脂肪酶包括lpl、lpla2和lp-pla2。在另一个实施方式中，脂肪酶包括lpl、lpla2和lal。在又一个实施方式中，脂肪酶包括lpl、lp-pla2和lal。在又一个实施方式中，脂肪酶包括lpla2、lp-pla2和lal。在一个实施方式中，脂肪酶包括plbl2、lpl、lpla2和lp-pla2。在另一个实施方式中，脂肪酶包括plbl2、lpl、lpla2和lal。在又一个实施方式中，脂肪酶包括plbl2、lpl、lp-pla2和lal。在又一个实施方式中，脂肪酶包括plbl2、lpla2、lp-pla2和lal。在又一个实施方式中，脂肪酶包括plbl2、lpl、lpla2、lp-pla2和lal。
[0492]
在药物组合物的其他实施方式中，治疗性蛋白是单克隆抗体。
[0493]
vi.实施例
[0494]
本节(第vi节)中的实施例是以说明的方式提供的，而不是以限制的方式提供的。
[0495]
实施例1：用于确定不同物质的k
p
的方法
[0496]
通过将已知液体浓度的蛋白质(或其他目的分子)与已知体积的色谱树脂混合并计算与树脂结合的蛋白质和保留在液体中的蛋白质的比率来确定分配系数k
p
：k
p
＝q/c＝[结合的]/[游离的]。
[0497]
对于所有随后的实施例，色谱体积为20μl，液体体积为200μl，蛋白质浓度为0.5mg/ml。对于5mg/ml的有效树脂负载量，这些体积提供10:1的相比。
[0498]
通过在96孔滤板(p/n msbvn1250，millipore sigma，burlington，ma)中剧烈混合树脂和液体进行筛选，通过真空过滤分离树脂和液体。步骤顺序如下：
[0499]
(a)3
×
平衡(不含进料的缓冲剂)，每个步骤孵育10min；
[0500]
(b)1
×
进料混合，60min温育；和
[0501]
(c)2x洗提条件，每个步骤孵育10min
[0502]
平衡步骤允许从初始树脂浆料缓冲剂交换缓冲剂。进料混合的60min时间允许在给定的一组条件下树脂配体和蛋白质之间的假平衡。通过280-320nm处的uv吸光度测量来自进料步骤的滤液，以确定蛋白质的最终液体浓度，c。通过大约c的质量平衡和已知的进料浓度c0(0.5mg/ml)确定蛋白质的结合浓度q。
[0503]
分配通常以log k
p
报告，其可以使用本文所述的uv方法从约0至2精确定量。log k
p
筛选的一般规则如下：
[0504]
log k
p
≥1.5，与树脂强结合；
[0505]
log k
p
《1，预期洗脱将用于结合-洗脱模式的条件；
[0506]
0.5《log k
p
《1，将显示一些结合的弱相互作用条件；
[0507]
log k
p
《0.5，非常少或没有结合。
[0508]
不同物质之间的log k
p
值也用于通过计算分离因子α来预测不同物质的分离，如下：α＝k
p,蛋白质1
/k
p,蛋白质2
；logα＝log k
p,蛋白质1-log k
p,蛋白质2
，其中logα远离0表示更好的分离。
在以下实施例中，α＝k
p,脂肪酶
/k
p,mab
；logα＝log k
p,脂肪酶-log k
p,mab
。logα大于0.5指示脂肪酶和单克隆抗体之间的良好分离。
[0509]
实施例2：在典型操作条件下plbl2和mab k
p
值的比较
[0510]
测定k
p
和α的方法用于评估在针对两种单克隆抗体mab1和mab2的操作条件下通过各种色谱方法分离已知脂肪酶杂质plbl2的能力。表1总结了在针对mab1的几种操作条件下mab1和plbl2的log k
p
和logα值。
[0511]
表1.在针对mab1的操作条件下mab1和plbl2的log k
p
和logα值
[0512][0513][0514]
表1显示了通过色谱方法从mab1分离plbl2的潜在操作条件。
[0515]
对于蛋白a方法，plbl2没有亲和力，因此预期大多数plbl2在加样或洗涤步骤期间流过蛋白a树脂。池中存在的唯一plbl2可能来自洗涤不足或与mab1缔合。
[0516]
对于以对于mab1的流过模式操作的aex过程，在加样和洗涤条件下，与mab1相比，plbl2显示出更强的结合(更高的log k
p
)。这导致在这些条件下logα大于1.0，这表明plbl2将在这些条件下保持与树脂结合，而mab1将流过。
[0517]
对于cex方法，与mab1相比，plbl2对盐调节显示出较低的敏感性，并且在盐范围的较高端具有较高的log k
p
。在中心点和高盐限处大于1.0的logα指示plbl2将在mab1洗脱期间保持结合。低盐限为plbl2与mab1的分离提供了远为不利的logα，预期其在这些条件下保
留一些结合(log k
p,mab1
为1.5)。
[0518]
表2总结了在针对mab2的几种操作条件下mab2和plbl2的log k
p
和logα值。
[0519]
表2.在针对mab2的处理条件下mab2和plbl2的log k
p
和logα值
[0520][0521]
表2显示了通过色谱方法将plbl2与mab2分离的潜在操作条件。
[0522]
mab2对于蛋白a和cex方法的趋势与mab1的趋势非常相似，其中mab2在蛋白a洗脱期间显示出略微更强的结合，并且在cex洗脱期间显示出更弱的结合。对于cex方法，mab2在较低盐下具有较低的结合，因此在整个盐范围内具有更稳健的logα。
[0523]
实施例3：对于不同树脂在一系列条件下plbl2和lpla2 k
p
值的作图
[0524]
进行广泛的作图以确定plbl2和lpla2对于可能潜在地用于下游操作的各种树脂以及不同缓冲剂和条件的分配系数(表3)。组合测试盐和ph条件。plbl2和lpla2 k
p
的综合作图可提供预测用已知mab纯化条件或待探索的条件分离plbl2或lpla2的基础。
[0525]
表3.针对绘制plbl2或lpla2 logk
p
筛选的条件。
[0526][0527]
3.1aex色谱法
[0528]
aex色谱的一组条件列于表3中，并且对于plbl2在图1a-1c中描绘，和对于使用poros 50hq树脂的lpla2在图1d-1f中描绘。第一缓冲剂组合代表在蛋白a和低ph保持步骤之后的流过模式中的aex加样步骤通常可见的范围内的缓冲剂混合物(图1a和图1b)。在这些条件下，乙酸盐充当抗衡离子以竞争结合，并且以适当的量添加tris碱以控制ph。plbl2即使在》100mm乙酸盐添加下也显示出强的相互作用，在约140mm乙酸盐下观察到log k
p
大为约1，推测在较高的乙酸盐浓度下log k
p
继续下降(图1d)。在ph 7.0-7.5范围内观察到很小的差异(图1a)。lpla2显示出与乙酸盐相似的趋势，但也显示出对ph的更强依赖性，其中在较高ph下观察到更强的结合(图1d)。
[0529]
另外两种aex条件代表可用于aex平衡和洗涤步骤的缓冲剂(tris和磷酸盐)。nacl盐调节的使用为在先盐洗脱(例如，从cex)之后的aex过程提供了可能的条件。在tris缓冲剂中(图1b和1e)，plbl2保持强烈结合(log k
p
》1.5)直至约50mm nacl添加，在高于大约100mm nacl下，log k
p
下降至低于1。lpla2表现相似，但保持不太强烈，其中log k
p
》1.5直至约30mm nacl，并且在高于约75mm nacl下log k
p
《1。磷酸盐比tris更强烈地防止plbl2和lpla2相互作用(图1c和1f)；没有任一种用脂肪酶筛选的条件提供了log k
p
》1.5，并且在每种情况下在约40mm nacl下log k
p
降至1以下。在测试的范围内对于任一缓冲剂ph几乎没有影响。
[0530]
3.2cex色谱
[0531]
cex色谱的一组条件列于表3中并对于poros 50hs树脂描绘于图2a-2c中。
[0532]
第一组合代表通常可用于mab结合和洗脱的ph和盐范围，使用nacl调节用于洗脱(图2a和2c)。在这种情况下，对于plbl2，nacl具有强烈的作用，在250mm nacl以上没有观察到结合，并且在150mm nacl附近log k
p
值为1(图2a)。ph也具有显著影响，其中在较低ph下，
特别是接近ph5.0，log k
p
增加。lpla2对于ph和盐调节表现出类似的趋势，但在200-250mm nacl之间具有显著更强的保留，log k
p
值为1(图2c)。
[0533]
第二组合代表其中使用ph调节结合的条件，通常在低得多的盐条件下(图2b)。在这种情况下，仅在ph 5.5以下观察到高于1.5的log k
p
的强plbl2结合，并且log k
p
值在约ph 5.8以上下降至低于1。这里测试的盐条件对这些ph值下的分配几乎没有影响。使用高达ph 6.0的乙酸盐缓冲剂，并且使用磷酸盐缓冲剂缓冲较高ph条件。
[0534]
3.3hic
[0535]
通过在20mm磷酸钠(ph 7.0)的缓冲条件下调节硫酸钠浓度进行plbl2和lpla2分配至hic树脂tosoh butyl-650m的测试(表3，图3)。两种脂肪酶均显示出典型的hic行为，在高盐下具有强结合(对于plbl2在高于250mm硫酸钠下和对于lpla2在高于400mm硫酸钠下，log k
p
》1.5)，并且在较低盐下分配降低(对于plbl2在150mm硫酸钠以下和对于lpla2在200mm硫酸钠以下log k
p
《1)。
[0536]
3.4多模色谱
[0537]
还在两种多模色谱树脂上测试plbl2的分配：多模aex树脂capto adhere和多模cex树脂capto mmc(表3，图4a和4b)。对于capto adhere，在所有测试条件下log k
p
值大于1.9，表明在宽范围的操作条件下的强结合(图4a)。对于capto mmc，主要通过宽得多的盐范围内的ph变化来调节结合(图4b)。在约ph5.8以下观察到log k
p
高于1.5的强结合范围。仅在高盐添加下在约5.9的ph以上观察到log k
p
小于1的较弱结合范围。
[0538]
实施例4：将plbl2与igg1 mab、mab3分离的条件的优化
[0539]
使用实施例3中为plbl2提供的分配图谱来优化plbl2与igg1mab、mab3的分离。mab3的性能针对蛋白a过程类似于mab1。在蛋白a加载条件下观察到mab3的强结合(数据未显示)。
[0540]
4.1aex色谱法
[0541]
对于poros hq树脂，在20cm床高下使用的柱大约为7ml体积。mab3进料在ph 7.5的tris和乙酸盐混合物中的浓度为13.5mg/ml，其中乙酸根抗衡离子为约110mm。在这种条件下，mab3 log k
p
接近于零，而plbl2 log k
p
约为1.4(图1a)，表明mab3不与树脂结合但plbl2将在一定程度上与树脂结合。该过程以流过模式运行，并且色谱图表明非常少的与柱结合的mab3(图5)。在qe hf-x系统上使用质谱法对不同级分中的plbl2进行定量，其中将已知的plbl2肽用于校准浓度。进料中plbl2的浓度为77ppm。流过物中的plbl2浓度为9ppm。洗提中plbl2的浓度为3841ppm。检测的量表明超过85％的plbl2从流出物池中的mab3中除去。洗提池中的大量plbl2表明脂肪酶在流出条件下与树脂结合，如通过1.4的log k
p
值预测的，并且在1m nacl高盐洗提条件下洗脱，也通过0的log k
p
值预测。
[0542]
因此，蛋白a和aex代表了有前景的在常见操作条件下除去plbl2的步骤，在流过模式下，在蛋白a加样期间logα值为-2，在aex加样期间logα值为约1.5。对于proa，用lpla2可以实现类似的α值，并且对于流过模式中的aex加样，甚至可以实现高达约1.7的更好的分离。
[0543]
对于mab3，还需要蛋白a和aex方法之外的额外清除，因此在与实施例3中用于plbl2和lpla2的条件类似的条件下产生log k
p
图谱。然后使用这些log k
p
值计算筛选范围内的logα，以鉴定最大分离的条件。
[0544]
4.2cex色谱法
[0545]
在表3中列出的条件下，使用poros 50hs树脂的cex色谱分离的条件描绘为logα值，对于plbl2，在图6a和6b中，和对于lpla2，在图6c中。为了用盐调节结合，plbl2的最佳分离条件在ph 5-5.2和200-225mm nacl之间，其中logα值为约0.4(图6a，黑框)。由于logα为正的，mab3的结合不如plbl2强，表明在这些条件下，mab3将从树脂洗脱，而plbl2可能保持结合。优化的区域代表稍微窄的ph和盐范围，并且不具有特别高的logα。对于该方法，仍然可能需要使用传统柱色谱进行确认。
[0546]
如图6c所示，lpla2和mab3在这些cex条件下的分离大得多。虽然优化的范围与plbl2类似，但在200-250mm nacl和ph 5.0-5.3的条件下，lpla2和mab3的α值大于1。
[0547]
与盐调节相反，通过ph改变结合产生了大约-0.6的负logα值(图6b，黑框)。涵盖约ph 6.0-6.6和小于20mm nacl的区域代表其中mab3比plbl2更强地与树脂结合的条件。因此，这些条件可用作中间洗涤，其中可在较高ph(和/或较高盐)下洗脱mab3前除去plbl2。
[0548]
为了评估另外的cex方法是否可以在实施例4.1中指定的加样操作条件下以流过模式操作的aex方法后进一步将plbl2和lpla2与mab3分离，将aex流过物池加载到含有poros hs树脂的cex柱上，以结合-洗脱模式操作，其中洗脱条件为ph 5.1和165mm nacl。在这个洗脱操作条件下，plbl2的logα为0.2(图6a)，并且lpla2的logα为0.9(图6c)。虽然这些logα值小于约200mm nacl的最佳范围内的值，但正值仍然表明脂肪酶在该洗脱条件下将更强地结合树脂，特别是对于lpla2。质谱分析显示了cex进料中的plbl2为5ppm，但cex洗脱池中的plbl2降至0.3ppm。洗脱池中的lpla2低于检测限(数据未显示)。这些结果表明，在指定的洗脱操作条件下，在以流过模式运行aex方法后，另外的cex方法可以进一步将plbl2与mab3分离。
[0549]
4.3hic
[0550]
还在表3中列出的条件下在hic树脂tosoh butyl-650m(图7)上比较了mab3和脂肪酶的分配。改变硫酸钠浓度在mab3和plbl2之间提供了很少的分离，其中仅300mm硫酸钠在该条件下提供任何分离，logα为约0.3。lpla2在300-400mm硫酸钠之间提供了稍微更好的分离，其中logα为约0.5。相比之下，mab2比mab3、plbl2或lpla2疏水性低得多，且因此直到大于600mm硫酸钠才转变为高于1.5的log k
p
与hic树脂的强结合。对于mab2和plbl2，可以在300-500mm硫酸钠之间实现1.5-2.0的logα值，这是一种非常宽的盐范围，具有有前景的用于在该范围内操作的分离能力。类似地对于lpla2，在该相同的盐范围内观察到大于1的logα值。
[0551]
4.4多模色谱
[0552]
最后，在表3中列出的条件下，针对不同的多模树脂、多模aex树脂capto adhere(图8a)和多模cex树脂capto mmc(图8b)，比较mab3和plbl2的分配。
[0553]
对于capto adhere，plbl2在所有条件下强烈结合(图4a)，而mab3表现出在较高盐下具有更强分配的疏水相互作用。所得的logα图显示在低盐下在ph 7.3-7.6的条件下最高的分离因子(logα》0.8)，其中mab3结合最低(图8a)。这些条件可用于mab3洗脱或流过，同时保持plbl2与capto adhere树脂结合。
[0554]
对于筛选的条件，capto mmc不提供与capto adhere相同的mab3和plbl2分离水平。在ph 5.9-6.0和高于300mm nacl下观察到最佳条件，其中观察到logα值高达0.3。因为
logα大于零，所以这些条件可用于mab3洗脱，同时维持plbl2结合(图8b)。在较高的ph和/或较高的盐下，更宽或更有利的分离条件组可以是可能的，因为在这个筛选中在两个因素的上限处看到最佳范围。
[0555]
实施例5：单克隆抗体mab4(mk-1308，抗ctla4抗体)的cex操作条件的优化
[0556]
如表4所示，在cex实验设计(doe)中研究了五个因素。使用可变量的三水合乙酸钠、4m乙酸和氯化钠调节洗脱缓冲剂ph和电导率。使用1m tris、1m乙酸和1m氯化钠调节加样ph和电导率。
[0557]
表4.待研究的cex doe因素
[0558][0559]
doe设计达到总共40次运行，如表5所示。每种洗脱缓冲剂制备两次，中心点洗脱缓冲剂制备三次。
[0560]
表5.cex doe运行
[0561]
[0562][0563]
根据表6中的步骤在7ml色谱柱上操作每次运行。收集每次运行的洗脱池和洗提用于产率和质量分析。
[0564]
表6.cex操作步骤
[0565]
[0566][0567]
将每次运行的洗脱池和洗提进行残留hcp elisa分析。发现洗脱缓冲剂ph和电导率对残留hcp elisa结果具有最大影响(图9)。
[0568]
因此，通过液相色谱-质谱(lc-ms)进一步分析基于洗脱缓冲剂条件的特定运行(参见表7)。由于材料限制，将具有相同洗脱缓冲剂条件的一些运行的池和洗提组合(例如，以下的10&13)。
[0569]
表7.用于lcms分析提交的cex doe池和洗提
[0570]
[0571][0572]
*平均值：运行11具有加样条件：ph 5.3，条件4ms/cm@50g/l加样
[0573]
运行24具有加样条件：ph 4.9，条件4ms/cm@30g/l加样
[0574]
基于已知肽序列的数据库搜索，lc-ms结果表明了所有测试样品的cex池中不存在脂肪酶。通过掺加范围为500amole至50pmole的48种不同的人蛋白质(6至83kda)来评估1mg ds中lc-ms的检测限。对于低至0.6ppm掺加的蛋白质，鉴定了至少两种独特的肽(数据未显示)。
[0575]
在每个cex洗提样品中鉴定并相对定量五种脂肪酶，包括磷脂酶b样2(plbl2)、脂蛋白脂肪酶(lpl)、磷脂酶a2 xv(lpla2)、磷脂酶a2 vii(lp-pla2)和溶酶体酸性脂肪酶a(lal/lipa)(参见表8)。这些结果表明在测试的洗脱缓冲剂范围内脂肪酶与cex树脂的强结合(ph 4.9-5.4，电导率15-21ms/cm，其对应于135-195mm的氯化钠浓度)。
[0576]
表8.mab4 cex洗提中内源性脂肪酶的相对定量
[0577][0578][0579]
为了证实ps-80稳定性在洗脱缓冲剂设计空间中的改善，进行了ps-80稳定性研究。为了具有足够的mab质量用于稳定性研究，将来自表5的不同运行(但相同的洗脱缓冲剂条件)的cexp通过相等的mab质量比(1:1)组合并配制。在5
±
3℃和25
±
3℃下对组合的cexp运行进行ps-80稳定性研究，分别持续24周和16周(图13)。这个研究证明了对于所有测试的cexp样品，在研究期间稳定的ps-80(《20％ps-80降解)，而阳性对照aexp在25
±
3℃下16周后降解约30％。cex洗脱缓冲剂ph 5.1
±
0.2和电导率18
±
2ms/cm的操作空间对于改善cexp中的ps-80稳定性是明显稳健的，并因此改善ds。
[0580]
实施例6：随着去除宿主细胞脂肪酶，ps-80稳定性增加
[0581]
通过在指定温度下在指定时间内测量含有ps80的溶液的ps-80浓度来评估ps-80稳定性。ps-80浓度的显著变化被定义为与时间零点结果相比，在
±
0.02mg/ml ps-80浓度范围之外的两个连续结果(即，测定变异性)。
[0582]
mab4药物物质(ds)是通过配制步骤制备的含ps-80的溶液，所述配制步骤需要分开添加49％(w/w)蔗糖和85mm甲硫氨酸储备溶液和10％(w/w)ps-80储备溶液以在10mm组氨酸缓冲剂(ph5.5)、10mm甲硫氨酸、7％(w/v)蔗糖和0.02％(w/v)ps-80中实现50mg/ml的mab4的最终ds浓度。
[0583]
在由双柱和三柱纯化方案产生的两种mab4 ds样品之间比较ps-80稳定性。双柱纯化方案包括蛋白a和aex。将得到的aex池(aexp)配制成ds，并称为“aexp ds”。三柱纯化方案包括蛋白a、aex和cex。将得到的cex池(cexp)配制成ds，并称为“cexp ds”。此外，在整个研究中使用含有相同ds制剂但不含蛋白质的安慰剂作为阴性对照。
[0584]
将安慰剂、aexp ds和cexp ds以2.2ml填充体积填充到单独的玻璃小瓶中，并用橡胶塞盖住以模拟药品的储存。将小瓶置于以下稳定室中：
[0585]
·
5℃
±
3℃
[0586]
·
25℃
±
3℃，60％
±
5％相对湿度(rh)
[0587]
·
40℃
±
2℃，75％
±
5％相对湿度(rh)
[0588]
抽取样品并以2周的间隔测试ps-80浓度，直至12周和6个月(26周)。
[0589]
如图10a所示，在5℃下，aexp ds中的ps-80浓度从0.21(0周)降至0.18mg/ml(12周)。ps-80的降解随着储存温度的升高而增加。例如，在25℃下，aexp ds中的ps-80浓度从0.21(0周)降至0.18mg/ml(4周)和0.15mg/ml(26周)(图10b)；在40℃下，aexp ds中的ps-80浓度从0.21(0周)降至0.17mg/ml(2周)和0.09mg/ml(26周)(图10c)。另一方面，在所有三种不同温度下，cexp ds中的ps-80浓度不随时间显著变化，这与安慰剂相当。
[0590]
与这个ps-80稳定性研究平行，通过液相色谱-质谱(lc-ms)测试相同批次的过程中中间体以及相应的色谱洗提样品的脂肪酶鉴定(表9)。plbl2和lpl在aexp中发现，但在cexp中不存在。plbl2和lpl都存在于aex洗提和cex洗提中，表明脂肪酶与树脂的强结合。因此，假设aexp中plbl2和lpl的存在可能是aexp ds中在5-40℃下ps-80浓度下降的一个潜在原因。添加第三cex柱可以有效地除去这些脂肪酶并改善cexp ds中的ps-80稳定性。
[0591]
表9.mab4过程中间体中的内源性plbl2和lpl的相对定量
[0592]
[0593][0594]
将来自仅利用两个色谱步骤(蛋白a和aex)的四个mab4纯化批次的ds在-40℃、5℃和25℃下进行稳定性研究长达六个月(图11a)。在25℃下的平均ps80降解在仅1个月后为约20％，在6个月后为约45％。将来自利用三个色谱步骤(蛋白a、aex和cex)的三个mab4纯化批次的ds在-40℃、5℃和25℃下进行稳定性研究长达六个月(图11b)。6个月后，在25℃下的平均ps80降解不超过10％。这些结果进一步支持cex去除杂质(如脂肪酶)并改善ps-80稳定性的主张。
[0595]
为了确定在整个过程中是否可以跳过aex步骤，将蛋白a步骤后的材料，特别是过滤的中和病毒灭活池(fnvtp)加样到cex柱上。将得到的cex池配制成ds并命名为“fnvip-cexp ds”。此外，将cex洗提中鉴定的一种脂肪酶lpla2以两种浓度5ppm和50ppm掺加到ds中，作为阳性脂肪酶对照。将这些ds样品以及来自蛋白a池(pap)、fnvip、aexp、安慰剂(不含ds的相同制剂)和三柱纯化过程(蛋白a、aex和cex)的ds置于5℃和40℃下进行稳定性研究(图12)。在40℃下12周后，pap ds、fnvip ds和两种lpla2掺加的ds样品经历超过50％ps80降解，而安慰剂ds和标准三柱方法ds保持为或低于10％ps80降解。这些结果表明脂肪酶(如lpla2)引起ps80降解，并且在纯化过程的pap和fnvip中更浓缩。在40℃下12周后，aexp ds和fnvip-cexp ds ps80降解了约30-40％，表明三柱纯化过程(蛋白a、aex和cex)对于从mab4 ds中完全除去残留的脂肪酶是必需的。
[0596]
为了进一步验证通过cex除去脂肪酶，将来自500l hccf批次(19k-1308-19002)和2000l hccf批次(w18-mk1308-010)的过程中间体样品进行液相色谱-多反应监测(lc-mrm)。进行lc-mrm以定量三种脂肪酶：磷脂酶b样2(plbl2)、磷脂酶a2 xv(lpla2)和脂蛋白脂肪酶(lpl)。参见下表7中的分析结果。
[0597]
表10：mab4过程中间体中内源性plbl2、lpla2和lpl的相对定量
[0598]
样品idplbl2(ng/mg)lpla2(ng/mg)lpl(ng/mg)19k-1308-19002pap-230.21.842.919k-1308-19002aexl-126.41.839.719k-1308-19002aexp-13.1blq5.219k-1308-19002cexp-2blqblqblqw18-mk1308-010pap-1271.738.1w18-mk1308-010aexl-123.91.527.7
w18-mk1308-010cexl-23.2blq5.9w18-mk1308-010cexp-2blqblqblq
[0599]
blq＝低于定量限。blq≤1ng/mg
[0600]
实施例7：脂肪酶掺加研究-使用mk-1308(一种抗-ctla4抗体)清除plbl2、lpl和基本变体
[0601]
这个实施例目的是理解单个单元操作除去过程和产物相关杂质的能力。plbl2和lpl的清除通过在相应步骤的用aex浓缩洗提和cex浓缩洗提的掺加补料来评估。使用多反应监测-质谱(mrm-ms)脂肪酶测定法来测定脂肪酶水平。
[0602]
阴离子交换色谱(aex)利用poros hq50树脂。以200g产物/l树脂的目标加载抗-ctla4抗体。抗体流过柱，而杂质(如宿主细胞蛋白、hmw和dna)与柱结合。将aex洗提的一部分使用1:1体积比的20mm乙酸钠ph 5.1稀释，使用30kda再生纤维素超滤膜浓缩，渗滤，并使用1m tris碱将ph调节至7.5的目标ph。将浓缩和透析的aex洗提掺加至aexl中用于评估aex步骤中的rhcp、脂肪酶和hmw清除率。将cho dna浓缩并掺加至aexl中以评估aex步骤中的rdna清除率。
[0603]
阳离子交换色谱(cex)利用poros hs50树脂。抗-ctla4抗体以40g产物/l树脂的目标加载。杂质，如hcp、hmw和rproa配体，通过洗脱缓冲剂中的氯化钠浓度分离。将cex洗提的一部分使用1:1体积比的20mm乙酸钠ph 5.1稀释，使用30kda再生纤维素超滤膜浓缩并渗滤。将浓缩和透析的cex条掺加至cexl中用于评估cex步骤中的rhcp、脂肪酶、基本变体和hmw清除。
[0604]
mabselect sure蛋白a配体购自ge healthcare，在di水中稀释至0.2g/l，并掺加至cexl中以评估cex步骤的rproa配体清除率。测试的所有rproa配体水平(高达79ppm)导致在cexp中低于loq(0.3mg/ml)。
[0605]
aex在较低的进料ph和较高的进料电导率下运行，而cex在中心点条件下运行。aex的中心点条件是：上样：ph 7.5，≤5ms/cm，200g/l，洗涤：25mm tris-hcl，ph 7.5。cex的中心点条件是：上样：ph 5.1，≤6ms/cm，40g/l，洗涤：20mm乙酸钠，ph 5.1，和洗脱：20mm乙酸钠，ph 5.1，18ms/cm，通过添加165mm nacl实现。
[0606]
每个掺加水平的进料和产物plbl2结果显示在图14-图15中。对于cex中的几乎每个掺加水平，plbl2被清除至低于1.0ppm的定量限(loq)(图15)。cex的最大plbl2容量为约62ppm(图15)。对于aex，aexp中的plbl2水平随着aexl中的plbl2掺加水平增加而指数地增加(图14)。aex的最大plbl2容量为约350-400ppm(图14)。
[0607]
每个掺加水平的进料和产物lpl结果显示在图16-图17中。对于cex中的每个掺加水平，两个lpl均被清除至1.0ppm的loq以下(图17)。cex的最大lpl容量为约94.6ppm(图17)。对于aex，aexp中的lpl水平随着aexl中的lpl掺加水平增加而指数地增加(图16)。aex的最大lpl容量为约300-350ppm(图16)。
[0608]
通过以各种不同水平用cex浓缩洗提掺加进料并使用hp-iex测量所得的基本变体水平，在中心点条件下在cex上研究基本变体的清除。图18中示出了每个掺加水平的进料和产物基本变体结果。对于头两个杂质掺加水平，基本变体水平在cexp中保持恒定(图18)，其对应于约6.4％的最大hmw水平(图19)。基本变体在第三和第四掺加水平中在cexp中线性增加(图18)。对于cex的基本变体的最大容量为30.9％(图18)，但cexp中的hmw水平为5.0％
(图13)，这将不满足约2％的预计商业ds规格。因此，cex的基本变体的最大容量为21.5％(图18)。
[0609]
本文引用的所有参考文献通过引用并入，其程度如同每个单独的出版物、数据库条目(例如genbank序列或geneid条目)、专利申请或专利被具体和单独地指出通过引用并入。这个通过引用并入的陈述是申请人依据37c.f.r.
§
1.57(b)(1)提出的，涉及每一个单独的出版物、数据库条目(例如genbank序列或geneid条目)、专利申请或专利，其中每一个都根据37c.f.r.
§
1.57(b)(2)清楚地标识，即使这样的引用不与通过引用并入的专门陈述直接相邻。在说明书内包括通过引用并入的专用陈述(如果有的话)不会以任何方式削弱通过引用并入的这种一般陈述。本文对参考文献的引用并不旨在承认该参考文献是相关的现有技术，也不构成对这些出版物或文献的内容或日期的任何承认。
[0610]
表11提供了序列表中ctla-4相关序列的简述。
[0611]
[0612]