用于研究皮质-纹状体-中脑神经通路的人细胞模型的制作方法

技术特征：
1.一种用于在体外产生人纹状体基底神经节球状体或类器官的方法，所述方法包含：(a)将悬浮培养物中的人多能干细胞向神经命运诱导，以提供神经球状体；(b)使所述神经球状体分化为纹状体基底神经节球状体；以及(c)保持所述纹状体球状体处于神经培养基中，使所述纹状体球状包含人纹状体神经元。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述人纹状体神经元包含具有成熟形态和电生理学特性的中型多棘神经元。3.根据权利要求2所述的方法，其中成熟形态具有带棘状突起的神经元。4.根据权利要求2或3所述的方法，其中电生理学特性是内向整流。5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述纹状体球状进一步包含选自由以下各项组成的群组的所述细胞中的至少一种：神经组细胞、放射状胶质细胞和星形胶质细胞。6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述人多能干细胞是诱导性人多能干细胞。7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其中步骤(a)中将悬浮培养物中的所述人多能干细胞向所述神经命运诱导包含在培养基中培养，所述培养基包含骨形态生成蛋白(bmp)抑制剂和转化生长因子β(tgfβ)抑制剂，任选地，其中所述培养基进一步包含所述wnt通路抑制剂。8.根据权利要求7所述的方法，其中所述bmp抑制剂是多索吗啡，所述tgfβ抑制剂是sb-431542。9.根据权利要求7或8所述的方法，其中在包含所述bmp抑制剂和tgfβ抑制剂的所述培养基中培养2至10天。10.根据权利要求1-9中任一项所述的方法，其中步骤(a)中的所述悬浮培养物不含饲养层。11.根据权利要求1-10中任一项所述的方法，其中步骤(b)中使所述神经球状体分化为所述纹状体球状体包含在神经培养基中培养悬浮培养物中的所述神经球状体，所述培养基包含所述wnt通路抑制剂、活化素a和类视黄醇x受体(rxr)激动剂，任选地，其中所述神经球状体在包含所述wnt通路抑制剂和所述活化素a的神经培养基中培养4至8周，并且其中在2至10天后用所述rxr激动剂补充所述神经培养基。12.根据权利要求11所述的方法，其中步骤(b)进一步包含用选自由以下各项组成的群组的化合物中的至少一种补充所述神经培养基：脑源性神经营养因子(bdnf)、nt3、l-抗坏血酸2-磷酸三钠盐(aa)、n6、2'-o-二丁酰腺苷3',5'-环单磷酸钠盐(camp)、顺式-4,7,10,13,16,19-二十二碳六烯酸(dha)和dapt，任选地，其中在3至4周后用所述至少一种化合物补充所述神经培养基。13.根据权利要求1-12中任一项所述的方法，其中步骤(c)中的保持所述纹状体球状体是在无生长因子存在的神经培养基中进行的。14.根据权利要求1-13中任一项所述的方法，其中步骤(c)中的保持所述纹状体球状体至少持续1个月。15.根据权利要求1-14中任一项所述的方法，其中所述纹状体球状体的细胞包含至少
一种与神经或精神病症相关的等位基因。16.根据权利要求15所述的方法，其中所述神经或精神病症选自由以下各项组成的群组：精神分裂症、强迫症、图雷特综合征、亨廷顿病、帕金森病和孤独症谱系障碍(asd)。17.一种包含人纹状体神经元的纹状体球状体，其中所述纹状体球状体能够在悬浮培养物中保持至少1个月而不粘附于表面。18.一种通过根据权利要求1-16中任一项所述的方法获得的纹状体球状体。19.一种用于在体外产生皮质-纹状体类组装体的方法，所述方法包含：(i)(a)将悬浮培养物中的第一人多能干细胞向神经命运诱导，以提供第一神经球状体；(b)使所述第一神经球状体分化为纹状体球状体(hstrs)，(ii)(a)将悬浮培养物中的第二人多能干细胞向神经命运诱导，以提供第二神经球状体；(b)使所述第二神经球状体分化为皮质球状体(hcs)，以及(iii)在允许细胞融合的条件下于神经培养基中培养所述hstrs和hcs，使得所述皮质-纹状体类组装体包含从所述hcs投射至所述hstrs中的人皮质神经元。20.根据权利要求19所述的方法，其中所述人皮质神经元包含表达ctip2的神经元和/或表达satb2的神经元，其可特异性地投射和连接中型多棘神经元。21.根据权利要求19或20所述的方法，其中所述hstrs包含人纹状体神经元，任选地，其中所述人纹状体神经元包含中型多棘神经元，任选地，其中所述类组装体包含位于所述人皮质神经元与人纹状体神经元之间的功能性神经回路。22.根据权利要求19-21中任一项所述的方法，其中融合入皮质-纹状体类组装体中能诱导中型多棘神经元的功能成熟。23.根据权利要求19-22中任一项所述的方法，其中步骤(i)(a)和(ii)(a)中将悬浮培养物中的所述第一和第二人多能干细胞向所述神经命运诱导包含在培养基中培养，所述培养基包含骨形态生成蛋白(bmp)抑制剂和转化生长因子β(tgfβ)抑制剂，任选地，其中所述培养基进一步包含所述wnt通路抑制剂。24.根据权利要求23所述的方法，其中所述bmp抑制剂是多索吗啡，所述tgfβ抑制剂是sb-431542。25.根据权利要求23或24所述的方法，其中在包含所述bmp抑制剂和tgfβ抑制剂的所述培养基中培养2至10天。26.根据权利要求19-25中任一项所述的方法，其中步骤(i)(b)中使所述第一神经球状体分化为所述hstrs包含在神经培养基中培养悬浮培养物中的所述第一神经球状体，所述培养基包含所述wnt通路抑制剂、活化素a和类视黄醇x受体(rxr)激动剂，任选地，其中所述第一神经球状体在包含所述wnt通路抑制剂和所述活化素a激动剂的神经培养基中培养4至8周，并且其中在2至10天后用所述rxr激动剂补充所述神经培养基。27.根据权利要求19-26中任一项所述的方法，其中步骤(ii)(b)中使所述第二神经球状体分化为所述hcs包含：在包含成纤维细胞生长因子2(fgf2)和表皮生长因子(egf)的培养基中培养悬浮培养
物中的所述第二神经球状体，以提供皮质祖细胞球状体；以及在培养基中培养悬浮培养物中的所述皮质祖细胞球状体，所述培养基缺乏fgf2和egf且包含脑源性神经营养因子(bdnf)和神经营养蛋白3(nt3)、l-抗坏血酸2-磷酸三钠盐(aa)、n6、2'-o-二丁酰腺苷3',5'-环单磷酸钠盐(camp)、顺式-4,7,10,13,16,19-二十二碳六烯酸(dha)。28.根据权利要求27所述的方法，其中在包含fgf2和egf的所述培养基中培养悬浮培养物中的所述第二神经球状体1至4周，并且在缺乏fgf2和egf且包含bdnf、nt3、aa、camp、dha的培养基中培养悬浮培养物中的所述神经祖细胞球状体1至4周。29.根据权利要求19-28中任一项所述的方法，其中步骤(iii)包含在允许细胞融合的条件下培养所述hstrs和hcs至少10天。30.根据权利要求19-29中任一项所述的方法，其中步骤(iii)包含在允许细胞融合的条件下培养所述hstrs和hcs，其包含培养彼此紧靠的所述hstrs和hcs。31.根据权利要求19-30中任一项所述的方法，其中步骤(i)(a)和/或步骤(ii)(a)中的所述悬浮培养物不含饲养层。32.根据权利要求19-31中任一项所述的方法，其中所述皮质-纹状体类组装体的细胞包含至少一种与神经或精神病症相关的等位基因，任选地，其中所述神经或精神病症选自由以下各项组成的群组：精神分裂症、强迫症、图雷特综合征、亨廷顿病、帕金森病和孤独症谱系障碍(asd)。33.一种包含与皮质球状体(hcs)融合的纹状体球状体(hstrs)的皮质-纹状体类组装体，其中所述皮质-纹状体类组装体包含从所述hcs投射至所述hstrs中的人皮质神经元，并且其中所述皮质-纹状体类组装体能够在悬浮培养物中保持至少4周而不粘附于表面。34.一种通过根据权利要求19-32中任一项所述的方法产生的皮质-纹状体类组装体。35.一种确定候选药剂对皮质-纹状体神经回路的影响的方法，所述方法包含：使所述候选药剂与根据权利要求33或权利要求34所述的皮质-纹状体类组装体接触；并确定所述候选药剂对所述皮质-纹状体类组装体中所述皮质-纹状体神经回路的数量和/或功能的影响，任选地，其中所述皮质-纹状体类组装体的细胞包含至少一种与神经或精神病症相关的等位基因，进一步任选地，其中所述神经或精神病症选自由以下各项组成的群组：精神分裂症、强迫症、图雷特综合征、亨廷顿病、帕金森病和孤独症谱系障碍(asd)。36.一种用于产生人中脑球状体或类器官的方法，所述方法包含：(a)将悬浮培养物中的人多能干细胞向神经命运诱导，以提供神经球状体；(b)使所述神经球状体分化为中脑球状体；以及(c)保持所述中脑球状体处于神经培养基中，使所述中脑球状体包含人中脑神经元。37.根据权利要求36所述的方法，其中所述人中脑神经元包含多巴胺能神经元，包括黑质。38.根据权利要求36或37所述的方法，其中所述人多能干细胞是诱导性人多能干细胞。39.根据权利要求35-38中任一项所述的方法，其中步骤(a)中将悬浮培养物中的所述人多能干细胞向所述神经命运诱导包含在培养基中培养，所述培养基包含骨形态生成蛋白(bmp)抑制剂、转化生长因子β(tgfβ)抑制剂、fgf8和音猬因子通路激动剂。
40.根据权利要求39所述的方法，其中所述bmp抑制剂是多索吗啡，所述tgfβ抑制剂是sb-431542。41.根据权利要求39所述的方法，其中所述音猬因子通路激动剂是平滑激动剂(sag)。42.根据权利要求36-41中任一项所述的方法，其中步骤(a)包含在包含所述bmp抑制剂和tgfβ抑制剂的培养基中培养4至10天，并且在包含所述bmp抑制剂和tgfβ抑制剂的所述培养基中培养约3天后，向所述培养基中加入所述fgf8和音猬因子通路激动剂。43.根据权利要求42所述的方法，其中保持所述fgf8和音猬因子通路激动剂约1天。44.根据权利要求36-43中任一项所述的方法，其中步骤(b)中使所述神经球状体分化为中脑球状体包含：将所述神经球状体转移至所述神经培养基内的悬浮培养物中，所述神经培养基补充有fgf8、音猬因子通路激动剂、bmp抑制剂和gsk-3抑制剂；以及在神经培养基中培养悬浮培养物中的所述神经球状体，所述神经培养基补充有脑源性神经营养因子(bdnf)、nt3、l-抗坏血酸、camp、dha和dapt。45.根据权利要求44所述的方法，其中所述音猬因子通路激动剂是平滑激动剂(sag)，所述bmp抑制剂是lnd 193189，并且所述gsk-3抑制剂是chir99021。46.一种包含人中脑神经元的中脑球状体，其中所述中脑球状体能够在悬浮培养物中保持至少1个月而不粘附于表面。47.一种通过根据权利要求36-45中任一项所述的方法获得的中脑球状体。48.一种用于在体外产生中脑-纹状体类组装体的方法，所述方法包含：(i)(a)将悬浮培养物中的第一人多能干细胞向神经命运诱导，以提供第一神经球状体；(b)使所述第一神经球状体分化为纹状体球状体(hstrs)，(ii)(a)将悬浮培养物中的第二人多能干细胞向神经命运诱导，以提供第二神经球状体；(b)使所述第二神经球状体分化为中脑球状体；以及(iii)在允许细胞融合的条件下于神经培养基中培养所述hstrs和hmbs，使得所述中脑-纹状体类组装体包含从所述hmbs投射至所述hstrs中的人中脑神经元。49.根据权利要求48所述的方法，其中所述人中脑神经元包含多巴胺能神经元。50.根据权利要求48或49中任一项所述的方法，其中步骤(i)(a)中将悬浮培养物中的所述第一多能干细胞向所述神经命运诱导包含在培养基中培养，所述培养基包含骨形态生成蛋白(bmp)抑制剂和转化生长因子β(tgfβ)抑制剂。51.根据权利要求48-50中任一项所述的方法，其中在包含所述bmp抑制剂和tgfβ抑制剂的所述培养基中培养2至10天。52.根据权利要求48-51中任一项所述的方法，其中步骤(ii)(a)中将悬浮培养物中的所述第二多能干细胞向所述神经命运诱导包含在培养基中培养，所述培养基包含骨形态生成蛋白(bmp)抑制剂、转化生长因子β(tgfβ)抑制剂、fgf8和音猬因子通路激动剂。53.根据权利要求48-52中任一项所述的方法，其中步骤(ii)(a)包含在包含所述bmp抑制剂和tgfβ抑制剂的培养基中培养4至10天，并且在包含所述bmp抑制剂和tgfβ抑制剂的所述培养基中培养约3天后，向所述培养基中加入所述fgf8和音猬因子通路激动剂，
任选地，其中保持所述fgf8和音猬因子通路激动剂约1天。54.根据权利要求52或53所述的方法，其中所述音猬因子通路激动剂是平滑激动剂(sag)。55.根据权利要求52至54中任一项所述的方法，其中所述bmp抑制剂是多索吗啡，所述tgfβ抑制剂是sb-431542。56.根据权利要求52至55中任一项所述的方法，其中在包含所述bmp抑制剂和tgfβ抑制剂的所述培养基中培养2至10天。57.根据权利要求48-56中任一项所述的方法，其中步骤(i)(b)中使所述第一神经球状体分化为所述hstrs包含在神经培养基中培养悬浮培养物中的所述第一神经球状体，所述培养基包含所述wnt通路抑制剂、活化素a和类视黄醇x受体(rxr)激动剂。58.根据权利要求57所述的方法，其中所述第一神经球状体在包含所述wnt通路抑制剂和活化素a的神经培养基中培养4至8周，并且其中在2至10天后用所述rxr激动剂补充所述神经培养基。59.根据权利要求48-58中任一项所述的方法，其中步骤(ii)(b)中使所述第二神经球状体分化为所述hmbs包含将所述神经球状体转移至所述神经培养基内的悬浮培养物中，所述神经培养基补充有fgf8、音猬因子通路激动剂、bmp抑制剂和gsk-3抑制剂；以及在神经培养基中培养悬浮培养物中的所述神经球状体，所述神经培养基补充有脑源性神经营养因子(bdnf)、nt3、l-抗坏血酸、camp、dha和dapt。60.根据权利要求59所述的方法，其中所述音猬因子通路激动剂是平滑激动剂(sag)，所述bmp抑制剂是lnd 193189，并且所述gsk-3抑制剂是chir99021。61.根据权利要求48-60中任一项所述的方法，其中在允许细胞融合的条件下培养所述hstrs和hmbs至少10天。62.根据权利要求61所述的方法，其中在允许细胞融合的条件下培养所述hstrs和hmbs包含培养彼此紧靠的所述hstrs和hmbs。63.根据权利要求48-62中任一项所述的方法，其中步骤(i)(a)和/或步骤(ii)(b)中的所述悬浮培养物不含饲养层。64.根据权利要求48-63中任一项所述的方法，其中所述中脑-纹状体类组装体的细胞包含至少一种与神经或精神病症相关的等位基因，任选地，其中所述神经或精神病症选自由以下各项组成的群组：精神分裂症、强迫症、图雷特综合征、亨廷顿病、帕金森病和孤独症谱系障碍(asd)。65.一种包含与中脑球状体(hmbs)融合的纹状体球状体(hstrs)的中脑-纹状体类组装体，其中所述中脑-纹状体类组装体包含从所述hmbs投射至所述hstrs中的人中脑神经元，并且其中所述中脑-纹状体类组装体能够在悬浮培养物中保持至少4周而不粘附于表面。66.一种通过根据权利要求48-64中任一项所述的方法产生的中脑-纹状体类组装体。67.一种确定候选药剂对纹状体-中脑神经回路的影响的方法，所述方法包含：使所述候选药剂与根据权利要求65或权利要求66所述的中脑-纹状体类组装体接触；并确定所述候选药剂对所述中脑-纹状体类组装体中所述纹状体-中脑神经回路的数量和/或功能的影响，
任选地，其中所述中脑-纹状体类组装体的细胞包含至少一种与神经或精神病症相关的等位基因，进一步任选地，其中所述神经或精神病症选自由以下各项组成的群组：精神分裂症、强迫症、图雷特综合征、亨廷顿病、帕金森病和孤独症谱系障碍(asd)。

技术总结
人纹状体和中脑类器官或球状体在体外生成，其可以至少部分由人多能干(hPS)细胞生成。此类球状体模拟所述人脑的所述区域并包含与人的所述纹状体(包括成熟中型多棘神经元)和中脑相关的特定细胞组，随后可与所述皮质组装以在体外形成皮质-纹状体-中脑回路。中脑回路。


技术研发人员：塞尔久
受保护的技术使用者：小利兰
技术研发日：2020.10.29
技术公布日：2022/6/15