测定阿托伐他汀钙片体外溶出的方法及应用与流程

1.本发明涉及药物分析技术领域，具体涉及一种测定阿托伐他汀钙片体外溶出的方法及应用。


背景技术：

2.对化学仿制药口服固体制剂而言，与参比制剂的溶出曲线一致或具有相似性，是评价仿制药与参比制剂质量一致性的重要指标之一。而口服固体制剂的体外溶出行为受到原料的晶型和粒度、辅料的种类和用量、原料微粉化技术、片剂制备工艺等诸多因素的影响。制剂中的辅料一般较难与主药发生化学反应，但可以通过吸附药物、改变颗粒表面性质、改变溶出介质的ph值或黏度等影响口服固体制剂的溶出行为。
3.阿托伐他汀钙片是辉瑞制药有限公司开发的一种口服给药的hmg-co a还原酶的选择性、竞争性抑制剂，商品名为lipitor，通过抑制细胞内胆固醇合成的限速酶hmg-coa，使细胞内ldl合成减少，上调ldlr 受体含量，使血浆中ldl-c被大量摄入到细胞内，从而降低了血浆中ldl 的含量。主要用于高胆固醇血症、冠心病或冠心病等危症（如：症状性动脉粥样硬化性，糖尿病疾病等）合并高胆固醇血症或混合型血脂异常的治疗，是目前临床应用最广泛的一类药物。阿托伐他汀钙口服后吸收迅速；1~2小时内血浆浓度达峰(cmax)。吸收程度随阿托伐他汀钙的剂量成正比例增加。阿托伐他汀钙（母体药物）的绝对生物利用度约为14%。系统生物利用度较低的原因在于进入体循环前胃肠粘膜清除和肝脏首过效应，该药物在小肠部位吸收。
4.阿托伐他汀钙片属于高变异性药物，其生物不等效性风险较高，由于个体内差异性较大，极可能导致发生统计学上的错误。高变异性药物采用参比制剂自身比较，也存在生物不等效的风险。基于此，在进行阿托伐他汀钙片的溶出过程中，体内外相关研究具有重要意义。通过研究阿托伐他汀钙片受试制剂的体外溶出过程与参比制剂的溶出过程的一致性，得到较好的区分度以真实反映其在体内实际的溶出行为，以恰当地模拟药物的溶出/吸收机理，为良好预测人体生物等效性提供参考。
5.申请号为cn202110173192.6的中国专利公开了一种测定非洛地平缓释片体外溶出的方法，将非洛地平缓释片利用二室模型实验装置进行溶出，溶出介质为0.3%十二烷基硫酸钠的ph 6.8磷酸盐缓冲液，将非洛地平缓释片置于转篮中，转篮的转速为100 rpm，溶出液经滤膜过滤后持续提取溶出液，溶出液的提取速度与溶出介质的补充速度均为5~12 ml/min测定溶出液中非洛地平的浓度，直至非洛地平缓释片溶出完成；采用高效液相测定溶出液中在不同时间点的非洛地平的平均溶出浓度。该方法针对非洛地平缓释片，应用于阿托伐他汀钙片的溶出过程具有一定的局限性，不适用。
6.因此，开发一种模拟阿托伐他汀钙片在体内吸收的体外溶出方法，对于医药企业来说具有重要的意义。


技术实现要素：

7.为解决上述技术问题，本发明的目的在于提供一种测定阿托伐他汀钙片体外溶出的方法及应用，通过模拟体内溶出和吸收的动态持续过程，测定阿托伐他汀钙片溶出浓度，进而实现良好预测人体生物等效性。
8.为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：一方面，本发明提供一种测定阿托伐他汀钙片体外溶出的方法，利用模拟难溶性口服药物制剂体内溶出和跨膜吸收过程的二室模型实验装置检测阿托伐他汀钙片在不同溶出时间点的累积溶出度，并绘制溶出曲线。
9.进一步地，所述阿托伐他汀钙片经过研磨后进行检测。
10.进一步地，所述研磨可以是手工研磨或球磨。进一步地，所述研磨可以用研钵、研磨机、球磨机或借助机械力可以进行研磨的设备进行。
11.进一步地，所述手工研磨在材质为玻璃、不锈钢、玛瑙、氧化铝或氧化锆的研钵中进行，所述研磨的速度为10～60转/min，研磨时间为0.1～20 min。优选地，所述研磨的速度为10～30转/min，研磨时间为0.1～5 min。
12.进一步地，所述球磨在球磨机中进行，所述球磨的转速为1～100转/秒，球磨时间为1～120 s。其中，球磨珠为球形或圆柱形，直径为1～30 mm，材质为不锈钢、氧化铝 或氧化锆陶瓷。通过上述的手工研磨或者球磨工艺，使固体制剂变粉末状，粒径分布和形貌基本达到一致，无肉眼可见颗粒即可。本技术的发明人通过意外发现研磨过程在一定程度上模拟药物在体内崩解后的情况，更利于溶出体内外相关性的研究。
13.进一步地，所述研磨过的阿托伐他汀钙片呈粉末状，没有肉眼可见颗粒即可。进一步地，所述研磨过的阿托伐他汀钙片的粒径为0.001～1 mm；优选粒径在0.01~0.5 mm，0.01~0.1mm。
14.进一步地，所述二室模型实验装置内流动的溶出介质为水或ph4~7的磷酸盐缓冲液。
15.进一步地，所述溶出介质为水或ph6.8的磷酸盐缓冲液。
16.进一步地，所述方法的具体步骤为：1）溶出介质经进液泵作用进入多孔滤膜杯，待多孔滤膜杯和外室溶出杯中溶出介质体积相同时，开启出液泵，进液泵和出液泵的工作频率一致，保持溶出介质的总体积不变；2）将研磨过的阿托伐他汀钙片置于多孔滤膜杯中，经安装转篮的支架旋转搅拌，溶出液经滤膜过滤后持续提取溶出液，在不同的固定的时间点取样测定溶出液中阿托伐他汀钙的浓度，直至阿托伐他汀钙片溶出完成；3）利用高效液相色谱法测定溶出液中在不同时间点的阿托伐他汀钙的累积溶出度，并绘制累积溶出量与时间的溶出曲线图。
17.进一步地，所述二室模型实验装置中转篮的支架的转速为50~300 rpm。优选地，所述转篮的支架的转速为50、100、150 rpm。在该转速条件下，在多孔滤膜杯中形成涡旋，溶出度高，不会出现水动力学紊乱。
18.进一步地，所述溶出液的提取速度与溶出介质的补充速度均为3~12 ml/min。
19.进一步地，所述溶出液的提取速度与溶出介质的补充速度为3 ml/min、4 ml/min、
5 ml/min、6 ml/min、8 ml/min、10 ml/min或12 ml/min。
20.进一步地，所述固定的时间点为5、10、20、30、45、60、90、120、150、180 min等等，直至阿托伐他汀钙片溶出完成。所述阿托伐他汀钙片在180min，完全溶出，在转篮中没有残留物，大大提升片溶出的质量可控性和溶出度的稳定性。
21.进一步地，所述溶出液中阿托伐他汀钙的浓度采用高效液相测定，具体过程为：将溶出液进行离心处理后，精密量取20 μl ，注入高效液相色谱仪中，记录色谱图，计算对应的阿托伐他汀钙的浓度；所述离心处理条件为：3号转子，10000rpm，3 min。
22.进一步地，高效液相仪的色谱条件：色谱柱：kromasil c
18 ，12.5 cm
×
4.0 mm，5
ꢀµ
m；流动相：0.05 mol/l柠檬酸溶液(用氨水调节p h值至7.4)，并和乙腈按照乙腈：柠檬酸溶液=45∶55混合)；流速：1 ml/min；柱温：35 ℃；检测波长为：260 nm；进样量:10 μl。
23.进一步地，所述阿托伐他汀钙片包括参比制剂和受试制剂，采用相似因子法，利用阿托伐他汀钙片的参比制剂和受试制剂的平均溶出浓度数据，计算相似因子f2，所述相似因子f2用于比较阿托伐他汀钙片的参比制剂溶出曲线和受试制剂溶出曲线的相似性；利用相似因子f2的值判断相似性时，相似因子f2≥50时，阿托伐他汀钙片的参比制剂和受试制剂的溶出度曲线相似，相似因子f2《50时，阿托伐他汀钙片的参比制剂和受试制剂的溶出度曲线不相似。
24.进一步地，所述溶出介质的温度控制在（37
±
0.5）℃。通过实验证明，溶出介质的温度使得阿托伐他汀钙具有较高的稳定性，同时也利于模拟人体内温度，测得的溶出曲线更接近体内吸收的趋势。
25.进一步地，所述模拟难溶性口服药物制剂体内溶出和跨膜吸收过程的二室模型实验装置在申请号为cn201920858418.4的中国专利公开了。
26.进一步地，所述阿托伐他汀钙片的规格为10 mg。
27.另一方面，本发明提供一种阿托伐他汀钙固体制剂质量的评价方法，将阿托伐他汀钙固体制剂研磨后利用模拟难溶性口服药物制剂体内溶出和跨膜吸收过程的二室模型实验装置检测其在不同溶出时间点的累积溶出度，并绘制溶出曲线；对比参比制剂阿托伐他汀钙固体制剂与受试制剂阿托伐他汀钙固体制剂的溶出曲线之间的差异，评价受试制剂的质量。
28.一方面，本发明提供一种测定阿托伐他汀钙固体制剂溶出的方法或阿托伐他汀钙固体制剂质量的评价在阿托伐他汀钙固体制剂参比制剂和受试制剂一致性评价中的应用。
29.本发明体外溶出方法通过模拟体内吸收过程，保证体外溶出实验的准确性，实现体外溶出实验测定的溶出曲线与体内吸收过程一致，为实现良好预测人体生物等效性提供保障。
30.与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：本发明方法通过利用二室模型模拟阿托伐他汀钙片在体内的吸收/溶出情况，保证体外溶出实验的准确度，实现体外溶出曲线与be实验体内吸收药时曲线趋势一致，实现体内外相关；不仅可评价阿托伐他汀钙片药物制剂的优劣，区分阿托伐他汀钙片单位时间内的溶出能力，还能指导制剂研发，也为生物等效性做出预测，提高生物等效性实验的成功率，保证药品上市后的生物有效性，降低研发风险。
31.本发明采用二室模型实现提供连续的新鲜溶出介质，模拟体内消化液流动过程，
满足难溶性药物的漏槽条件；通过改变溶出介质、转速、提取速度和补充速度、取样时间点以及预处理方式-研磨等实验溶出参数，实现对人体胃肠道生理环境的动态模拟，比现有浆法、篮法、流通池法更接近体内流体动力学，使得溶出曲线曲线与体内吸收药时曲线一致，实现体内外一致性，受试制剂和参比制剂之间的曲线具有更好的区分度，利于有效评价仿制受试制剂的质量，为药品批间质量的一致性提供保证。
32.本发明提供一种测定阿托伐他汀钙片体外溶出的方法，以现有参比制剂与受试制剂一的预be实验作为基准，构建体内外相关性的溶出方法；基于构建的溶出方法，进一步验证受试制剂二与参比制剂的体外溶出曲线趋势，进而判断受试制剂一和受试制剂二的优势。本发明方法不仅建立的阿托伐他汀钙片的体内外相关性，而且还能用于体外评估受试制剂的质量情况，有效降低研发风险和成本。
附图说明
33.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
34.图1实施例1筛选试验三中10mg阿托伐他汀钙片参比制剂和受试制剂平均微分溶出曲线。
35.图2实施例1筛选试验三中10mg阿托伐他汀钙片参比制剂和受试制剂平均累积溶出曲线。
36.图3实施例1筛选试验四中10mg阿托伐他汀钙片参比制剂和受试制剂平均微分溶出曲线。
37.图4实施例1筛选试验四中10mg阿托伐他汀钙片参比制剂和受试制剂平均微分溶出曲线。
38.图5实施例2筛选试验五中10mg阿托伐他汀钙片参比制剂和受试制剂平均微分溶出曲线。
39.图6实施例2筛选试验五中10mg阿托伐他汀钙片参比制剂和受试制剂平均微分溶出曲线。
40.图7实施例2筛选试验六中10mg阿托伐他汀钙片参比制剂和受试制剂平均微分溶出曲线。
41.图8实施例2筛选试验六中10mg阿托伐他汀钙片参比制剂和受试制剂平均微分溶出曲线。
具体实施方式
42.下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
43.实施例1本发明实施例提供一种测定阿托伐他汀钙片体外溶出的方法，利用模拟难溶性口服药物制剂体内溶出和跨膜吸收过程的二室模型实验装置进行溶出，
溶出检测过程为：1）溶出介质经进液泵作用进入多孔滤膜杯，待多孔滤膜杯和外室溶出杯中溶出介质体积相同时，开启出液泵，进液泵和出液泵的工作频率一致，保持溶出介质的总体积不变；2）将整片阿托伐他汀钙片置于转篮中，溶出液经滤膜过滤后持续提取溶出液，在不同的固定的时间点取样测定溶出液中阿托伐他汀钙的浓度，直至阿托伐他汀钙片溶出完成；3）采用高效液相测定溶出液中在不同时间点的阿托伐他汀钙的平均溶出浓度，将对应时间点和阿托伐他汀钙的平均溶出浓度，得到阿托伐他汀钙的平均溶出浓度和溶出时间之间的平均微分溶出曲线图，根据微分溶出关系得到累积溶出质量分数与溶出时间之间的累积溶出曲线图；所述溶出液中阿托伐他汀钙的浓度采用高效液相测定，具体过程为：将溶出液进行离心处理后，精密量取20 μl ，注入高效液相色谱仪中，记录色谱图，计算对应的阿托伐他汀钙的浓度；所述离心处理条件为：3号转子，10000 rpm，3 min。
44.高效液相仪的色谱条件：色谱柱：kromasil c18 ，12.5 cm
ꢀ×ꢀ
4.0 mm，5
ꢀµ
m；流动相：0.05 mol/l柠檬酸溶液(用氨水调节p h值至7.4)，并和乙腈按照乙腈：柠檬酸溶液=45∶55混合)；流速：1 ml/min；柱温：35 ℃；检测波长为：260 nm；进样量:10 μl。
45.溶出度检测过程的条件筛选：条件筛选一：参比制剂：阿托伐他汀钙片，溶出介质为水；溶出液的提取速度与溶出介质的补充速度、转篮的转速进行筛选；循环150ml/min；取样时间点为0、5、10、20、30、45、60、90、120、150、180 min；表1：水介质下，速度和转速对参比制剂的累积溶出的影响
条件筛选二：参比制剂：阿托伐他汀钙片，溶出介质为ph6.8磷酸盐介质；溶出液的提取速度与溶出介质的补充速度、转篮的转速进行筛选；循环150ml/min；取样时间点为0、5、10、20、30、45、60、90、120、150、180 min；表2：ph6.8磷酸盐介质下，速度和转速对参比制剂的累积溶出的影响
通过对不同溶出介质、溶出液的提取速度与溶出介质的补充速度、转篮的转速的筛选，得出较优条件，使用较优条件对参比制剂和受试制剂的进行一致性评价。
46.一致性评价的条件筛选：1）通过对参比制剂或受试制剂进行预be实验，检测血浆中阿托伐他汀钙的含量，具体实验过程不是本技术的保护重点，此处不再一一赘述了。可参考现有技术，计算主要药动学参数，结果如下表3。预be试验结果表明，受试制剂一在体内的溶出速度略慢于参比制剂。
47.表3. 受试制剂一和参比制剂的预be试验等效性评价结果从预be结果来看，参比制剂的cmax值大于受试制剂一的cmax值，且参比制剂的auc药时曲线下面积也大于受试制剂一，初步预判参比制剂的溶出比受试制剂一快，基于此，开展溶出条件的筛选。
48.2）以表3的预be结果作为参考，筛选符合受试制剂和参比制剂体内溶出相关的溶出条件。
49.筛选试验三：溶出介质为水；溶出液的提取速度与溶出介质的补充速度均为6 ml/min；转篮的转速为150rpm；循环150ml/min；取样时间点为0、5、10、20、30、45、60、90、120、150、180 min；参比制剂：阿托伐他汀钙片，受试制剂一：阿托伐他汀钙片，受试制剂二：阿托伐他汀钙片，每个药物制剂测试6批，最终获得微分溶出及累积溶出结果如下表及附图1-2：表4：参比制剂和受试制剂的平均微分溶出的结果
表5：参比制剂和受试制剂的平均累积溶出的结果筛选试验四：溶出介质为ph6.8磷酸盐缓冲液；溶出液的提取速度与溶出介质的补充速度均为6 ml/min；转篮的转速为50rpm；循环150ml/min；取样时间点为0、5、10、20、30、
45、60、90、120、150、180 min；参比制剂：阿托伐他汀钙片，受试制剂一：阿托伐他汀钙片，受试制剂二：阿托伐他汀钙片，每个药物制剂测试6批，最终获得微分溶出及累积溶出结果如下表及附图3-4：表6：参比制剂和受试制剂的平均微分溶出的结果表7：参比制剂和受试制剂的平均累积溶出的结果
由表4-7的结果可知，参比制剂和受试制剂的溶出行为接近，受试制剂的溶出速度变化趋势与参比制剂相似；但是受试制剂和参比制剂的溶出趋势与体内预be趋势不一致，不能很好的区分参比制剂和受试制剂的差异，说明此条件下不能很好检测出阿托伐他汀钙片在体内产生差异的主要原因，需要进一步调整溶出方法。
50.实施例2本发明实施例提供一种测定阿托伐他汀钙片体外溶出的方法，利用模拟难溶性口服药物制剂体内溶出和跨膜吸收过程的二室模型实验装置进行溶出，溶出检测过程为：1）将阿托伐他汀钙片进行研磨后，待用；2）溶出介质经进液泵作用进入多孔滤膜杯，待多孔滤膜杯和外室溶出杯中溶出介质体积相同时，开启出液泵，进液泵和出液泵的工作频率一致，保持溶出介质的总体积不变；3）将步骤1）研磨后的阿托伐他汀钙片粉末置于多孔滤膜杯中，经安装转篮的支架旋转搅拌，溶出液经滤膜过滤后持续提取溶出液，在不同的固定的时间点取样测定溶出液中阿托伐他汀钙的浓度，直至阿托伐他汀钙片溶出完成；4）采用高效液相测定溶出液中在不同时间点的阿托伐他汀钙的平均溶出浓度，将对应时间点和阿托伐他汀钙的平均溶出浓度，得到阿托伐他汀钙的平均溶出浓度和溶出时间之间的平均微分溶出曲线图，根据微分溶出关系得到累积溶出质量分数与溶出时间之间的累积溶出曲线图；所述溶出液中阿托伐他汀钙的浓度采用高效液相测定，具体过程为：将溶出液进行离心处理后，精密量取20 μl ，注入高效液相色谱仪中，记录色谱图，计算对应的阿托伐
他汀钙的浓度；所述离心处理条件为：3号转子，10000rpm，3 min。
51.高效液相仪的色谱条件：色谱柱：kromasil c18 ，12.5 cm
ꢀ×ꢀ
4.0 mm，5
ꢀµ
m；流动相：0.05 mol/l柠檬酸溶液(用氨水调节p h值至7.4)，并和乙腈按照乙腈：柠檬酸溶液=45∶55混合)；流速：1 ml/min；柱温：35 ℃；检测波长为：260 nm；进样量:10 μl。
52.溶出度检测过程的条件筛选：筛选实验五：手工研磨3分钟后阿托伐他汀钙的粒径在0.01~0.1 mm范围；溶出介质为水；溶出液的提取速度与溶出介质的补充速度均为6 ml/min；转篮的支架的转速为50 rpm；循环量150 ml/min；取样时间点为0、5、10、20、30、45、60、90、120、150、180 min；参比制剂：阿托伐他汀钙片，受试制剂一：阿托伐他汀钙片，受试制剂二：阿托伐他汀钙片，每个药物制剂测试6批，最终获得微分溶出及累积溶出结果如下表及附图5-6：表8：参比制剂和受试制剂的平均微分溶出的结果表9：参比制剂和受试制剂的平均累积溶出的结果
本实施例在实施例1的基础上，将阿托伐他汀钙片的受试制剂和参比制剂均进行研磨，使其模拟胃肠道中整片药剂崩解后消除剂型带来的粒径因素，对阿托伐他汀钙片进行溶出情况考察，得到了意外之喜，这是之前开发阿托伐他汀钙片溶出方法过程中从没出现过的，也解决了本技术发明人一直纠结阿托伐他汀钙片体内外相关性无法实现的问题。
53.通过本技术实施例2实验过程测定的累积溶出度实验结果表明（图5和表8），溶出90 min后受试制剂一的累积溶出度（69.8%）低于参比制剂的累积溶出度（87.7%）。从微分溶出曲线可以看出（图6和表9），溶出10 min前，受试制剂一的溶出速率与参比制剂的溶出速率相似，但在10 min至90 min时间段，受试制剂一的溶出速率明显慢于参比制剂的溶出速率。
54.在本实施例的条件下，受试制剂一与参比制剂体外溶出实验结果与两个制剂体内预be试验结果趋势一致，提示药物制剂中原料药粒径差异可能是导致该品种受试制剂一体内溶出速度慢于参比制剂的重要原因。
55.基于本实施例的方法，我们继续对新受试制剂二进行了评价。累积溶出度结果表明，受试制剂二累积溶出度（93.2%）显著高于受试制剂一累积溶出度（69.8%），并且与参比制剂的累积溶出度（87.7%）接近。从微分溶出曲线可以看出（图5和表8），在溶出后10 min到90 min时间段，受试制剂二的溶出速率明显快于受试制剂一的溶出速率，并且受试制剂二的溶出速率变化趋势与参比制剂更加相似。
56.综上所述，本技术建立的溶出方法对阿托伐他汀钙固体制剂体内溶出速度差异具有较好的区分力。在本技术的溶出条件下，受试制剂二的溶出行为与参比制剂更加相似。
57.溶出度检测过程的条件筛选：筛选实验六：手工碾碎阿托伐他汀钙，肉眼可见小块颗粒，部分颗粒粒径在1 mm以
上；溶出介质为水；溶出液的提取速度与溶出介质的补充速度均为6 ml/min；转篮的支架的转速为50 rpm；循环量150 ml/min；取样时间点为0、5、10、20、30、45、60、90、120、150、180 min；参比制剂：阿托伐他汀钙片，受试制剂一：阿托伐他汀钙片，受试制剂二：阿托伐他汀钙片，每个药物制剂测试1批，最终获得微分溶出及累积溶出结果如附图7-8：由图7-8可以看出，受试制剂和参比制剂的溶出行为趋势不一致，区分力不够。
58.以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。