4种RAF蛋白及其编码基因在植物抗旱中的应用

4种raf蛋白及其编码基因在植物抗旱中的应用
技术领域
1.本发明涉及植物生物技术领域，具体涉及4种raf蛋白及其编码基因在植物抗旱中的应用。


背景技术：

2.mapk(mitogen-activated protein kinase)级联反应在真核生物的进化上普遍保守，一般认为外界刺激被受体感知，受体被激活，激活的受体激活mapk级联反应。mapk级联由mapkkk(mapk kinase kinase)、mapkk(mapk kinase)、mapk(map kinase)所组成，mapkkk可以磷酸化mapkk，磷酸化的mapkk可以磷酸化mapk，mapk靶向细胞胞质或者核内的效应蛋白从而将信号向下游传递。mapk级联可通过三种类型可逆的磷酸化激酶将信号逐级放大和传递。植物中的mapkkk主要分为三类：ziks、mekks、raf-like mapkkks。在拟南芥中，有一些rfa类的激酶有些报道，比如ctr1参与乙烯信号通路的转导，lik1参与离子渗透以及转运体的调控等过程，raf19参与二氧化碳信号通路等研究。但是在玉米中该类基因的研究和报导相对很少。作为第二大粮食作物和重要的饲料作物，玉米的产量和质量关系到我国农业经济的发展。因此如何利用新技术和新方法，通过对重要基因进行遗传改造，提高玉米抗旱性，最终获得抗逆新品种，是现代基础生物学和农业育种的共同目标之一。玉米的产量容易受到干旱胁迫影响，通过基因工程方法改良玉米抗旱性，对保护玉米产量具有重要意义。


技术实现要素：

3.本发明所要解决的技术问题是如何调控植物的抗旱性。
4.为了解决上述技术问题，本发明首先提供了蛋白质的下述任一种应用。
5.所述蛋白质为蛋白质a、蛋白质b、蛋白质c或蛋白质d。
6.p1、所述蛋白质在调控植物抗旱性中的应用，
7.p2、所述蛋白质在制备降低植物抗旱性的产品中的应用，
8.p3、所述蛋白质在植物育种中的应用。
9.所述蛋白质a为如下a1)、a2)或a3)的蛋白质：
10.a1)氨基酸序列是序列表中序列1的蛋白质；
11.a2)将序列表中序列1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的且具有相同功能的由a1)衍生的或与a1)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且具有相同功能的蛋白质；
12.a3)在a1)或a2)的n末端或/和c末端连接蛋白标签得到的融合蛋白质。
13.所述蛋白质b为如下b1)、b2)或b3)的蛋白质：
14.b1)氨基酸序列是序列表中序列2的蛋白质；
15.b2)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的且具有相同功能的由b1)衍生的或与b1)所示的蛋白质具有80％以上
的同一性且具有相同功能的蛋白质；
16.b3)在b1)或b2)的n末端或/和c末端连接蛋白标签得到的融合蛋白质。
17.所述蛋白质c为如下c1)、c2)或c3)的蛋白质：
18.c1)氨基酸序列是序列表中序列3的蛋白质；
19.c2)将序列表中序列3所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的且具有相同功能的由c1)衍生的或与c1)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且具有相同功能的蛋白质；
20.c3)在c1)或c2)的n末端或/和c末端连接蛋白标签得到的融合蛋白质。
21.所述蛋白质d为如下d1)、d2)或d3)的蛋白质：
22.d1)氨基酸序列是序列表中序列4的蛋白质；
23.d2)将序列表中序列4所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的且具有相同功能的由d1)衍生的或与d1)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且具有相同功能的蛋白质；
24.d3)在d1)或d2)的n末端或/和c末端连接蛋白标签得到的融合蛋白质。
25.上述蛋白质中，序列表中序列1由415个氨基酸残基组成。序列表中序列2由762个氨基酸残基组成。序列表中序列3由574个氨基酸残基组成。序列表中序列4由598个氨基酸残基组成。
26.上述蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。
27.上述蛋白质中，所述蛋白标签(protein-tag)是指利用dna体外重组技术，与目的蛋白一起融合表达的一种多肽或者蛋白，以便于目的蛋白的表达、检测、示踪和/或纯化。所述蛋白标签可为flag标签、his标签、mbp标签、ha标签、myc标签、gst标签和/或sumo标签等。
28.上述蛋白质中，同一性是指氨基酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定氨基酸序列的同一性，如ncbi主页网站的blast网页。例如，可在高级blast2.1中，通过使用blastp作为程序，将expect值设置为10，将所有filter设置为off，使用blosum62作为matrix，将gap existence cost，per residue gap cost和lambda ratio分别设置为11，1和0.85(缺省值)并进行检索一对氨基酸序列的同一性进行计算，然后即可获得同一性的值(％)。
29.上述蛋白质中，所述80％以上的同一性可为至少81％、82％、85％、86％、88％、90％、91％、92％、95％、96％、98％、99％或100％的同一性。
30.上述应用中，所述植物可为玉米。
31.为了解决上述技术问题，本发明还提供了与上述蛋白质相关的生物材料的下述任一种应用：
32.q1、所述生物材料在调控植物抗旱性中的应用，
33.q2、所述生物材料在制备降低植物抗旱性的产品中的应用，
34.q3、所述生物材料在植物育种中的应用。
35.所述生物材料为下述e1)至e11)中的任一种：
36.e1)编码上述蛋白质的核酸分子；
37.e2)含有e1)所述核酸分子的表达盒；
38.e3)含有e1)所述核酸分子的重组载体、或含有e2)所述表达盒的重组载体；
39.e4)含有e1)所述核酸分子的重组微生物、或含有e2)所述表达盒的重组微生物、或含有e3)所述重组载体的重组微生物；
40.e5)含有e1)所述核酸分子的转基因植物细胞系、或含有e2)所述表达盒的转基因植物细胞系；
41.e6)含有e1)所述核酸分子的转基因植物组织、或含有e2)所述表达盒的转基因植物组织；
42.e7)含有e1)所述核酸分子的转基因植物器官、或含有e2)所述表达盒的转基因植物器官；
43.e8)促进或提高上述蛋白质的基因表达的核酸分子；
44.e9)含有e8)所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因植物细胞系；
45.e10)抑制或降低上述蛋白质的基因表达的核酸分子；
46.e11)含有e10)所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因植物细胞系。
47.上述生物材料中，所述核酸分子为如下a1)、b1)、c1)或d1)。
48.所述a1)为a1-1)、a1-2)或a1-3)所示的所述蛋白质的编码基因：
49.a1-1)编码链的编码序列是序列表中序列5的核苷酸的cdna分子或dna分子；
50.a1-2)核苷酸是序列表中序列5的cdna分子或dna分子；
51.a1-3)与a1-2)限定的cdna或dna分子杂交且编码具有相同功能的蛋白质的cdna分子或dna分子。
52.所述b1)为b1-1)、b1-2)或b1-3)所示的所述蛋白质的编码基因：
53.b1-1)编码链的编码序列是序列表中序列6的核苷酸的cdna分子或dna分子；
54.b1-2)核苷酸是序列表中序列6的cdna分子或dna分子；
55.b1-3)与b1-2)限定的cdna或dna分子杂交且编码具有相同功能的蛋白质的cdna分子或dna分子。
56.所述c1)为c1-1)、c1-2)或c1-3)所示的所述蛋白质的编码基因：
57.c1-1)编码链的编码序列是序列表中序列7的核苷酸的cdna分子或dna分子；
58.c1-2)核苷酸是序列表中序列7的cdna分子或dna分子；
59.c1-3)与c1-2)限定的cdna或dna分子杂交且编码具有相同功能的蛋白质的cdna分子或dna分子。
60.所述d1)为d1-1)、d1-2)或d1-3)所示的所述蛋白质的编码基因：
61.d1-1)编码链的编码序列是序列表中序列8的核苷酸的cdna分子或dna分子；
62.d1-2)核苷酸是序列表中序列8的cdna分子或dna分子；
63.d1-3)与d1-2)限定的cdna或dna分子杂交且编码具有相同功能的蛋白质的cdna分子或dna分子。
64.上述生物材料中，b2)所述的含有核酸分子的表达盒，是指能够在宿主细胞中表达上述应用中所述蛋白质的dna，该dna不但可包括启动蛋白编码基因转录的启动子，还可包括终止蛋白编码基因转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。可用于本发明的启动子包括但不限于：组成型启动子，组织、器官和发育特异的启动子，和诱导型启动子。可用现有的植物表达载体构建含有所述蛋白编码基因表达盒的重组表达载体。所述植
物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。如pahc25、pwmb123、pbin438、pcambia1302、pcambia2301、pcambia1301、pcambia1300、pbi121、pcambia1391-xa或pcambia1391-xb(cambia公司)等。
65.上述生物材料中，所述重组微生物具体可为酵母，细菌，藻和真菌。
66.为了解决上述技术问题，本发明还提供了调控基因表达的物质的下述任一种应用：
67.f1、调控基因表达的物质在调控植物抗旱性中的应用，
68.f2、调控基因表达的物质在制备降低植物抗旱性的产品中的应用，
69.f3、调控基因表达的物质在植物育种中的应用。
70.所述调控基因表达的物质具体可为下述任一种：
71.e1)编码上述蛋白质的核酸分子；
72.e2)含有e1)所述核酸分子的表达盒；
73.e3)含有e1)所述核酸分子的重组载体、或含有e2)所述表达盒的重组载体。
74.上文所述调控植物抗旱性为提高植物对干旱的敏感性。
75.上述应用中，所述调控基因表达可为增强或提高所述基因表达。
76.上述应用中，所述调控基因表达的物质可为增强或提高所述基因表达的试剂。
77.为了解决上述技术问题，本发明还提供了一种培育干旱敏感植物的方法。包括提高目的植物中上述蛋白质的生物表达量或/和上文所述核酸分子的表达量，得到干旱敏感的植物。所述干旱敏感植物对干旱的敏感性高于所述目的植物。
78.包含上文所述蛋白质和/或上文所述的生物材料和/或上文所述调控基因表达的物质的下述任意一种产品，也属于本发明的保护范围：
79.g1、调控植物抗旱性的产品；
80.g2、降低植物抗旱性的产品；
81.g3、提高植物干旱敏感性的产品。
82.上文中，所述降低植物抗旱性的产品可为植物抗逆调控剂。所述植物抗逆调控剂可含有上述蛋白质或/和所述生物材料。
83.上述方法中，所述对干旱敏感植物可为转基因植物，也可为通过杂交等常规育种技术获得的植物。
84.上述方法中，所述转基因植物理解为不仅包含第一代到第二代转基因植物，也包括其子代。对于转基因植物，可以在该物种中繁殖该基因，也可用常规育种技术将该基因转移进入相同物种的其它品种，特别包括商业品种中。所述转基因植物包括种子、愈伤组织、完整植株和细胞。
85.上文所述植物和/或所述目的植物可为玉米。
86.上文所述蛋白质和/或上文所述生物材料也属于本发明的保护范围。
87.上文所述核酸分子可产生不同转录本，翻译出不同蛋白质，所述核酸分子产生的不同转录本以及翻译出的不同蛋白质均在本专利保护范围内。
88.本发明将来自玉米b73的四种mapkkk家族蛋白基因zmraf11、zmraf19、zmraf32和zmraf34分别导入玉米b73中得到四种基因的转基因过表达株系；与未转化的野生型b73对照植株相比，分别过表达四种基因均增加了转基因玉米对干旱胁迫的敏感性。说明玉米
zmraf11中，序列表中的序列5所示的dna分子由玉米泛素基因ubi的启动子启动并由nos终止子终止，能够表达zmraf11蛋白(氨基酸序列如序列表中序列1所示)；pbcxun-zmraf19中，序列表中的序列6所示的dna分子由玉米泛素基因ubi的启动子启动并由nos终止子终止，能够表达zmraf19蛋白(氨基酸序列如序列表中序列2所示)；pbcxun-zmraf32中，序列表中的序列7所示的dna分子由玉米泛素基因ubi的启动子启动并由nos终止子终止，能够表达zmraf32蛋白(氨基酸序列如序列表中序列3所示)；pbcxun-zmraf34中，序列表中的序列8所示的dna分子由玉米泛素基因ubi的启动子启动并由nos终止子终止，能够表达zmraf34蛋白(氨基酸序列如序列表中序列4所示)。
100.pbcxun载体是将pcxun(genbank:fj905215.1，06-jul-2009)的hyg基因(hptii，潮霉素抗性基因)替换为bar基因(编码膦丝菌素乙酰转移酶)(genbank:mg719235.1中的第284-835位核苷酸，02-oct-2018)，保持pcxun的其它核苷酸不变得到的表达载体。
101.2.zmraf11、zmraf19、zmraf32和zmraf34基因过表达株系的获得
102.2.1重组农杆菌的获得
103.将步骤1中构建的pbcxun-zmraf11、pbcxun-zmraf19、pbcxun-zmraf32和pbcxun-zmraf34过表达载体转化农杆菌eha105感受态，菌落pcr鉴定阳性克隆，并测序。含有pbcxun-zmraf11的阳性克隆即为pbcxun-zmraf11/eha105重组农杆菌；含有pbcxun-zmraf19的阳性克隆即为pbcxun-zmraf19/eha105重组农杆菌；含有pbcxun-zmraf32的阳性克隆即为pbcxun-zmraf32/eha105重组农杆菌；含有pbcxun-zmraf34的阳性克隆即为pbcxun-zmraf34/eha105重组农杆菌。四种重组农杆菌的菌落pcr和测序鉴定引物均为ubip-seq(对应于ubi启动子中)和nosr-seq(对应于nos终止子中)。
104.ubip-seq:5
′‑
ttttagccctgccttcatacgc-3
′
，
105.nosr-seq:5
′‑
agaccggcaacaggattcaatc-3
′
。
106.将重组农杆菌pbcxun-zmraf11/eha105、pbcxun-zmraf19/eha105、pbcxun-zmraf32/eha105和pbcxun-zmraf34/eha105的单菌落分别接种于2-3ml含有100μg/ml硫酸卡那霉素和50μg/ml利福平的液体培养基中，28℃振荡培养过夜。第二天转接到含有相应抗生素的大量液体培养基中震荡培养，转接几次后收集菌体。将菌体重新悬浮至od
600
在0.8-1.0之间，得到四种重组农杆菌的菌悬液。
107.2.2转基因过表达株系的获得
108.将2.1中获得的四种重组农杆菌的菌悬液侵染无菌条件下扒出的b73玉米幼胚，然后使用除草剂草丁膦筛选诱导出的愈伤组织，将筛选出的愈伤组织诱导成苗。
109.采用pcr鉴定筛选得到的zmraf11、zmraf19、zmraf32和zmraf34转基因植株(提取植株叶片的基因组dna，采用ubip-seq和nosr-seq组成的引物对进行pcr扩增，得到特异性扩增产物的植株为zmraf11、zmraf19、zmraf32和zmraf34的转基因植株)。转四种基因的转基因植株分别经过自交繁种后获得t3代稳定遗传的zmraf11、zmraf19、zmraf32和zmraf34基因的过表达植株，用于进行后续干旱处理实验。
110.提取不同转基因自交系的rna(magen公司的rna提取试剂盒)，反转录出cdna(thermo公司的反转录试剂盒)，定量pcr检测转基因过表达情况(takara公司的定量pcr试剂)。zmraf11转基因过表达植株中zmraf11基因的表达量高于野生型b73中zmraf11基因的表达量；zmraf19转基因过表达植株中zmraf19基因的表达量高于野生型b73中zmraf19基因
的表达量；zmraf32转基因过表达植株中zmraf32基因的表达量高于野生型b73中zmraf32基因的表达量；zmraf34转基因过表达植株中zmraf34基因的表达量高于野生型b73中zmraf34基因的表达量。
111.二、zmraf11、zmraf19、zmraf32和zmraf34基因过表达玉米干旱处理表型检测
112.实验包含三个重复。每个重复中包含对照b73的15个小盆和zmraf11、zmraf19、zmraf32和zmraf34基因过表达植株(t3代)的各15个小盆。在每个小盆中加入140g土，托盘里加上水，每小盆放4粒种子，覆盖50ml土，吸满水后将托盘中剩余的水倒掉后于培养间(温度25℃，湿度40％)正常培养，出苗后将长势不齐的一棵苗去掉，在托盘里加入1l水，吸满后将水倒掉，开始干旱处理不再浇水。
113.在干旱处理1周时，玉米植株叶片出现干旱萎蔫表型，结果如图1和图2所示。图1中zmraf11基因过表达株系(图1中a中的zmraf11-oe1和zmraf11-oe2所示)、zmraf19基因过表达株系(图1中b中的zmraf19-oe1和zmraf19-oe2所示)以及zmraf34基因过表达株系(图1中c中的zmraf34所示)和zmraf32基因过表达株系(图2中的zmraf32所示)的生长状况均差于对照b73(图1和图2中wt所示)；所有材料植株在干旱胁迫下均出现叶片萎蔫表型，但四种转基因株系植株叶片的萎蔫程度均高于wt。结果表明四种转基因株系植株相比于野生型对照b73对干旱更敏感；zmraf11、zmraf19、zmraf32和zmraf34基因的过表达会导致干旱敏感的表型。
114.在干旱处理3周出现较严重干旱胁迫后进行复水，复水3天后观察玉米植株存活率。结果显示三次重复zmraf32基因过表达株系的平均存活率为2％，对照b73植株的平均存活率为46.7％(图2)。结果表明，在干旱条件下zmraf32基因过表达株系的存活率远低于野生型对照b73，zmraf32基因在玉米抵御干旱胁迫中起负调控作用。
115.以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本技术欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本技术中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。