一种基于青蒿素的铁池靶向分子影像探针制备及其应用

1.本发明属于医学影像探针领域，具体是涉及一种基于青蒿素的铁池靶向分子影像探针制备及其应用。


背景技术：

2.铁是人体中最丰富的过渡金属元素，它能够在不同的氧化价态之间转换，这使其在氧气运输、能量产生、酶代谢等功能方面发挥着重要作用。但这种高效的氧化还原能力同样给细胞带来潜在的危险，异常蓄积的铁能够通过fenton反应产生高活性的活性氧ros如羟基自由基，造成细胞氧化损伤，引起病理性病变。因此，体内具有一套精密复杂的调节机制用于调控铁稳，即铁转运系统。外周循环中的fe
3
与转铁蛋白结合形成复合物后与细胞膜上的转铁蛋白受体结合，进入细胞内的内涵体，此时的fe
3
通过铁氧还原酶steap3(sixtransmembrane epithelial antigen of the prostate)还原为fe
2
，随后在二价金属离子转运蛋白1的介导下，fe
2
从内涵体解体释放到细胞质，一部分储存于不稳定的铁池lip(fe
2
)，过多的铁则存储在由铁蛋白轻链和铁蛋白重链1组成的铁储存蛋白复合物中，剩余部分fe
2
将被氧化成fe
3
通过铁转蛋白转出细胞，参与体内铁再循环。
3.铁死亡是一种铁依赖的氧化性细胞死亡，区别于传统的细胞凋亡、坏死和自噬，其特征为细胞死亡过程中伴随着大量的铁离子累积和脂质过氧化，同时耗竭谷胱甘肽过氧化酶gpx4；细胞内高富集的lip是脂质过氧化和诱导铁死亡的关键因素。近年来研究表明，铁死亡与许多疾病的病理生理进程密切相关，如肿瘤、神经系统疾病、缺血再灌注损伤、肾脏损伤等。遗传学证据显示铁死亡的发生与大脑退化相关，在成年小鼠中，诱导gpx4缺失会导致星形胶质细胞增生时海马神经元的丢失，这种缺失在阿尔茨海默症中会导致记忆功能的下降。fang等人(proc.natl acad.sci.usa 116,2672
–
2680(2019)发现，大鼠心肌缺血再灌注损伤后，铁稳态调节通路被激活，铁离子水平上调，ros生成增加，引起了铁依赖性的细胞死亡即铁死亡，这表明铁死亡参与了心肌的缺血再灌注损伤。因此，研究铁死亡有助于深入认识这些疾病的发生发展机制并为药物研发提供指导。
4.基于lip在铁死亡机制中发挥着关键作用，近年来针对lip检测的荧光探针的开发受到极大关注。目前已有一系列铁池靶向的荧光探针被报道，如ac-mtflunox,lyso-rhonox和fipc-1，它们能在细胞水平上对lip进行成像。但是，这类铁离子的荧光探针受限于荧光的低穿透深度，因而无法在活体上对非浅表组织进行成像。因此，急需开发一种更具临床潜力的探针，如正电子发射断层扫描探针/磁共振成像探针(pet/mri)，用于活体层面示踪铁池浓度变化，探究铁池含量变化与铁死亡相关疾病进程的内在联系，从而实现对疾病的精准早期诊断和预后评价。
5.青蒿素是1972年由屠呦呦博士从草本植物青蒿(artemisia annua)中分离并鉴定出来的一种化合物，其结构中的含有的内过氧桥与抗疟机制密切相关。研究表明，疟原虫在红细胞内期发育繁殖时，会在吸收消化血红蛋白后产生血红素，青蒿素及其衍生物特异性的靶向血红素中fe
2
，在fe
2
催化下打开内过氧桥，产生高活性的碳自由基或者氧自由基，
这些高活性的物质与疟原虫多种蛋白以共价键结合并使之烷基化，破坏疟原虫的正常生理功能，从而杀死疟原虫。


技术实现要素：

6.本发明的目的在于提供具有高特异选择性的一种基于青蒿素的铁池靶向分子影像探针。
7.本发明的第二目的在于提供所述基于青蒿素的铁池靶向分子影像探针分子的制备方法。
8.本发明的第三目的在于提供所述基于青蒿素的铁池靶向分子影像探针在铁死亡相关疾病活体成像中的应用。
9.所述基于青蒿素的铁池靶向分子影像探针为art-x-co-linker-r1，分子式(1)为：
[0010][0011]
或分子式(2)为：
[0012][0013]
其中，art为青蒿素；x为-o-c＝o-或s；r1为nota、dota、dtpa等大环配体；可标记的顺磁性金属离子为gd
3
，mn
2
，eu
2
，可标记的核素为
99m
tc、
111
in、
18
f、
177
lu、
64
cu或
68
ga等；n和m代表不同代数的骨架分子。
[0014]
所述nota、dota以及dtpa的结构式如下：
[0015][0016]
所述linker的结构为：
[0017][0018]
所述探针选自但不限于如下结构化合物中的任一种：
[0019][0020]
所述基于青蒿素的铁池靶向分子影像探针的制备方法可为：以青蒿素为fe
2
靶向部分，在其结构的12位羟基位点引出链接基团，接着通过酰胺反应连接大环配体，最后螯合上具有磁共振成像造影能力的顺磁性金属离子gd
3
、mn
2
或eu
2
或具有正电子断层扫描成像能力的放射性核素
99m
tc、
111
in、
18
f、
177
lu、
64
cu或
68
ga，构建基于青蒿素的铁池靶向分子影像探针。
[0021]
所述基于青蒿素的铁池靶向分子影像探针可应用于铁死亡相关疾病的活体成像。
[0022]
所述铁死亡相关疾病包括但不限于阿尔茨海默症、帕金森综合征、亨廷顿病、急性/慢性肾损伤、心肌损伤、风湿性关节炎等。
[0023]
所述成像为磁共振成像(mri)或正电子断层扫描成像(pet)，所述应用为对病灶部位进行可视化分析，提供精确的组织结构信息。
[0024]
本发明的有益效果是：
[0025]
(1)本发明报道的基于青蒿素的铁池靶向分子影像探针具有良好的化学稳定性、
生物安全性和生物分布性质，制备方法简单易行，可用于铁死亡相关疾病的pet/mri活体成像。
[0026]
(2)本发明报道的基于青蒿素的铁池靶向分子影像探针对病灶部位造影效果较好。在心肌损伤小鼠模型中，优选探针能够选择性富集在心肌损伤区域，对病灶部位进行可视化分析，并提供精确的组织结构信息。
附图说明
[0027]
图1为本发明制备例1art-s-dota的质谱图。
[0028]
图2为art-s-dota-gd的mri成像效果图及其弛豫率r1。
[0029]
图3为art-s-dota-gd在心肌损伤小鼠模型的mri显像图。
[0030]
图4为art-s-dota-68
ga在心肌损伤小鼠模型的pet显像图。
具体实施方式
[0031]
以下实施例将结合附图对本发明作进一步的说明。下列实施例说明被本发明所涵盖的探针分子及其设计、制备、应用，此举例不限制本发明：
[0032]
本发明提供一类化合物如下分子式：
[0033][0034]
或如下分子式：
[0035][0036]
art为青蒿素；x为-o-c＝o-或者s；r1为nota、dota、dtpa等大环配体，可标记的顺磁性金属离子为gd
3
，mn
2
，eu
2
，可标记的核素为
99m
tc、
111
in、
18
f、
177
lu、
64
cu或
68
ga等；n和m代表不同代数的骨架分子。
[0037]
配位基团nota、dota以及dtpa结构式如下：
[0038][0039]
在本发明的一个优选实施方案中，选用分子式(1)，所述x为s，r1为dota,所述探针分子为用于标记gd
3
的mri探针art-s-dota-gd或标记
68
ga的pet探针art-s-dota-68
ga。
[0040][0041]
以下给出具体制备方法实施例。
[0042]
实施例1制备art-s-dota-gd/art-s-dota-68
ga
[0043][0044]
1)art-s-cooh的合成
[0045]
将200mg双氢青蒿素溶于无水二氯甲烷，用注射器加入67微升巯基丙酸，控温至50℃反应10min。接着将反应瓶转移到冰浴条件下，逐步滴加88微升三氟化硼乙醚溶液，溶液从无色转变为淡粉色，这一过程持续30min。反应结束后，加入适量的水淬灭多余的三氟化硼乙醚，加入足量二氯甲烷进行分液，收集合并有机相，并用无水硫酸镁干燥，减压浓缩之后，采用柱层析分离(pe︰ea＝10～5︰1)得到白色固体，收率60％。
[0046]
2)art-s-nhs的合成
[0047]
溶解120mg art-s-cooh的无水二氯甲烷溶液中，接着依次将44.4mg n-羟基丁二酰亚胺、71mg 4-二甲氨基吡啶和73.7mg 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐，室温搅拌2h之后，加入适量的水，分液收集有机相，无水硫酸镁干燥之后，减压浓缩得到橙黄色油状物，收率70％。
[0048]
3)dota-nh2的合成
[0049]
将50mg 2-氨基乙基单酰胺-dota-tris溶于1ml 35％hcl，室温反应30min之后，旋蒸除去溶剂，加入丙酮，持续搅拌1h，有白色固体析出，抽滤后，用丙酮和乙醚洗滤饼层。干燥后得到dota-nh2，产率72％。
[0050]
4)art-s-dota的合成
[0051]
将50mg dota-nh2溶于水中，加入dipea或者tfa调节ph到12，接着将57mg的art-s-nhs溶于2ml dmf中，溶解完成后将溶液加入到水中，35℃搅拌12～24h。制备型高效液相色谱分离，白色固体20mg，产率20.9％。
[0052]
5)art-s-dota-gd的合成
[0053]
在10ml单颈瓶中，将20mg art-s-dota溶于1.5ml水中，使其完全溶解。将gdcl3·
6h2o溶于1ml水中，加入至反应体系。用0.1m naoh维持体系ph在6～7范围，室温48h。反应结束后，0.22μm微孔滤膜滤除不溶物，收集滤液并冻干，得到固体15mg，收率68％。
[0054]
6)art-s-dota-68
ga的合成
[0055]
采用5ml 0.1mmol/l盐酸淋洗
68
ge/
68
ga发生器得到
68
ga原液，加入1.25mol/l醋酸钠调节ph至3.5～4.0，在加入20μg art-s-dota，混匀，100℃加入10min，室温冷却。过无菌滤膜至无菌瓶得到art-s-dota-68
ga。
[0056]
实施例2制备art-o-dota-gd/art-o-dota-68
ga
[0057][0058]
1)art-o-cooh的合成
[0059]
将200mg双氢青蒿素、400mg丁二酸酐和19.6mg dmap溶解在无水的dcm中，室温搅拌过夜。加入水、50mm hcl和饱和食盐水水洗，收集有机相，浓缩旋干。柱层析分离(pe︰ea＝5～3︰1)得到白色固体，收率80％。
[0060]
2)art-o-nhs的合成
[0061]
将100mg art-o-cooh溶解无水二氯甲烷溶液中，接着依次将40mg n-羟基丁二酰亚胺、65mg 4-二甲氨基吡啶和70mg 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐，室温搅拌2h之后，加入适量的水，分液收集有机相，无水硫酸镁干燥之后，减压浓缩得到白色固体，收率68％。
[0062]
3)dota-nh2的合成
[0063]
将50mg 2-氨基乙基单酰胺-dota-tris溶于1ml35％hcl，室温反应30min之后，旋蒸除去溶剂，加入丙酮，持续搅拌1h，有白色固体析出，抽滤后，用丙酮和乙醚洗滤饼层。干燥后得到dota-nh2，产率72％。
[0064]
4)art-o-dota的合成
[0065]
将50mgdota-nh2溶于水中，加入dipea或者tfa调节ph到12，接着将57mg的art-o-nhs溶于2ml dmf中，溶解完成后将溶液加入到水中，35℃搅拌12～24h。制备型高效液相色谱分离，白色固体23mg，产率为32％。
[0066]
5)art-o-dota-gd的合成
[0067]
在10ml单颈瓶中，将20mg art-o-dota溶于1.5ml水中，使其完全溶解。将gdcl3·
6h2o溶于1ml水中，加入至反应体系。用0.1m naoh维持体系ph在6～7范围，室温48h。反应结束后，0.22μm微孔滤膜滤除不溶物，收集滤液并冻干，得到固体15mg，收率79％。
[0068]
6)art-o-dota-68
ga的合成
[0069]
采用5ml 0.1mmol/l盐酸淋洗
68
ge/
68
ga发生器得到
68
ga原液，加入1.25mol/l醋酸钠调节ph至3.5～4.0，在加入20μg art-o-dota，混匀，100℃加入10min，室温冷却。过无菌滤膜至无菌瓶，得到art-o-dota-68
ga。
[0070]
以上述art-s-dota-gd/art-s-dota-68
ga探针为例，实验结果表明，其基本性能如下：
[0071]
1、art-s-dota-gd弛豫率r1的测量
[0072]
实施例1制备的art-s-dota的质谱图如图1，为了评估art-s-dota-gd的r1弛豫率，在缓冲液中制备了一系列不同浓度的art-s-dota-gd溶液(0.125mm、0.25mm、0.5mm和1mm)。为了测定art-s-dota-gd被fe
2
激活之后的r1弛豫率，将art-s-dota-gd和fe
2
按1︰1的比例在bsa缓冲液中共孵育。接着在7t磁共振扫描仪(bruker icon
tm
)使用t1-flash序列采集每个溶液的t1加权自旋回波图像(tr/te，500/20ms)，弛豫速率(r1,定义为1/t1)对不同探针的浓度作图。曲线采用线性回归拟合，并根据各曲线的斜率计算纵向摩尔弛豫率(r1,单位为mm-1
s-1
)。结果如图2所示，art-s-dota-gd的弛豫率r1为5.1mm-1
s-1
；与fe
2
在bsa共孵育之后弛豫率r1为11.4mm-1
s-1
(见表1)，提高了2倍多。
[0073]
表1
[0074][0075]
2、art-s-dota-gd在心肌小鼠模型体内mri成像
[0076]
在心肌损伤小鼠模型进行t1加权核磁共振成像实验时，通过尾静脉注射200μl含有art-s-dota-gd生理盐水溶液。异氟烷气体麻醉，在注射后0min、30min、1h和2h扫描小鼠t1加权磁共振成像。采集到核磁共振数据以dicom图像形式传输到radiant dicom viewer以进行图像定量分析。结果如图3所示，在注射art-s-dota-gd 60min之后，能够明显观察心肌部分有信号增强，提示心肌损伤。
[0077]
3、art-s-dota-68
ga在心肌小鼠模型体内pet成像
[0078]
在心肌损伤小鼠模型进行pet成像实验时，通过尾静脉注射art-s-dota-68
ga注射液100微升(200uci)。异氟烷气体麻醉，在注射后0min、15min,30min、1h、2h和4h进行
micropet显像。观察不同时间点心肌损伤小鼠对art-s-dota-68
ga的摄取情况。结果如图4所示，在注射art-s-dota-68
ga 15min之后，心肌损伤部位有明显的信号蓄积。
[0079]
本发明基于青蒿素内过氧桥结构对fe
2
的高特异性，以青蒿素为fe
2
靶向部分，利用大环配体(dtpa、dota、nota)跟金属离子(m为顺磁性金属离子或放射性元素)的螯合作用，赋予了分子探针mri造影或pet成像功能，构建得到在活体内特异性示踪活性铁池fe
2
的分子影像探针。本发明所涉及的探针分子与fe
2
具有高特异选择性，可实现在活体层面对病灶部位高蓄积铁池进行动态可视化评估。该探针可以对铁死亡相关疾病(如阿尔茨海默症、帕金森综合征、亨廷顿病、急性/慢性肾损伤、心肌损伤、风湿性关节炎等)进行pet/mri活体成像。此外，本发明还涉及该类探针分子的结构设计、制备方法及其在铁死亡相关疾病中的活体成像应用。