一种用于新冠病毒奥密克戎变异株分型的多重荧光检测引物探针组及试剂盒的制作方法

1.本发明涉及一种用于新冠病毒奥密克戎变异株分型的多重荧光检测引物探针组及试剂盒，属于生物技术领域。


背景技术：

3.研究发现，相比野生株或其他voc，奥密克戎变异株变异速度更快，目前已有ba.1、ba.2、ba.3及ba.1.1四种主要型别，在我国引起传播流行的主要是ba.1及ba.2型。新冠疫情出现时第一时间进行防控溯源已成为常态，然而病毒型别未知很难对其密接及来源进行有效判断，使得防控溯源比较被动。但目前主流的奥密克戎分型检测方法是高通量测序，经济成本高耗时长。同时很多基层检测单位没有高通量测序仪，难以第一时间开展奥密克戎分型的检测，耽误了宝贵的防控时间及防控策略的制定。
4.目前上市的奥密克戎分型荧光检测试剂盒针对特定的几个变异位点进行检测，且仅能检测一种基因型别，造价昂贵，操作复杂。
5.申请人于2022年2月22日提交了一个发明专利申请，专利申请号为“2022101630826”，专利名称为“一种针对新冠病毒奥密克戎变异株的多重荧光检测引物探针组及试剂盒”。此发明中的引物探针组及试剂盒主要用于同时判断是否感染sars-cov-2及是否感染奥密克戎变异株，未涉及新冠病毒奥密克戎变异株的分型。
6.专利申请号为“202111618758.8”，名称为“检测sars-cov-2变异株的组合物、试剂盒、方法及其用途”的中国专利，提供了包含所述组合物的试剂盒，所述组合物的用途，以及用于检测sars-cov-2变异株并分型的方法。此专利中，其所表述的分型是指新冠病毒其它型别与奥密克戎型别的区分，即此专利可区分该变异株是否为奥密克戎型别，但是不能判定病毒是奥密克戎的哪个亚型。


技术实现要素：

7.本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种用于新冠病毒奥密克戎变异株分型的多重荧光检测引物探针组及试剂盒。
8.本发明的发明人设计了一种用于奥密克戎变异株分型的多重荧光检测引物探针组，可同时检测sars-cov-2的两个基因片段(s基因及n基因)，分别是用于判断ba1感染及ba2感染的s基因，及用于判断奥密克戎变异株感染的n基因。所有用于检测的引物探针均是发明人自行设计的。omicron-f引物位于全基因组的28316-28335核苷酸位点，omicron-r引物位于全基因组的28435-28454核苷酸位点，omicron-probe引物位于全基因组的28362-28381核苷酸位点；ba1-f引物位于全基因组的22191-22211核苷酸位点，ba1-r引物位于全基因组的 22327-22348核苷酸位点，ba1-probe引物位于全基因组的22213-22234核苷酸位点；ba2-f引物位于全基因组的21583-21607核苷酸位点，ba2-r引物位于全基因组的21710-21733核苷酸位点，ba2-probe引物位于全基因组的21620-21647核苷酸位点。
9.本发明中，用于新冠病毒奥密克戎变异株分型的多重荧光检测引物探针组，其核苷酸序列如下表所示：
[0010][0011][0012]
其中，
[0013]
荧光探针是一种寡核苷酸探针，荧光基团连接在探针的5’末端，而淬灭基团则连接在探针的3’末端。所述检测ba.1的荧光基团为fam，淬灭基团为dbq1。所述检测ba.2的荧光基团为vic，淬灭基团为dbq1。所述检测奥密克戎感染的荧光基团为cy5，淬灭基团为bhq2。
[0014]
本发明还提供了本发明的引物探针组工作液的制备方法，包括如下步骤：
[0015]
1)将合成的引物探针干粉加无rna酶水配制成10微摩尔/升的工作浓度。
[0016]
2)将用于检测奥密克戎ba1型、ba2型和奥密克戎感染的引物探针组分别按照上游引物：下游引物：探针的体积比为2:2:1的比例分别配置成三种探针引物混合液；在本发明中上游引物：下游引物：探针所加体积比为400:400:200(μl)。
[0017]
3)最后将三种探针引物混合液等体积混合制备为引物探针工作液。
[0018]
在检测时，通用的多重荧光检测试剂加上本发明的引物探针工作液即可上机检测，判断奥密克戎变异株感染型别。
[0019]
本发明还提供了用于新冠病毒奥密克戎变异株分型的多重荧光检测试剂盒，包括上述用于新冠病毒奥密克戎变异株分型的多重荧光检测引物探针组。
[0020]
进一步地，所述的试剂盒还包括多重荧光检测试剂，多重荧光检测试剂可以是市场通用的多重荧光检测试剂，如南京诺唯赞生产的hiscript ii u one stepqrt-pcr probe kit试剂。
[0021]
本发明是发明人在2022年2月22日申请的申请号为“2022101630826”，名称为“一种针对新冠病毒奥密克戎变异株的多重荧光检测引物探针组及试剂盒”的发明专利的研究基础上，所进行的进一步深入研究。
[0022]
本发明的发明构思如下：
[0023]
针对特异的奥密克戎变异株的基因保守序列，设计pcr引物和荧光taqman 探针。在常规pcr的基础上添加一条两端标记荧光染料基团的核苷酸探针，其中荧光基团在5’端，淬灭基团在3’端，二者构成能量转移结构。当探针完整时荧光基团被淬灭基团抑制，不产生荧光，当探针结合到靶序列时，上游引物会延伸至该位置，在外切酶作用下探针被水解，荧光基团荧光信号释放并被仪器收集检测，从而提示靶序列的存在。发明人加入了用于判断奥密克戎感染的n基因的荧光探针引物序列，以及判断奥密克戎ba.1及ba.2型别感染的s基因的荧光探针引物序列，从而形成了一个组合，利用荧光pcr技术的实时性、高灵敏性及良好的特异性，在反应结束时甚至结束前便可直观快速的判断奥密克戎变异株感染型别。此外s基因荧光基团选择fam及vic，淬灭基团选择双淬灭探针 dbq1而不是bhq1，即在常规探针中间额外添加淬灭基团，在保证低本底信号的前提下，大幅度提高了扩增后的荧光强度。
[0024]
与现有技术cn 202111618758.8相比，本发明的分型是首先区分变异株是否为奥密克戎型别，然后进一步判定是奥密克戎的哪个亚型，如ba.1或ba.2。现在的流行株以ba.2为主，同时存在少量ba.1散发感染，专利申请号为“202111618758.8”的专利无法区分两者，而本专利可实现这一目的，因此两者有着本质的区别。
[0025]
本发明的用于新冠病毒奥密克戎变异株分型的多重荧光检测引物探针组及试剂盒，具有如下技术效果：
[0026]
1.造价低廉。
[0027]
引物合成中仅探针价格稍高，三个基因共6条引物3条探针，每条引物合成仅需几十元，探针为1500元左右，总的合成成本约为5000元左右，以合成最低的1 个od量计算可检测1200个标本，每个标本成本为4元左右。试剂盒为通用多重荧光检测试剂盒，100人份约为800元，每个标本成本为8元左右。因此单个标本总体的试剂成本为12元。目前上市的奥密克戎荧光分型检测试剂盒针对特定的几个变异位点进行检测，造价昂贵，50人份约10000元，单个标本的试剂成本为200 元，是本发明的16倍。此外高通量测序方法造价更高，单个标本的试剂成本为2000 元。在本发明中选择的是南京诺唯赞生产的hiscript ii u one step qrt-pcrprobe kit试剂盒。该试剂盒为100人份，发明人降低原有量的三分之一其结果仍无明显变化，因此100人份试剂盒可检测300个标本，实际成本更低。
[0028]
2.灵敏度高，特异性好，可重复性好，且能够应用于环境标本检测
[0029]
本发明是基于目前全球出现的所有奥密克戎基因型的序列进行设计的，理论上可检测出所有型别的奥密克戎变异株感染。在实际应用中，发明人对江苏的所有奥密克戎变异株进行了检测(包括ba.1、ba.2及ba.1.1三种型别)，同时以 alpha(b.1.1.7)变异株、delta(b.1.617.2)变异株及其它病毒作为对照，结果显示其灵敏度及特异性均为100％。在对每周的新冠病毒标本进行复检时，发现与测序结果完全一致，显示出了很好的稳定性与可重复性。此外，最能体现其灵敏度优势的地方就是环境标本的检测。环境标本量大，病毒载量低，给检测工作造成了很大困难。环境标本由于病毒载量低很难开展高通量测序，但目前的形势是有感染者的地方基本都存在环境污染，无法测序就无法提供是否为奥密克戎变异株感染。利用本发明的方法在对环境标本进行检测时可检出奥密克戎变异株及具体型别的感染，检测结果与流行病学溯源调查结果完全一致，其灵敏度及特异性均为100％。
附图说明
[0030]
图1为奥密克戎变异株ba.1型别患者样本检测结果。
[0031]
图2为奥密克戎变异株ba.2型别患者样本检测结果。
[0032]
图3为奥密克戎变异株ba.1.1型别患者样本检测结果。
[0033]
图4为环境标本检测结果(奥密克戎变异株ba.1感染)。
[0034]
图5为特异性验证结果(alpha变异株b.1.1.7型、delta变异株b.1.617.2型、流感病毒、肠道病毒、轮状病毒及诺如病毒)。
[0035]
图6为单淬灭探针bhq1与双淬灭探针dbq1比对结果。
[0036]
图7为奥密克戎变异株ba.1型别及奥密克戎变异株ba.2型别患者样本综合比对结果。
具体实施方式
[0037]
以下是本发明的具体实施例并结合附图，对本发明的技术方案作进一步的描述，但本发明并不限于这些实施例。
[0038]
实施例1
[0039]
1.引物探针的设计：
[0040]
发明人自行设计的奥密克戎变异株分型检测引物是通过下载所有基因型别 (包括ba.1、ba.2、ba.3及ba.1.1四种型别)的奥密克戎序列，对其26个基因片段进行比对分析，最后在s区设计了110对引物探针，在n区设计了10对引物探针。通过ncbi blast在线数据库对上述引物探针进行特异性比对分析。筛选 pcr效率高，灵敏度高，特异性好，稳定性好的引物，最终得到2对s区的可用于判断奥密克戎ba.1及ba.2型别感染的引物及对应的探针序列，1对n区的可用于判断奥密克戎感染的引物及对应的探针序列。同时将其淬灭基团由bhq1更换为 dbq1提高了其稳定性和扩增效率，降低了背景噪音。
[0041]
表1奥密克戎变异株分型多重荧光检测引物探针序列
[0042]
名称序列修饰ba1-ftta tag tgc gtg agc cag aag ba1-ragc tgt cca acc tga aga aga a ba1-probetct ccc tca ggg ttt ttc ggc t5’fam/dbq1 3’ba2-fatt gcc act agt ctc tag tca gtg t ba2-ragg taa gaa caa gtc ctg agt tga ba2-probeacc aga act caa tca tac act aat tct t5’vic/dbq1 3’omicron-ftgc act ccg cat tac gtt tg omicron-ragt gag agc ggt gaa cca ag omicron-probeaac cag aat ggt ggg gcg cg5’cy5/bhq2 3’[0043]
2.用于奥密克戎变异株分型的多重荧光检测的试剂盒
[0044]
用于奥密克戎变异株分型的多重荧光检测的试剂盒，包含上述引物探针组与多重荧光检测试剂，其中多重荧光检测试剂可选择市面目前通用的多重荧光检测试剂，在本发明中发明人选择的是南京诺唯赞生产的hiscript ii u one stepqrt-pcr probe kit试剂盒。
[0045]
引物探针组配置成引物探针工作液使用，配置方法如下：
[0046]
1)将引物探针合成干粉加无rna酶水配制成10微摩尔/升的工作浓度。
[0047]
2)按照上游引物：下游引物：探针的体积比为2:2:1的比例配置成探针引物混合液，在本发明中所加体积比为400:400:200(μl)。
[0048]
3)最后将三种混合液等体积混合制备为引物探针工作液。
[0049]
在检测时，通用的多重荧光检测试剂加上配置好的引物探针工作液即可上机检测，并能同时判断是否奥密克戎变异株感染及感染型别。
[0050]
3.检测过程如下：
[0051]
3.1体系配制
[0052]
在体系配制室进行实验体系配制。可选择市面目前通用的多重荧光检测试剂盒，在本发明中发明人选择的是南京诺唯赞生产的hiscript ii u one step qrt-pcr probe kit试剂盒。体系配制如表2所示：
[0053]
表2pcr反应体系
[0054]
组分名称加入体积(μl)/人份2
×
one step u

mix5one step u

enzyme mix0.5dye0.2引物探针工作液2.4h2o1.9总体积10
[0055]
体系配制完成后震荡混匀离心，按照10μl/人份分装至pcr反应管。
[0056]
3.2样本处理
[0057]
在加样室向上述准备好的pcr反应管中加入待测样本核酸、阳性对照及阴性对照各2.5μl，终体积为12.5μl，盖紧管盖，震荡离心。其中样本为发明人实验室所拥有的新冠病毒奥密克戎变异株核酸，型别有奥密克戎变异株ba.1、ba.2 及ba.1.1三种型别，来源有患者标本及外环境标本。此外还包括用于特异性检测的其他新冠病毒型别包括alpha变异株b.1.1.7型及delta变异株b.1.617.2型、流感病毒、肠道病毒、轮状病毒及诺如病毒等核酸样本。阳性对照为测序成功的奥密克戎变异株ba.1及ba.2核酸。阴性对照为无rna酶水。
[0058]
3.3pcr扩增
[0059]
将pcr反应管放入abi quantstudio q5荧光定量pcr仪进行扩增检测，不选择rox校正。荧光基团分别为fam、vic及cy5。循环参数设定如表3所示:
[0060]
表3反应程序
[0061]
[0062]
3.4.结果分析
[0063]
阴性对照无荧光曲线，阳性对照出现三条平滑曲线。标本荧光曲线平滑且循环数(ct值)小于38判定为阳性，否则为阴性。当fam和vic中的一种ct≤38，cy5 ct》38时检测结果无效。具体判定结果如表4所示：
[0064]
表4结果判定
[0065][0066]
(1)奥密克戎变异株ba.1型别患者样本检测结果，fam及cy5通道均出现曲线且ct≤38，表明为sars-cov-2感染，且是奥密克戎变异株。见图1
[0067]
(2)奥密克戎变异株ba.2型别患者样本检测结果，vic及cy5通道均出现曲线且ct≤38，表明为sars-cov-2感染，且是奥密克戎变异株。见图2
[0068]
(3)奥密克戎变异株ba.1.1型别患者样本检测结果，fam及cy5通道均出现曲线且ct≤38，表明为sars-cov-2感染，且是奥密克戎变异株。见图3
[0069]
(4)环境标本检测结果(奥密克戎变异株ba.1感染)，fam及cy5通道均出现曲线且ct≤38，表明为sars-cov-2感染，且是奥密克戎变异株。见图4
[0070]
(5)特异性验证(alpha变异株b.1.1.7型、delta变异株b.1.617.2型、流感病毒、肠道病毒、轮状病毒及诺如病毒)，fam、vic及cy5通道均无曲线，表明本发明引物组合不与其它新冠病毒型别及其它病毒核酸发生反应。见图5
[0071]
(6)单淬灭探针bhq1与双淬灭探针dbq1比对结果，vic及cy5通道均出现曲线且ct≤38，表明是奥密克戎变异株ba.2型感染，但明显双淬灭探针曲线更平滑，两个通道的曲线差异更小，背景噪音更低。见图6
[0072]
(7)奥密克戎变异株ba.1型别患者样本及奥密克戎变异株ba.2型别患者样本综合比对结果，奥密克戎变异株ba.1型别患者样本fam及cy5通道出现曲线且ct≤38，表明为sars-cov-2奥密克戎变异株ba.1感染；奥密克戎变异株ba.2 型别患者样本vic及cy5通道均出现曲线且ct≤38，表明为sars-cov-2奥密克戎变异株ba.2感染。见图7
[0073]
上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。