一个参与桃果实果香型芳香物质合成的基因及其应用

1.本发明涉及植物分子生物技术和基因工程技术领域，涉及一个参与桃果实果香型芳香物质合成的基因及其应用。


背景技术：

2.桃(prunus persica)是蔷薇科桃属，原产于中国，种质资源丰富，我国桃的栽培面积和产量均居世界首位。香气能够强化消费者对果实的感官记忆，是影响果实风味品质的关键因子。近年来消费者常抱怨桃果实风味变淡，其中香气的丢失是主要原因。
3.乙酸己酯、乙酸-e-2-己烯酯和乙酸-z-3-己烯酯等酯类，以及γ-癸内酯和δ-癸内酯等内酯是成熟桃果实果香型芳香品质形成的物质基础。感官评价分析表明，酯类和内酯芳香物质含量与消费者喜好正相关，随着桃果实成熟逐渐积累。已有研究鉴别出了参与桃果实酯类芳香物质合成的醇酰基转移酶(aat)，位于合成途径的末端。除了参与酯类合成，桃ppaat1还催化4-羟基癸酰coa的羟基与酰基相连形成γ-癸内酯。此外，脂肪酸β-氧化途径的端口酶ppacx1(酰基coa氧化酶)也参与了桃果实内酯合成。
4.酯和内酯均以脂肪酸作为前体物质，在理论上通过调控脂肪酸组分与含量可以影响桃果实酯和内酯等果香型芳香物质合成。参与脂肪酸组分合成与转化的基因包括脂肪酸去饱和酶fad、脂肪酸裂解酶lip等。目前，从番茄果实中发现lip参与了醛和醇类芳香物质合成，草莓果实中鉴别出可以控制γ-癸内酯合成的脂肪酸去饱和酶fafad1。但是，通过影响前体物质脂肪酸含量，进而调控酯和内酯芳香物质合成的基因尚未得到鉴别。考虑到酯和内酯芳香物质对于桃果实，以及其他果实成熟期间芳香品质形成的重要作用，鉴别可以同时调控上述芳香物质合成的基因，对于果实品质改良具有重要的应用价值。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于提供一个参与桃果实果香型芳香物质合成的基因，是一种同时调控桃果实酯和内酯芳香物质合成的基因。为了实现上述发明目的，本发明主要提供以下技术方案：
6.本发明提供的一个参与桃果实果香型芳香物质合成的基因的核苷酸序列如seq id no.1所示。
7.本发明提供的上述基因编码的蛋白质氨基酸序列如seq id no.2所示。
7.本发明还提供了一种包含上述方案所述基因的重组载体trv2-ppfad2。
8.本发明还提供了一种包含上述方案所述重组载体的重组微生物。
9.本发明的另一个目的是提供所述基因在促进或抑制桃果实内酯类芳香物质合成中的应用，尤其在促进桃果实γ-癸内酯和δ-癸内酯芳香物质合成中的应用。
10.本发明的再一个目的是提供所述基因在促进或抑制桃果实酯类芳香物质合成中的应用，尤其在促进桃果实乙酸己酯芳香物质合成中的应用。
11.本发明的第4个目的是提供所述基因在桃树品种选育及芳香品质改良中的应用。
本发明的有益效果：
12.本发明提供的基因在桃果实成熟过程中表达逐渐增加，与果香型的γ-癸内酯、δ-癸内酯及乙酸己酯含量变化正相关；该基因在不同品种桃果实中的表达水平与果实内酯及乙酸己酯芳香物质含量正相关；在桃果实中过量表达该基因可以促进γ-癸内酯、δ-癸内酯和乙酸己酯积累，沉默该基因则减少了γ-癸内酯、δ-癸内酯和乙酸己酯含量。过量表达该基因能够促进果香型芳香物质酯和内酯的合成，为果实品质改良提供了靶基因。
附图说明
13.图1：桃果实发育过程ppfad2的表达与内酯和酯类含量正相关。
14.图2：乙烯及1-mcp处理调控桃果实内酯和酯类的含量及ppfad2的表达。
15.图3：不同品种桃果实内酯、酯类含量与ppfad2基因表达的相关性。
16.图4：桃果实中瞬时过量表达ppfad2促进内酯和酯类芳香物质合成。
17.图5：桃果实中vigs沉默ppfad2抑制内酯和酯类芳香物质合成。
具体实施方式
18.下面结合具体实施例和附图对本发明提供的一个参与桃果实果香型内酯和酯类芳香物质合成的基因ppfad2及其应用进行详细的说明，但是实施例不限制本发明的保护范围。
19.实施例1：桃果实发育过程ppfad2基因表达与内酯含量正相关
20.(一)实验方法
21.1.桃果实材料采自浙江省奉化市水蜜桃研究所的5个不同生长发育阶段的
‘
湖景蜜露’(prunus persica l.batsch cv.hujingmilu)果实：花后34天(幼果期)、花后71天(膨大期)、花后94天(转色期)、花后108天(成熟期)、花后111天(成熟果实采后20℃放置3天)和花后114天(成熟果实采后20℃放置6天)。样品采收当天运达实验室，挑选大小、成熟度一致，且未受病虫害和机械伤的果实，每个取样时间点设置3个生物学重复，每个重复5个果实。果肉组织经液氮冷冻后于-80℃保存。
22.2.内酯及酯类芳香物质含量分析桃果肉样品经液氮研磨后称取5g，加入3ml 200mm edta溶液3ml 20％cacl2溶液及20μl的内标2-辛醇(0.8mg/ml)密封后混合均匀，恒温平衡30min后，使用65μm聚二甲基硅氧烷和二乙烯苯(pdms-dvb)萃取头(supelco co.)进行30min固相微萃取。萃取头在gc-ms(agilent 7890-5975)进样口解吸附5min后用db-wax毛细管色谱柱(0.25mm，30m，0.25μm，j&w scientific)进行分离。升温程序为从40℃以3℃
·
min-1
速率升至100℃，然后再以5℃
·
min-1
速率升至245℃。以1.0ml
·
min-1
氦气为载气，ms离子源温度230℃，采用电子轰击电离方式，电子能量为70ev，质谱扫描范围为35到350m/z。采用质谱库nist-8(nist/epa/nih)和保留指数(retention index，ri)进行物质鉴别，内标面积归一化方法进行物质的浓度计算。
23.3.rna提取及转录组分析液氮冷冻研磨的样品1g，加入4ml 65℃预热的ctab/β-巯基乙醇提取液，涡旋混
合，65℃水浴5min；加入4ml氯仿：异戊醇(24：1)抽提液，充分涡旋混合；15℃10000rpm离心10min，吸取上清液到新的离心管，重新抽提一次；上清液吸取到新的离心管中，加入1/4体积的10mol/l的licl，4℃放置12h；4℃10000rpm离心20min，倒掉上清液，沉淀加入400μl 65℃预热的sste溶解沉淀；再加入400μl氯仿：异戊醇(24：1)抽提液，涡旋混合；转移至1.5ml离心管中20℃10000rpm离心10min，吸上清液到新的离心管中加入2倍体积的-20℃预冷的无水乙醇，上下颠倒混匀，-80℃放置30min；4℃10000rpm离心25min，去上清液，短暂离心后吸出残余液体，将沉淀在通风橱晾干；加入20μl depc水溶解沉淀，得到总rna样品。总rna用turbo dnase(ambion)试剂盒除去残留的基因组dna。凝胶电泳进行检测rna完整性。委托百迈客公司开展rna-seq转录组测序，测试平台为hiseq-2000。
24.(二)实验结果γ-癸内酯和δ-癸内酯是
‘
湖景蜜露’桃果实中的主要内酯类香气物质，其含量在转色期(94天)前的果实中未检测到，转色后及果实后熟过程中逐渐积累；乙酸己酯是桃果实中以亚油酸为底物合成的酯类芳香物质，其含量随果实成熟也大致呈增加趋势，在转色期有个含量高峰。ppfad2基因的表达水平在桃果实发育前期较低，转色期后快速增加，与γ-癸内酯(r＝0.90)和δ-癸内酯(r＝0.93)香气物质含量变化显著正相关，与乙酸己酯含量变化也呈现正相关(r＝0.67)(图1)。
25.实施例2：乙烯及1-mcp处理影响桃果实内酯含量及ppfad2表达
26.(一)实验方法
27.1.实验材料转色期前
‘
湖景蜜露’果实(94dab)，分为3组。乙烯处理组：100μl/l的乙烯室温密封处理12h；1-mcp处理组：5μl/l乙烯信号转导抑制剂1-mcp室温密封处理12h；对照组：果实不做处理室温密封12h。处理后的果实放置于室温25℃贮藏24h、60h和96h后分别用液氮冷冻取样，保存于-80℃，用于后续分析。每组实验设置3个生物学重复，每个重复5个果实。
28.2.内酯及酯类芳香物质含量分析内酯及酯类芳香物质含量分析方法参照实施例1。实验结果参见图2。
29.3.rn a提取及转录组测序分析ctab法提取总rna：参照实施例1。委托百迈客公司开展rna-seq转录组测序，测试平台为hiseq-2000。实验结果参见图2。
30.(二)实验结果与对照果实相比，乙烯处理可以显著诱导γ-癸内酯、δ-癸内酯及乙酸己酯的合成，而1-mcp可以显著抑制它们的合成；基因表达分析显示，乙烯处理可以显著诱导ppfad2的表达，而1-mcp处理则显著抑制了ppfad2基因的表达(图2)。以上结果表明，ppfad2的表达与γ-癸内酯、δ-癸内酯及乙酸己酯的合成均受到乙烯的调控。
31.实施例3：不同品种桃果实内酯及ppfad2表达分析
32.(一)实验方法
33.1.实验材料采收自江苏省农科院桃资源圃的127个不同品种的桃果实，每个品种设置3个生物学重复，每个重复5个果实。果肉组织经液氮冷冻取样，-80℃保存，用于后续香气物质及基因表达分析。
34.2.内酯及酯类芳香物质含量分析内酯及酯类芳香物质含量分析方法参照实施例1。实验结果参见图3。
35.3.rna提取及转录组测序分析ctab法提取总rna：参照实施例1。委托百迈客公司开展rna-seq转录组测序，测试平台为hiseq-2000。实验结果参见图3。
36.(二)实验结果不同品种桃果实内酯及酯类芳香物质含量差异很大，根据γ-癸内酯和δ-癸内酯总量的差异，将127份桃果实分为：低内酯(《100ng/g)、中内酯(》100ng/g且《400ng/g)和高内酯(》400ng/g)3组。分析3组果实中ppfad2基因的表达，结果显示，低内酯组的桃果实中ppfad2基因的平均表达水平较低，而高内酯组的桃果实中ppfad2基因的平均表达水平较高；将桃果实品种按照乙酸己酯含量分为3组：低酯(《30ng/g)、中酯(》30ng/g且《100ng/g)和高酯(》100ng/g)。3组桃中ppfad2基因表达也表现出由低到高的趋势。ppfad2基因表达量与物质含量相关性分析显示，ppfad2基因表达量与内酯类含量显著正相关(r＝0.61，p《0.01)，同时与乙酸己酯含量也呈正相关(r＝0.46，p《0.01)(图3)。以上结果表明，ppfad2基因的表达可能影响了不同桃果实中内酯及酯类芳香物质的含量。
37.实施例4：桃果实瞬时过表达ppfad2促进桃果实内酯和酯类芳香物质合成
38.(一)实验方法
39.1.cdna合成及ppfad2基因表达分析桃果实总rna 1.0μg，用takara试剂盒去除基因组dna后，按说明书操作逆转录合成cdna。利用qpcr分析ppfad2基因表达，以桃pptef2为内参基因，ppfad2引物序列为seq id no.3和seq id no.4。qpcr反应体系包括10μl ssofast evagreen supermix(bio-rad)，上下游引物(10μm)各1μl，2μl cdna，6μl h2o。pcr程序为：95℃3min；95℃10s，60℃30s，45个循环；95℃10s；从65℃到95℃，每上升0.5℃读取一次荧光信号值。所用仪器为bio-rad cfx96实时荧光定量pcr仪，qpcr引物特异性经熔点曲线分析析和qpcr产物测序验证。实验结果参见图4。
40.2.sk-ppfad2重组载体构建及农杆菌转化根据桃基因组数据库中的ppfad2基因参考序列，以cdna为模板，利用引物对seq id no.5和seq id no.6扩增获得ppfad2的全长seq id no.1。pcr反应体系为50μl，成分分别为：25μl primestar max premix(2x)酶(takara)，上下游引物(10μm)各2μl，1μl桃果实cdna，20μl h2o。利用同源重组方法，将pcr产物与经限制性内切酶bamh i和sal i酶切后的pgreen ii 002962-sk载体进行连接。连接产物加入20ul dh5α感受态，冰上放置30min，42℃热激90s，转化dh5α，挑取阳性菌落后测序验证。
41.3.将序列确认正确的sk-ppfad2载体、ptrv1载体及trv2-ppfad2载体利用电击转化法，分别转入农杆菌gv3101::psoμp中，并分别挑取阳性克隆保存。空载sk及trv2以同样方法转化农杆菌，用作阴性对照。
42.桃果实同源瞬时过量表达将含有sk-ppfad2载体的gv3101农杆菌在含kan(50mg/l)及get(25mg/l)的固体培养基上划线28℃培养2d后，挑取单克隆菌株于5ml含kan与get的lb中，过夜培养后转移至500ml lb(kan 50mg/l get 25mg/l)，培养至od600＝0.8～1.0。4℃，5000g，离心10min收集
菌。用等体积mes渗透液(10mm mes，10mm mgcl2，150mm乙酰丁香酮，0.04％tritonrx-100，ph 5.6)重悬，常温放置2h，待用。含空sk载体的农杆菌以同样方法准备，作为对照。
43.取转色期后桃果实，以腹逢线为分界，一边注射含有目的基因的菌液，一边注射对照。每面注射3个孔，每个孔300μl菌液。每个果实为一个重复，过表达及基因沉默组分别设置20个重复。注射后的果实放置于25℃培养箱，8～10d后取注射孔附近1cm直径的果肉样品，用液氮冷冻，用于后续基因表达及内酯含量测定。实验结果参加图4。
44.(二)实验结果在桃果实中瞬时过量表达ppfad2基因后，ppfad2基因表达水平增加至对照的2.5倍，同时果实中γ-癸内酯含量增加为对照果实的3.6倍，δ-癸内酯含量增加为对照果实的2.6倍，乙酸己酯的含量增加为对照果实的3.8倍(图4)。以上结果表明，桃果实中过量表达ppfad2基因可以促进内酯和酯类芳香物质合成。
45.实施例5：桃果实vigs(病毒介导的基因沉默)ppfad2抑制内酯和酯类合成
46.(一)实验方法
47.1.cdna合成及ppfad2基因表达分析桃果实cdna合成方法及ppfad2基因表达分析方法参照实施例4。
48.2.vigs重组载体构建及农杆菌转化以cdna为模板，利用引物对seq id no.7和seq id no.8扩增获得ppfad2的cds区域400bp的序列，如seq id no.9所示。利用同源重组方法，将pcr产物与经限制性内切酶xho i和bamh i酶切后的ptrv2载体进行连接。连接产物加入20μl dh5α感受态，冰上放置30min，42℃热激90s，转化dh5α，挑取阳性菌落后测序验证。
49.将序列确认正确的ptrv2-ppfad2载体及辅助病毒载体ptrv1分别利用电击转化法，分别转入农杆菌gv3101::psoμp中，并分别挑取阳性克隆保存。空载ptrv2以同样方法转化农杆菌，用作阴性对照。
50.1.桃果实同源瞬时vigs基因沉默携带ptrv1、空载ptrv2、ptrv2-ppfad2质粒的农杆菌分别在3抗(rgk)lb培养基(25mg/l rif 25mg/l get 50mg/l kan)上划线，28℃培养2-3d。挑取单菌落，用含3抗(10mg/l rif 25mg/l gen 50mg/l kan)的lb液体培养基摇菌，200r/min，28℃摇16-18h。取菌液按1:25加入诱导培养基(含有10mg/l rif 25mg/l get 50mg/l kan 200μm乙酰丁香酮)，28℃摇16-24h，使菌液od600值为0.5-0.8。收集菌体，5000r/min离心10min，用相同体积的mes悬浮液重悬。再次离心，收集菌体，用1/2体积的mes渗透液重悬。在含有ptrv1质粒的悬浮菌液里加入乙酰丁香酮(终浓度400μm)，室温放置3-5h。将含ptrv1的菌液分别与ptrv2-ppfad2及ptrv2空载(作为阴性对照)的菌液等体积混合，用于桃果实注射。桃果实注射侵染方法参照实施例4，实验结果见图5。
51.(二)实验结果利用vigs沉默桃果实中ppfad2基因，其表达水平下降为对照果实的1/2，同时与对照果实相比，基因沉默的果实中γ-癸内酯含量下降了3.6倍，δ-癸内酯含量下降了1倍，乙酸己酯含量下降了1.5倍(图5)。以上结果证明，沉默ppfad2基因表达会抑制桃果实内酯和酯类合成。