一种连续化制备细胞培养肉可食用纤维支架的方法与流程

1.本发明涉及生物材料和食品领域，特别是涉及一种连续化制备细胞培养肉可食用纤维支架的方法。


背景技术：

2.由于肉类消费增长、环境恶化、动物福利、人类营养、食品安全和其他因素，需要开发替代蛋白质。细胞培养肉是一种新兴技术，也被称为体外肉、培养肉、清洁肉或实验室培养肉，是通过体外培养细胞而不是通过收获动物组织来生产的。培养肉商业化的一个重大挑战是大规模生产，其中包括用于细胞培养肉支架的规模化生产。支架生物材料作为支持网络，使细胞附着，并促进氧气和营养物质运输到厚组织。此外，支架可以指导细胞的增殖、分化和对齐。理想情况下，用于养殖肉类的支架材料应该易于消化，食用安全且美味。此外，人工肉支架还需要满足特定的口味、质地、热稳定性和营养要求，并能大规模、低成本地供应。
3.用于细胞培养和组织工程的支架有多种形式，最简单的支架是微载体，通常用于大规模细胞增殖。在组织成熟方面，大多数支架可分为多孔支架、水凝胶支架和纤维支架。多孔支架和纤维支架都含有空隙空间，介质可以在其中流通，但它们在结构上有所不同，多孔支架具有海绵状结构，而纤维支架由长而细的纤维组成。通常，纤维支架是通过静电纺丝生产的，某些种类的真菌也可以生产高度相似的结构，适用于组织工程。水凝胶支架是最常见的支架，3d生物打印等附加方法也很常见，通常使用基于水凝胶的生物墨水。纤维支架非常适合于诱导肌纤维排列的任务，而且在整个结构中制作具有强烈各向异性的支架相对简单。由于支架制备技术多应用于组织工程领域，可连续化、规模化制备支架的技术尚未见报道。因此有必要以细胞培养肉行业所要求的成本和规模，开发适合于细胞培养肉的纤维支架的制备技术。可用于细胞培养肉的纤维状生物支架需要具备支持细胞粘附到纤维支架上的能力，氧气、营养物质扩散(通过纤维之间的空间)的能力，以及产生排列整齐的纤维的能力，这可能有助于促进肌肉纤维的成熟。
4.纺丝技术包括湿法纺丝、静电纺丝和旋转喷射纺丝等，可以用于生产具有多种有用性能的纤维状支架。湿法纺丝技术目前多用于衣物纺织中。静电纺丝被广泛应用于空气过滤、水处理、异相催化、环境保护、智能织物、表面涂层、能量的收集转化和存储、封装生物活性材料、药物缓释、再生医学等领域。据报道，旋转喷射纺丝明胶的孔隙度值在≈20％到≈60％之间，这表明纤维间存在足够的空间，有利于氧气、营养物质和废物的运输。纺丝技术可以应用于多种材料，包括聚乳酸(pla)，聚(乳酸-羟基乙酸)(plga)，聚ε-己内酯(pcl)，明胶甲基丙烯酰(gelma)等。材料的组合也很常见，包括pcl和聚(n-异丙基丙烯酰胺)(pnipaam)，pcl和胶原或明胶，pcl和海藻酸盐等组合。但尚未发现纺丝技术应用于连续化制备细胞培养肉可食用纤维支架上。
5.现有纤维支架生产技术大多针对于生物医药和组织工程中的支架制备技术，不具备大批量连续化、规模化生产的技术，使用的支架材料大多属于化工合成的多聚化合物，且
生产过程中可能添加有危害食品安全的交联剂，不能应用于食品生产中。同时，由于生物医药行业中使用的支架不可食用，如果应用于细胞培养肉生产中，需要进行细胞胰酶消化等过程脱除支架，极大地增加了生产的复杂性。


技术实现要素：

6.鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种连续化制备细胞培养肉可食用纤维支架的方法，用于解决现有技术中的问题。
7.为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供湿法纺丝在制备细胞培养肉纤维支架中的用途。
8.本发明还提供一种细胞培养肉纤维支架的制备方法，所述制备方法为采用湿法纺丝法制备细胞培养肉支架。
9.在一种实施方式中，所述湿法纺丝包括以下步骤：
10.1)纺丝液的配制；
11.2)凝固液的配制；
12.3)纺丝、拉伸；
13.4)纺丝后处理。
14.本发明还提供所述制备方法获得的细胞培养肉纤维支架。
15.本发明还提供一种细胞培养肉，所述细胞培养肉包括所述细胞培养肉纤维支架和附着在其上的细胞。
16.如上所述，本发明的细胞培养肉纤维支架的制备方法，具有以下有益效果：提供了一种可连续化生产细胞培育肉纤维支架的思路，即采用可工业量产的湿法纺丝技术，不添加有生物安全考虑的交联剂，采用可食用的蛋白质、多糖进行纺丝，所生产的支架不需降解，可直接应用于最终的培育肉产品中，本发明的制备方法在实验室规模下每小时可生产1kg纤维支架，工业化生产中每天可达数吨级别。
附图说明
17.图1显示为实施例1制备大豆分离蛋白纤维支架材料大体观。
18.图2显示为实施例1制备大豆分离蛋白纤维支架微观形貌图。
19.图3显示为小鼠成肌细胞在实施例1制备大豆分离蛋白纤维支架上生长形貌图。
20.图4显示为实施例2制备大豆蛋白/谷朊粉复合纤维支架微观形貌图。
21.图5显示猪卫星细胞在大豆蛋白/谷朊粉复合纤维支架上生长形貌图。
22.图6显示为实施例3制备海藻酸钠/谷朊粉复合纤维支架微观形貌图。
23.图7显示为小鼠成肌细胞在海藻酸钠/谷朊粉复合纤维支架上生长形貌图。
24.图8显示为实施例4制备海藻酸钠纤维支架微观形貌图。
25.图9显示为实施例5制备大米蛋白/海藻酸钠复合纤维支架微观形貌图。
26.图10显示为本发明使用的纺丝设备示意图(左)和纤维支架的流程示意图(右)。
具体实施方式
27.本发明提供湿法纺丝在制备细胞培养肉纤维支架中的用途。
28.在一种实施方式中，所述细胞培养肉纤维支架为可食用纤维支架。
29.在一种实施方式中，所述用途为湿法纺丝在连续化制备细胞培养肉纤维支架中的用途。
30.所述“连续化”是指各步骤之间无缝衔接实现不间断操作，从而能连续不断地制备纤维支架。
31.本发明提供一种细胞培养肉纤维支架的制备方法，所述制备方法为采用湿法纺丝制备细胞培养肉支架。
32.在一种实施方式中，所述湿法纺丝包括以下步骤：
33.1)纺丝液的配制；
34.2)凝固液的配制；
35.3)纺丝、拉伸；
36.4)纺丝后处理。
37.所述纺丝液包括可食用生物材料和可食用溶剂。
38.在一种实施方式中，所述可食用生物材料选自蛋白或多糖。
39.所述蛋白选自植物蛋白、动物蛋白或真菌蛋白。
40.所述植物蛋白选自豆类蛋白、谷类蛋白、坚果蛋白或薯类蛋白。
41.具体的，所述植物蛋白例如为小麦蛋白、大豆蛋白、豌豆蛋白、绿豆蛋白、谷朊蛋白、大米蛋白、花生蛋白、核桃蛋白、杏仁蛋白、土豆蛋白、鹰嘴豆蛋白、海藻蛋白、酵母蛋白、玉米蛋白或藜麦蛋白中的任一种或多种。
42.所述真菌蛋白例如为酵母蛋白。
43.所述多糖选自植物多糖或微生物多糖。
44.所述多糖例如为淀粉、糖原、纤维素、海藻酸钠、结冷胶、果胶、壳聚糖中的任一种或多种。
45.多糖(polysaccharide)是由糖苷键结合的糖链，至少要超过10个的单糖组成的聚合糖高分子碳水化合物。
46.所述可食用溶剂选自酸、碱、无机盐或添加剂中的一种或多种。
47.所述可食用溶剂选自食用碱、氢氧化钠、醋酸或亚硫酸钠中的一种或多种的水溶液。
48.所述纺丝液中可食用生物材料的浓度例如为10～5000mg/ml。
49.所述纺丝液中可食用生物材料的浓度可以选自以下范围中的任一项：10～50mg/ml、50～100mg/ml、100～150mg/ml、150～200mg/ml、200～500mg/ml、500～1000mg/ml、1000～2000mg/ml、2000～3000mg/ml、3000～4000mg/ml、4000～5000mg/ml。
50.所述纺丝液中含有少量未溶解的物质也可以进行纺丝。
51.所述凝固液由可应用于食品领域的物质配制而成。
52.所述凝固液选自酸溶液、碱溶液或无机盐溶液。
53.所述凝固液为酒精、碳酸钠溶液、醋酸、食盐溶液、氯化钙溶液中的任一种或多种。
54.在一种实施方式中，所述凝固液为酒精、醋、氯化钙溶液、食盐溶液的混合液。
55.以所述凝固液的总体积为基准，所述酒精的体积分数为0.1～70％。优选的，酒精的体积分数选自0.1～10％、10％～20％、20％～30％、30％～40％、40％～50％、50％～
60％、60％～70％。
56.以所述凝固液的总体积为基准，醋酸体积分数为1％～8％。优选的，醋酸的体积分数为3％～6％。
57.碳酸钠溶液、食盐溶液、氯化钙溶液的溶剂为水。
58.以所述凝固液的总体积为基准，所述凝固液中食盐的终浓度为1～200mg/ml。优选的，食盐的质量浓度为50～150mg/ml；更优选的，为60～100mg/ml。
59.以所述凝固液的总体积为基准，所述凝固液中氯化钙的终浓度为1～200mg/ml。优选的，氯化钙的质量浓度为10～100mg/ml；更优选的，为30～70mg/ml。
60.在另一种实施方式中，所述凝固液为氯化钙溶液。所述氯化钙溶液的溶剂为水。
61.所述氯化钙溶液的浓度为1～200mg/ml。优选的，氯化钙的质量浓度为10～100mg/ml；更优选的，为30～70mg/ml。
62.在另一种实施方式中，所述凝固液为醋、食盐溶液、氯化钙溶液的混合液。在一种实施方式中，所述食盐溶液、氯化钙溶液的溶剂为水。
63.以凝固液的总体积为基准，所述醋的体积分数为1％～8％。优选的，醋的体积分数为3％～6％。
64.以凝固液的总体积为基准，食盐的质量浓度为1～200mg/ml。优选的，食盐的质量浓度为50～150mg/ml。
65.以凝固液的总体积为基准，氯化钙的质量浓度为1～200mg/ml。优选的，氯化钙的质量浓度为10～100mg/ml。
66.本发明所使用的原料、试剂如无特殊说明，则均为食品级或食用级。
67.在一种实施方式中，步骤3)纺丝过程中纺丝液的流量为15～40ml/min。即，纺丝液以15～40ml/min的速度通过纺丝头进入到凝固液中。纺丝液进入凝固液后，被凝固成型，制成初生丝。所述流量可以是以下任一范围：15～20ml/min、20～25ml/min、25～30ml/min或35～40ml/min。工业化生产中可在此基础上根据实际生产情况扩大纺丝液的流量。
68.在一种实施方式中，步骤3)中拉伸是指使用拉伸装置对初生丝进行拉伸，获得纺丝材料。
69.拉伸的程度根据需要进行设定，以满足生产设定纤维强度和直径为准。
70.所述步骤4)中纺丝后处理选自对纺丝材料进行清洗、干燥、蒸汽处理、高温高压处理、调色或调味中的任一项或多项。
71.清洗是指使用包括水、酸碱液等物质对纺丝材料进行清洗中和，调整材料ph值等。
72.所述干燥选自风干、烘干或冷冻干燥。
73.本发明还提供所述制备方法获得的细胞培养肉纤维支架。
74.所述细胞培养肉纤维支架的直径为20～300μm。
75.本发明还提供一种细胞培养肉，所述细胞培养肉包括所述细胞培养肉纤维支架和附着在其上的细胞。
76.所述细胞为动物细胞。具体的，所述细胞为哺乳动物细胞。
77.所述细胞包括但不限于成肌细胞、成体干细胞、脂肪细胞、胚胎干细胞、间充质干细胞、多能干细胞、肌细胞、肌肉卫星细胞、肝细胞、成骨细胞、成纤维细胞、成脂细胞、造牙本质细胞、成体神经元祖细胞、神经干细胞、来自脑室下前脑区的多个多潜能干细胞、室管
膜神经干细胞、造血干细胞、肝造血干细胞、骨髓干细胞、脂肪的成纤维细胞、脂肪干细胞、产生多个胰岛细胞的干细胞、胰源性多能产生胰岛干细胞、间质干细胞、胎盘细胞、骨髓基质细胞、肌肉侧群细胞、骨髓来源的回收细胞、血液来源的间质前体细胞、骨髓来源的侧群细胞、肌肉前体细胞、循环的骨骼干细胞、神经祖细胞、多潜能成体祖细胞、中胚层祖细胞、脊髓祖细胞及孢子样细胞及任何组合所组成的群组以及悬浮驯化后的上述细胞。以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。
78.在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围；在本发明说明书和权利要求书中，除非文中另外明确指出，单数形式“一个”、“一”和“这个”包括复数形式。
79.当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。
80.本发明以下实施例中湿法纺丝使用的纺丝设备为现有技术中的湿法纺丝设备。
81.实施例1
82.本实施例提供了一种连续化生产细胞培育肉纤维支架的方法，将大豆分离蛋白溶解于0.5mg/ml碳酸钠或氢氧化钠的水溶液)中，得到150mg/ml的大豆分离蛋白溶液，作为纺丝液。
83.通过将食用酒精、醋、食用氯化钙、食用盐等溶解或稀释于食用纯水中，得到食用酒精体积分数为50％、醋酸体积分数为4％、食用盐质量浓度为80mg/ml、食用氯化钙质量浓度为50mg/ml的凝固液。
84.通过将纺丝液以30ml/min速度通过纺丝头，进入到凝固液中，通过使用卷轴将纤维进行拉伸，并通过清水清洗得到大豆分离蛋白纤维支架。大豆分离蛋白纤维支架材料大体观如图1所示，微观形貌如图2所示，连续化纺丝大豆纤维呈现奶白色外观，显微形貌图发现纤维呈现圆形，纤维直径在200μm左右，说明纤维具有良好纺丝性能。
85.将纤维经过120℃灭菌20分钟，待灭菌结束冷却材料，将材料转移到生物安全柜中，取出材料置于24孔板中，加入1ml细胞培养液，放入培养箱中进行静置过夜。第二天取出24孔板，将浸泡材料培养液去除。取出细胞使用0.25％胰酶进行消化，稀释至细胞密度为2*105个细胞/ml，按照每孔1ml体积加入细胞悬液，然后将孔板放入培养箱中进行培养7天。培养结束后获得的细胞肉微观形貌如图3所示，细胞基本都已经呈现铺展状态，细胞密度较大，细胞在纤维支架上生长良好，说明制备纤维支架生物相溶性好。
86.实施例2
87.本实施例提供了一种连续化生产细胞培育肉纤维支架的方法，将谷朊粉溶解于
1mg/ml食用氢氧化钠的水溶液中，得到50mg/ml的谷朊粉溶液，进一步加入大豆分离蛋白，得到谷朊粉质量浓度为50mg/ml、大豆分离蛋白150mg/ml的复合纺丝液。
88.通过将食用酒精、醋酸、氯化钙、食用盐等溶解于食用纯水中，得到食用酒精体积分数为50％、醋酸体积分数为4％、食用盐80mg/ml、食用氯化钙50mg/ml的凝固液。
89.通过将纺丝液以30ml/min速度通过纺丝头，进入到凝固液中，通过将纤维进行拉伸，并通过清水清洗得到大豆蛋白/谷朊粉复合纤维支架，微观形貌图如图4所示，纤维直径在200μm左右，呈现连续状，说明复合纤维纺丝性能良好。
90.将纤维经过120℃灭菌20分钟，待灭菌结束冷却材料，将材料转移到生物安全柜中，取出材料置于24孔板中，加入1ml细胞培养液，放入培养箱中进行静置过夜。第二天取出24孔板，将浸泡材料培养液去除。取出细胞使用0.25％胰酶进行消化，稀释至细胞密度为2*105个细胞/ml，按照每孔1ml体积加入细胞悬液，然后将孔板放入培养箱中进行培养3天。图5为猪卫星细胞在纤维支架上生长形貌，可以看出细胞在纤维支架上开始黏附铺展，说明细胞可以在纤维支架上生长。
91.实施例3
92.本实施例提供了一种连续化生产细胞培育肉纤维支架的方法，将谷朊粉溶解于1mg/ml食用氢氧化钠的水溶液中，得到50mg/ml的谷朊粉溶液，海藻酸钠溶解于上述溶液中，得到海藻酸钠10mg/ml、谷朊粉50mg/ml的纺丝液。
93.通过将食用醋酸、食盐、氯化钙溶解于食用纯水中，得到醋酸体积分数为4％、食用盐80mg/ml、食用氯化钙50mg/ml的凝固液。
94.将纺丝液以30ml/min的速度通过纺丝头进入到凝固液中，并同时将纤维进行拉伸，得到可食用海藻酸钠/谷朊粉纤维支架，微观形貌图如图6所示，可以看出纤维支架直径在200μm左右，纤维呈现连续状，说明纤维可纺性良好。
95.将纤维经过120℃灭菌20分钟，待灭菌结束冷却材料，将材料转移到生物安全柜中，取出材料置于24孔板中，加入1ml细胞培养液，放入培养箱中进行静置过夜。第二天取出24孔板，将浸泡材料培养液去除。取出细胞使用0.25％胰酶进行消化，稀释至细胞密度为2*105个细胞/ml，按照每孔1ml体积加入细胞悬液，然后将孔板放入培养箱中进行培养1天。图7为小鼠成肌细胞在纤维支架上生长形貌，可以看出小鼠成肌细胞在纤维周围成团贴附生长，说明纤维可以为细胞提供一个生长的空间，但细胞铺展形态不如实施例1。
96.实施例4
97.本实施例提供了一种连续化生产细胞培育肉纤维支架的方法，将海藻酸钠溶解于食用纯水中，得到海藻酸钠浓度为20mg/ml的纺丝液。
98.通过将食用氯化钙溶解于食用纯水中，得到氯化钙50mg/ml的凝固液。
99.将纺丝液以20ml/min的速度通过纺丝头进入到凝固液中，并同时将纤维进行拉伸，得到可食用海藻酸钠纤维支架，然后进行清水清洗。微观形貌图如图8所示，可以看出纤维呈现连续状，说明海藻酸钠纤维纺丝性能良好。
100.实施例5
101.本实施例提供了一种连续化生产细胞培育肉纤维支架的方法，将大米蛋白溶解于0.1mg/ml食用氢氧化钠的水溶液中，得到300mg/ml的大米蛋白溶液，海藻酸钠溶解于上述溶液中，得到海藻酸钠20mg/ml、大米蛋白300mg/ml的纺丝液。
102.通过将食用氯化钙溶解于食用纯水中，得到食用氯化钙50mg/ml的凝固液。
103.将纺丝液以30ml/min的速度通过纺丝头进入到凝固液中，并同时将纤维进行拉伸，得到可食用大米蛋白/海藻酸钠纤维支架，微观形貌图如图9所示，可以看出纤维支架呈现连续状，纤维直径在200μm左右，说明纤维具有良好可纺性。
104.以上的实施例是为了说明本发明公开的实施方案，并不能理解为对本发明的限制。此外，本文所列出的各种修改以及发明中方法的变化，在不脱离本发明的范围和精神的前提下对本领域内的技术人员来说是显而易见的。虽然已结合本发明的多种具体优选实施例对本发明进行了具体的描述，但应当理解，本发明不应仅限于这些具体实施例。事实上，各种如上所述的对本领域内的技术人员来说显而易见的修改来获取发明都应包括在本发明的范围内。