一种光/pH双重响应偶联药物前体化合物及其制备方法和应用

一种光/ph双重响应偶联药物前体化合物及其制备方法和应用
技术领域
1.本发明涉及医药材料技术领域，具体涉及一种光/ph双重响应偶联药物前体化合物及其制备方法和应用。


背景技术：

2.恶性肿瘤对人类健康极具威胁。通过药物前体分子在一定条件下响应性释放药物活性分子，是提高药物抗肿瘤作用效率和保证安全性的有效途径。基于此，研究者们开发了对独特的外源条件或肿瘤微环境特征具有响应性的分子或材料，利用药物前体分子或纳米材料在不同光、声、热、力、磁、酸碱度、氧化还原物质和酶等刺激下，化学结构、溶解度、稳定性、电荷分布、尺寸大小等性质的变化，实现药物或活性分子的控制释放。另外，通过结构设计和有机组装，以纳米材料为载体的药物靶向递送也能进一步提高可控释放体系的时间、位置和浓度的精准度。


技术实现要素：

3.本发明的目的是为了克服现有技术中的问题，提供一种光/ph双重响应偶联药物前体化合物及其制备方法和应用。该前体化合物具有邻硝基二硫代苄酯结构，硝基对位通过连接片段及希夫碱结构偶联药物分子阿霉素，且阿霉素能络合游离铜离子。该化合物在酸性ph条件下，希夫碱结构断裂释放药物分子阿霉素，在光照条件下邻硝基二硫代苄酯断裂释放二乙基二硫代氨基甲酸盐，所释放的二乙基二硫代氨基甲酸盐对铜离子的络合能力强于阿霉素，能有效抢夺阿霉素所络合的铜离子，同时生成药物分子阿霉素dox和金属药物cuet。在内源性酸性ph和外源性光照条件下，所生成的两种药物分子在均能有效产生杀死癌细胞，具有有效的癌症协同治疗效果，制备过程简单，易操作，在癌症治疗领域有广泛应用前景。
4.本发明第一个目的是提供一种光/ph双重响应偶联药物前体化合物，所述前体化合物具有如式(ⅰ)所示的结构，
5.6.其中，式(ⅰ)中，n＝2～12。
7.优选的，所述前体化合物具有光响应性和/或酸性ph响应性。
8.优选的，所述前体化合物能与铜离子发生络合作用，且与铜离子络合后发生荧光猝灭。
9.本发明第二个目的是提供一种光/ph双重响应偶联药物前体化合物的制备方法，包括以下步骤：
10.s1、在氮气保护条件下，将式(ⅳ)化合物和对甲酰基苯甲酸溶于无水四氢呋喃，在4-二甲氨基吡啶和二环己基碳二亚胺存在条件下，搅拌反应，过滤并除去溶剂后得到粗产物一，进行柱分离后得到式(ⅲ)中间产物；
11.s2、在无氧条件下，将式(ⅲ)中间产物和dtc前体化合物溶于四氢呋喃，在碘化亚铜和五甲基二亚乙基三胺的催化条件下，搅拌反应，除去溶剂后得到粗产物二，进行柱分离后得到式(ⅱ)中间产物；
12.s3、将阿霉素盐酸盐溶于二甲亚砜并以三乙胺中和，再加入式(ⅱ)中间产物的二甲亚砜溶液，避光搅拌反应，萃取并除去溶剂得到粗产物三，乙腈洗涤并干燥，即得式(ⅰ)药物前体化合物；
13.所述式(ⅱ)结构为：
[0014][0015]
所述式(ⅲ)结构为：
[0016][0017]
所述式(ⅳ)结构为：
[0018][0019]
其中，式(ⅱ)、式(ⅲ)、式(ⅳ)中，n＝2～12；
[0020]
所述dtc前体化合物结构式为：
[0021][0022]
优选的，s1中，所述式(ⅳ)化合物和对甲酰基苯甲酸摩尔比为1:1.1～2；4-二甲氨基吡啶和二环己基碳二亚胺的摩尔比为0.015:1.5；
[0023]
所述搅拌的温度为25～35℃，反应的时间为12～24h；所述柱分离过程中，流动相为石油醚和乙酸乙酯的混合物，体积比为15:1～20:1。
[0024]
优选的，s2中，所述的无氧条件为向体系中鼓入氮气两次，每次鼓气时间≥30min。
[0025]
更优选的，所述dtc前体化合物和式(ⅲ)中间产物的摩尔比为1:1.1～1.5，催化剂
碘化亚铜和五甲基二亚乙基三胺的质量比为1:1。
[0026]
更优选的，s2中，反应温度为20～30℃，反应时间为24h；所述柱分离过程中，以石油醚：乙酸乙酯体积比从5:1至2:1为流动相梯度洗脱进行柱分离。
[0027]
优选的，s3中，所述阿霉素盐酸盐、三乙胺和式(ⅱ)中间产物的摩尔比为1:1.2:0.8～1；所述搅拌反应的温度为20～30℃；所述提纯过程中，向固体粗产物中加入5ml乙腈。
[0028]
本发明第三个目的是提供一种光/ph双重响应偶联药物前体化合物在制备抗癌药物中的应用。
[0029]
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
[0030]
本发明提供的光/ph双重响应偶联药物前体化合物，具有光响应性和酸性ph响应性，同时具有与铜离子发生络合作用，且与铜离子络合后发生荧光猝灭。在外源性365nm紫外光照条件下能有效释放的二乙基二硫代氨基甲酸盐，在内源性酸性ph条件下释放药物分子阿霉素，具备有优良的可控性，在紫外光照条件下有效释放的二乙基二硫代氨基甲酸盐能有效结合游离铜离子，生成的金属药物cuet保留有其本身的抗肿瘤效果。
[0031]
本发明提供的光/ph双重响应偶联药物前体化合物的制备方法，将光响应dtc前体化合物和阿霉素分子通过连接片段分别以1,2,3-三氮唑和希夫碱结构进行偶联反应所得，产率可观，制备过程简单易操作，实用性强。
附图说明
[0032]
图1为式(ⅲ)中间产物的核磁共振氢谱图；
[0033]
图2为式(ⅱ)中间产物的核磁共振氢谱图；
[0034]
图3为阿霉素dox的核磁共振氢谱图；
[0035]
图4为实施例1提供的药物前体化合物的核磁共振氢谱图；
[0036]
图5为实施例1提供的药物前体化合物酸响应后的核磁共振氢谱图；
[0037]
图6为阿霉素的紫外吸收光谱图；
[0038]
图7为阿霉素与cucl2络合后的紫外吸收光谱图；
[0039]
图8为实施例1提供的药物前体化合物的紫外吸收光谱图；
[0040]
图9为实施例1提供的药物前体化合物与cucl2络合后的紫外吸收光谱图；
[0041]
图10为阿霉素的荧光发射光谱图；
[0042]
图11为阿霉素与cucl2络合后的荧光发射光谱图；
[0043]
图12为实施例1提供的药物前体化合物的荧光发射光谱图；
[0044]
图13为实施例1提供的药物前体化合物与cucl2络合后的荧光发射光谱图；
[0045]
图14为阿霉素与cucl2络合并光照5min后的荧光发射光谱图；
[0046]
图15为阿霉素与cucl2络合并光照10min后的荧光发射光谱图；
[0047]
图16为实施例1提供的药物前体化合物与cucl2络合并光照5min后的荧光发射光谱图；
[0048]
图17为实施例1提供的药物前体化合物与cucl2络合并光照10min后的荧光发射光谱图；
[0049]
图18为阿霉素的细胞成像图；
[0050]
图19为实施例1提供的药物前体化合物的细胞成像图；
[0051]
图20为响应细胞毒性的工艺步骤图；
[0052]
图21为阿霉素的细胞毒性图；
[0053]
图22为实施例1提供的药物前体化合物的响应细胞毒性图。
具体实施方式
[0054]
下面将结合本发明实施例中的数据，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0055]
需要说明的是，本发明中所使用的专业术语只是为了描述具体实施例的目的，并不是旨在限制本发明的保护范围，除非另有特别说明，本发明以下各实施例中用到的各种原料、试剂、仪器和设备均可通过市场购买得到或者通过现有方法制备得到。
[0056]
下述实施例中采用的光响应dtc前体化合物结构式为：
[0057][0058]
实施例1
[0059]
一种光/ph双重响应偶联药物前体化合物，包括以下步骤：
[0060]
s1、分别称取式(ⅳ)6-叠氮-1-己醇(0.71g，5mmol)、对甲酰基苯甲酸(0.83g，5.5mmol)和4-二甲氨基吡啶dmap(0.12g，0.075mmol)在n2保护下溶解于25ml超干四氢呋喃(thf)，然后向溶液中加入二环己基碳二亚胺dcc(1.59g，7.5mmol)，30℃搅拌反应过夜。反应结束后，抽滤除去固体，固体用thf清洗2次。所得溶液通过旋蒸除去溶剂，以石油醚：乙酸乙酯(v/v)＝20:1为流动相进行柱分离，得到1.12g淡黄色油状式(ⅲ)中间产物，产率为81％。取10mg式(ⅲ)中间产物溶解后，通过核磁共振氢谱对其结构进行表征，如图1所示，1h nmr(400m hz,cdcl3),δ(ppm):10.11(s,1h),8.21/.19(d,2h),7.97/.95(d,2h),4.39/.37/.35(t,2h),3.31/.29/.27(t,2h),1.48～1.85(m,8h).
[0061]
s2、称取光响应dtc前体化合物(1.01g，3mmol)、式(ⅲ)中间产物(0.91g，3.3mmol)和16mg n,n,n',n,'n
”‑
五甲基二亚乙基三胺(pmdeta)溶解于20mlthf，向溶液中鼓入氮气以排除体系中的氧气，鼓气30min；然后称取16mg碘化亚铜(cui)加入以上溶液，继续鼓入氮气排氧30min；反应瓶以氮气保护并封闭，室温下搅拌反应24h。反应结束后，旋蒸除去溶剂，以石油醚和乙酸乙酯体积比依次为5:1、4:1、3:1、2:1为流动相梯度洗脱进行柱分离，得到1.92g棕黄色粘液或块状固体中间产物(ii)，产率为94％。取10mg式(ⅲ)中间产物溶解后，通过核磁共振氢谱对其结构进行表征，如图2所示，1hnmr(400m hz,cdcl3),δ(ppm):10.11(s,1h),8.20/.18(d,2h),8.11/.09(d,1h),7.97/.95(d,2h),7.67(s,1h),7.50(s,1h),6.99/.96(d,1h),5.28(s,2h),5.04(s,2h),4.39～4.35(2
×
t,4h),4.00～3.70(2
×
q,4h),2.00～1.40(2
×
m,8h),1.28/.27/.25(t,6h).
[0062]
s3、称取阿霉素dox(58mg，0.1mmol)溶解于2ml二甲亚砜dmso，向溶液中加入24μl三乙胺，室温下避光搅拌2h；称取式(ⅱ)中间产物(49mg，0.08mmol)溶解于2mldmso，加入上
述反应溶液中，室温下避光搅拌反应48h。反应结束后，向反应溶液中加入75ml二氯甲烷稀释，然后加入等体积去离子水洗涤3次，有机相用无水na2so4干燥，过滤，通过旋蒸除去有机相溶剂得到粗产物。固体粗产物中加入5ml乙腈清洗3次后，倒除液体后真空干燥得深红色固体产物，即得式(ⅰ)药物前体化合物，产率65％。分别取10mg阿霉素和式(ⅰ)药物前体化合物溶解后，通过核磁共振氢谱对其结构进行表征，如图3和图4所示。将图4与图2、图3进行对比，结果显示，图2中10.11ppm处的芳醛基(-cho)的特征吸收峰于图4中消失，图4中出现化学位移值为8.41ppm出现希夫碱中-ch＝n-中的特征吸收峰，即阿霉素通过希夫碱键与式(ⅱ)中间产物偶联得到式(ⅰ)药物前体化合物；
[0063]
制备路线如下：
[0064][0065]
实施例2
[0066]
一种光/ph双重响应偶联药物前体化合物，包括以下步骤：
[0067]
s1、分别称取式(ⅳ)2-叠氮-1-乙醇(0.44g，5mmol)、对甲酰基苯甲酸(1.13g，7.5mmol)和4-二甲氨基吡啶dmap(0.12g，0.075mmol)在n2保护下溶解于25ml超干四氢呋喃(thf)，然后向溶液中加入二环己基碳二亚胺dcc(1.59g，7.5mmol)，30℃搅拌反应过夜。反应结束后，抽滤除去固体，固体用thf清洗2次。所得溶液通过旋蒸除去溶剂，以石油醚和乙酸乙酯体积比为5:1、4:1、3:1、2:1为流动相梯度洗脱进行柱分离，得到1.00g无色油状式(ⅲ)中间产物，产率为91％。
[0068]
s2、称取光响应dtc前体化合物(1.01g，3mmol)、式(ⅲ)中间产物(0.99g，3.6mmol)和16mg n,n,n',n,'n
”‑
五甲基二亚乙基三胺(pmdeta)溶解于20mlthf，向溶液中鼓入氮气以排除体系中的氧气，鼓气35min；然后称取16mg碘化亚铜(cui)加入以上溶液，继续鼓入氮气排氧35min；反应瓶以氮气保护并封闭，室温下搅拌反应24h。反应结束后，旋蒸除去溶剂，以石油醚和乙酸乙酯体积比依次为5:1、4:1、3:1、2:1为流动相梯度洗脱进行柱分离，得到1.59g棕黄色粘液为式(ⅱ)中间产物，产率为95％。
[0069]
s3、称取阿霉素dox(58mg，0.1mmol)溶解于2ml二甲亚砜dmso，向溶液中加入24μl三乙胺，室温下避光搅拌2h；称取式(ⅱ)中间产物(56mg，0.1mmol)溶解于2ml dmso，加入上述反应溶液中，室温下避光搅拌反应48h。反应结束后，向反应溶液中加入75ml二氯甲烷稀释，然后加入等体积去离子水洗涤3次，有机相用无水na2so4干燥，过滤，通过旋蒸除去有机
相溶剂得到粗产物。固体粗产物中加入5ml乙腈清洗3次后，倒除液体后真空干燥得深红色固体产物，即得式(ⅰ)药物前体化合物，产率60％；
[0070]
制备路线如下：
[0071][0072]
实施例3
[0073]
一种光/ph双重响应偶联药物前体化合物，包括以下步骤：
[0074]
s1、分别称取式(ⅳ)12-叠氮-1-十二烷醇(1.14g，5mmol)、对甲酰基苯甲酸(1.51g，10.0mmol)和4-二甲氨基吡啶dmap(0.12g，0.075mmol)在n2保护下溶解于25ml超干四氢呋喃(thf)，然后向溶液中加入二环己基碳二亚胺dcc(1.59g，7.5mmol)，30℃搅拌反应过夜。反应结束后，抽滤除去固体，固体用thf清洗2次。所得溶液通过旋蒸除去溶剂，以石油醚：乙酸乙酯(v/v)＝20:1为流动相进行柱分离，得到1.54g淡黄色油状式(ⅲ)中间产物，产率为86％。
[0075]
s2、称取光响应dtc前体化合物(1.01g，3mmol)、式(ⅲ)中间产物(1.62g，4.5mmol)和16mg n,n,n',n,'n
”‑
五甲基二亚乙基三胺(pmdeta)溶解于20mlthf，向溶液中鼓入氮气以排除体系中的氧气，鼓气30min；然后称取16mg碘化亚铜(cui)加入以上溶液，继续鼓入氮气排氧40min；反应瓶以氮气保护并封闭，室温下搅拌反应24h。反应结束后，旋蒸除去溶剂，以石油醚和乙酸乙酯体积比依次为5:1、4:1、3:1、2:1为流动相梯度洗脱进行柱分离，得到1.99g棕黄色粘液或块状固体式(ⅱ)中间产物，产率为95％。
[0076]
s3、称取阿霉素dox(58mg，0.1mmol)溶解于2ml二甲亚砜dmso，向溶液中加入24μl三乙胺，室温下避光搅拌2h；称取式(ⅱ)中间产物(63mg，0.09mmol)溶解于2ml dmso，加入上述反应溶液中，室温下避光搅拌反应48h。反应结束后，向反应溶液中加入75ml二氯甲烷稀释，然后加入等体积去离子水洗涤3次，有机相用无水na2so4干燥，过滤，通过旋蒸除去有机相溶剂得到粗产物。固体粗产物中加入5ml乙腈清洗3次后，倒除液体后真空干燥得深红色固体产物，即得式(ⅰ)药物前体化合物，产率62％；
[0077]
制备路线如下：
dox，其荧光发射光谱如图11所示，其最大吸收波长仍为599nm左右，但荧光强度仅为592；以上结果表明了dox与铜离子的络合性质，且铜离子络合后dox的荧光发生猝灭。
[0087]
同样地，配置浓度为10μm的药物前体化合物溶液，测试所得荧光发射光谱如图12所示，其最大发射波长为598nm，荧光强度为3086；向配置浓度为10μm的药物前体化合物溶液中加入浓度为10μm的铜离子得cu
‑ⅰ
，其荧光发射光谱如图13所示，图像基本没有峰形，在598nm处的荧光强度仅为375；以上结果表明了药物前体化合物仍具有dox类似的铜离子络合性质，且铜离子络合后药物前体化合物的荧光发生猝灭。
[0088]
为了测试药物前体化合物的光响应性质，将向配置浓度为10μm的dox溶液中加入浓度为10μm的铜离子获得的cu-dox和向配置浓度为10μm的药物前体化合物溶液中加入浓度为10μm的铜离子获得的cu
‑ⅰ
在光功率密度为12mw/cm2的365nm紫外光下进行光照后，进行荧光发射光谱分析。
[0089]
cu-dox分别光照5min或10min后所得荧光发射光谱如图14和图15所示，对比图11可知，其在599nm处的发射强度进一步降低分别为259和217，即光照对cu-dox荧光发射基本无影响；同样地对cu
‑ⅰ
溶液光照5min或10min后测试得荧光发射光谱如图16和图17所示，其在599nm处的发射强度分别上升至1531和1954，峰形与dox一致。以上结果表明，药物前体化合物具有光响应性，且光响应产物dtc能有效夺取与该分子dox络合的铜离子，形成cuet的同时使dox恢复荧光。
[0090]
为了测试细胞对药物前体分子的摄取，依据dox和实施例1提供的药物前体化合物(ⅰ)的荧光性质，通过激光共聚焦细胞成像表征其在细胞中的分布。将hela细胞接种到玻底培养皿(φ＝40mm)中，密度为每孔5
×
104个细胞，并在含有10％胎牛血清的完全培养基、5％co2的37℃培养箱中孵育24h。将hela细胞分别与浓度为5μm的阿霉素(dox)、cu-dox、实施例1提供的药物前体化合物(ⅰ)和cu
‑ⅰ
孵育12h。其中，cu-dox是向配置浓度为5μm的dox溶液中加入浓度为5μm的铜离子获得的cu-dox；cu
‑ⅰ
是向配置浓度为5μm的药物前体化合物溶液中加入浓度为5μm的铜离子获得的cu
‑ⅰ
。成像激发波长为490nm，发射波长范围为500～600nm。dox和cu-dox的成像结果如图18所示，图像显示dox主要进入癌细胞的细胞核；ⅰ和cu
‑ⅰ
的成像结果如图19所示，图像显示药物前体分子同样能进入癌细胞；而在细胞中，由于癌症肿瘤细胞微环境或细胞内吞时溶酶体的酸性微环境影响，药物前体化合物中可响应释放处dox，而铜离子对dox或药物前体化合物的荧光基本无影响。
[0091]
为了利用阿霉素(dox)和实施例1提供的药物前体化合物(ⅰ)分别对hela细胞毒性的测试，则通过噻唑蓝(mtt)检测dox和实施例1提供的药物前体化合物及其相应的铜络合物光照前后的细胞毒性水平，以期在癌症治疗领域获得应用。实施例1提供的药物前体化合物响应细胞毒性的方法步骤如图20所示。mtt法是实验室常用的检测细胞存活度的方法。其检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使mtt还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。将hela细胞接种到96孔板(每孔2
×
104个)中，并在含有10％胎牛血清的完全培养基、5％co2的37℃培养箱中孵育24h。将hela细胞分别与不同浓度的阿霉素(dox)、cu-dox、i和cu-i进行孵育；光照组细胞孵育24h后，用光功率密度为12mw/cm2的365nm紫外光照射5min，非光照组避光条件培养，光照结束后细胞继续孵育24h。弃去培养基并用pbs缓冲液洗涤2次后，向每个孔中加入含有mtt(100μl，0.5mg/ml)的新鲜培养基，并在培养条件下孵育4h。弃去上清液，用pbs缓冲液洗涤，然后加入dmso(100μl)以溶解
甲瓒，用酶标仪检测在490nm、560nm和720nm紫外吸光度，通过比值计算可间接反映活细胞力水平。
[0092]
其中，上述不同浓度阿霉素(dox)、cu-dox、i和cu-i的测试溶液按照如下方法配置：
[0093]
dox：取dox溶解于dmso得到浓度为10mm的浓溶液后，将浓溶液用完全培养基稀释至浓度分别为1、2、4、6、8、10、12μm，以完全培养基为空白对照组；
[0094]
cu-dox：取dox溶解于dmso得到浓度为10mm的dox溶液，然后加入葡萄糖酸铜使得铜离子浓度为10mm，得cu-dox浓溶液，将浓溶液用完全培养基稀释至浓度分别为1、2、4、6、8、10、12μm，以完全培养基为空白对照组；
[0095]ⅰ：取药物前体化合物ⅰ溶解于dmso得到浓度为10mm的浓溶液后，将浓溶液用完全培养基稀释至浓度分别为1、2、4、6、8、10、12μm，以完全培养基为空白对照组；
[0096]
cu
‑ⅰ
：取药物前体化合物ⅰ溶解于dmso得到浓度为10mm的溶液，然后加入葡萄糖酸铜使得铜离子浓度为10mm，得cu
‑ⅰ
浓溶液，将浓溶液用完全培养基稀释至浓度分别为1、2、4、6、8、10、12μm，以完全培养基为空白对照组。
[0097]
对hela细胞毒性测试，结果如图21和图22所示；结果显示：随着药物前体化合物浓度的增大，孵育处理后的细胞存活率稍有降低，说明药物前体化合物本身的细胞毒性较弱，见表1、表2所示；在铜离子的存在条件下，阿霉素dox展现出高的细胞杀伤能力，而相同浓度下的药物前体化合物在存在铜离子的条件下，细胞毒性仍然较弱；在无铜离子的光照条件下，阿霉素(dox)和药物前体化合物(ⅰ)的细胞毒性都较弱，即短时间的光照并不会对细胞状态有过大的影响；在铜离子存在的非光照条件下，阿霉素dox在细胞中显示了较强的细胞杀伤功能，即其在试管中需通过光照才可释放dtc，而细胞中的如硝基还原酶等对硝基结构的影响，可能使其在细胞内能够发生断裂生成dtc；而在铜离子存在条件下加入光照，药物前体化合物才能显示出强细胞杀伤能力，即说明该药物前体化合物具有紫外光照可控性，该可控释放产物在细胞中也能有效结合铜离子生成金属药物，与阿霉素协同作用产生更强的抗肿瘤效果。
[0098]
表1阿霉素dox细胞存活率数据
[0099]
[0100]
表2药物前体化合物细胞存活率数据
[0101][0102]
需要说明的是，本发明中涉及数值范围时，应理解为每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用，由于采用的步骤方法与实施例相同，为了防止赘述，本发明描述了优选的实施例。尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例做出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。
[0103]
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。