一种益脑通络中药组合物的质量检测方法

1.本发明涉及中药领域，具体涉及一种益脑通络中药组合物的质量检测方法，该中药组合物用于防治缺血性脑卒中等疾病。


背景技术：

2.缺血性脑卒中(cerebral ischemic stroke,cis)是由于大脑内动脉闭塞、脑部血液供应障碍，导致脑组织缺血缺氧出现局部不可逆损伤的一种脑血管疾病，具有发病率高、致残率高、致死率高、复发率高的特点，是我国成人致死、致残的首位病因。因此，探寻缺血性脑卒中的有效防治手段至关重要。
3.缺血性脑卒中的发病机制涉及多个生理病理环节，其治疗关键在于尽早开通闭塞血管、恢复脑血流供应，以保护缺血半暗带组织。现代医学对于本病的治疗以静脉输液溶栓较为常用，却受限于溶栓时间窗及适应症，仅有少数患者可以受益；动脉溶栓、支架取栓、导管抽栓等手术介入疗法虽临床疗效明显，但对患者身体素质要求较高，且具有动脉出血、血管夹层或导丝穿孔等风险；增强型体外反搏是以器械辅助增加脑血流灌注的无创疗法，其实际疗效和安全性具有争议性，缺乏大样本试验验证；西药治疗主要是以抗血小板聚集、抗凝血、扩张血管等改善血液循环障碍为目的，但服药时间长，可能会出现耐药性及肝肾损伤等副作用。相较于其他治疗手段的局限性及不确定性，中药复方治疗则展现出整体调节、多环节治疗的优势，具有多样性及安全性，协同作用强，能有效减轻患者病残程度，促进神经功能恢复，提高生存质量，具有良好的发展前景，在防治cis的研究过程中取得了良好的疗效。益脑通络中药组合物作为一种有效治疗缺血性脑卒中的药物，具有市场应用价值，但是其质量检测目前并没有相关的研究，未见相关的质量检测报道。


技术实现要素：

4.本发明提供一种益脑通络中药组合物及其制备和质量检测方法，以解决益脑通络中药组合物质量检测不准确的问题。中药在防治上述疾病中有着悠久的历史，结合前人的诊疗经验，并经过长期的临床实践，我们总结出一种疗效确切的益脑通络中药组合。由于中药种类及炮制方法繁多，为使其临床疗效更加稳定，我们提出了益脑通络中药组合的制备及质量检测方法。
5.本发明的一种益脑通络中药组合物的质量检测方法，检测方法包括以下内容：
6.1)葛根的检测
7.一、取益脑通络中药组合物产品，研细，按照质量体积比为1g:3～5ml的比例加入甲醇，在20～30khz的条件下超声20～30min，滤过，滤液蒸干，残渣按照质量体积比为1g:1～2ml加甲醇溶解，作为供试品溶液；
8.二、另取葛根对照药材，按照步骤一的方法制成对照药材溶液；再取葛根素对照品，按照质量体积比为1g:1ml比例加入加甲醇，作为对照品溶液；
9.三、吸取供试品溶液、葛根素对照品和对照药材溶液各8μl，分别点于同一硅胶g薄
层板上，使成条状，以三氯甲烷-甲醇-水为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯下检视；在与对照药材色谱和对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光条斑，即为供试品色谱；
10.其中，三氯甲烷、甲醇和水的体积比为7:2～3:0.2～0.3；
11.2)川芎的检测
12.四、取益脑通络中药组合物产品，研细，按照质量体积比为1g:3～5ml的比例加入水溶解，滤过，滤液用乙酸乙酯-甲酸混合溶液振摇提取，取乙酸乙酯液，滤液回收溶剂至干，残渣加甲醇溶解，作为供试品溶液；
13.其中，乙酸乙酯与甲酸的体积比为19∶1；乙酸乙酯-甲酸混合溶液与滤饼的体积质量比为3～5ml:1g；残渣与甲醇的质量体积比为5g：0.5～1.5ml；
14.五、取阿魏酸对照品，加甲醇制成每1ml含0.5mg的溶液，作为对照品溶液；
15.六、吸取供试品溶液8μl，对照品溶液2μl，分别点于同一硅胶g薄层板上，以环己烷-乙酸乙酯甲酸为展开剂，展开，取出，晾干，喷以质量分数为1％三氯化铁溶液与质量分数为1％铁氰化钾溶液的混合溶液，置日光下检视；在与对照品色谱相应的位置上，显相同的颜色斑点为供试品色谱；
16.其中，三氯化铁溶液与铁氰化钾溶液的体积比为1：1；环己烷-乙酸乙酯甲酸的体积比为20∶10∶1；
17.3)红花的检测
18.七、取益脑通络中药组合物产品，研细，按照质量体积比为1g:3～5ml的比例加乙酸乙酯，超声30min，滤过，滤液回收溶剂至干，残渣加甲醇使溶解，作为供试品溶液；
19.其中，残渣与甲醇的质量体积比为5g：1～2ml；
20.八、另红花对照药材，按照步骤七的方法制成对照药材溶液；
21.九、分别取供试品溶液和对照药材溶液各10μl，分别点于同-硅胶gf254薄层板上，以二氯甲烷-乙酸乙酯-冰醋酸为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯下检视，在与对照品色谱相应的位置上，显相同的颜色斑点为供试品色谱；
22.其中，二氯甲烷-乙酸乙酯-冰醋酸的体积比为5∶4∶1；
23.通过上述葛根、川芎和红花检测，完成所述的益脑通络中药组合物的质量检测；
24.所述的益脑通络中药组合物，按照重量份数是由200～400份的益母草、100～300份的制首乌、100～300份的川芎、100～300份的葛根、100～300份的杜仲、100～200份的红花和50～150份的泽泻组成。
25.进一步地，所述的益脑通络中药组合物制备方法如下：
26.1)按照重量份数取200～400份的益母草、100～300份的制首乌、100～300份的川芎、100～300份的葛根、100～300份的杜仲、100～200份的红花和50～150份的泽泻，备用；
27.2)将上述各药物混合后加水煎煮两次，第一次煎煮1～2h，第二次煎煮0.5～1.5h，合并煎液，滤过，滤液减压浓缩至80℃温度下相对密度为1.25～1.30，减压干燥，制粒，即得。
28.进一步地，所述的紫外光灯的波长均为365nm。
29.进一步地，所述的葛根检测还包括葛根的β-谷甾醇检测，具体如下：
30.一、取益脑通络中药组合物产品，研细，加入到甲醇和丙酮浸提，减压浓缩至膏状浸提物，将浸提物用水混合后，再加入石油醚-二氯甲苯的混合液萃取，然后加入乙酸乙酯
萃取，对所得萃取液浓缩后，过硅胶柱，采用正己烷与乙酸乙酯溶剂系统按体积比10:1、5:1、3:1和1:1依次洗脱；收集体积比为1:1洗脱液，得β-谷甾醇供试品溶液；
31.其中，甲醇和丙酮的体积比为2～3:1；石油醚与二氯甲苯的比例1～2:1；
32.二、取β-谷甾醇对照品加醋酸乙酯/甲醇中制成每毫升含0.5～1毫克的溶液作为对照品溶液；
33.三、吸取供试品溶液和对照品溶液各8μl，分别点于同一硅胶g薄层板上，使成条状，以体积比为20:5:4:0.5的环己烷-三氯甲烷-乙酸乙酯-甲酸为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸无水乙醇溶液，置365nm的紫外光灯下检视。
34.进一步地，所述的川芎的检测还包括川芎藁本内酯的检测，具体如下：
35.一、取益脑通络中药组合物产品，研细，加入石油醚和乙醇的混合液，在温度为10～50℃下超声提取10～30min，然后停止超声，抽滤后，滤饼用石油醚和乙醇混合液洗脱三次，收集洗脱液；滤液继续在温度为10～50℃下搅拌提取30～60min，抽滤后，滤饼用石油醚和乙醇混合液洗脱三次，收集洗脱液；合并两次的洗脱液，浓缩，得川芎藁本内酯供试品溶液；
36.其中乙醇的体积百分含量为70％；石油醚和乙醇的体积比为2:1；
37.二、取藁本内酯对照品，加丙酮配制成0.5mg/ml的溶液，作为对照品；
38.三、吸取供试品溶液和对照品溶液各5μl，分别点于同一硅胶g薄层板上，使成条状，以体积比为4:1的环己烷-乙酸乙酯甲酸为展开剂，展开，取出，晾干，喷以质量分数为1％三氯化铁溶液与质量分数为1％铁氰化钾溶液的混合溶液，置日光下检视；在与对照品色谱相应的位置上，显相同的颜色斑点为供试品色谱；
39.其中，三氯化铁溶液与铁氰化钾溶液的体积比为1:1。
40.进一步地，所述的红花的检测还包括红花多酚的检测，具体如下：
41.一、取益脑通络中药组合物产品，研细，加入体积百分含量为60％的甲醇，在温度为50～60℃、料液比为1g:20～40ml、超声功率为500～700w，频率为50khz的条件下，提取20～30min，过滤，滤液蒸干，残渣加甲醇使溶解，得供试品溶液；
42.二、取没食子酸对照品，按照1mg:1ml的比例加入体积百分含量为30％的丙酮，作为对照品溶液；
43.三、分别取供试品溶液和对照品溶液各10μl，分别点于同一硅胶g薄层板上，以醋酸为展开剂，展开，取出，晾干，喷1％的三氯化铁乙醇溶液，晾干，置760nm紫外光灯下检视；
44.其中，二氯甲烷-乙酸乙酯-冰醋酸的体积比为5∶4∶1。
45.进一步地，所述的红花的检测还包括红花黄酮的检测，具体如下：
46.一、取益脑通络中药组合物产品，研细，加入三氯甲烷，在料液比为1g：20～40ml、超声功率为300～500w，频率为50khz的条件下，提取10～20min，过滤，滤液作为供试品溶液；
47.二、取靛蓝、靛玉红对照品，分别按照0.5mg：1ml的比例加入氯仿，作为靛蓝对照品溶液和靛玉红对照品；
48.三、取供试品溶液、靛蓝和靛玉红对照品各5μl，分别点于同一硅胶g薄层板上，以体积比为5∶4∶1甲苯-三氯甲烷-丙酮为展开剂，展开，取出，晾干，置日光下检视；供试品溶液色谱中，在与对照品溶液色谱相应位置上显相同颜色的斑点。
49.进一步地，所述的益脑通络中药组合物的质量检测还包括益母草的检测，具体如下：
50.1)益母草生物碱的检测
51.一、取益脑通络中药组合物产品，研细，按照质量体积比为1g：8～10ml的比例加入盐酸和乙醇的混合液，加入到索氏提取器中提取，抽滤，浓缩，然后以盐酸溶液后，得供试品溶液a；其中，盐酸的浓度为0.1mol/l，乙醇体积浓度为90％；
52.二、取盐酸水苏碱对照品，按照4mg：1ml的比例加入乙醇，作为对照品溶液；
53.三、分别取供试品溶液a和对照品溶液各10μl，分别点于同-硅胶薄层板上，以10∶6∶1的丙酮-无水乙醇-盐酸为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5∶1的改良碘化铋钾试液-1％三氯化铁的无水乙醇溶液的混合溶液；供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上显相同颜色斑点；在盐酸水苏碱斑点的下方，至少有另一个红色斑点；
54.2)益母草生物多糖的检测
55.四、另取益脑通络中药组合物产品，研细，以按照质量体积比为1g：15～30ml的比例加入体积百分含量为60％的甲醇，在超声频率为30～50khz的条件下，超声提取30～60min，得供试品溶液b；
56.五、采用苯酚-硫酸法测定供试品溶液b的多糖含量；
57.六、取阿魏酸对照品，按照质量体积比为0.01mg：1ml加入体积百分含量为60％的甲醇，作为阿魏酸对照品；取金丝桃苷对照品，按照质量体积比为0.07mg：1ml加入体积百分含量为60％的甲醇，作为金丝桃苷对照品；
58.七、取对照品，注入高效液相色谱仪中，建立标准曲线；然后取供试品溶液b，注入高效液相色谱仪中，以外标法计算益脑通络中药组合物中益母草的阿魏酸和金丝桃苷含量；
59.其中，色谱条件为：色谱柱为kromasii c18，以含0.1％磷酸体积的水作为流动相a，以乙腈为流动相b，梯度洗脱，流速为0.5～1.5ml
·
min-1
，柱温25～40℃，检测波长200～360nm；梯度洗脱程序：0-10min，流动相a为90％；11-15min，流动相a为90％-75％；16-45min，流动相a为75％-60％；46-55min，流动相a为60％。
60.益母草，归肝、心包经。功能主治：活血调经，利尿消肿。用于月经不调，痛经，经闭，恶露不尽，水肿尿少；急性肾炎水肿。
61.制首乌，归肝、心、肾经。功能主治：补肝肾，益精血，乌须发，强筋骨。用于血虚萎黄，眩晕耳鸣，须发早白，腰膝酸软，肢体麻木，崩漏带下，久疟体虚；高血脂。
62.川芎，归肝、胆、心包经。功能主治：活血行气，祛风止痛。用于月经不调，经闭痛经，症瘕腹痛，胸胁刺痛，跌扑肿痛，头痛，风湿痹痛。
63.葛根，归脾、胃经。功能主治：解肌退热，生津，透疹，升阳止泻。用于外感发热头痛、项背强痛，口渴，消渴，麻疹不透，热痢，泄泻；高血压颈项强痛。
64.杜仲，归肝、肾经。功能主治：补肝肾，强筋骨，安胎。用于肾虚腰痛，筋骨无力，妊娠漏血，胎动不安；高血压。
65.红花，归心、肝经。功能主治：活血通经，散瘀止痛。用于经闭，痛经，恶露不行，症瘕痞块，跌扑损伤，疮疡肿痛。
66.泽泻，归肾、膀胱经。功能主治：利小便，清湿热。用于小便不利，水肿胀满，泄泻尿
少，痰饮眩晕，热淋涩痛；高血脂。
67.本发明的益脑通络中药组合物，具有活血化瘀、疏散气机、补益肝肾、生髓益脑等功效。可用于治疗血瘀型缺血性中风。
68.本发明的益脑通络中药组合物，以葛根、川芎、红花和益母草作为主要的药效成分，发挥了重要的作用。为了益脑通络中药组合物的顺利推广，因此，本发明建立了以上述几种物质为标准的益脑通络中药组合物质量检测方法。本发明研究发现葛根中的葛根素、β-谷甾醇；川芎中的阿魏酸和藁本内酯；红花的黄酮、多酚；以及益母草的生物碱、多糖对于益脑通络中药组合物的药效发挥起到了主要的作用。以上述主要指标作为检测的标准，通过上述物质的检测，构建出了益脑通络中药组合物全面、准确的检测方法，本发明的检测方法针对益脑通络中药组合物中各组分的药物成分，基于薄层色谱(tlc)方法，建立了适用于本发明独有的检测方法。
69.本发明通过tlc、色谱法等益脑通络中药组合物中的上述关键物质进行检测，能够有效考察益脑通络中药组合物的质量，检测准确，且针对性强。本发明所建立的方法是依托于本发明对于益脑通络中药组合物的深入研究，得出该组合物中主要的药效成分，并建立各药物成分的针对性检测方法。通过多种检测的方式组合，共同形成了本发明的质量检测方案，对于本发明的益脑通络中药组合物的质量评价更具有实用价值。
附图说明
70.图1为益脑通络颗粒中川芎的tlc图谱；其中，1阿魏酸对照品溶液，2、3、4供试品溶液，5阴性对照溶液；
71.图2为益脑通络颗粒中葛根的tlc图谱；其中，1葛根素，2葛根对照药材，3、4、5供试品溶液，6阴性对照溶液；
72.图3为益脑通络颗粒中红花的tlc图谱图；其中，1红花对照药材溶液，2、3、4、供试品溶液，5红花阴性对照溶液；
73.图4为葛根素标准曲线图。
具体实施方式
74.为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面将详细叙述本发明所揭示内容的精神，任何所属技术领域技术人员在了解本发明内容的实施例后，当可由本发明内容所教示的技术，加以改变及修饰，其并不脱离本发明内容的精神与范围。
75.本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，但并不作为对本发明的限定。
76.实施例1
77.本实施例的一种益脑通络中药组合物，是由300g益母草、200g制首乌、200g川芎、200g葛根、200g杜仲、150g红花和100g泽泻制成。
78.以上七味，加水煎煮两次，第一次1.5小时，第二次1小时，合并煎液，滤过，滤液减压浓缩至相对密度为1.25～1.30(80℃)，减压干燥，加入适量可溶性淀粉、阿司帕坦，混匀，制成颗粒，干燥，制成600g，即得。
79.实施例2
80.对实施例1制备的益脑通络中药产品进行质量检测，具体如下：
81.一、性状
82.实施例1制备的益脑通络中药产品为棕褐色的颗粒；气微香，味甜、微苦。通过多批小试品种和中试品种比效，放置时间长短比效，气、味并无显著性差异。
83.二、鉴别试验
84.因实施例1制备的益脑通络中药产品为颗粒剂，处方饮片经水煎煮之后制成颗粒，故对选薄层色谱鉴别。
85.(1)川芎的薄层色谱(tlc)鉴别
86.川芎是伞形科植物，其化学成分主要为挥发油及有机酸。将颗粒剂加水20ml使溶解，滤过，滤液用乙酸乙酯-甲酸(体积比19:1)混合溶液20ml振摇提取，分取乙酸乙酯液，蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液。用阿魏酸作对照，加甲醇制成每1ml含0.5mg的溶液，作为对照品溶液。建立起tlc鉴别方法，经阴性对照，无干扰，专属性较强，重现性好。参照薄层色谱法(2020年版《中国药典》四部通则0502)试验，吸取对照品2μl，供试品8μl，分别点于同一硅胶g薄层板上，以环己烷-乙酸乙酯-甲酸(体积比20:10:1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以1％三氯化铁溶液1％铁氰化钾(体积比1:1)溶液临用新制的混合溶液，置日光下检视。供试品色谱中，在与对照药品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。结果见图1。
87.川芎藁本内酯的鉴别：
88.取益脑通络中药组合物产品，研细，加入石油醚和乙醇的混合液，在温度为15℃下超声提取15min，然后停止超声，抽滤后，滤饼用石油醚和乙醇混合液洗脱三次，收集洗脱液；滤液继续在温度为20℃下搅拌提取60min，抽滤后，滤饼用石油醚和乙醇混合液洗脱三次，收集洗脱液；合并两次的洗脱液，浓缩，得川芎藁本内酯供试品溶液；
89.其中乙醇的体积百分含量为70％；石油醚和乙醇的体积比为2:1；取藁本内酯对照品，加丙酮配制成0.5mg/ml的溶液，作为对照品；吸取供试品溶液和对照品溶液各5μl，分别点于同一硅胶g薄层板上，使成条状，以环己烷-乙酸乙酯甲酸为展开剂，展开，取出，晾干，喷以质量分数为1％三氯化铁溶液与质量分数为1％铁氰化钾溶液的混合溶液，置日光下检视；在与对照品色谱相应的位置上，显相同的颜色斑点为供试品色谱；
90.其中，三氯化铁溶液与铁氰化钾溶液的体积比为1：1。
91.(2)葛根的薄层色谱(tlc)鉴别
92.葛根主要成分为异黄酮类化合物:大豆素、大豆皂苷、大豆素葡萄糖苷、葛根素等。还含谷甾醇、羽扇烯酮、尿素、廿二烷酸、廿四烷酸甘油酯、花生酸和多量淀粉。
93.葛根素是鉴别：葛根常用的对照成分，所以选择甲醇作为提取溶剂，采用葛根素对照品和葛根对照药材作对照，建立起鉴别方法。经阴性对照，无干扰，专属性较强，重现性好。取本品适量，研细，取本品粉末5g，加甲醇20ml，超声30分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇2ml使溶解，作为供试品溶液。另取葛根对照药材2g，同法制成对照药材溶液。再取葛根素对照品，加甲醇制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液。参照薄层色谱法(2020年版《中国药典》四部通则0502)试验，吸取上述三种溶液各8μl，分别点于同一硅胶g薄层板上，使成条状，以三氯甲烷-甲醇-水(7:2.5:0.25)为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯(365nm)下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱和对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光条斑。结果见图2。
94.β-谷甾醇鉴别：取益脑通络中药组合物产品，研细，加入到甲醇和丙酮浸提，减压浓缩至膏状浸提物，将浸提物用水混合后，再加入石油醚-二氯甲苯的混合液萃取，然后加入乙酸乙酯萃取，对所得萃取液浓缩后，过硅胶柱，采用正己烷与乙酸乙酯溶剂系统按体积比10:1、5:1、3:1和1:1依次洗脱；收集体积比为1:1洗脱液，得β-谷甾醇供试品溶液；
95.其中，甲醇和丙酮的体积比为2:1；石油醚与二氯甲苯的比例1:1；取β-谷甾醇对照品加醋酸乙酯/甲醇中制成每毫升含0.5毫克的溶液作为对照品溶液；吸取供试品溶液和对照品溶液各8μl，分别点于同一硅胶g薄层板上，使成条状，以三氯甲烷-甲醇-水(7:2.5:0.25)为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯(365nm)下检视；在与对照药材色谱和对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光条斑，即为供试品色谱。
96.(3)红花的薄层色谱(tlc)鉴别
97.1)红花含红色的和黄色的色素，有红花苷，前红花苷，红花黄色素a及红花明苷等成分，还包括黄酮、多酚等物质。用乙酸乙酯超声提取，用红花对照药材作对照，建立起鉴别方法，经阴性对照，无干扰，专属性较强，重现性好。取本品适量，研细，取本品粉末5g，加乙酸乙酯20ml，超声30分钟，滤过,滤液蒸干，残渣加甲醇2ml使溶解，作为供试品溶液。另取红花对照药材1g，同法制成对照药材溶液。照薄层色谱法(2020年版《中国药典》四部通则0502)试验，吸取上述两种溶液各10ul，分别点于同一硅胶gf254薄层板上，以二氯甲烷-乙酸乙酯冰醋酸(5:4:1)为展开剂，展开,取出，晾干，置紫外光灯(254nm)下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置.上，显相同颜色的斑点。结果见图3。
98.通过上述薄层色谱(tlc)鉴别，可以看出川芎、葛根、红花tlc鉴别重现性好，斑点较为清晰，方法学考察阴性无干扰。
99.2)红花多酚的检测，具体如下：
100.一、取益脑通络中药组合物产品，研细，加入体积百分含量为60％的甲醇，在温度为50℃、料液比为1g：30ml、超声功率为500w，频率为50khz的条件下，提取30min，过滤，滤液蒸干，残渣加甲醇使溶解，得供试品溶液；
101.二、取没食子酸对照品，按照1mg：1ml的比例加入体积百分含量为30％的丙酮，作为对照品溶液；
102.三、分别取供试品溶液和对照品溶液各10μl，以醋酸为展开剂，展开，取出，晾干，喷1％的三氯化铁乙醇溶液，晾干，置760nm紫外光灯下检视；
103.其中，二氯甲烷-乙酸乙酯-冰醋酸的体积比为5∶4∶1。
104.3)红花黄酮的检测，具体如下：
105.一、取益脑通络中药组合物产品，研细，加入三氯甲烷，在料液比为1g：30ml、超声功率为350w，频率为50khz的条件下，提取10min，过滤，滤液作为供试品溶液；
106.二、取靛蓝、靛玉红对照品，分别按照0.5mg：1ml的比例加入氯仿，作为靛蓝对照品溶液和靛玉红对照品；
107.三、取供试品溶液、靛蓝和靛玉红对照品各5μl，分别点于同一硅胶g薄层板上，以体积比为5∶4∶1甲苯-三氯甲烷-丙酮为展开剂，展开，取出，晾干，置日光下检视；供试品溶液色谱中，在与对照品溶液色谱相应位置上显相同颜色的斑点。
108.(4)益母草的检测，具体如下：
109.1)益母草生物碱的检测
110.一、取益脑通络中药组合物产品，研细，按照质量体积比为1g：8ml的比例加入盐酸和乙醇的混合液，加入到索氏提取器中提取，抽滤，浓缩，然后以盐酸溶液后，得供试品溶液a；其中，盐酸的浓度为0.1mol/l，乙醇体积浓度为90％；
111.二、取盐酸水苏碱对照品，按照4mg：1ml的比例加入乙醇，作为对照品溶液；
112.三、分别取供试品溶液a和对照品溶液各10μl，分别点于同-硅胶薄层板上，以10∶6∶1的丙酮-无水乙醇-盐酸为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5∶1的改良碘化铋钾试液-1％三氯化铁的无水乙醇溶液的混合溶液；供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上显相同颜色斑点；在盐酸水苏碱斑点的下方，至少有另一个红色斑点；
113.2)益母草生物多糖的检测
114.四、另取益脑通络中药组合物产品，研细，以按照质量体积比为1g：15～30ml的比例加入体积百分含量为60％的甲醇，在超声频率为50khz的条件下，超声提取30min，得供试品溶液b；
115.五、采用苯酚-硫酸法测定供试品溶液b的多糖含量；
116.六、取阿魏酸对照品，按照质量体积比为0.01mg：1ml加入体积百分含量为60％的甲醇，作为阿魏酸对照品；取金丝桃苷对照品，按照质量体积比为0.07mg：1ml加入体积百分含量为60％的甲醇，作为金丝桃苷对照品；
117.七、取对照品，注入高效液相色谱仪中，建立标准曲线；然后取供试品溶液b，注入高效液相色谱仪中，以外标法计算益脑通络中药组合物中益母草的阿魏酸和金丝桃苷含量；
118.其中，色谱条件为：色谱柱为kromasii c18，以含0.1％磷酸体积的水作为流动相a，以乙腈为流动相b，梯度洗脱，流速为0.5～1.5ml
·
min-1
，柱温25～40℃，检测波长200～360nm；梯度洗脱程序：0-10min，流动相a为90％；11-15min，流动相a为90％-75％；16-45min，流动相a为75％-60％；46-55min，流动相a为60％。
119.实施例3
120.按照中国药典2020版《中国药典》四部通则(0104)，颗粒剂项下有关的各项规定检测。粒度、含水量、溶化性、装量差异等完全符合各项要求。故对实施例1的产品检查项可遵照药典规定执行。
121.一、含量测定
122.1、仪器和试剂
123.1.1药材
[0124][0125]
1.2仪器
[0126][0127]
1.3试剂
[0128][0129]
2.溶液配制
[0130]
(1)对照品溶液配制
[0131]
盐酸益母草碱对照品溶液的制备精密称定质量约为0.30mg的盐酸益母草碱对照品，再将此对照品与75％甲醇溶液定容于10ml容量瓶中，混匀，制成约含30μg/ml的溶液，过0.45μm微孔滤膜，即得。
[0132]
葛根素对照品溶液的制备精密称定质量约为4.0mg的葛根素对照品，再将此对照品与30％乙醇溶液定容于50ml容量瓶中，混匀，制成约80μg/ml的溶液，过0.45μm微孔滤膜，即得。
[0133]
(2)供试品溶液的配制
[0134]
益母草碱供试品溶液的制备取益脑通络颗粒，研细，精密称定1.0070g，置具塞锥形瓶中，精密加入75％甲醇25ml,超声处理30min，用75％甲醇补足减失的质量，过滤，取续滤液2.5ml至10ml容量瓶中，加75％甲醇至刻度。摇匀过0.45μm微孔滤膜，即得。
[0135]
葛根素供试品溶液的制备取益脑通络颗粒，研细，精密称定1.0018g，置具塞锥形瓶中,精密加入30％乙醇25ml,加热回流30分钟，放冷，用30％乙醇补足减失的质量，过滤，取续滤液2.5ml至10ml容量瓶中，加30％甲醇至刻度。过0.45μm微孔滤膜，即得。
[0136]
3.葛根方法学考察
[0137]
(1)测定色谱条件
[0138]
色谱柱：填充剂为十八烷基硅烷键合硅胶(4.6mm
×
150mm，5μm)；
[0139]
流动相：甲醇-水(25:75)；
[0140]
检测波长为250nm；
[0141]
流速1ml/min；
[0142]
进样量为10μl
[0143]
(2)专属性实验按处方比，除去葛根药材，按原工艺制成阴性样品，按“供试品溶液制备”项下同法处理制成阴性空白对照液，按原供试品色谱条件，以供试品溶液、对照品溶液和阴性空白对照液各10μl进行测定，结果在阴性空白对照色谱图中，葛根素峰处无其他药物干扰。
[0144]
(3)线性关系的考察
[0145]
分六次精密吸取对照品溶液(80μg/ml)，吸取量分别为6、8、10、12、14、16μl，依次注入液相色谱仪，测定峰面积，绘制折线图。折线图的纵坐标(y)为峰面积、横坐标(x)为含量。结果见图4。
[0146]
根据实验结果求出回归方程:y＝92.709x-3.9977及r2＝0.9992，表明葛根素在0.48μg～1.28μg范围内线性关系较好。
[0147]
(4)重复性实验
[0148]
根据供试品溶液的制备方法，将同一供试品平行处理6份，对这6份供试品均进行测定，测得葛根素平均含量为4.043mg/g，rsd为1.94％。表明样品具有较好的重复性。
[0149]
表1重复性实验结果
[0150][0151]
(5)精密度实验
[0152]
精密量取葛根素对照品溶液(80μg/ml)10μl，连续6次进样。测得峰面积平均值为72.564，rsd为0.31％。可知，该方法的测定性能良好，仪器精密度不错，可用于本实验测定。
[0153]
表2精密度实验结果
[0154][0155]
(6)稳定性实验
[0156]
一般考察供试品稳定性时间为24h，取葛根供试品溶液适量，按每4小时一次的时间间隔进样7次。进样时间分别为0、4、8、12、16、20、24h，测得峰面积平均值为83.914，rsd为3.41％。根据稳定性实验结果，说明样品在24h具有较好的稳定性。
[0157]
表3稳定性实验结果
[0158][0159][0160]
(7)加样回收率实验
[0161]
精密称定6份质量约为0.1g的供试品(已知含量)，并向每份供试品中精密加入10ml的葛根素对照品溶液(约80μg/ml)，定容至25ml容量瓶再按照“供试品溶液制备”项的操作制备6份供试品溶液，依次测定供试品的峰面积，计算回收率和平均回收率，平均回收率为97.57％，rsd为4.77％。结果见表4。
[0162]
表4样品回收率测定结果表
[0163][0164]
(8)葛根含量测定
[0165]
精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入色谱仪，对六份供试品进行测定，每份样品平行测定两次，计算葛根素含量，葛根素的平均含量为4.005mg/g，rsd为3.54％。结果见表5。
[0166]
表5样品含量测定结果
[0167][0168]
4.益母草含量测定方法学研究
[0169]
(1)色谱条件
[0170]
色谱柱：填充剂为十八烷基硅烷键合硅胶(4.6mm
×
150mm，5μm)；
[0171]
流动相：乙腈-0.2％磷酸溶液(22∶78)；
[0172]
检测波长为280nm；
[0173]
流速1ml/min；进样量为10μl；
[0174]
(2)专属性实验按处方比，除去益母草药材，按原工艺制成阴性样品，按“供试品溶液制备”项下同法处理制成阴性空白对照液，按原供试品色谱条件，以供试品溶液，对照品溶液和阴性空白对照液各10μl进行测定，结果在阴性空白对照色谱图中，盐酸益母草碱峰处无其他药物干扰。
[0175]
采用高效液相色谱法对益脑通络颗粒中的盐酸益母草碱和葛根素的含量测定。其中葛根素的含量测定方法具有分离效果好、高效、重复性好等优点。葛根素平均含量为4.005mg/g。