具有4-氨基苯甲酸羟化活性的多肽及其用途的制作方法

1.本发明涉及具有4-氨基苯甲酸羟化活性的多肽及其用途。


背景技术：

2.聚苯并噁唑(pbo)已知能够作为耐热性和力学强度优异的工程塑料被用于纤维材料和半导体元件的绝缘膜等(非专利文献1)。
3.苯并噁唑骨架通过邻氨基苯酚骨架与羧酸的缩合而生成。因此，期待分子内具有这些官能团的4-氨基-3-羟基苯甲酸(4,3-ahba)类作为pbo单体是有用的。实际上，研究了使用4,3-ahba的聚苯并噁唑的合成和物性评价(非专利文献2)。
4.近年来，面向减轻地球环境负荷等，以可再生能源为原料而利用微生物发酵的化合物制造方法备受瞩目。例如，进行了具有与4,3-ahba类似结构的3-氨基-4-羟基苯甲酸(3,4-ahba)利用微生物的生产和聚合物化的研究(专利文献1)。
5.关于4,3-ahba的制造，迄今为止已知以化学方式将硝基芳香族还原而进行合成的方法等(专利文献2)。作为能够利用微生物法进行4,3-ahba发酵生产的策略，可以考虑将能够在微生物内进行生物合成的4-氨基苯甲酸(4-aba)的3位羟化，但关于这种反应，仅报道了部分4-羟基苯甲酸羟化酶具有微弱的活性(非专利文献3、4)。
6.专利文献1：日本特许第5445453号公报
7.专利文献2：日本特许第3821350号公报
8.非专利文献1：村濑浩贵，seni gakkaishi(纤维与工业)，vol.66，no.6(2010)
9.非专利文献2：lon j.mathias et al.，macromolecules，vol.18，no.4，pp.616-622(1985)
10.非专利文献3：barrie entsch et al.the journal of biological chemistry，vol.262，no.13，pp.6060-6068(1987)
11.非专利文献4：domenico l.gatti et al.，biochemistry，vol.35，no.2，pp.567-578(1996)


技术实现要素：

12.本发明涉及以下的1)～7)。
13.1)一种以下a)～c)所示的具有4-氨基苯甲酸羟化活性的多肽。
14.a)其是在序列号2所示的氨基酸序列或与其具有至少47％的同一性的氨基酸序列中序列号2所示的氨基酸序列的47位或与其对应的位置的氨基酸残基为亮氨酸的具有4-氨基苯甲酸羟化活性的多肽。
15.b)其是在序列号2所示的氨基酸序列或与其具有至少51％的同一性的氨基酸序列中序列号2所示的氨基酸序列的201位或222位、或者与201位或222位对应的位置的氨基酸残基为苯丙氨酸的具有4-氨基苯甲酸羟化活性的多肽。
16.c)其是在序列号2所示的氨基酸序列或与其具有至少90％的同一性的氨基酸序列
中序列号2所示的氨基酸序列的47位、72位、210位、294位或385位、或者与47位、72位、210位、294位或385位对应的位置的氨基酸残基为下列氨基酸的具有4-氨基苯甲酸羟化活性的多肽。
17.(a)47位或与其对应的位置：异亮氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸、谷氨酰胺，
18.(b)72位或与其对应的位置：丙氨酸、蛋氨酸，
19.(c)210位或与其对应的位置：蛋氨酸，
20.(d)294位或与其对应的位置：丙氨酸、甘氨酸、半胱氨酸、丝氨酸，
21.(e)385位或与其对应的位置：缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、蛋氨酸。
22.2)一种具有4-氨基苯甲酸羟化活性的突变多肽的制造方法，其包括以下a
′
)～c
′
)所示的氨基酸残基的取代。
23.a
′
)在由序列号2所示的氨基酸序列或与其具有至少47％的同一性的氨基酸序列构成、且具有4-氨基苯甲酸羟化活性的多肽中，将序列号2所示的氨基酸序列的47位或与其对应的位置的氨基酸残基取代为亮氨酸。
24.b
′
)在由序列号2所示的氨基酸序列或与其具有至少51％的同一性的氨基酸序列构成、且具有4-氨基苯甲酸羟化活性的多肽中，将序列号2所示的氨基酸序列的201位或222位、或者与201位或222位对应的位置的氨基酸残基取代为苯丙氨酸。
25.c
′
)在由序列号2所示的氨基酸序列或与其具有至少90％的同一性的氨基酸序列构成、且具有4-氨基苯甲酸羟化活性的多肽中，将序列号2所示的氨基酸序列的47位、72位、210位、294位或385位、或者与47位、72位、210位、294位或385位对应的位置的氨基酸残基取代为下列氨基酸。
26.(a)47位或与其对应的位置：异亮氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸、谷氨酰胺，
27.(b)72位或与其对应的位置：丙氨酸、蛋氨酸，
28.(c)210位或与其对应的位置：蛋氨酸，
29.(d)294位或与其对应的位置：丙氨酸、甘氨酸、半胱氨酸、丝氨酸，
30.(e)385位或与其对应的位置：缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、蛋氨酸。
31.3)一种提升4-氨基苯甲酸羟化活性的方法，其包括以下a
′
)～c
′
)所示的氨基酸残基的取代。
32.a
′
)在由序列号2所示的氨基酸序列或与其具有至少47％的同一性的氨基酸序列构成、且具有4-氨基苯甲酸羟化活性的多肽中，将序列号2所示的氨基酸序列的47位或与其对应的位置的氨基酸残基取代为亮氨酸。
33.b
′
)在由序列号2所示的氨基酸序列或与其具有至少51％的同一性的氨基酸序列构成、且具有4-氨基苯甲酸羟化活性的多肽中，将序列号2所示的氨基酸序列的201位或222位、或者与201位或222位对应的位置的氨基酸残基取代为苯丙氨酸。
34.c
′
)在由序列号2所示的氨基酸序列或与其具有至少90％的同一性的氨基酸序列构成、且具有4-氨基苯甲酸羟化活性的多肽中，将序列号2所示的氨基酸序列的47位、72位、210位、294位或385位、或者与47位、72位、210位、294位或385位对应的位置的氨基酸残基取代为下列氨基酸。
35.(a)47位或与其对应的位置：异亮氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸、谷氨酰胺，
36.(b)72位或与其对应的位置：丙氨酸、蛋氨酸，
37.(c)210位或与其对应的位置：蛋氨酸，
38.(d)294位或与其对应的位置：丙氨酸、甘氨酸、半胱氨酸、丝氨酸，
39.(e)385位或与其对应的位置：缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、蛋氨酸。
40.4)一种编码1)或2)的多肽的多核苷酸。
41.5)一种包含4)的多核苷酸的载体或dna片段。
42.6)一种包含5)的载体或dna片段的转化细胞。
43.7)一种4-氨基-3-羟基苯甲酸类的制造方法，其包括对6)的转化细胞进行培养的工序。
具体实施方式
44.本发明涉及提供一种具有优异的4-氨基苯甲酸羟化活性的多肽及其利用方法。
45.本发明的发明人发现，具有特定的氨基酸序列的4-羟基苯甲酸羟化酶的突变体具有优异的4-氨基苯甲酸羟化活性，能够有效地用于制造4-氨基-3-羟基苯甲酸类。
46.由于本发明的具有4-氨基苯甲酸羟化活性的多肽具有优异的4-氨基苯甲酸羟化活性，所以通过使用该多肽能够高效地由4-氨基苯甲酸类制造4-氨基-3-羟基苯甲酸类。
47.在本说明书中，氨基酸序列或核苷酸序列的同一性通过lipman-pearson法(science，1985，227：1435-1441)来计算。具体而言，通过使用遗传信息处理软件genetyx ver.12的同一性分析(search homology)程序，将unit size to compare(ktup)设为2进行分析来计算。
48.在本说明书中，氨基酸序列或核苷酸序列上的“对应的位置”可以通过以使目标序列与参照序列(例如序列号2所示的氨基酸序列)具有最大相同性的方式进行排列(alignment，比对)而确定。氨基酸序列或核苷酸序列的比对可以使用公知的算法实行，其步骤是本领域技术人员公知的。例如，比对可以以系统设定使用clustal w多序列比对程序(thompson，j.d.et al，1994，nucleic acids res.22：4673-4680)来进行。或者，也可以使用作为clustal w的修订版的clustal w2或clustal omega。clustal w、clustal w2和clustal omega例如可以在欧州生物信息研究所(european bioinformatics institute：ebi[www.ebi.ac.uk/index.html])或日本国立遗传学研究所所运营的日本dna数据库(ddbj[www.ddbj.nig.ac.jp/searches-j.html])的网页上利用。通过上述比对，与参照序列的任意位置对齐的目标序列的位置被视为与该任意位置“对应的位置”。
[0049]
本领域技术人员能够进一步进行微调使得上述所得到的氨基酸序列的比对最优化。这种最优比对优选考虑氨基酸序列的类似性和所插入的空位的频率等来确定。在此，氨基酸序列的类似性是指对2个氨基酸序列进行比对时这两个序列中存在相同或类似氨基酸残基的位置数相对于全长氨基酸残基数的比例(％)。类似的氨基酸残基是指在构成蛋白质的20种氨基酸中，在极性和电荷方面具有彼此类似的性质，发生所谓的保守取代的氨基酸残基。由这样的类似氨基酸残基构成的组是本领域技术人员所公知的，例如可以分别举出如下组合：精氨酸与赖氨酸或谷氨酰胺、谷氨酸与天冬氨酸或谷氨酰胺、丝氨酸与苏氨酸或
丙氨酸、谷氨酰胺与天冬氨酸或精氨酸、亮氨酸与异亮氨酸等，但并不限定于这些。
[0050]
在本说明书中，“氨基酸残基”是指构成蛋白质的20种氨基酸残基，丙氨酸(ala或a)、精氨酸(arg或r)、天冬氨酸(asn或n)、天冬氨酸(asp或d)、半胱氨酸(cys或c)、谷氨酰胺(gln或q)、谷氨酸(glu或e)、甘氨酸(gly或g)、组氨酸(his或h)、异亮氨酸(ile或i)、亮氨酸(leu或l)、赖氨酸(lys或k)、蛋氨酸(met或m)、苯丙氨酸(phe或f)、脯氨酸(pro或p)、丝氨酸(ser或s)、苏氨酸(thr或t)、色氨酸(trp或w)、酪氨酸(tyr或y)和缬氨酸(val或v)。
[0051]
在本说明书中，启动子等控制区域与基因的“可工作地连接”是指基因与控制区域以该基因能够在该控制区域的控制下表达的方式连接。基因与控制区域的“可工作地连接”的步骤是本领域技术人员公知的。
[0052]
在本说明书中，关于基因的“上游”和“下游”是指该基因的转录方向的上游和下游。例如，“配置于启动子的下游的基因”是指在dna有义链中该基因存在于启动子的3
′
侧，基因的上游是指dna有义链中的该基因的5
′
侧的区域。
[0053]
在本说明书中，用于细胞的功能或性状、特性的术语“本来”是为了表示该细胞原本就存在该功能或性状、特性而使用的。对照而言，术语“外来”不是该细胞原本就存在的，而是用于表示从外部导入的功能或性状、特性。例如，“外来”基因或多核苷酸是从外部导入细胞的基因或多核苷酸。外来基因或多核苷酸可以来源于与导入其的细胞同种的生物，也可以来源于不同种的生物(即异种基因或多核苷酸)。＜具有4-氨基苯甲酸羟化活性的多肽＞
[0054]
本发明的具有4-氨基苯甲酸羟化活性的多肽(称作“本发明的多肽”)由以下a)～c)表示。
[0055]
a)其是在序列号2所示的氨基酸序列或与其具有至少47％的同一性的氨基酸序列中序列号2所示的氨基酸序列的47位或与其对应的位置的氨基酸残基为亮氨酸的多肽。
[0056]
b)其是在序列号2所示的氨基酸序列或与其具有至少51％的同一性的氨基酸序列中序列号2所示的氨基酸序列的201位或222位、或者与201位或222位对应的位置的氨基酸残基为苯丙氨酸的多肽。
[0057]
c)其是序列号2所示的氨基酸序列或与其具有至少90％的同一性的氨基酸序列中序列号2所示的氨基酸序列的47位、72位、210位、294位或385位、或者与47位、72位、210位、294位或385位对应的位置的氨基酸残基为下列氨基酸的多肽。
[0058]
(a)47位或与其对应的位置：异亮氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸、谷氨酰胺，
[0059]
(b)72位或与其对应的位置：丙氨酸、蛋氨酸，
[0060]
(c)210位或与其对应的位置：蛋氨酸，
[0061]
(d)294位或与其对应的位置：丙氨酸、甘氨酸、半胱氨酸、丝氨酸，
[0062]
(e)385位或与其对应的位置：缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、蛋氨酸。
[0063]
a)所示的多肽是在作为基准的多肽、即由序列号2所示的氨基酸序列或与其具有至少47％的同一性的氨基酸序列构成的多肽中，序列号2所示的氨基酸序列的47位或与其对应的位置的氨基酸残基被取代为亮氨酸的、具有4-氨基苯甲酸羟化活性的突变多肽。
[0064]
b)所示的多肽是在作为基准的多肽、即由序列号2所示的氨基酸序列或与其具有至少51％的同一性的氨基酸序列构成的多肽中，序列号2所示的氨基酸序列的201位或222
位、或者与201位或222位对应的位置的氨基酸残基被取代为苯丙氨酸的、具有4-氨基苯甲酸羟化活性的突变多肽。
[0065]
c)所示的多肽是在作为基准的多肽、即由序列号2所示的氨基酸序列或与其具有至少90％的同一性的氨基酸序列构成的多肽中，序列号2所示的氨基酸序列的47位、72位、210位、294位或385位、或者与47位、72位、210位、294位或385位对应的位置的氨基酸残基被取代为以上(a)～(e)的氨基酸的、具有4-氨基苯甲酸羟化活性的突变多肽。
[0066]
在本发明中，“4-氨基苯甲酸羟化活性”是指催化4-氨基苯甲酸类的羟化的活性，优选催化4-氨基苯甲酸类的3位的羟化的活性。
[0067]
4-氨基苯甲酸羟化活性可以如后述实施例所示通过培养产生本发明的多肽的微生物并利用hplc等测定所生成的4-氨基-3-羟基苯甲酸量来确定。
[0068]
这种本发明的a)所示的多肽可以通过在由序列号2所示的氨基酸序列或与其具有至少47％的同一性的氨基酸序列构成、且具有4-氨基苯甲酸羟化活性的多肽中，将序列号2所示的氨基酸序列的47位或与其对应的位置的氨基酸残基取代为亮氨酸而制造。
[0069]
在此，由序列号2所示的氨基酸序列或与其具有至少47％的同一性的氨基酸序列构成、且具有4-氨基苯甲酸羟化活性的多肽是本发明的a)所示的多肽的“亲本”多肽。
[0070]
该亲本多肽是指因其氨基酸残基发生规定的突变而成为本发明的a)所示的多肽的基准多肽。
[0071]
另外，本发明的b)所示的多肽可以通过在由序列号2所示的氨基酸序列或与其具有至少51％的同一性的氨基酸序列构成、且具有4-氨基苯甲酸羟化活性的多肽中，将序列号2所示的氨基酸序列的201位或222位、或者与201位或222位对应的位置的氨基酸残基取代为苯丙氨酸而制造。
[0072]
在此，由序列号2所示的氨基酸序列或与其具有至少51％的同一性的氨基酸序列构成、且具有4-氨基苯甲酸羟化活性的多肽是本发明的b)所示的多肽的“亲本”多肽。
[0073]
该亲本多肽是指因其氨基酸残基发生规定的突变而成为本发明的b)所示的多肽的基准多肽。
[0074]
另外，本发明的c)所示的多肽可以通过在由序列号2所示的氨基酸序列或与其具有至少90％的同一性的氨基酸序列构成、且具有4-氨基苯甲酸羟化活性的多肽中，将序列号2所示的氨基酸序列的47位、72位、210位、294位或385位、或者与47位、72位、210位、294位或385位对应的位置的氨基酸残基取代为下列氨基酸而制造。
[0075]
(a)47位或与其对应的位置：异亮氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸、谷氨酰胺，
[0076]
(b)72位或与其对应的位置：丙氨酸、蛋氨酸，
[0077]
(c)210位或与其对应的位置：蛋氨酸，
[0078]
(d)294位或与其对应的位置：丙氨酸、甘氨酸、半胱氨酸、丝氨酸，
[0079]
(e)385位或与其对应的位置：缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、蛋氨酸。
[0080]
在此，由序列号2所示的氨基酸序列或与其具有至少90％的同一性的氨基酸序列构成、且具有4-氨基苯甲酸羟化活性的多肽是本发明的c)所示的多肽的“亲本”多肽。
[0081]
该亲本多肽是指因其氨基酸残基发生规定的突变而成为本发明的c)所示的多肽的基准多肽。
[0082]
在本发明中，由序列号2所示的氨基酸序列(ncbi reference sequence：wp_010920262.1)构成的多肽hfm122作为4-羟基苯甲酸-3-单加氧酶(ec1.14.13.2)是已知的。4-羟基苯甲酸-3-单加氧酶是具有促进将4-羟基苯甲酸的3位羟化而生成原儿茶酸的反应和其逆反应的任一方或双方的催化活性的酶，是催化4-羟基苯甲酸类的羟化的酶(4-羟基苯甲酸羟化酶)的一种。
[0083]
本技术人发现该hfm122具有4-氨基苯甲酸羟化活性(日本特愿2018-171849)。
[0084]
＜a)所示的多肽中的亲本多肽＞
[0085]
在a)所示的多肽中，作为由与序列号2所示的氨基酸序列具有至少47％的同一性的氨基酸序列构成、且具有4-氨基苯甲酸羟化活性的多肽，可以举出由与序列号2所示的氨基酸序列具有至少47％的同一性、具体为47％以上、更优选为50％以上、更优选为60％以上、更优选为70％以上、更优选为80％以上、更优选为90％以上、更优选为95％以上、更优选为96％以上、进一步优选为97％以上、进一步优选为98％以上、进一步优选为99％以上的同一性的氨基酸序列构成的具有4-氨基苯甲酸羟化活性的多肽。具体可以举出例如hfm388(序列号4：与序列号2的氨基酸序列同一性为62％、ncbi reference sequence：wp_010976283.1)、hfm339(序列号6：与序列号2的氨基酸序列同一性为61％、ncbi reference sequence：wp_011157287.1)、hfm77(序列号8：与序列号2的氨基酸序列同一性为51％、ncbi reference sequence：wp_011089160.1)、hfm737(序列号10：与序列号2的氨基酸序列同一性为51％、ncbi reference sequence：wp_011519894.1)、hfmss0-1(序列号12：与序列号2的氨基酸序列同一性为47％、ncbi reference sequence：wp_027494688.1)等。其中，从本发明的多肽所具有的4-氨基苯甲酸羟化活性的观点出发，优选hfm737、hfmss0-1。
[0086]
作为适当的“亲本”多肽，除了序列号2所示的氨基酸序列之外，可以举出由相对于序列号2所示的氨基酸序列具有90％以上、更优选为95％以上、更优选为96％以上、更优选为98％以上的同一性的氨基酸序列构成、且具有4-氨基苯甲酸羟化活性的多肽。还可以举出由序列号4、序列号6、序列号8、序列号10或序列号12所示的氨基酸序列、或者相对于它们分别具有90％以上、优选为95％以上、更优选为96％以上、更优选为98％以上的同一性的氨基酸序列构成、且具有4-氨基苯甲酸羟化活性的多肽。
[0087]
该亲本多肽优选在序列号2所示的氨基酸序列的47位或与其对应的位置均具有缬氨酸残基，本发明的a)所示的多肽更优选将该47位或与其对应的位置的缬氨酸取代为亮氨酸。
[0088]
＜b)所示的多肽中的亲本多肽＞
[0089]
在b)所示的多肽中，作为由与序列号2所示的氨基酸序列具有至少51％的同一性的氨基酸序列构成、且具有4-氨基苯甲酸羟化活性的多肽，可以举出由与序列号2所示的氨基酸序列具有至少51％的同一性、具体为51％以上、优选为60％以上、更优选为70％以上、更优选为80％以上、更优选为90％以上、更优选为95％以上、更优选为96％以上、进一步优选为97％以上、进一步优选为98％以上、进一步优选为99％以上的同一性的氨基酸序列构成的具有4-氨基苯甲酸羟化活性的多肽。具体可以举出例如hfm388(序列号4：与序列号2的氨基酸序列同一性为62％、ncbi reference sequence：wp_010976283.1)、hfm339(序列号6：与序列号2的氨基酸序列同一性为61％、ncbi reference sequence：wp_011157287.1)、hfm77(序列号8：与序列号2的氨基酸序列同一性为51％、ncbi reference sequence：wp_
011089160.1)等。其中，从本发明的多肽所具有的4-氨基苯甲酸羟化活性的观点出发，优选hfm388、hfm339。
[0090]
作为适当的“亲本”多肽，除了序列号2所示的氨基酸序列之外，可以举出由相对于序列号2所示的氨基酸序列具有90％以上、更优选为95％以上、更优选为96％以上、更优选为98％以上的同一性的氨基酸序列构成、且具有4-氨基苯甲酸羟化活性的多肽。还可以举出由序列号4、序列号6或序列号8所示的氨基酸序列、或者相对于它们分别具有90％以上、优选为95％以上、更优选为96％以上、更优选为98％以上的同一性的氨基酸序列构成、且具有4-氨基苯甲酸羟化活性的多肽。
[0091]
该亲本多肽优选在序列号2所示的氨基酸序列的201位或222位、或者与201位或222位对应的位置均具有酪氨酸残基，本发明的b)所示的多肽更优选将该201位或222位、或者与201位或222位对应的位置的酪氨酸取代为苯丙氨酸的突变多肽。作为与序列号2的201位或222位对应的位置，例如，在序列号4时201位和222位对应于这些位置，在序列号6时201位和222位对应于这些位置，在序列号8时203位和224位对应于这些位置。
[0092]
因此，该亲本多肽优选在序列号4所示的氨基酸序列的201位或222位、或者与201位或222位对应的位置均具有酪氨酸残基，本发明的b)所示的多肽更优选将该201位或222位、或者与201位或222位对应的位置的酪氨酸取代为苯丙氨酸的突变多肽。
[0093]
另外，该亲本多肽优选在序列号6所示的氨基酸序列的201位或222位、或者与201位或222位对应的位置均具有酪氨酸残基，本发明的b)所示的多肽更优选将该201位或222位、或者与201位或222位对应的位置的酪氨酸取代为苯丙氨酸的突变多肽。
[0094]
另外，该亲本多肽优选在序列号8所示的氨基酸序列的203位或224位、或者与203位或224位对应的位置均具有酪氨酸残基，本发明的b)所示的多肽更优选将该203位或224位、或者与203位或224位对应的位置的酪氨酸取代为苯丙氨酸的突变多肽。
[0095]
＜c)所示的多肽中的亲本多肽＞
[0096]
在c)所示的多肽中，作为由与序列号2所示的氨基酸序列具有至少90％的同一性的氨基酸序列构成、且具有4-氨基苯甲酸羟化活性的多肽，可以举出由与序列号2所示的氨基酸序列具有至少90％的同一性、具体为90％以上、优选为95％以上、更优选为96％以上、进一步优选为97％以上、进一步优选为98％以上、进一步优选为99％以上的同一性的氨基酸序列构成的具有4-氨基苯甲酸羟化活性的多肽。
[0097]
该亲本多肽优选在序列号2所示的氨基酸序列的47位或与其对应的位置均具有缬氨酸残基，优选在72位或与其对应的位置均具有组氨酸残基，优选在210位或与其对应的位置均具有亮氨酸残基，优选在294位或与其对应的位置均具有苏氨酸残基，优选在385位或与其对应的位置均具有酪氨酸残基。本发明的c)所示的多肽更优选将该47位或与其对应的位置的缬氨酸取代为异亮氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸或谷氨酰胺，将72位或与其对应的位置的组氨酸取代为丙氨酸或蛋氨酸，将210位或与其对应的位置的亮氨酸取代为蛋氨酸，将294位或与其对应的位置的苏氨酸取代为丙氨酸、甘氨酸、半胱氨酸或丝氨酸，将385位或与其对应的位置的酪氨酸取代为缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸或蛋氨酸。更优选将294位或与其对应的位置的苏氨酸取代为丝氨酸，将47位或与其对应的位置的缬氨酸取代为异亮氨酸、苏氨酸、蛋氨酸或谷氨酰胺，将72位或与其对应的位置的组氨酸取代为蛋氨酸。进一步优选将294位或与其对应的位置的苏氨酸取代为丝氨酸，将47位或与其对应的位
置的缬氨酸取代为异亮氨酸。
[0098]
＜编码本发明的多肽的多核苷酸＞
[0099]
在本发明中，作为使亲本多肽的氨基酸残基突变的手段，可以采用本技术领域中公知的各种突变导入技术。例如，在编码亲本多肽的氨基酸序列的多核苷酸(以下也称为亲本基因)中，使编码应突变的氨基酸残基的核苷酸序列突变为编码突变后的氨基酸残基的核苷酸序列，由此能够得到编码本发明的多肽的多核苷酸。
[0100]
向亲本基因导入目标突变基本上可以采用本领域技术人员公知的各种定点突变导入法进行。定点突变导入法可以利用例如反向pcr法或退火法等任意方法进行。也可以使用市售的定点突变导入用试剂盒(例如安捷伦科技有限公司的quikchange ii site-directed mutagenesis kit或quikchange multi site-directed mutagenesis kit等)。
[0101]
向亲本基因的定点突变导入最通常使用包含应导入的核苷酸突变的突变用引物进行。该突变用引物以对包含编码亲本基因内的应突变的氨基酸残基的核苷酸序列的区域进行退火，并且代替编码该应突变的氨基酸残基的核苷酸序列(密码子)而包含具有编码突变后的氨基酸残基的核苷酸序列(密码子)的核苷酸序列的方式设计即可。编码突变前和突变后的氨基酸残基的核苷酸序列(密码子)是本领域技术人员能够基于通常的教科书等适当识别并选择的。或者，定点突变导入也可以采用利用soe(重叠延伸剪切技术，splicing by overlap extension)-pcr(gene，1989，77(1)：p61-68)将分开使用包含应导入的核苷酸突变的2个互补引物而分别使突变部位的上游侧和下游侧扩增得到的dna片段连结为1个整体。
[0102]
包含亲本基因的模板dna可通过如下方式制备：利用常规方法从上述的产生4-羟基苯甲酸羟化酶的微生物中提取基因组dna，或者提取rna并利用逆转录合成cdna。或者也可以基于亲本多肽的氨基酸序列化学合成与之对应的核苷酸序列而用作模板dna。将包含编码已作为具有4-氨基苯甲酸羟化活性的多肽描述的hfm122、hfm388、hfm339、hfm77、hfm737、hfmss0-1的碱基序列的dna序列分别表示为序列号1、序列号3、序列号5、序列号7、序列号9和序列号11。
[0103]
突变用引物可以通过亚磷酰胺法(nucleic acids r4esearch，1989，17：7059-7071)等公知的寡核苷酸合成法来制备。这样的引物合成也可以使用例如市售的寡核苷酸合成装置(例如abi公司制造的装置等)来实施。使用包括该突变用引物的引物组，将亲本基因作为模板dna，进行上述那样的定点突变导入，由此能够得到编码具有目标突变的本发明的多肽的多核苷酸。
[0104]
编码该本发明多肽的多核苷酸可以包含单链或双链的dna、cdna、rna或其它的人工核酸。该dna、cdna和rna可以通过化学合成得到。并且，该多核苷酸除了开放阅读框(orf)之外，还可以包含非翻译区(utr)的核苷酸序列。并且，该多核苷酸可以与产生本发明的突变多肽用的转化体的种类匹配而使密码子最优化。各种生物所使用的密码子的信息可以由codon usage databas([www.kazusa.or.jp/codon/])获取。
[0105]
＜载体或dna片段＞
[0106]
编码所得到的本发明的多肽的多核苷酸可以重组至载体中。包含该多核苷酸的载体是表达载体。另外，优选该载体是能够将编码本发明的多肽的多核苷酸导入宿主微生物中、且能够在宿主微生物内表达该多核苷酸的表达载体。优选该载体包含编码本发明的多
肽的多核苷酸、以及与其可工作地连接的控制区域。该载体可以是质粒等能够在染色体外自我增殖和复制的载体，或者也可以是重组于染色体内的载体。
[0107]
作为载体的具体例，例如可以举出pbluescript ii sk(-)(stratagene)、puc18/19、puc118/119等puc系载体(takara bio)、pet系载体(takara bio)、pgex系载体(gehealthcare)、pcold系载体(takara bio)、phy300plk(takara bio)、pub110(mckenzie，t.et al.，1986，plasmid 15(2)：93-103)、pbr322(takara bio)、prs403(stratagene)、pmw218/219(nippon gene)、pri909/910等的pri系载体(takara bio)、pbi系载体(clontech)、in3系载体(inplanta innovations)、pptr1/2(takara bio)、pdjb2(d.j.ballance et al.，gene，36，321-331，1985)、pab4-1(van hartingsveldt w et al.，mol gen genet，206，71-75，1987)、pleu4(m.i.g.roncero et al.，gene，84,335-343，1989)、ppyr225(c.d.skory et al.，mol genet genomics，268，397-406，2002)、pfg1(gruber，f.et al.，curr genet，18，447-451，1990)等。
[0108]
此外，编码本发明的多肽的多核苷酸也可以构建为包含该多核苷酸的dna片段。作为该dna片段，例如可以举出pcr扩增dna片段和限制性内切酶切断dna片段。优选该dna片段可以为包含编码本发明的多肽的多核苷酸、和与其可工作地连接的控制区域的表达盒。
[0109]
上述载体或dna片段中所包含的控制区域是用于在导入了该载体或dna片段的宿主细胞内表达编码本发明的多肽的多核苷酸的序列，例如可以举出启动子或终止子等表达调节区域、复制起始点等。该控制区域的种类可以根据导入载体或dna片段的宿主微生物的种类适当选择。根据需要，该载体或dna片段还可以具有抗生素抗性基因、氨基酸合成相关基因等选择标记(例如氨苄西林、新霉素、卡那霉素、氯霉素等药物抗性基因)。
[0110]
上述载体或dna片段可以包含用于编码生物合成4-氨基苯甲酸类所必需的多肽的多核苷酸序列。作为用于生物合成4-氨基苯甲酸类所必需的多肽，例如可以举出4-氨基-4-脱氧分支酸合成酶(4-amino-4-deoxychorismate synthase,pabab)或4-氨基-4-脱氧分支酸裂解酶(4-amino-4-deoxychorismate lyase,pabc)等。
[0111]
编码本发明的多肽的多核苷酸与上述控制区域或标记基因序列的连接可以通过上述的soe-pcr法等方法进行。基因序列向载体的导入步骤是本领域公知的。启动子区、终止子、分泌信号区等控制区域的种类没有特别限定，可以对应于导入宿主而适当选择通常使用的启动子或分泌信号序列使用。
[0112]
作为该控制区域的优选例，可以例示与野生型相比能够强化表达的强控制区域，例如作为公知的高表达启动子的t7启动子、lac启动子、tac启动子、trp启动子等，但并不限定于它们＜转化细胞＞
[0113]
通过将包含编码本发明的多肽的多核苷酸的载体导入宿主、或者将包含编码本发明的多肽的多核苷酸的dna片段导入宿主的基因组，能够得到本发明的转化细胞。
[0114]
该转化细胞是以能够表达的方式导入了编码本发明的多肽的多核苷酸的细胞，可以说是该多核苷酸的表达被强化了的细胞，进而可以说是本发明的多肽的表达被强化了的细胞。
[0115]
作为宿主细胞，可以使用真菌、酵母、放线菌、大肠杆菌、枯草杆菌等中的任一种，优选大肠杆菌、放线菌。作为放线菌，可以举出棒状杆菌属菌、分枝杆菌属菌、红球菌属菌、链霉菌属菌、丙酸杆菌属菌等，优选棒状杆菌属菌，更优选为谷氨酸棒状杆菌。
[0116]
其中，优选能够提供成为4-氨基-3-羟基苯甲酸类的生物合成的底物的4-氨基苯甲酸类的微生物，更优选4-氨基苯甲酸类的提供能力被强化了的微生物。作为强化微生物的4-氨基苯甲酸类的提供能力的方法，例如可以举出：向微生物导入包含用于编码生物合成4-氨基苯甲酸类所必需的多肽的多核苷酸以及与其可工作地连接的控制区域的载体的方法；将微生物本来所具有的编码用于生物合成4-氨基苯甲酸类所必需的多肽的多核苷酸的控制区域取代为强表达启动子的方法等。
[0117]
作为向宿主导入载体或dna片段的方法，可以使用例如电穿孔法、转化法、转染法、拼接法、原生质体法、粒子枪法、农杆菌法等。
[0118]
另外，作为将多核苷酸导入宿主的基因组的方法，没有特别限定，例如可以举出使用了包含该多核苷酸的dna片段的双交换法。该dna片段可以在上述的宿主细胞中导入到表达量多的基因的启动子序列的下游，或者，也可以预先制作将该dna片段和上述的控制区域可工作地连接而成的片段，将该连接片段导入宿主的基因组。另外，该dna片段也可以预先与用于选择正确导入了本发明的多核苷酸的细胞的标记(药物抗性基因或营养缺陷型互补基因等)连接。
[0119]
导入了目标载体或dna片段的转化细胞可以利用选择标记进行选择。例如，在选择标记为抗生素抗性基因时，通过利用该抗生素添加培养基进行培养，能够选择导入了目标载体或dna片段的转化细胞。另外，例如在选择标记为氨基酸合成相关基因时，在该氨基酸要求性的宿主微生物中导入基因之后，可以将该氨基酸要求性的有无作为指标，选择导入了目标载体或dna片段的转化细胞。或者，通过利用pcr等研究转化细胞的dna序列，也能够确认目标载体或dna片段的导入。
[0120]
这样所得到的转化细胞如果在适当的培养基中对其进行培养，则导入了该细胞的多核苷酸表达，生成本发明的多肽。即，该转化细胞成为具有4-氨基苯甲酸羟化活性的多肽产生菌株。并且，在如后述的实施例所示培养本发明的转化细胞时，与使用产生亲本多肽的转化细胞的情况相比，4-氨基-3-羟基苯甲酸的生产率提高。
[0121]
即，在由序列号2所示的氨基酸序列或与其具有至少47％的同一性的氨基酸序列构成、且具有4-氨基苯甲酸羟化活性的多肽中，将序列号2所示的氨基酸序列的47位或与其对应的位置的氨基酸残基取代为亮氨酸的突变，对于提升4-氨基苯甲酸羟化活性而言是有用的，进而对于提高4-氨基-3-羟基苯甲酸类的生产率而言是有用的。
[0122]
另外，在由序列号2所示的氨基酸序列或与其具有至少51％的同一性的氨基酸序列构成、且具有4-氨基苯甲酸羟化活性的多肽中，将序列号2所示的氨基酸序列的201位或222位、或者与201位或222位相应的位置的氨基酸残基取代为苯丙氨酸的突变，对于提升4-氨基苯甲酸羟化活性而言是有用的，进而对于提高4-氨基-3-羟基苯甲酸类的生产率而言是有用的。
[0123]
另外，在由序列号2所示的氨基酸序列或与其具有至少90％的同一性的氨基酸序列构成、且具有4-氨基苯甲酸羟化活性的多肽中，将序列号2所示的氨基酸序列的47位、72位、210位、294位或385位、或者与47位、72位、210位、294位或385位相应的位置的氨基酸残基取代为下列氨基酸的突变，对于提升4-氨基苯甲酸羟化活性而言是有用的，进而对于提高4-氨基-3-羟基苯甲酸类的生产率而言是有用的。
[0124]
(a)47位或与其对应的位置：异亮氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸、谷氨酰
胺，
[0125]
(b)72位或与其对应的位置：丙氨酸、蛋氨酸，
[0126]
(c)210位或与其对应的位置：蛋氨酸，
[0127]
(d)294位或与其对应的位置：丙氨酸、甘氨酸、半胱氨酸、丝氨酸，
[0128]
(e)385位或与其对应的位置：缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、蛋氨酸。
[0129]
于是，本发明的转化细胞是4-氨基苯甲酸羟化活性得到了提升的多肽的产生菌株，是有用的4-氨基-3-羟基苯甲酸类的生产株。
[0130]
＜4-氨基-3-羟基苯甲酸类的制造＞
[0131]
本发明的4-氨基-3-羟基苯甲酸类的制造方法包括培养本发明的转化细胞的工序，能够通过从培养基中回收4-氨基-3-羟基苯甲酸类而获得4-氨基-3-羟基苯甲酸类。
[0132]
在本发明中，作为4-氨基-3-羟基苯甲酸类，具体可以举出以下通式(1)所示的4-氨基-3-羟基苯甲酸衍生物。
[0133][0134]
〔式中，r1表示氢原子、羟基(-oh)、甲氧基(-och3)、氨基(-nh2)、氟原子(-f)、氯原子(-cl)、溴原子(-br)、碘原子(-i)、羧基(-cooh)、甲基(-ch3)、乙基(-ch2ch3)，r2表示氢原子或羟基(-oh)、甲氧基(-och3)、氨基(-nh2)、氟原子(-f)、氯原子(-cl)、溴原子(-br)、碘原子(-i)、羧基(-cooh)、甲基(-ch3)或乙基(-ch2ch3)，x1和x2为氢原子或羟基且至少一方表示羟基。〕
[0135]
作为r1所示的官能团，优选氢原子、羟基(-oh)、甲氧基(-och3)、氟原子(-f)或甲基(-ch3)。
[0136]
作为r2所示的官能团，优选氢原子、羟基(-oh)、甲氧基(-och3)、氟原子(-f)或甲基(-ch3)。
[0137]
更优选r1和r2均为氢原子。
[0138]
另外，x1和x2可以均为羟基，但优选x1和x2的任一方为羟基。
[0139]
另外，该培养基中可以根据需要存在成为4-氨基-3-羟基苯甲酸类的生物合成底物的4-氨基苯甲酸类。
[0140]
在此，作为4-氨基苯甲酸类，可以举出以下通式(2)所示的4-氨基苯甲酸衍生物。
[0141][0142]
〔式中，r1和r2所表示的含义同上。〕
[0143]
培养转化细胞的培养基只要是含有碳源、氮源、无机盐类等且能够高效地培养本发明的转化细胞的培养基，则可以使用天然培养基、合成培养基的任一种。作为碳源，例如可以使用葡萄糖等糖类、甘油等多元醇类、乙醇等醇类、或丙酮酸、琥珀酸或柠檬酸等有机酸类。此外，作为氮源，例如可以使用蛋白胨、肉提取物、酵母提取物、酪蛋白水解物、大豆粕
碱性提取物、甲胺等烷基胺类、或者氨或其盐等。另外，还可以根据需要使用磷酸盐、碳酸盐、硫酸盐、镁、钙、钾、铁、锰、锌等的盐类、特定的氨基酸、特定的维生素、消泡剂等。
[0144]
培养通常可以在10℃～40℃下根据需要边搅拌或振荡边进行6小时～72小时、优选9小时～60小时、更优选12小时～48小时。此外，培养中也可以根据需要在培养基中添加氨苄西林或卡那霉素等抗生素。
[0145]
来自培养物的4-氨基-3-羟基苯甲酸类的回收和精制方法没有特别限制。即，可以通过组合公知的离子交换树脂法、沉淀法、晶析法、重结晶法、浓缩法或其它方法来实施。例如，利用离心分离等将菌体除去后，利用阳离子和阴离子交换树脂除去离子性物质，进行浓缩，则能够获得4-氨基-3-羟基苯甲酸类。培养物中蓄积的4-氨基-3-羟基苯甲酸类可以不离析而直接使用。
[0146]
另外，作为例示的实施方式，本发明包括以下的产品、制造方法、用途、方法等。但本发明并不限定于这些实施方式。
[0147]
＜1＞一种以下a)～c)所示的具有4-氨基苯甲酸羟化活性的多肽。
[0148]
a)其是在序列号2所示的氨基酸序列或与其具有至少47％的同一性的氨基酸序列中序列号2所示的氨基酸序列的47位或与其对应的位置的氨基酸残基为亮氨酸的具有4-氨基苯甲酸羟化活性的多肽。
[0149]
b)其是在序列号2所示的氨基酸序列或与其具有至少51％的同一性的氨基酸序列中序列号2所示的氨基酸序列的201位或222位、或者与201位或222位相应的位置的氨基酸残基为苯丙氨酸的具有4-氨基苯甲酸羟化活性的多肽。
[0150]
c)其是在序列号2所示的氨基酸序列或与其具有至少90％的同一性的氨基酸序列中序列号2所示的氨基酸序列的47位、72位、210位、294位或385位、或者与47位、72位、210位、294位或385位相应的位置的氨基酸残基为下列氨基酸的具有4-氨基苯甲酸羟化活性的多肽。
[0151]
(a)47位或与其对应的位置：异亮氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸、谷氨酰胺，
[0152]
(b)72位或与其对应的位置：丙氨酸、蛋氨酸，
[0153]
(c)210位或与其对应的位置：蛋氨酸，
[0154]
(d)294位或与其对应的位置：丙氨酸、甘氨酸、半胱氨酸、丝氨酸，
[0155]
(e)385位或与其对应的位置：缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、蛋氨酸。
[0156]
＜2＞一种以下a
″
)～c
″
)所示的具有4-氨基苯甲酸羟化活性的多肽。
[0157]a″
)在序列号2所示的氨基酸序列或与其具有至少47％的同一性的氨基酸序列中序列号2所示的氨基酸序列的47位或与其对应的位置的氨基酸残基被取代为亮氨酸的具有4-氨基苯甲酸羟化活性的突变多肽。
[0158]b″
)在序列号2所示的氨基酸序列或与其具有至少51％的同一性的氨基酸序列中序列号2所示的氨基酸序列的201位或222位、或者与201位或222位相应的位置的氨基酸残基被取代为苯丙氨酸的具有4-氨基苯甲酸羟化活性的多肽。
[0159]c″
)在序列号2所示的氨基酸序列或与其具有至少90％的同一性的氨基酸序列中序列号2所示的氨基酸序列的47位、72位、210位、294位或385位、或者与47位、72位、210位、294位或385位相应的位置的氨基酸残基被取代为下列氨基酸的具有4-氨基苯甲酸羟化活
性的多肽。
[0160]
(a)47位或与其对应的位置：异亮氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸、谷氨酰胺，
[0161]
(b)72位或与其对应的位置：丙氨酸、蛋氨酸，
[0162]
(c)210位或与其对应的位置：蛋氨酸，
[0163]
(d)294位或与其对应的位置：丙氨酸、甘氨酸、半胱氨酸、丝氨酸，
[0164]
(e)385位或与其对应的位置：缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、蛋氨酸。
[0165]
＜3＞如＜2＞所述的突变多肽，其中，a
″
)所示的氨基酸残基的取代是由缬氨酸向亮氨酸的取代，b
″
)所示的氨基酸残基的取代是由酪氨酸向苯丙氨酸的取代，c
″
)所示的氨基酸残基的取代是294位或与其对应的位置的苏氨酸向丝氨酸的取代，47位或与其对应的位置的缬氨酸向异亮氨酸、苏氨酸、蛋氨酸或谷氨酰胺的取代，或者72位或与其对应的位置的组氨酸向蛋氨酸的取代。
[0166]
＜4＞一种具有4-氨基苯甲酸羟化活性的突变多肽的制造方法，其包括以下a
′
)～c
′
)所示的氨基酸残基的取代。
[0167]a′
)在由序列号2所示的氨基酸序列或与其具有至少47％的同一性的氨基酸序列构成、且具有4-氨基苯甲酸羟化活性的多肽中，将序列号2所示的氨基酸序列的47位或与其对应的位置的氨基酸残基取代为亮氨酸。
[0168]b′
)在由序列号2所示的氨基酸序列或与其具有至少51％的同一性的氨基酸序列构成、且具有4-氨基苯甲酸羟化活性的多肽中，将序列号2所示的氨基酸序列的201位或222位、或者与201位或222位相应的位置的氨基酸残基取代为苯丙氨酸。
[0169]c′
)在由序列号2所示的氨基酸序列或与其具有至少90％的同一性的氨基酸序列构成、且具有4-氨基苯甲酸羟化活性的多肽中，将序列号2所示的氨基酸序列的47位、72位、210位、294位或385位、或者与47位、72位、210位、294位或385位相应的位置的氨基酸残基取代为下列氨基酸。
[0170]
(a)47位或与其对应的位置：异亮氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸、谷氨酰胺，
[0171]
(b)72位或与其对应的位置：丙氨酸、蛋氨酸，
[0172]
(c)210位或与其对应的位置：蛋氨酸，
[0173]
(d)294位或与其对应的位置：丙氨酸、甘氨酸、半胱氨酸、丝氨酸，
[0174]
(e)385位或与其对应的位置：缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、蛋氨酸。
[0175]
＜5＞如＜4＞所述的方法，其中，a
′
)所示的氨基酸残基的取代是由缬氨酸向亮氨酸的取代，b
′
)所示的氨基酸残基的取代是由酪氨酸向苯丙氨酸的取代，c
′
)所示的氨基酸残基的取代是294位或与其对应的位置的苏氨酸向丝氨酸的取代，47位或与其对应的位置的缬氨酸向异亮氨酸、苏氨酸、蛋氨酸或谷氨酰胺的取代，或者72位或与其对应的位置的组氨酸向蛋氨酸的取代。
[0176]
＜6＞一种提升4-氨基苯甲酸羟化活性的方法，其包括以下a
′
)～c
′
)所示的氨基酸残基的取代。
[0177]a′
)在由序列号2所示的氨基酸序列或与其具有至少47％的同一性的氨基酸序列构成、且具有4-氨基苯甲酸羟化活性的多肽中，将序列号2所示的氨基酸序列的47位或与其
对应的位置的氨基酸残基取代为亮氨酸。
[0178]b′
)在由序列号2所示的氨基酸序列或与其具有至少51％的同一性的氨基酸序列构成、且具有4-氨基苯甲酸羟化活性的多肽中，将序列号2所示的氨基酸序列的201位或222位、或者与201位或222位相应的位置的氨基酸残基取代为苯丙氨酸。
[0179]c′
)在由序列号2所示的氨基酸序列或与其具有至少90％的同一性的氨基酸序列构成、且具有4-氨基苯甲酸羟化活性的多肽中，将序列号2所示的氨基酸序列的47位、72位、210位、294位或385位、或者与47位、72位、210位、294位或385位相应的位置的氨基酸残基取代为下列氨基酸。
[0180]
(a)47位或与其对应的位置：异亮氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸、谷氨酰胺，
[0181]
(b)72位或与其对应的位置：丙氨酸、蛋氨酸，
[0182]
(c)210位或与其对应的位置：蛋氨酸，
[0183]
(d)294位或与其对应的位置：丙氨酸、甘氨酸、半胱氨酸、丝氨酸，
[0184]
(e)385位或与其对应的位置：缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、蛋氨酸。
[0185]
＜7＞如＜6＞所述的方法，其中，a
′
)所示的氨基酸残基的取代是由缬氨酸向亮氨酸的取代，b
′
)所示的氨基酸残基的取代是由酪氨酸向苯丙氨酸的取代，c
′
)所示的氨基酸残基的取代是294位或与其对应的位置的苏氨酸向丝氨酸的取代，47位或与其对应的位置的缬氨酸向异亮氨酸、苏氨酸、蛋氨酸或谷氨酰胺的取代，或者72位或与其对应的位置的组氨酸向蛋氨酸的取代。
[0186]
＜8＞一种提高4-氨基苯甲酸类的生产率的方法，其包括以下a
′
)～c
′
)所示的氨基酸残基的取代。
[0187]a′
)在使用由序列号2所示的氨基酸序列或与其具有至少47％的同一性的氨基酸序列构成、且具有4-氨基苯甲酸羟化活性的多肽制造4-氨基-3-羟基苯甲酸类时，将序列号2所示的氨基酸序列的47位或与其对应的位置的氨基酸残基取代为亮氨酸。
[0188]b′
)在由序列号2所示的氨基酸序列或与其具有至少51％的同一性的氨基酸序列构成、且具有4-氨基苯甲酸羟化活性的多肽中，将序列号2所示的氨基酸序列的201位或222位、或者与201位或222位相应的位置的氨基酸残基取代为苯丙氨酸。
[0189]c′
)在由序列号2所示的氨基酸序列或与其具有至少90％的同一性的氨基酸序列构成、且具有4-氨基苯甲酸羟化活性的多肽中，将序列号2所示的氨基酸序列的47位、72位、210位、294位或385位、或者与47位、72位、210位、294位或385位相应的位置的氨基酸残基取代为下列氨基酸。
[0190]
(a)47位或与其对应的位置：异亮氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸、谷氨酰胺，
[0191]
(b)72位或与其对应的位置：丙氨酸、蛋氨酸，
[0192]
(c)210位或与其对应的位置：蛋氨酸，
[0193]
(d)294位或与其对应的位置：丙氨酸、甘氨酸、半胱氨酸、丝氨酸，
[0194]
(e)385位或与其对应的位置：缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、蛋氨酸。
[0195]
＜9＞如＜8＞所述的方法，其中，a
′
)所示的氨基酸残基的取代是由缬氨酸向亮氨酸的取代，b
′
)所示的氨基酸残基的取代是由酪氨酸向苯丙氨酸的取代，c
′
)所示的氨基酸
残基的取代是294位或与其对应的位置的苏氨酸向丝氨酸的取代，47位或与其对应的位置的缬氨酸向异亮氨酸、苏氨酸、蛋氨酸或谷氨酰胺的取代，或者72位或与其对应的位置的组氨酸向蛋氨酸的取代。
[0196]
＜10＞一种编码＜1＞～＜3＞中任一项所述的多肽的多核苷酸。
[0197]
＜11＞一种包含＜10＞所述的多核苷酸的载体或dna片段。
[0198]
＜12＞一种包含＜11＞所述的载体或dna片段的转化细胞。
[0199]
＜13＞如＜12＞所述的转化细胞，其为大肠杆菌或棒状杆菌属菌。
[0200]
＜14＞一种＜12＞或＜13＞所述的转化细胞，其是能够提供4-氨基苯甲酸类的微生物。
[0201]
＜15＞如＜12＞或＜13＞所述的转化细胞，该转化细胞的4-氨基苯甲酸类的提供能力得到了提升。
[0202]
＜16＞一种4-氨基-3-羟基苯甲酸类的制造方法，其包括培养＜12＞～＜15＞中任一项所述的转化细胞的工序。
[0203]
＜17＞如＜16＞所述的方法，利用含有糖类作为碳源的培养基进行培养。
[0204]
＜18＞如＜16＞或＜17＞所述的方法，其包括从培养基回收4-氨基-3-羟基苯甲酸类的工序。
[0205]
＜19＞如＜16＞～＜18＞中任一项所述的方法，其中，培养在存在4-氨基苯甲酸类的条件下进行。
[0206]
＜20＞如＜16＞～＜19＞中任一项所述的方法，其中，4-氨基-3-羟基苯甲酸类为以下通式(1)所示的4-氨基-3-羟基苯甲酸衍生物。
[0207][0208]
〔式中，r1表示氢原子、羟基、甲氧基、氨基、氟原子、氯原子、溴原子、碘原子、羧基、甲基、乙基，r2表示氢原子或羟基、甲氧基、氨基、氟原子、氯原子、溴原子、碘原子、羧基、甲基或乙基，x1和x2为氢原子或羟基且至少一方表示羟基。〕
[0209]
＜21＞如＜19＞或＜20＞所述的方法，其中，4-氨基苯甲酸类为以下通式(2)所示的4-氨基苯甲酸衍生物。
[0210][0211]
〔式中，r1表示氢原子、羟基、甲氧基、氨基、氟原子、氯原子、溴原子、碘原子、羧基、甲基、乙基，r2表示氢原子或羟基、甲氧基、氨基、氟原子、氯原子、溴原子、碘原子、羧基、甲基或乙基。〕
[0212]
实施例
[0213]
以下，基于实施例对本发明进行更详细的说明，但本发明并不限定于此。
[0214]
实施例a1 4-氨基-3-羟基苯甲酸的生产
[0215]
在以下的实施例中，pcr使用prime star max premix(takara bio)进行。
[0216]
(1)包含编码野生型酶的基因的质粒的制作
[0217]
(a)质粒pecsf_gaps_pababc的制作
[0218]
将按照常规方法从谷氨酸棒状杆菌(corynebacterium glutamicum)atcc13032株提取的基因组作为模板，使用引物gn14_127(序列号13、tattaattaaatgcgcgttttaattattgataattatgattc)和gn14_133(序列号14、ttgcggccgcttgtttaaacctccttacagaaaaatggttgggcg)，利用pcr使包含编码4-氨基-4-脱氧分支酸合成酶和4-氨基-4-脱氧分支酸裂解酶的基因的dna片段扩增，将其插入质粒pecsf_gaps(参照日本特愿2015-25491)的paci部位与noti部位之间，由此得到质粒pecsf_gaps_pababc。
[0219]
(b)质粒pecsf_gaps_pababc_hfm122的制作
[0220]
将上述所得到的质粒pecsf_gaps_pababc作为模板，使用引物pababccory vec r(序列号15、aaatttaaacctcctttacagaaaaatggttgg)和pababccory vec f(序列号16、ggaggtttaaacaagcggccgcgatatc)利用pcr合成了载体用dna片段。接着，通过人工基因合成制作包含编码具有4-氨基苯甲酸羟化活性的多肽hfm122的基因(序列号1)的质粒，将其作为模板，使用引物pecsfdhfm122 f(序列号17、aggaggtttaaatttatgcgcactcaggtggctat)和pecsfd hfm122 r(序列号18、cttgtttaaacctccttatacgagtggcagtccta)利用pcr合成了插入用dna片段。对这些pcr产物利用dpni(takara bio)进行处理后，使用nucleospin gel and pcr clean-up(takara bio)对各dna片段进行精制，利用in-fusion hd cloning kit(takara bio)连接，由此构建了质粒pecsf_gaps_pababc_hfm122。使用所得到的质粒溶液对ecos competent e.coli dh5α株(nippon gene)进行转化，将细胞液涂布于lbkm琼脂培养基(bacto trypton 1％、酵母提取物0.5％、nacl 1％，硫酸卡那霉素50μg/ml、琼脂1.5％)后，以37℃静置一夜，对于所得到的菌落，使用sapphire amp(takara bio)和引物pababc poba for cpcr f(序列号19，gctatcaaaacattcggcacattggttttcc)、pababc poba for cpcr r(序列号20，ggaagatgcgtgatctgatccttcaactc)进行pcr反应，选择确认了目标dna片段导入的转化株。将所得到的转化株接种于lbkm液体培养基(bacto trypton 1％、酵母提取物0.5％、nacl 1％，硫酸卡那霉素50μg/ml)2ml中，以37℃培养一夜。由该培养液使用nucleospin plasmid easypure(takara bio)进行质粒的精制。
[0221]
(c)质粒pecsf_gaps_pababc_tud_hfm122的制作
[0222]
将上述所得到的质粒pecsf_gaps_pababc_hfm122作为模板，使用引物pabc last r(序列号21、ttacagaaaaatggttgggcgcaa)和hfm122 f(序列号22、atgcgcactcaggtggctatcg)利用pcr合成了载体用dna片段。接着，通过人工基因合成制作了使用包含谷氨酸棒状杆菌atcc13032株所具有的tuf基因(cg0587)的启动子(以下称为tu启动子)的dna片段(序列号23、tacgtacctgcaggtagcgtgtcagtaggcgcgtagggtaagtggggtagcggcttgttagatatcttgaaatcggctttcaacagcattgatttcgatgtatttagctggccgttaccctgcgaatgtccacagggtagctggtagtttgaaaatcaacgccgttgcccttaggattcagtaactggcacattttgtaatgcgctagatctgtgtgctcagtcttccaggctgcttatcacagtgaaagcaaaaccaattcgtggctgcgaaagtcgtagccaccacgaagtccaaaggaggatctaaattatgaataatataaaaggaggaattaattaa)，将其作为模板，使用引物pabc-ptu f(序列号24、accatttttctgtaatacgtacctgcaggtagcgtg)和ptu-hfm122 r(序列号25、cacctgagtgcgcatttaattaattcctcctttta)利用pcr合成了插入用dna片段。对
于这些pcr产物利用dpni(takara bio)进行处理后，使用nucleospin gel and pcr clean-up(takara bio)对各dna片段进行精制，利用in-fusion hd cloning kit(takara bio)连接，由此构建了质粒pecsf_gaps_pababc_tud_hfm122。使用所得到的质粒溶液对ecos competent e.coli dh5α株(nippon gene)进行转化，将细胞液涂布于lbkm琼脂培养基后，以37℃静置一夜，对于所得到的菌落，使用sapphire amp(takara bio)和引物ptu seq 1(序列号26，gcttgttagatatcttgaaatcggctttc)、pababc poba for cpcr r(序列号20，ggaagatgcgtgatctgatccttcaactc)进行pcr反应，选择确认了目标dna片段导入的转化株。将所得到的转化株接种于lbkm液体培养基2ml中，以37℃培养一夜。由该培养液使用nucleospin plasmid easypure(takara bio)进行质粒的精制。
[0223]
在所构建的质粒中，在gap启动子的控制下，编码4-氨基-4-脱氧分支酸合成酶和4-氨基-4-脱氧分支酸裂解酶的基因连接，并且在tu启动子的控制下，编码野生型hfm122的基因连接。
[0224]
(d)其它质粒的制作
[0225]
将上述所得到的质粒pecsf_gaps_pababc_tud_hfm122作为模板，使用引物pgapaba_tu vec f(序列号27、ggaggtttaaacaagcgg)和pgapaba_tu vec r(序列号28、aatttagatcctcctttggacttcgtg)利用pcr合成了载体用dna片段。接着，通过人工基因合成制作了包含编码具有4-氨基苯甲酸羟化活性的各多肽的基因(序列号3，5，7，9，11)的质粒，将其作为模板，使用表a1的“引物”一栏所示的引物，利用pcr合成了插入用dna片段。对于这些pcr产物利用dpni(takara bio)进行处理后，使用nucleospin gel and pcr clean-up(takara bio)对各dna片段进行精制，利用in-fusion hd cloning kit(takara bio)连接，由此构建了表1的“质粒”一栏所示的质粒。使用所得到的质粒对溶液ecos competent e.coli dh5α株(nippon gene)进行转化，将细胞液涂布于lbkm琼脂培养基后，以37℃静置过夜，对于所得到的菌落，使用sapphire amp(takara bio)和引物ptu seq 1(序列号26，gcttgttagatatcttgaaatcggctttc)、pababc poba for cpcr r(序列号20，ggaagatgcgtgatctgatccttcaactc)进行pcr反应，选择确认了目标dna片段导入的转化株。将所得到的转化株接种于lbkm液体培养基2ml中，以37℃培养一夜。利用培养液，使用nucleospin plasmid easypure(takara bio)进行质粒的精制。
[0226]
在所构建的质粒中，在gap启动子的控制下，编码4-氨基-4-脱氧分支酸合成酶和4-氨基-4-脱氧分支酸裂解酶的基因连接，并且在tu启动子的控制下，编码野生型羟化酶的基因连接。
[0227]
[表a1]
[0228][0229]
(2)包含编码突变型酶的基因的质粒的制作
[0230]
关于包含编码突变型酶的基因的质粒的制作，作为例示，以下表示包含编码hfm77的47位的缬氨酸被取代为亮氨酸的突变型酶的基因的质粒的制作。
[0231]
将质粒pecsf_gaps_pababc_tu_hfm77作为模板，使用互补引物hfm77 v47l f(序列号39、gccgggctcctggaacagtctacggtt)、hfm77 v47l r(序列号40、ttccaggagcccggcgcggatggtctg)利用pcr构建了质粒pecsf_gaps_pababc_tu_hfm77_v47l。对于pcr产物利用dpni(takara bio)进行处理，使用处理后的液体，对ecos competent e.coli dh5α株(nippon gene)进行转化，将细胞液涂布于lbkm琼脂培养基后，以37℃静置一夜，选取所得到的菌落作为转化株。将转化株接种于lbkm液体培养基2ml中，以37℃培养一夜。由该培养液使用nucleospin plasmid easypure(takara bio)进行质粒的精制。
[0232]
同样，使用表a2的“模板”所示的质粒代替质粒pecsf_gaps_pababc_tu_hfm77，使用表a2的“引物”所示的引物代替引物hfm77 v47l f和hfm77 v47l r，利用pcr得到了包含编码各酶突变体的基因的质粒。
[0233]
[表a2]
[0234][0235]
(3)将质粒导入宿主细胞
[0236]
使用上述所得到的各质粒，利用电穿孔法(bio-rad)对谷氨酸棒状杆菌drhg145株(参照日本特愿2014-523757)进行转化。将所得到的转化细胞液涂布于lbkm琼脂培养基后，以30℃静置2日，将所得到的菌落作为转化株。
[0237]
(4)转化株的培养
[0238]
将上述所得到的转化株分别接种于表a3所示的cgye培养基(含有硫酸卡那霉素50μg/ml)1ml中，以30℃培养一夜。将所得到的培养液100μl接种于表a4所示的cgxii培养基(含有硫酸卡那霉素50μg/ml)10ml中，以30℃培养约48小时后，将利用离心分离除去菌体后的产物作为培养上清。按照参考例1的方法将所得到的培养上清中的4-氨基-3-羟基苯甲酸浓度定量，按照下式算出4-氨基-3-羟基苯甲酸的生产能力提高率。在此，“wt”表示“导入了包含编码野生型酶的基因的质粒的转化株”，“mt”表示“由包含编码该野生型酶的基因的质粒制成的导入了包含编码突变型酶的基因的质粒的转化株”。
[0239]
(数学式1)
[0240]
生产能力提高率＝mt的4-氨基-3-羟基苯甲酸生产能力/wt的4-氨基-3-羟基苯甲酸生产能力
[0241]
[表a3]
[0242]
cgye培养基组成(每1l)
[0243]
葡萄糖50g(nh4)2so420g尿素5gkh2po41gk2hpo41gmgso4·
7h2o0.25gcacl2·
2h2o10mgfeso4·
7h2o10mgmnso4·
5h2o10mgznso4·
7h2o1mgcuso4·
5h2o0.2mgnicl2·
6h2o0.02mg生物素(ph7)0.2mg酵母提取物1g
[0244]
[表a4]
[0245]
cgxii培养基组成(每1l)
[0246]
葡萄糖50g(nh4)2so420g尿素5gkh2po41gk2hpo41gmgso4·
7h2o0.25gcacl2·
2h2o10mgfeso4·
7h2o10mgmnso4·
5h2o10mgznso4·
7h2o1mg
cuso4·
5h2o0.2mgnicl2·
6h2o0.02mg生物素(ph7)0.2mg胰蛋白胨10g
[0247]
(5)结果
[0248]
如表a5所示，导入了各突变型酶的菌株与导入了野生型酶的菌株相比，4-氨基-3-羟基苯甲酸的生产能力提高。
[0249]
[表a5]
[0250][0251]
实施例b1 4-氨基-3-羟基苯甲酸的生产
[0252]
在以下的实施例中，pcr使用primestar max premix(takara bio)进行。
[0253]
(1)包含编码野生型酶的基因的质粒的制作
[0254]
(a)质粒pecsf_gaps_pababc的制作
[0255]
将按照常规方法从谷氨酸棒状杆菌(corynebacterium glutamicum)atcc13032株提取的基因组作为模板，使用引物gn14_127(序列号13、tattaattaaatgcgcgttttaattattgataattatgattc)和gn14_133(序列号14、ttgcggccgcttgtttaaacctccttacagaaaaatggttgggcg)，利用pcr使包含编码4-氨基-4-脱氧分支酸合成酶和4-氨基-4-脱氧分支酸裂解酶的基因的dna片段扩增，将其插入质粒pecsf_gaps(参照日本特愿2015-25491)的paci部位与noti部位之间，由此得到了质粒pecsf_gaps_pababc。
[0256]
(b)质粒pecsf_gaps_pababc_hfm122的制作
[0257]
将上述所得到的质粒pecsf_gaps_pababc作为模板，使用引物pababccory vec r(序列号15、aaatttaaacctcctttacagaaaaatggttgg)和pababccory vec f(序列号16、ggaggtttaaacaagcggccgcgatatc)，利用pcr合成了载体用dna片段。接着，通过人工基因合成了制作包含编码具有4-氨基苯甲酸羟化活性的多肽hfm122的基因(序列号1)的质粒，将其作为模板，使用引物pecsfd hfm122 f(序列号17、aggaggtttaaatttatgcgcactcaggtggctat)和pecsfd hfm122 r(序列号18、cttgtttaaacctccttatacgagtggcagtccta)，利用pcr合
成了插入用dna片段。对于这些pcr产物利用dpni(takara bio)进行处理后，使用nucleospin gel and pcr clean-up(takara bio)对各dna片段进行精制，利用in-fusion hd cloning kit(takara bio)连接，由此构建了质粒pecsf_gaps_pababc_hfm122。使用所得到的质粒溶液对ecos competent e.coli dh5α株(nippon gene)进行转化，将细胞液涂布于lbkm琼脂培养基(bacto trypton 1％、酵母提取物0.5％、nacl 1％，硫酸卡那霉素50μg/ml、琼脂1.5％)后，以37℃静置一夜，对于所得到的菌落，使用sapphire amp(takara bio)和引物pababc poba for cpcr f(序列号19，gctatcaaaacattcggcacattggttttcc)、pababc poba for cpcr r(序列号20，ggaagatgcgtgat ctgatccttcaactc)进行pcr反应，选择确认了目标dna片段导入的转化株。将所得到的转化株接种于lbkm液体培养基(bacto trypton 1％、酵母提取物0.5％、nacl 1％、硫酸卡那霉素50μg/ml)2ml中，以37℃培养一夜。由该培养液使用nucleospin plasmid easypure(takara bio)进行质粒的精制。
[0258]
(c)质粒pecsf_gaps_pababc_tud_hfm122的制作
[0259]
将上述所得到的质粒pecsf_gaps_pababc_hfm122作为模板，使用引物pabc last r(序列号21、ttacagaaaaatggttgggcgcaa)和hfm122 f(序列号22、atgcgcactcaggtgg ctatcg)，利用pcr合成了载体用dna片段。接着，通过人工基因合成了制作包含谷氨酸棒状杆菌atcc13032株所具有的tuf基因(cg0587)的启动子(以下称为tu启动子)的dna片段(序列号23、tacgtacctgcaggtagcgtgtcagtaggcgcgtagggtaagtggggtagcggcttgttagatatcttgaaatcggctttcaacagcattgatttcgatgtatttagctggccgttaccctgcgaatgtccacagggtagctggtagtttgaaaatcaacgccgttgcccttaggattcagtaactggcacattttgtaatgcgctagatctgtgtgctcagtcttccaggctgcttatcacagtgaaagcaaaaccaattcgtggctgcgaaagtcgtagccaccacgaagtccaaaggaggatctaaattatgaataatataaaaggaggaattaattaa)，将其作为模板，使用引物pabc-ptu f(序列号24、accatttttctgtaatacgtacctgcaggtagcgtg)和ptu-hfm122 r(序列号25、cacctgagtgcgcatttaattaattcctcctttta)，利用pcr合成了插入用dna片段。对于这些pcr产物利用dpni(takara bio)进行处理后，使用nucleospingel and pcr clean-up(takara bio)对各dna片段进行精制，利用in-fusion hd cloning kit(takara bio)连接，由此构建了质粒pecsf_gaps_pababc_tud_hfm122。使用所得到的质粒溶液对ecos competent e.coli dh5α株(nippon gene)进行转化，将细胞液涂布于lbkm琼脂培养基后，以37℃静置一夜，对于所得到的菌落，使用sapphire amp(takara bio)和引物ptu seq 1(序列号26，gcttgttagatatcttgaaatcggctttc)、pababc poba for cpcr r(序列号20，ggaagatgcgtgatctgatccttcaactc)，进行pcr反应，选择确认了目标dna片段导入的转化株。将所得到的转化株接种于lbkm液体培养基2ml中，以37℃培养一夜。由该培养液使用nucleospin plasmid easypure(takara bio)进行质粒的精制。
[0260]
在所构建的质粒中，在gap启动子的控制下，编码4-氨基-4-脱氧分支酸合成酶和4-氨基-4-脱氧分支酸裂解酶的基因连接，并且在tu启动子的控制下，编码野生型hfm122的基因连接。
[0261]
(d)其它质粒的制作
[0262]
将上述所得到的质粒pecsf_gaps_pababc_tud_hfm122作为模板，使用引物pgapaba_tu vec f(序列号27、ggaggtttaaacaagcgg)和pgapaba_tu vec r(序列号28、aatttagatcctcctttggacttcgtg)，利用pcr合成了载体用dna片段。接着，通过人工基因合成
制作包含编码具有4-氨基苯甲酸羟化活性的各多肽的基因(序列号3，5，7)的质粒，将其作为模板，使用表b1的“引物”一栏所示的引物，利用pcr合成了插入用dna片段。对于这些pcr产物利用dpni(takara bio)进行处理后，使用nucleospin gel and pcr clean-up(takara bio)对各dna片段进行精制，利用in-fusion hd cloning kit(takara bio)连接，由此构建了表b1的“质粒”一栏所示的质粒。使用所得到的质粒溶液对ecos competent e.coli dh5α株(nippon gene)进行转化，将细胞液涂布于lbkm琼脂培养基后，以37℃静置一夜，对于所得到的菌落，使用sapphire amp(takara bio)和引物ptu seq 1(序列号26，gcttgttagatatcttgaaatcggctttc)、pababc poba for cpcr r(序列号20，ggaagatgcgtgatctgatccttcaactc)，进行pcr反应，选择确认了目标dna片段导入的转化株。将所得到的转化株接种于lbkm液体培养基2ml中，以37℃培养一夜。由该培养液使用nucleospin plasmid easypure(takara bio)进行质粒的精制。
[0263]
在所构建的质粒中，在gap启动子的控制下，编码4-氨基-4-脱氧分支酸合成酶和4-氨基-4-脱氧分支酸裂解酶的基因连接，并且在tu启动子的控制下，编码野生型羟化酶的基因连接。
[0264]
[表b1]
[0265][0266]
(2)包含编码突变型酶的基因的质粒的制作
[0267]
关于包含编码突变型酶的基因的质粒的制作，作为例示，以下表示包含编码hfm77的201位的酪氨酸被取代为苯丙氨酸的突变型酶的基因的质粒的制作。
[0268]
将质粒pecsf_gaps_pababc_tu_hfm77作为模板，使用互补引物hfm77 y201f f(序列号51、ctcatcttcgcacatcacgaccgcgga)、hfm77 y201f r(序列号52、atgtgcgaagatgagctcttcggatga)利用pcr构建了质粒pecsf_gaps_pababc_tu_hfm77_y201f。对于pcr产物利用dpni(takara bio)进行处理，使用处理后的液体对ecos competent e.coli dh5α株(nippon gene)进行转化。将细胞液涂布于lbkm琼脂培养基后，以37℃静置一夜，选取所得到的菌落作为转化株。将转化株接种于lbkm液体培养基2ml中，以37℃培养一夜。由该培养液使用nucleospin plasmid easypure(takara bio)进行质粒的精制。
[0269]
同样，使用表b2的“模板”所示的质粒代替质粒pecsf_gaps_pababc_tu_hfm77，使用表b2的“引物”所示的引物代替引物hfm77 y201f f和hfm77 y201f r，利用pcr得到了包含编码各酶突变体的基因的质粒。
[0270]
[表b2]
[0271][0272]
(3)将质粒导入宿主细胞
[0273]
使用上述所得到的各质粒，利用电穿孔法(bio-rad)对谷氨酸棒状杆菌drhg145株(参照日本特愿2014-523757)进行转化。将所得到的转化细胞液涂布于lbkm琼脂培养基后，以30℃静置2日，将所得到的菌落作为转化株。
[0274]
(4)转化株的培养
[0275]
将上述所得到的转化株分别接种于表b3所示的cgye培养基(含有硫酸卡那霉素50μg/ml)1ml中，以30℃培养一夜。将所得到的培养液100μl接种于表b4所示的cgxii培养基(含有硫酸卡那霉素50μg/ml)10ml中，以30℃培养约48小时后，将利用离心分离除去菌体后的产物作为培养上清。按照参考例1的方法将所得到的培养上清中的4-氨基-3-羟基苯甲酸浓度定量，按照下式算出4-氨基-3-羟基苯甲酸的生产能力提高率。在此，“wt”表示“导入了包含编码野生型酶的基因的质粒的转化株”，“mt”表示“由包含编码该野生型酶的基因的质粒制成的导入了包含编码突变型酶的基因的质粒的转化株”。
[0276]
(数学式1)
[0277]
生产能力提高率＝mt的4-氨基-3-羟基苯甲酸生产能力/wt的4-氨基-3-羟基苯甲酸生产能力
[0278]
[表b3]
[0279]
cgye培养基组成(每1l)
[0280]
葡萄糖50g(nh4)2so420g尿素5gkh2po41gk2hpo41gmgso4·
7h2o0.25gcacl2·
2h2o10mg
feso4·
7h2o10mgmnso4·
5h2o10mgznso4·
7h2o1mgcuso4·
5h2o0.2mgnicl2·
6h2o0.02mg生物素(ph7)0.2mg酵母提取物1g
[0281]
[表b4]
[0282]
cgxii培养基组成(每1l)
[0283]
葡萄糖50g(nh4)2so420g尿素5gkh2po41gk2hpo41gmgso4·
7h2o0.25gcacl2·
2h2o10mgfeso4·
7h2o10mgmnso4·
5h2o10mgznso4·
7h2o1mgcuso4·
5h2o0.2mgnicl2·
6h2o0.02mg生物素(ph7)0.2mg胰蛋白胨10g
[0284]
(5)结果
[0285]
如表b5所示，导入了各突变型酶的菌株与导入了野生型酶的菌株相比，4-氨基-3-羟基苯甲酸的生产能力提高。
[0286]
[表b5]
[0287]
羟化酶4-氨基-3-羟基苯甲酸的生产能力(g/l)生产能力提高率hfm77 wt0.0731.00hfm77 y201f0.1141.56hfm77 y222f0.1001.37hfm122 wt0.1341.00hfm122 y201f0.2241.67hfm122 y222f0.2561.90hfm339 wt0.0161.00hfm339 y201f0.0613.80hfm339 y222f0.1398.74hfm388 wt0.0331.00hfm388 y201f0.0792.38
hfm388 y222f0.2306.95
[0288]
实施例c1 4-氨基-3-羟基苯甲酸的生产
[0289]
在以下的实施例中，pcr使用primestar max premix(takara bio)进行。
[0290]
(1)包含编码野生型酶的基因的质粒的制作
[0291]
(a)质粒pecsf_gaps_pababc的制作
[0292]
将按照常规方法从谷氨酸棒状杆菌(corynebacterium glutamicum)atcc13032株提取的基因组作为模板，使用引物gn14_127(序列号13、tattaattaaatgcgcgttttaattattgataattatgattc)和gn14_133(序列号14、ttgcggccgcttgtttaaacctccttacagaaaaatggttgggcg)，利用pcr使包含编码4-氨基-4-脱氧分支酸合成酶和4-氨基-4-脱氧分支酸裂解酶的基因的dna片段扩增，将其插入质粒pecsf_gaps(参照日本特愿2015-25491)的paci部位与noti部位之间，由此得到了质粒pecsf_gaps_pababc。
[0293]
(b)质粒pecsf_gaps_pababc_hfm122的制作
[0294]
将上述所得到的质粒pecsf_gaps_pababc作为模板，使用引物pababccory vec r(序列号15、aaatttaaacctcctttacagaaaaatggttgg)和pababccory vec f(序列号16、ggaggtttaaacaagcggccgcgatatc)，利用pcr合成了载体用dna片段。接着，通过人工基因合成制作了包含编码具有4-氨基苯甲酸羟化活性的多肽hfm122的基因(序列号1)的质粒，将其作为模板，使用引物pecsfd hfm122 f(序列号17、aggaggtttaaatttatgcgcactcaggtggctat)和pecsfd hfm122 r(序列号18、cttgtttaaacctccttatacgagtggcagtccta)，利用pcr合成了插入用dna片段。对于这些pcr产物利用dpni(takara bio)进行处理后，使用nucleospin gel and pcr clean-up(takara bio)对各dna片段进行精制，利用in-fusion hd cloning kit(takara bio)连接，由此构建了质粒pecsf_gaps_pababc_hfm122。使用所得到的质粒溶液对ecos competent e.coli dh5α株(nippon gene)进行转化，将细胞液涂布于lbkm琼脂培养基(bacto trypton 1％、酵母提取物0.5％、nacl 1％，硫酸卡那霉素50μg/ml、琼脂1.5％)后，以37℃静置一夜，对于所得到的菌落，使用sapphire amp(takara bio)和引物pababc poba for cpcr f(序列号19，gctatcaaaacattcggcacattggttttcc)、pababc poba for cpcr r(序列号20，ggaagatgcgtgatctgatccttcaactc)进行pcr反应，选择确认了目标dna片段导入的转化株。将所得到的转化株接种于lbkm液体培养基(bacto trypton 1％、酵母提取物0.5％、nacl 1％，硫酸卡那霉素50μg/ml)2ml中，以37℃培养一夜。由培养液使用nucleospin plasmid easypure(takara bio)进行质粒的精制。
[0295]
(c)质粒pecsf_gaps_pababc_tud_hfm122的制作
[0296]
将上述所得到的质粒pecsf_gaps_pababc_hfm122作为模板，使用引物pabc last r(序列号21、ttacagaaaaatggttgggcgcaa)和hfm122 f(序列号22、atgcgcactcaggt ggctatcg)，利用pcr合成载体用dna片段。接着，通过人工基因合成制作包含谷氨酸棒状杆菌atcc13032株所具有的tuf基因(cg0587)的启动子(以下成为tu启动子)的dna片段(序列号23、tacgtacctgcaggtagcgtgtcagtaggcgcgtagggtaagtggggtagcggcttgttagatatcttgaaatcggctttcaacagcattgatttcgatgtatttagctggccgttaccctgcgaatgtccacagggtagctggtagtttgaaaatcaacgccgttgcccttaggattcagtaactggcacattttgtaatgcgctagatctgtgtgctcagtcttccaggctgcttatcacagtgaaagcaaaaccaattcgtggctgcgaaagtcgtagccaccacgaagtccaaaggaggatctaaattatgaataatataaaaggaggaattaattaa)，将其作为模板，使用引物pabc-ptu f
(序列号24、accatttttctgtaatacgtacctgcaggtagcgtg)和ptu-hfm122 r(序列号25、cacctgagtgcgcatttaattaattcctcctttta)，利用pcr合成了插入用dna片段。对于这些pcr产物进行利用dpni(takara bio)的处理后，使用nucleospin gel and pcr clean-up(takara bio)对各dna片段进行精制，利用in-fusion hd cloning kit(takara bio)连接，由此构建了质粒pecsf_gaps_pababc_tud_hfm122。使用所得到的质粒溶液对ecos competent e.coli dh5α株(nippon gene)进行转化，将细胞液涂布于lbkm琼脂培养基后，以37℃静置一夜，对于所得到的菌落，使用sapphire amp(takara bio)和引物ptu seq 1(序列号26，gcttgttagatatcttgaaatcggctttc)、pababc poba for cpcr r(序列号20，ggaagatgcgtgatctgatccttcaactc)进行pcr反应，选择确认了目标dna片段导入的转化株。将所得到的转化株接种于lbkm液体培养基2ml中，以37℃培养一夜。由该培养液使用nucleospin plasmid easypure(takara bio)进行质粒的精制。
[0297]
在所构建的质粒中，在gap启动子的控制下，编码4-氨基-4-脱氧分支酸合成酶和4-氨基-4-脱氧分支酸裂解酶的基因连接，并且在tu启动子的控制下，编码野生型hfm122的基因连接。
[0298]
(2)包含编码突变型酶的基因的质粒的制作
[0299]
关于包含编码突变型酶的基因的质粒的制作，作为例示，以下表示包含编码hfm122的47位的缬氨酸被取代为异亮氨酸的突变型酶的基因的质粒的制作。
[0300]
将质粒pecsf_gaps_pababc_tud_hfm122作为模板，使用互补引物hfm122 v47i f(序列号67、gctggtattctggaacgtatcacggtg)、hfm122 v47i r(序列号68、ttccagaataccagcccgaactcggcc)，利用pcr构建质粒pecsf_gaps_pababc_tud_hfm122_v47i。对于pcr产物利用dpni(takara bio)进行处理，使用处理后的液体对ecos competent e.coli dh5α株(nippon gene)进行转化，将细胞液涂布于lbkm琼脂培养基后，以37℃静置一夜，选取所得到的菌落作为转化株。将转化株接种于lbkm液体培养基2ml中，以37℃培养一夜。由该培养液使用nucleospin plasmid easypure(takara bio)进行质粒的精制。
[0301]
同样，使用表c1的“引物”所示的引物代替引物hfm122 v47i f和hfm122 v47i r，利用pcr得到了包含编码各酶突变体的基因的质粒。
[0302]
[表c1]
[0303][0304]
(3)将质粒导入宿主细胞
[0305]
使用上述所得到的各质粒，利用电穿孔法(bio-rad)对谷氨酸棒状杆菌drhg145株(参照日本特愿2014-523757)进行转化。将所得到的转化细胞液涂布于lbkm琼脂培养基后，以30℃静置2日，将所得到的菌落作为转化株。
[0306]
(4)转化株的培养
[0307]
将上述所得到的转化株分别接种于表c2所示的cgye培养基(含有硫酸卡那霉素50μg/ml)1ml，以30℃培养一夜。将所得到的培养液100μl接种于表c3所示的cgxii培养基(含
有硫酸卡那霉素50μg/ml)10ml中，以30℃培养48小时后，将利用离心分离除去菌体后的产物作为培养上清。按照参考例1的方法将所得到的培养上清中的4-氨基-3-羟基苯甲酸浓度定量，按照下式算出4-氨基-3-羟基苯甲酸的生产能力提高率。在此，“wt”表示“导入了包含编码野生型酶的基因的质粒的转化株”，“mt”表示“由包含编码该野生型酶的基因的质粒制成的导入了包含编码突变型酶的基因的质粒的转化株”。
[0308]
(数学式1)
[0309]
生产能力提高率＝mt的4-氨基-3-羟基苯甲酸生产能力/wt的4-氨基-3-羟基苯甲酸生产能力
[0310]
[表c2]
[0311]
cgye培养基组成(每1l)
[0312]
葡萄糖50g(nh4)2so420g尿素5gkh2po41gk2hpo41gmgso4·
7h2o0.25gcacl2·
2h2o10mgfeso4·
7h2o10mgmnso4·
5h2o10mgznso4·
7h2o1mgcuso4·
5h2o0.2mgnicl2·
6h2o0.02mg生物素(ph7)0.2mg酵母提取物1g
[0313]
[表c3]
[0314]
cgxii培养基组成(每1l)
[0315]
葡萄糖50g(nh4)2so420g尿素5gkh2po41gk2hpo41gmgso4·
7h2o0.25gcacl2·
2h2o10mgfeso4·
7h2o10mgmnso4·
5h2o10mgznso4·
7h2o1mgcuso4·
5h2o0.2mgnicl2·
6h2o0.02mg生物素(ph7)0.2mg
胰蛋白胨10g
[0316]
(5)结果
[0317]
如表c4所示，导入了各突变型酶的菌株与导入了野生型酶的菌株相比，4-氨基-3-羟基苯甲酸的生产能力提高。
[0318]
[表c4]
[0319][0320]
参考例1 4-氨基-3-羟基苯甲酸的定量
[0321]
4-氨基-3-羟基苯甲酸的定量通过hplc进行。供于hplc分析的反应液利用0.1％磷酸适当稀释后，使用acroprep 96孔滤板(0.2μmghp膜、日本pall corporation)除去不溶物。
[0322]
hplc装置使用chromaster(株式会社日立高新技术)。分析柱使用l-柱ods(4.6mm i.d.
×
150mm、化学物质评价研究机构)，洗脱液a为0.1m磷酸二氢钾的0.1％磷酸溶液，洗脱液b为70％甲醇，以流速1.0ml/分钟、柱温40℃的条件进行梯度洗脱。4-氨基-3-羟基苯甲酸的检出使用uv检测器(检测波长280nm)。使用标准试样〔4-氨基-3-羟基苯甲酸(销售商代码a1194、东京化成工业株式会社)〕制作浓度校准曲线，基于浓度校准曲线进行4-氨基-3-羟基苯甲酸的定量。