1.本发明属于动物基因工程和基因遗传修饰领域，具体地说，涉及一种cd3e、cd3d和/或cd3g基因人源化的非人动物及其构建方法和在生物医药领域的应用。
背景技术：
：：2.实验动物疾病模型对于研究人类疾病发生的病因、发病机制、开发防治技术和开发药物是不可缺少的研究工具。但由于动物与人类的生理结构和代谢系统本身的差异，传统的动物模型并不能很好的反映人体的真实状况，在动物体内建立更接近人类的生理特征的疾病模型是生物医药行业的迫切需求。3.随着基因工程技术的不断发展和成熟，用人类基因替代或置换动物的同源性基因已经实现，通过这种方式开发人源化实验动物模型(humanizedanimalmodel)是动物模型未来的发展方向。其中基因人源化动物模型，即，利用基因编辑技术，用人源正常或突变基因替换动物基因组的同源基因，可建立更接近人类生理或疾病特征的正常或突变基因动物模型。基因人源化动物不但本身具有重要应用价值，如通过基因人源化可改进和提升细胞或组织移植人源化动物模型，更重要的是，由于人类基因片段的插入，动物体内可表达或部分表达人源蛋白，可作为仅能识别人蛋白序列的药物的靶点，为在动物水平进行抗人抗体及其它药物的筛选提供了可能。然而，由于动物与人类在生理学及病理学方面存在差异，加上基因(即遗传因子)的复杂性，如何能构建出“有效”的人源化动物模型用于新药研发仍是最大的挑战(scheern,snaithm,wolfcr,seiblerj.generationandutilityofgeneticallyhumanizedmousemodels,drugdiscovtoday；18(23-24):1200-11,2013)。4.免疫疗法通过激活免疫系统攻击并杀死癌细胞，是肿瘤研究的一个重要领域，近十年来已经应用在临床治疗中。免疫细胞尤其是t细胞在免疫应答整个过程中处于核心地位。t细胞表面存在众多的cd分子，广泛参与了t细胞识别抗原、活化增殖或失活、凋亡及清除异体抗原或自身抗原耐受等免疫效应全过程，其中cd3与t细胞表面的t细胞受体(tcr)组成tcr-cd3复合体，在抗原识别和免疫信号传导过程中具有重要作用。cd3分子是肽链以非共价键组成的复合分子，在哺乳动物中，该复合物含有一个cd3γ链、cd3δ链和2条cd3ε链。cd3主要的分子功能为：(1)稳定tcr结构；(2)传递t细胞活化信号，当tcr特异性识别并结合抗原后，cd3参与将信号传到t细胞胞浆内，作为诱导t细胞活化的第一信号。cd3分子除分布于t细胞外，还分布于胸腺细胞和部分自然杀伤细胞。5.由于所有t细胞表面均表达有cd3分子，因此可应用cd3抗体诱导调节t细胞水平。作为最早应用于临床的单克隆抗体，早在20世纪80年代，cd3抗体莫罗单抗(moronomab，okt3)作为免疫抑制剂，就被广泛应用于抑制器官移植时的免疫排斥反应且获得了良好效果。该抗体直接靶向cd3ε链，但由于是鼠源抗体(鼠igg2a)，由此引发的免疫原性和抗体本身的丝裂原性限制了其应用。随着基因工程技术的发展，目前已经开发出多种嵌合cd3抗体、人源化cd3抗体和全人cd3抗体，降低抗体免疫原性、提高安全性。多数治疗性抗人cd3抗体均与cd3ε链结合，目前均处于临床阶段。有研究证实相比静脉注射，采取口服cd3抗体的给药方式可诱导免疫耐受且减少副反应。如通过口服给药等方式施用cd3抗体可促进t细胞增殖，抑制th1和th17应答、增加tgf-β/il-10表达，并通过树突状细胞抑制il-23/il-6表达。此外，能结合cd3和其它抗原的双特异性抗体也是研究热点，全球范围内已有双特异性抗体药获批，包括removab(catumaxomab，同时阻断epcam和cd3，用于治疗肿瘤引起的恶性腹水)和blincyto(blinatumomab，阻断cd3和cd19，用于治疗急性淋巴细胞白血病)。cd3抗体联合其他药物以提高免疫应答或降低免疫耐受也是临床中的研究热点，已有研究表明cd3与其它抗体的联用往往具有协同作用，但有研究发现cd3与其它调节剂联用，如与免疫抑制剂(如环孢菌素)联用可能会干扰抗cd3单克隆抗体的耐受性，在考虑组合之前必须进行研究(kuhncetal.,immunotherapy.2016jul；8(8):889-906)。6.上述研究表明cd3抗体在治疗慢性炎症和自身免疫性疾病治疗方面具有巨大的潜力，但cd3抗体具有高度的物种特异性(species-specific)，即人cd3抗体与其它动物的t细胞没有交叉反应，甚至不与普通非人类灵长类动物如恒河猴或食蟹猴交叉反应，以前只能在黑猩猩体内进行临床前研究(raopeetal.,transplantation.1991oct；52(4):691-7)，很难在其它动物模型体内进行包括作用机理、潜在药效在内的相关临床前研究。7.人cd3蛋白和鼠cd3蛋白之间存在显著差异，如人cd3ε肽链和cd3γ肽链序列与鼠类对应序列的一致性分别为41％和43％，所以，无法用普通小鼠来筛选和评价靶向cd3药物的药效。目前用于人cd3抗体研究的小鼠模型主要有两种。其中一种是人源化cd3ε转基因小鼠(delaheraaetal.,jexpmed.1991jan1；173(1):7-17；kuhncetal.,scitranslmed.2011feb2)。该人源化cd3ε转基因小鼠使用小鼠cd3启动子调控人cd3ε基因的表达，小鼠体内同时表达人和鼠cd3e蛋白，在一些研究如药效研究中，鼠cd3e蛋白的存在可能会对药效有影响。并且，其制备过程需要与不同背景的小鼠多次回交，制备周期长、背景复杂。此外，转基因技术制备的小鼠存在诸多缺点，如插入位点的不确定性、插入拷贝数的不确定性、蛋白表达量不稳定以及后代的转基因遗传的不稳定性，从而造成实验数据的不可重复性及基因遗传丢失等等问题，而不能被广泛使用(mangsbosmetal.clincancerres,2015mar1；21(5):1115-26，uranoketal.vetpathol,2012jan:49(1):16-23)。另一种是人源肿瘤异体移植小鼠模型。建模过程是：先使用重度免疫缺陷小鼠进行人造血干细胞重建，再进行人肿瘤异体移植。该类模型构建过程繁琐、费用高，在特定靶点研究中的靶向性和特异性不强，用这类模型研究药效的结果准确性不高。因此本领域急需更便利的动物模型，用于靶向cd3的抗体及其联用的相关研究和临床前试验。8.鉴于cd3分子在免疫治疗领域具有巨大应用价值，为了使临床前期的试验更有效，并改进现有动物模型的不足，本发明旨在制备一种非人动物模型，该动物体内可表达人或人源化cd3e、cd3d和cd3g蛋白，且表达的人或人源化cd3蛋白能识别并结合人cd3抗体/抗原，该方法在药物筛选、验证等方面有着广阔的应用前景。技术实现要素：9.本发明的第一方面，提供了一种人源化cd3e基因，所述的人源化cd3e基因包含人cd3e基因的部分。10.优选的，所述的人cd3e基因的部分包含人cd3e基因1号外显子至9号外显子中的任一种或两种以上的组合。进一步优选包含2号至9号外显子的全部或部分。更进一步优选包含2号外显子的部分、3号至8号外显子的全部和9号外显子的部分，优选还包含2-3号内含子和/或8-9号内含子，其中，2号外显子的部分至少包含20bp的核苷酸序列，例如至少包含20、30、40、45、46、47、48、49、50、70、90、100、108bp的核苷酸序列；2号外显子的部分至少包含编码人cd3e蛋白信号肽的核苷酸序列，9号外显子的部分至少包含20bp的核苷酸序列，例如至少包含20、30、40、50、55、56、57、60、80、100、300、500、600、687bp、688bp的核苷酸序列；9号外显子的部分至少包含编码人cd3e蛋白胞质区的核苷酸序列。11.优选的，所述的人cd3e基因的部分包含人cd3e基因2号至7号外显子的全部或部分。进一步优选包含2号外显子的部分、3号至6号外显子的全部和7号外显子的部分，优选还包含2-3号内含子和/或6-7号内含子。其中，2号外显子的部分至少包含20bp的核苷酸序列，例如至少包含20、30、40、45、46、47、48、49、50、70、90、100、108bp的核苷酸序列。7号外显子的部分至少包含15bp的核苷酸序列，例如至少包含15、20、25、26、27、28、29、30、40、45、50、51、52、53、54、55、56、57、60、80、100、150、167bp、168bp的核苷酸序列。12.优选的，所述的人源化cd3e基因包含编码人cd3e蛋白信号肽、胞外区、胞质区和/或跨膜区的核苷酸序列。13.在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化cd3e基因包含编码人cd3e蛋白胞外区的核苷酸序列。14.优选的，所述的人源化cd3e基因编码所述的人源化cd3e蛋白。15.在本发明的一个具体实施方式中，所述的人cd3e基因的部分核苷酸序列包含下列组中的一种：16.(a)seqidno：14或63所示核苷酸序列；17.(b)与seqidno：14或63所示核苷酸序列的同一性至少为75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的核苷酸序列；18.(c)与seqidno：14或63所示核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸的核苷酸序列；或，19.(d)具有seqidno：14或63所示核苷酸序列的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。20.所述的人源化cd3e基因包含seqidno：15、16、17、64和/或36所示核苷酸序列，或包含与seqidno:15、16、17、64和/或36具有至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％同一性的核苷酸序列。21.优选的，所述人源化cd3e基因转录的mrna包含下列组中的一种：22.(a)seqidno：18或65所示核苷酸序列；23.(b)与seqidno：18或65所示核苷酸序列的同一性至少为75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的核苷酸序列；24.(c)与seqidno：18或65所示核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸的核苷酸序列；或，25.(d)具有seqidno：18或65所示核苷酸序列的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。26.本发明的第二方面，提供了一种嵌合基因，所述的嵌合基因包含上述的人源化cd3e基因。27.优选的，所述的嵌合基因还包含人cd3d基因与人cd3g基因的全部或部分核苷酸序列。更优选包含人cd3d基因的1号外显子至5号外显子的全部和人cd3g基因的1号外显子至7号外显子的全部。28.所述的嵌合基因包含seqidno:10、11和/或35所示核苷酸序列，或包含与seqidno:10、11和/或35具有至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％同一性的核苷酸序列。29.优选的，所述的嵌合基因还包含编码人cd3d和/或cd3g蛋白信号肽、胞外区、胞质区和/或跨膜区的核苷酸序列。30.优选的，所述的嵌合基因编码所述的人源化cd3e蛋白、人源化cd3d蛋白和/或人源化cd3g蛋白。31.在本发明的一个具体实施方式中，所述的嵌合基因包含下列组中的一种：32.(a)seqidno：9所示核苷酸序列；33.(b)与seqidno：9所示核苷酸序列的同一性至少为75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的核苷酸序列；34.(c)与seqidno：9所示核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸的核苷酸序列；或，35.(d)具有seqidno：9所示核苷酸序列的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。36.在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化cd3e基因或嵌合基因还包含特异性诱导物或阻遏物，进一步优选的，所述的特异性诱导物或阻遏物可以为常规可以诱导或阻遏的物质。37.在本发明的一个具体实施方式中，所述的特异性诱导物选自四环素系统(tet-offsystem/tet-onsystem)或他莫昔芬系统(tamoxifensystem)。38.本发明的第三方面，提供了一种人源化cd3e蛋白，所述的人源化cd3e蛋白包含人cd3e蛋白的全部或部分。39.优选的，所述的人源化cd3e蛋白是由上述的人源化cd3e基因编码的。40.优选的，所述的人源化cd3e蛋白包含人cd3e蛋白的信号肽、跨膜区、胞质区和/或胞外区。优选的，所述的人源化cd3e蛋白包含人cd3e蛋白的胞外区。41.进一步优选的，所述的人源化cd3e蛋白包含人cd3e蛋白的信号肽、跨膜区、胞质区和胞外区。42.在一些实施方式中，所述的人源化cd3e蛋白还包含非人动物跨膜区和/或胞质区。43.优选的，所述的人源化cd3e蛋白包含人cd3e基因的1号至9号外显子的全部或部分编码的氨基酸序列。进一步优选包含人cd3e基因的1号至9号外显子中的一种或两种以上的组合编码的氨基酸序列。更进一步优选包含人cd3e基因的2号至9号外显子编码的氨基酸序列。44.优选的，所述的人源化cd3e蛋白包含人cd3e基因的2号至7号外显子的全部或部分编码的氨基酸序列。45.在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化cd3e蛋白的氨基酸序列包含下列组中的一种：46.a)seqidno：2或66所示的氨基酸序列；47.b)与seqidno：2或66具有60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％同一性的氨基酸序列；48.c)与seqidno：2或66所示氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；或，49.d)包含具有seqidno：2或66所示的包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。50.本发明的第四方面，提供了一种人源化cd3d蛋白，所述的人源化cd3d蛋白包含人cd3d蛋白的全部或部分。51.优选的，所述的人源化cd3d蛋白是由上述的嵌合基因的部分编码的。52.优选的，所述的人源化cd3d蛋白包含人cd3d蛋白的信号肽、跨膜区、胞质区和/或胞外区。优选的，所述的人源化cd3d蛋白包含人cd3d蛋白的胞外区。53.进一步优选的，所述的人源化cd3d蛋白包含人cd3d蛋白的信号肽、跨膜区、胞质区和胞外区。54.优选的，所述的人源化cd3d蛋白包含人cd3d基因的1号至5号外显子的全部或部分编码的氨基酸序列。进一步优选包含人cd3d基因的1号至5号外显子中的任一种或两种以上的组合编码的氨基酸序列。更进一步优选包含人cd3d基因的1号至5号外显子的全部编码的氨基酸序列。55.在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化cd3d蛋白包含seqidno:4，或包含与seqidno:4具有至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％同一性的氨基酸序列。56.本发明的第五方面，提供了一种人源化cd3g蛋白，所述的人源化cd3g蛋白包含人cd3g蛋白的全部或部分。57.优选的，所述的人源化cd3g蛋白是由上述的嵌合基因的部分编码的。58.优选的，所述的人源化cd3g蛋白包含人cd3g蛋白的信号肽、跨膜区、胞质区和/或胞外区。优选的，所述的人源化cd3g蛋白包含人cd3g蛋白的胞外区。59.进一步优选的，所述的人源化cd3g蛋白包含人cd3g蛋白的信号肽、跨膜区、胞质区和胞外区。60.优选的，所述的人源化cd3g蛋白包含人cd3g基因的1号至7号外显子的全部或部分编码的氨基酸序列。进一步优选包含人cd3g基因的1号至7号外显子中的任一种或两种以上的组合编码的氨基酸序列。更进一步优选包含人cd3g基因的1号至7号外显子的全部编码的氨基酸序列。61.在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化cd3g蛋白包含seqidno:6，或包含与seqidno:6具有至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％同一性的氨基酸序列。62.本发明的第六方面，提供了一种tcr-cd3复合物，所述的tcr-cd3复合物包含1)人或人源化cd3e蛋白、2)人或人源化cd3d蛋白和/或3)人或人源化cd3g蛋白。63.本发明的第七方面，提供了一种cd3e基因的靶向载体，所述的靶向载体包含人cd3e基因2号至9号外显子的全部或部分。优选包含人cd3e基因的2号外显子的部分、3号至8号外显子的全部和9号外显子的部分，优选还包含2-3号内含子和/或8-9号内含子，进一步优选包含seqidno：14所示的核苷酸序列。或者所述的靶向载体包含人cd3e基因的2号至7号外显子的全部或部分。优选包含人cd3e基因的2号外显子的部分、3号至6号外显子的全部和7号外显子的部分核苷酸序列。进一步优选包含seqidno：63所示的核苷酸序列。所述的靶向载体至少包含编码胞外区的全部或部分核苷酸序列。64.所述的靶向载体还包含5’臂和/或3’臂；65.所述的5’臂为与待改变的转换区5’端同源的dna片段，所述的3’臂为与待改变的转换区3’端同源的dna片段，所述的待改变的转换区位于非人动物cd3g基因的2号至8号外显子上。66.所述的5’臂选自非人动物cd3e基因基因组dna的100-10000个长度的核苷酸，优选与ncbi登录号为nc_000075.7至少具有90％同源性的核苷酸，进一步优选与seqidno:12至少具有90％同源性，或者如seqidno:12所示；67.所述的3’臂选自非人动物cd3e基因基因组dna的100-10000个长度的核苷酸，优选与ncbi登录号为nc_000075.7至少具有90％同源性的核苷酸，进一步优选与seqidno:13至少具有90％同源性，或者如seqidno:13所示。68.所述的靶向载体包含seqidno：15、16、17、64和/或36所示核苷酸序列，或包含与seqidno：15、16、17、64和/或36具有至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％同一性的核苷酸序列。69.本发明的第八方面，提供了一种靶向载体，所述的靶向载体包含人cd3d基因与人cd3g基因的核苷酸序列。优选包含人cd3d基因的1号外显子至5号外显子的全部和人cd3g基因的1号外显子至7号外显子的全部。进一步优选包含seqidno:9所示的核苷酸序列。70.所述的靶向载体还包含5’臂和/或3’臂；71.所述的5’臂为与待改变的转换区5’端同源的dna片段，所述的待改变的转换区5’端位于非人动物cd3d基因的1号至5号外显子上。72.所述的3’臂为与待改变的转换区3’端同源的dna片段，所述的待改变的转换区3’端位于非人动物cd3g基因的1号至7号外显子上。73.所述的5’臂选自非人动物cd3d基因基因组dna的100-10000个长度的核苷酸，优选与ncbi登录号为nc_000075.7至少具有90％同源性的核苷酸，进一步优选与seqidno:7至少具有90％同源性，或者如seqidno:7所示；74.所述的3’臂选自非人动物cd3g基因基因组dna的100-10000个长度的核苷酸，优选与ncbi登录号为nc_000075.7至少具有90％同源性的核苷酸，进一步优选与seqidno:8至少具有90％同源性，或者如seqidno:8所示。75.所述的靶向载体包含seqidno:10、11和/或35所示核苷酸序列，或包含与seqidno:10、11和/或35具有至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％同一性的核苷酸序列。76.本发明所述的靶向载体还包含标记基因。进一步优选的，所述标记基因为负筛选标记的编码基因，更进一步优选的，所述负筛选标记的编码基因为白喉毒素a亚基的编码基因(dta)。77.在本发明的一个具体实施方式中，所述的靶向载体中还包括阳性克隆筛选的抗性基因，进一步优选的，所述阳性克隆筛选的抗性基因为新霉素磷酸转移酶编码序列neo或潮霉素抗性基因编码序列hygr。78.在本发明的一个具体实施方式中，所述的靶向载体中还包括特异性重组系统，进一步优选的，所述特异性重组系统为frt重组位点或loxp重组系统，所述的特异性重组系统为具有两个frt或loxp重组位点，分别同向连接在抗性基因的两侧。79.本发明的第九方面，提供了一种包含上述靶向载体的细胞。80.本发明的第十方面，提供了一种上述的靶向载体或上述的细胞在cd3e、cd3d和/或cd3g基因修饰中的应用。81.本发明的第十一方面，提供了一种经遗传修饰的非人动物，所述的非人动物体内表达1)人或人源化cd3e蛋白，2)人或人源化cd3d蛋白，和/或3)人或人源化cd3g蛋白。82.优选的，所述的非人动物的内源cd3e、cd3d和/或cd3g蛋白的表达降低或缺失。83.优选的，所述的人源化cd3e蛋白为上述的人源化cd3e蛋白。84.优选的，所述的人源化cd3d蛋白为上述的人源化cd3d蛋白。85.优选的，所述的人源化cd3g蛋白为上述的人源化cd3g蛋白。86.优选的，所述的人源化cd3e蛋白包含人cd3e蛋白的信号肽、跨膜区、胞质区和/或胞外区。进一步优选的，所述的人源化cd3e蛋白包含人cd3e蛋白的信号肽、跨膜区、胞质区和胞外区。87.在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化cd3e蛋白的氨基酸序列包含下列组中的一种：88.a)seqidno：2或66所示的氨基酸序列；89.b)与seqidno：2或66具有60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％同一性的氨基酸序列；90.c)与seqidno：2或66所示氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；或，91.d)包含具有seqidno：2或66所示的包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。92.优选的，所述的人源化cd3d蛋白包含人cd3d蛋白的信号肽、跨膜区、胞质区和/或胞外区。进一步优选的，所述的人源化cd3d蛋白包含人cd3d蛋白的信号肽、跨膜区、胞质区和胞外区。93.在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化cd3d蛋白包含seqidno:4，或包含与seqidno:4具有至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％同一性的氨基酸序列。94.优选的，所述的人源化cd3g蛋白包含人cd3g蛋白的信号肽、跨膜区、胞质区和/或胞外区。进一步优选的，所述的人源化cd3g蛋白包含人cd3g蛋白的信号肽、跨膜区、胞质区和胞外区。95.在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化cd3g蛋白包含seqidno:6，或包含与seqidno:6具有至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％同一性的氨基酸序列。96.所述的非人动物的基因组中包含1)人cd3e基因的全部或部分，2)人cd3d基因的全部或部分，和/或3)人cd3g基因的全部或部分。97.优选的，所述的人cd3e基因的部分包含人cd3e基因1号外显子至9号外显子中的任一种或两种以上的组合。进一步优选包含2号至9号外显子的全部或部分，进一步优选包含2号外显子的部分、3号至8号外显子的全部和9号外显子的部分，优选还包含2-3号内含子和/或8-9号内含子。98.其中，2号外显子的部分至少包含20bp的核苷酸序列，例如至少包含20、30、40、45、46、47、48、49、50、70、90、100、108bp的核苷酸序列；2号外显子的部分至少包含编码人cd3e蛋白信号肽的核苷酸序列。99.9号外显子的部分至少包含20bp的核苷酸序列，例如至少包含20、30、40、50、55、56、57、60、80、100、300、500、600、687、688bp的核苷酸序列；9号外显子的部分至少包含编码人cd3e蛋白胞质区的核苷酸序列。100.优选的，所述的人cd3e基因的部分包含人cd3e基因2号至7号外显子的全部或部分。进一步优选包含人cd3e基因2号外显子的部分、3号至6号外显子的全部和7号外显子的部分，优选还包含2-3号内含子和/或6-7号内含子。其中，2号外显子的部分至少包含20bp的核苷酸序列，例如至少包含20、30、40、45、46、47、48、49、50、70、90、100、108bp的核苷酸序列。7号外显子的部分至少包含15bp的核苷酸序列，例如至少包含15、20、25、26、27、28、29、30、40、45、50、51、52、53、54、55、56、57、60、80、100、150、167、168bp的核苷酸序列。101.进一步优选至少包含编码胞外区的全部或部分核苷酸序列。102.在本发明的一个具体实施方式中，所述的人cd3e基因的部分核苷酸序列包含下列组中的一种：103.(a)seqidno：14或63所示核苷酸序列；104.(b)与seqidno：14或63所示核苷酸序列的同一性至少为75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的核苷酸序列；105.(c)与seqidno：14或63所示核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸的核苷酸序列；或，106.(d)具有seqidno：14或63所示核苷酸序列的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。107.优选的，所述的非人动物的基因组中包含人源化cd3e基因，所述的人源化cd3e基因包含人cd3e基因的2号外显子的部分、3号至8号外显子的全部和9号外显子的部分，优选还包含2-3号内含子和/或8-9号内含子；或者所述的人源化cd3e基因包含人cd3e基因的2号外显子的部分、3号至6号外显子的全部和7号外显子的部分，优选还包含2-3号内含子和/或6-7号内含子。108.进一步优选的，所述的人源化cd3e基因转录的mrna包含下列组中的一种：109.(a)seqidno：18或65所示核苷酸序列；110.(b)与seqidno：18或65所示核苷酸序列的同一性至少为75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的核苷酸序列；111.(c)与seqidno：18或65所示核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸的核苷酸序列；或，112.(d)具有seqidno：18或65所示核苷酸序列的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。113.优选的，所述的人cd3e基因的部分或人源化cd3e基因通过内源性调控元件调控。优选的，所述的调控元件为启动子。114.优选的，所述的人cd3d基因的部分包含人cd3d基因1号外显子至5号外显子中的任一种或两种以上的组合，优选包含1号外显子至5号外显子的全部或部分。115.优选的，所述的人cd3g基因的部分包含人cd3g基因1号外显子至7号外显子中的任一种或两种以上的组合，优选包含1号外显子至7号外显子的全部或部分。116.进一步优选的，所述的非人动物的基因组中包含人cd3d基因与人cd3g基因的核苷酸序列。更优选包含下列组中的一种：117.(a)seqidno：9所示核苷酸序列；118.(b)与seqidno：9所示核苷酸序列的同一性至少为75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的核苷酸序列；119.(c)与seqidno：9所示核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸的核苷酸序列；或，120.(d)具有seqidno：9所示核苷酸序列的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。121.优选的，所述的非人动物的基因组中包含seqidno:10、11和/或35所示核苷酸序列，或包含与seqidno:10、11和/或35具有至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％同一性的核苷酸序列。122.优选的，所述的非人动物的基因组中包含seqidno：15、16、17、64和/或36所示核苷酸序列，或包含与seqidno：15、16、17、64和/或36具有至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％同一性的核苷酸序列。123.在本发明的一个具体实施方式中，所述的非人动物的基因组中包含seqidno：15和36所示的核苷酸序列。124.在本发明的一个具体实施方式中，所述的非人动物的基因组中包含seqidno：64和36所示的核苷酸序列。125.优选的，所述的人cd3d和/cd3g基因的部分由外源调控元件调控。进一步优选为人源。126.优选的，所述的人cd3e、cd3d和/或cd3g基因连接到内源或人调控元件上。进一步优选的，所述的人cd3e基因连接到内源调控元件上，所述的人cd3d和/或cd3g基因连接到人调控元件上。127.本发明所述的cd3e蛋白、cd3d蛋白以及cd3g蛋白在非人动物体内形成功能性复合物(优选为功能性tcr-cd3复合物)，并在该非人动物体内发挥作用。其中，cd3e蛋白可以为内源、人或人源化cd3e蛋白。cd3d蛋白可以为内源、人或人源化cd3d蛋白。cd3g蛋白可以为内源、人或人源化cd3g蛋白。但是三个蛋白中至少有一个包含人cd3e、cd3d或cd3g蛋白。例如，内源cd3e蛋白、人或人源化cd3d蛋白与人或人源化cd3g蛋白形成tcr-cd3复合物；或者人或人源化cd3e蛋白、内源cd3d蛋白与人或人源化cd3g蛋白形成tcr-cd3复合物；或者人或人源化cd3e蛋白、人或人源化cd3d蛋白与内源cd3g蛋白形成tcr-cd3复合物；或者内源cd3e蛋白、内源cd3d蛋白与人或人源化cd3g蛋白形成tcr-cd3复合物；或者内源cd3e蛋白、人或人源化cd3d蛋白与内源cd3g蛋白形成tcr-cd3复合物；或者人或人源化cd3e蛋白、内源cd3d蛋白与内源cd3g蛋白形成tcr-cd3复合物。128.优选的，所述的人或人源化cd3e蛋白、人或人源化cd3d蛋白与人或人源化cd3g蛋白形成tcr-cd3复合物。129.在本发明的一个具体实施方式中，人或人源化cd3e蛋白、人cd3d蛋白与人cd3g蛋白形成tcr-cd3复合物。130.根据本发明的一些实施例，所述的非人动物进一步包含其他基因修饰，所述其他基因选自pd-1、pd-l1、4-1bb、tigit、b7-h3、cd28、cd38和cldn18.2中的至少一种。131.优选的，所述的非人动物可以选自啮齿类动物、猪、兔子、猴子等任何可以进行基因编辑制备基因人源化的非人动物。132.优选的，所述的非人动物为非人哺乳动物，进一步优选的，所述的非人哺乳动物为啮齿类动物，更进一步优选的，所述的啮齿类动物为大鼠或小鼠。133.优选的，所述的非人动物是免疫缺陷的非人哺乳动物，进一步优选的，所述的免疫缺陷的非人哺乳动物为免疫缺陷的啮齿类动物、免疫缺陷的猪、免疫缺陷的兔子或免疫缺陷的猴子，更优选的，所述的免疫缺陷的啮齿类动物为免疫缺陷的小鼠或大鼠，更进一步优选的，所述免疫缺陷鼠是nod-prkdcscidil-2rγnull小鼠、nod-rag1-/-‑il2rg-/-(nrg)小鼠、rag2-/-‑il2rg-/-(rg)小鼠、nod/scid小鼠或者裸鼠。134.在本发明的一个具体实施方式中，所述的非人动物对于经遗传修饰的内源性非人cd3基因座而言为纯合的。135.在本发明的一个具体实施方式中，所述的非人动物对于经遗传修饰的内源性非人cd3基因座而言为杂合的。136.本发明的第十二方面，提供了一种上述的非人动物的构建方法，所述的构建方法包括用包含人cd3e基因的全部或部分、人cd3d基因的全部或部分和/或人cd3g基因的全部或部分导入非人动物cd3e、cd3d和/或cd3g基因座上。优选的，利用靶向载体进行导入。137.优选的，所述的非人动物的基因组中包含上述的嵌合基因。138.优选的，所述的非人动物体内表达上述的嵌合基因编码的蛋白。139.优选的，包括用包含人cd3e基因2号至9号外显子的全部或部分导入非人动物cd3e基因座上，优选用包含人cd3e基因的2号外显子的部分、3号至8号外显子的全部和9号外显子的部分导入非人动物cd3e基因座上，优选还包含2-3号内含子和/或8-9号内含子，其中，2号外显子的部分至少包含20bp的核苷酸序列，例如至少包含20、30、40、45、46、47、48、49、50、70、90、100、108bp的核苷酸序列；2号外显子的部分至少包含编码人cd3e蛋白信号肽的核苷酸序列，9号外显子的部分至少包含20bp的核苷酸序列，例如至少包含20、30、40、50、55、56、57、60、80、100、300、500、600、687、688bp的核苷酸序列；9号外显子的部分至少包含编码人cd3e蛋白胞质区的核苷酸序列，进一步优选用包含seqidno:14所示的核苷酸序列导入非人动物cd3e基因座上。140.优选的，包括用包含人cd3e基因2号至7号外显子的全部或部分导入非人动物cd3e基因座上。进一步优选包括用包含人cd3e基因2号外显子的部分、3号至6号外显子的部分和7号外显子的部分导入非人动物cd3e基因座上，优选还包含2-3内含子和6-7内含子的全部。其中，2号外显子的部分至少包含20bp的核苷酸序列，例如至少包含20、30、40、45、46、47、48、49、50、70、90、100、108bp的核苷酸序列；7号外显子的部分至少包含15bp的核苷酸序列，例如至少包含15、20、25、26、27、28、29、30、40、45、50、51、52、53、54、55、56、57、60、80、100、150、167、168bp的核苷酸序列，更进一步优选用包含seqidno：63所示的核苷酸序列导入非人动物cd3e基因座上。141.优选的，本技术中所述的导入包括但不限于插入、替换或转基因，所述的替换优选为原位替换或插入。142.优选的，所述的导入为替换或插入，任选地，所述的导入非人动物cd3e基因座为替换非人动物相应区域，进一步优选的，所述的替换到非人动物cd3e基因座为替换非人动物cd3e基因的2号外显子至8号外显子的核苷酸序列，优选替换非人动物cd3e基因的2号外显子的部分、3号至7号外显子的全部和8号外显子的部分，其中，2号外显子的部分至少包含从2号外显子3’‑5’的长度为20-100bp的核苷酸序列，具体为至少包含从2号外显子3’‑5’的长度为20、25、30、35、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、60、70、80、90或100bp，8号外显子的部分至少包含从8号外显子5’‑3’的长度为40-844bp的核苷酸序列，具体为40、45、50、51、52、53、54、55、56、57、60、80、100、300、500、600、700或844bp的核苷酸序列，更优选替换非人动物与ncbi登录号为nc_000075.7的第44910829至44920694所示序列相同的核苷酸序列。143.优选的，所述的导入非人动物cd3e基因座为替换编码seqidno：1第1-189位的核苷酸序列。144.优选的，所述的替换到非人动物cd3e基因座为替换非人动物cd3e基因的2号外显子至6号外显子的核苷酸序列，优选替换非人动物2号外显子的部分、3号至5号外显子的全部和6号外显子的部分，其中，2号外显子的部分至少包含从2号外显子3’‑5’的长度为20-100bp的核苷酸序列，具体为至少包含从2号外显子3’‑5’的长度为20、25、30、35、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、60、70、80、90或100bp的核苷酸序列，6号外显子的部分至少包含从6号外显子的5’‑3’的长度为10-167bp的核苷酸序列，具体为至少包含从6号外显子的5’至长度为10、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、40、50、60、70、80、90、100、150、160或167bp的核苷酸序列，更优选替换非人动物与ncbi登录号为nc_000075.7的第44912419至44920694所示序列相同的核苷酸序列。145.优选的，所述的导入非人动物cd3e基因座为替换编码seqidno：1第1-108位的核苷酸序列。146.优选的，使用基因编辑技术进行非人动物的构建，所述的基因编辑技术包括利用胚胎干细胞的基因打靶技术、crispr/cas9技术、锌指核酸酶技术、转录激活子样效应因子核酸酶技术、归巢核酸内切酶或其他分子生物学技术。147.在本发明的一个具体实施方式中，使用上述的靶向载体进行非人动物的构建。148.优选的，包括用包含人cd3d基因1号外显子至5号外显子的全部或部分导入非人动物cd3d基因座上。149.优选的，包括用包含人cd3g基因1号外显子至7号外显子的全部或部分导入非人动物cd3g基因座上。150.进一步优选的，包括用包含人cd3d基因与人cd3g基因的核苷酸序列导入非人动物cd3d和/或cd3g基因座上。更进一步优选用包含seqidno：9所示核苷酸序列导入非人动物cd3d和cd3g基因座上。151.优选的，所述的导入非人动物cd3d和/或cd3g基因座为替换非人动物相应区域，进一步所述的替换到非人动物cd3d和/或cd3g基因座为替换非人动物cd3d基因的1号至5号外显子的全部和cd3g基因的1号至7号外显子的全部。更优选替换非人动物与ncbi登录号为nc_000075.7的第44880866至44898910位所示序列相同的核苷酸序列。152.在本发明的一个具体实施方式中，使用上述的靶向载体进行非人动物的构建。153.在本发明的一个具体实施方式中，所述的构建方法包括将上述靶向载体导入非人动物细胞中，培养该细胞(优选为胚胎干细胞)，然后将培养后的细胞移植至雌性非人动物输卵管内，允许其发育，鉴定筛选获得经遗传修饰的非人动物。154.优选的，为提高重组效率，还可以使用靶向cd3e、cd3d和/或cd3g基因的sgrna与上述靶向载体一起进行非人动物的构建。其中，所述的sgrna靶向非人动物cd3e、cd3d和/或cd3g基因，同时所述sgrna的序列在待改变的cd3e、cd3d和/或cd3g基因上的靶序列上。155.优选的，所述的构建方法包括：156.a)用包含人cd3e基因的全部或部分导入非人动物cd3e基因座上；157.b)用包含人cd3d基因的全部或部分和/或人cd3g基因的全部或部分导入非人动物cd3d和/或cd3g基因座上；158.或者，159.a)所述的构建方法包括用包含人cd3d基因的全部或部分和/或人cd3g基因的全部或部分导入非人动物cd3d和/或cd3g基因座上；160.b)用包含人cd3e基因的全部或部分导入非人动物cd3e基因座上。161.在本发明提供的制备方法中，优选通过二次打靶制备cd3e、cd3d和cd3g人源化非人动物。在一些实施方式中，将人cd3d和cd3g基因片段的全部或部分导入非人动物相应区域后(非人动物cd3d和cd3g基因的内源位点)，再通过二次打靶将人cd3e基因片段的全部或部分导入相应区域(非人动物cd3e基因的内源位点)。在另一些实施方式中，将人cd3e基因片段的全部或部分导入相应区域(非人动物cd3e基因的内源位点)后，再通过二次打靶将人cd3d和cd3g基因片段的全部或部分导入非人动物相应区域后(非人动物cd3d和cd3g基因的内源位点)。162.具体地，所述的制备方法包括:163.a)使用上述的cd3e基因的靶向载体获得cd3e基因人源化非人动物；164.b)使用上述的cd3d和cd3g基因的靶向载体获得cd3e、cd3d和cd3g基因人源化非人动物；165.或者，166.a)使用上述的cd3d和cd3g基因的靶向载体获得cd3d和cd3g基因人源化非人动物；167.b)使用上述的cd3e基因的靶向载体获得cd3e、cd3d和cd3g基因人源化非人动物。168.在本发明的一个具体实施方式中，所述的构建方法包括：169.a)用包含seqidno：14或63所示的核苷酸序列导入非人动物cd3e基因座上；170.b)用包含seqidno：9所示核苷酸序列导入非人动物cd3d和cd3g基因座上；或者，171.a)用包含seqidno：9所示核苷酸序列导入非人动物cd3d和cd3g基因座上；172.b)用包含seqidno：14或63所示的核苷酸序列导入非人动物cd3e基因座上。173.所述的构建方法包括用包含编码人cd3e、cd3d和/或cd3g蛋白的全部或部分核苷酸序列导入非人动物cd3e、cd3d和/或cd3g基因座上。174.优选的，包括用包含编码人cd3e蛋白的全部或部分核苷酸序列导入非人动物cd3e基因座。进一步优选的，包括用包含编码人cd3e蛋白的信号肽、跨膜区、胞质区和/或胞外区的全部或部分核苷酸序列导入非人动物cd3e基因座。175.优选的，包括用包含编码人cd3d蛋白的全部或部分核苷酸序列导入非人动物cd3d基因座。进一步优选的，包括用包含编码人cd3d蛋白的信号肽、跨膜区、胞质区和/或胞外区的全部或部分核苷酸序列导入非人动物cd3d基因座。176.优选的，用包含编码人cd3g蛋白的全部或部分核苷酸序列导入非人动物cd3g基因座。进一步优选的，包括用包含编码人cd3g蛋白的信号肽、跨膜区、胞质区和/或胞外区的全部或部分核苷酸序列导入非人动物cd3g基因座。177.优选的，所述的插入为首先破坏非人动物内源cd3e、cd3d和/或cd3g基因的编码框，随后进行插入操作，或者所述的插入步骤既可以给内源cd3e、cd3d和/或cd3g基因造成移码突变又可以实现插入人源序列的步骤。178.优选的，所述的插入或替换的位点为cd3e基因的内源调控元件之后。179.优选的，所述非人动物的基因组中至少一个染色体上包含cd3e、cd3d和/或cd3g基因的部分。180.优选的，所述的非人动物中至少一个细胞表达人cd3e、cd3d和/或cd3g蛋白或人源化cd3e、cd3d和/或cd3g蛋白。181.本发明涉及三种基因的遗传修饰，其在非人动物基因组中修饰的个数或顺序均不受限制。既可以每个基因单独修饰，例如依次修饰非人动物cd3e、cd3d、cd3g基因，或者依次修饰非人动物cd3d、cd3g、cd3e，或者依次修饰非人动物cd3g、cd3e、cd3d，或者，依次修饰非人动物cd3e、cd3g、cd3d基因，或者依次修饰非人动物cd3d、cd3e、cd3g，或者，依次修饰非人动物cd3g、cd3d、cd3e。也可以先修饰一个基因后再进行修饰后两个基因，或者先修饰两个基因后再修饰另一个基因，例如先修饰cd3e基因，再一并修饰cd3g、cd3d，或者，先修饰cd3d基因，再一并修饰cd3e、cd3g，或者，先修饰cd3g基因，再一并修饰cd3e、cd3d。当然也可以同时修饰cd3d、cd3g、cd3e三个基因。182.根据本发明的一些实施例，该构建方法进一步包括：将cd3edg基因人源化的非人动物与其他基因修饰的非人动物交配、体外受精或直接进行基因编辑，并进行筛选，得到多基因修饰的非人动物。183.优选的，所述的其他基因为pd-1、pd-l1、4-1bb、tigit、b7-h3、cd28、cd38和cldn18.2中的至少一种基因修饰的非人动物。184.优选的，所述的非人动物还表达人或人源化的pd-1、pd-l1、4-1bb、tigit、b7-h3、cd28、cd38和cldn18.2蛋白中的至少一种。185.优选的，所述的多基因修饰的非人动物的基因组中修饰的多个基因中的每一个基因均对于内源被替换基因座为纯合或杂合的。186.优选的，所述的非人动物可以选自啮齿类动物、猪、兔子、猴子等任何可以进行基因编辑制备基因人源化的非人动物。187.优选的，所述的非人动物为非人哺乳动物。进一步优选的，所述的非人哺乳动物为啮齿类动物。更进一步优选的，所述的啮齿类动物为大鼠或小鼠。188.优选的，所述的非人动物是免疫缺陷的非人哺乳动物。进一步优选的，所述的免疫缺陷的非人哺乳动物为免疫缺陷的啮齿类动物、免疫缺陷的猪、免疫缺陷的兔子或免疫缺陷的猴子。更进一步优选的，所述的免疫缺陷的啮齿类动物为免疫缺陷的小鼠或大鼠。最为优选的，所述免疫缺陷鼠是nod-prkdcscidil-2rγnull小鼠、nod-rag1-/-‑il2rg-/-(nrg)小鼠、rag2-/-‑il2rg-/-(rg)小鼠、nod/scid小鼠或者裸鼠。189.本发明的第十三方面，提供了一种多基因修饰的非人动物的构建方法，包括如下步骤：190.i)提供上述的经遗传修饰的非人动物或上述构建方法获得的经遗传修饰的非人动物；191.ii)将步骤i)提供的非人动物与其他基因修饰的非人动物交配、体外受精或直接进行基因编辑，并进行筛选，得到多基因修饰的非人动物。192.优选的，所述的其他基因修饰的非人动物包括但不限于基因pd-1、pd-l1、4-1bb、tigit、b7-h3、cd28、cd38或cldn18.2修饰的非人动物。193.优选的，所述的多基因修饰的非人动物为双基因人源化非人动物、三基因人源化非人动物、四基因人源化非人动物、五基因人源化非人动物、六基因人源化非人动物、七基因人源化非人动物、八基因人源化非人动物或九基因人源化非人动物。194.优选的，所述的多基因修饰的非人动物相对于人源化的多个基因中的每一个基因均可以是纯合或杂合的。195.本发明的第十四方面，提供了一种上述构建方法获得的非人动物或其子代。196.本发明的第十五方面，提供了一种cd3e、cd3d和/或cd3g基因敲除的非人动物。优选的，所述的非人动物缺失cd3e基因的2号至8号外显子。优选的，所述的非人动物缺失cd3d基因的1号至5号外显子。优选的，所述的非人动物缺失cd3g基因的1号至7号外显子。197.本发明的第十六方面，提供了一种cd3e、cd3d和/或cd3g基因敲除的细胞。优选的，所述的细胞基因组中缺失cd3e基因的2号至8号外显子。优选的，所述的细胞基因组中缺失cd3d基因的1号至5号外显子。优选的，所述的细胞基因组中缺失cd3g基因的1号至7号外显子。198.本发明的第十七方面，提供了一种动物的疾病模型，所述的疾病模型来源于上述的经遗传修饰的非人动物或上述构建方法获得的经遗传修饰的非人动物或上述构建方法获得的多基因修饰的非人动物或上述的非人动物或其子代。优选的，所述的疾病包括自身免疫性疾病、肿瘤或炎症。199.本发明的第十八方面，提供了来源于上述的经遗传修饰的非人动物或上述构建方法获得的经遗传修饰的非人动物或上述构建方法获得的多基因修饰的非人动物或上述的非人动物或其子代在制备动物的疾病模型中的应用，优选的，所述的疾病包括自身免疫性疾病、肿瘤或炎症。200.本发明的第十九方面，提供了来源于上述的经遗传修饰的非人动物或上述构建方法获得的经遗传修饰的非人动物或上述构建方法获得的多基因修饰的非人动物或上述的非人动物或其子代在制备治疗自身免疫性疾病、肿瘤和/或炎症的药物中的应用，或者在制备人cd3e、cd3d和/或cd3g特异性调节剂中的应用，或者在筛选人cd3e、cd3d和/或cd3g特异性调节剂中的应用。201.本发明的第二十方面，提供了一种细胞或细胞系或原代细胞培养物，所述细胞或细胞系或原代细胞培养物来源于上述的经遗传修饰的非人动物或上述构建方法获得的经遗传修饰的非人动物或上述构建方法获得的多基因修饰的非人动物或上述的非人动物或其子代或上述的动物的疾病模型。优选的，所述的细胞或细胞系或原代细胞培养物不能发育为动物个体。202.本发明的第二十一方面，提供了一种组织或器官或其培养物，所述组织或器官或其培养物来源于上述的经遗传修饰的非人动物或上述构建方法获得的经遗传修饰的非人动物或上述构建方法获得的多基因修饰的非人动物或上述的非人动物或其子代或上述的动物的疾病模型。优选的，所述的组织或器官或其培养物不能发育为动物个体。203.本发明的第二十二方面，提供了一种荷瘤后的瘤组织，所述的瘤组织来源于上述的经遗传修饰的非人动物或上述构建方法获得的经遗传修饰的非人动物或上述构建方法获得的多基因修饰的非人动物或上述的非人动物或其子代或上述的动物的疾病模型。优选的，所述的荷瘤后的瘤组织不能发育为动物个体。204.本发明的第二十三方面，提供了一种经遗传修饰的细胞，述的细胞表达1)人或人源化cd3e蛋白，2)人或人源化cd3d蛋白，和/或3)人或人源化cd3g蛋白。205.优选的，所述的细胞的基因组中包含1)人cd3e基因的全部或部分，2)人cd3d基因的全部或部分，和/或3)人cd3g基因的全部或部分。优选的，所述的细胞不能发育为动物个体。206.本发明的第二十四方面，提供了一种包含上述的人源化cd3e基因或上述的嵌合基因的构建体。207.本发明的第二十五方面，提供了一种包含上述构建体的细胞。优选的，所述的细胞不能发育为动物个体。208.本发明的第二十六方面，提供了一种包含上述细胞的组织。优选的，所述的组织不能发育为动物个体。209.本发明的第二十七方面，提供了来源于上述的经遗传修饰的非人动物、上述构建方法获得的经遗传修饰的非人动物、上述的人源化cd3e基因、上述的嵌合基因、上述构建方法获得的多基因修饰的非人动物、上述的非人动物或其子代、上述的动物的疾病模型、上述的细胞或细胞系或原代细胞培养物、上述的组织或器官或其培养物、上述的荷瘤后的瘤组织或者上述的细胞的应用，所述的应用包括：210.a)涉及人类细胞的与cd3e、cd3d和/或cd3g相关的免疫过程的产品开发中的应用；211.b)作为药理学、免疫学、微生物学和医学研究的与cd3e、cd3d和/或cd3g相关的模型系统中的应用；212.c)涉及生产和利用动物实验疾病模型用于与cd3e、cd3d和/或cd3g相关的病原学研究和/或用于开发诊断策略和/或用于开发治疗策略中的应用；213.d)在体内研究人cd3e、cd3d和/或cd3g信号通路调节剂的筛选、药效检测、评估疗效、验证或评价中的应用；或者，214.e)研究cd3e、cd3d和/或cd3g基因功能，研究针对人cd3e、cd3d和/或cd3g靶位点的药物、药效，研究与cd3e、cd3d和/或cd3g相关的免疫相关疾病药物、炎症以及抗肿瘤药物方面的应用。215.优选的，所述应用不是疾病的治疗和/或诊断方法。216.本发明的第二十八方面，提供了一种筛选靶向目标抗原的候选药物的方法，所述的方法包括向个体引入目标抗原，使候选药物与个体接触，其中，所述的候选药物针对所述的人cd3和/或目标抗原，进行检测；其中，所述的个体选自上述的经遗传修饰的非人动物或上述构建方法获得的经遗传修饰的非人动物或上述构建方法获得的多基因修饰的非人动物或上述的非人动物或其子代或上述的动物的疾病模型。217.优选的，所述的引入包括在所述个体中表达所述目标抗原。优选向个体移入表达目标抗原的细胞。其中，所述的细胞可以是肿瘤细胞、细菌细胞。218.优选的，所述的引入包括用所述的目标抗原感染所述个体。其中，所述的感染可以为病毒感染或细菌感染。219.优选的，所述的目标抗原为肿瘤相关抗原或传染性疾病抗原。220.优选的，所述的候选药物为抗体或抗原结合蛋白。221.在本发明的一个具体实施方式中，所述的候选药物为双特异性抗体或双特异性抗原结合蛋白。其可以同时结合人cd3蛋白和所述的目标抗原。222.本发明的第二十九方面，提供了一种人cd3e、cd3d和/或cd3g特异性调节剂的筛选方法，所述的筛选方法包括向个体施加调节剂，检测调节效果；其中，所述的个体选自上的非人动物、上述的构建方法获得的非人动物、上述的非人动物或其子代，上述的疾病模型。223.优选的，所述的调节剂选自car-t、药物；优选的，所述的药物为抗体。优选的，所述的调节剂为单抗或双特异性抗体或两种及两种以上药物的联合使用。224.优选的，所述的筛选方法还包括向个体植入肿瘤的步骤。225.优选的，所述检测包括测定肿瘤细胞的大小和/或增殖速率。226.优选的，所述检测的方法包括游标卡尺测量、流式细胞检测和/或动物活体成像检测。227.优选的，所述的检测包括评估个体体重、脂肪量、活化途径、神经保护活性或代谢变化，所述的代谢变化包括食物消耗或水消耗的变化。228.优选的，所述的肿瘤细胞来源于人或非人动物。229.优选的，所述的筛选方法还包括向个体植入肿瘤的步骤。230.本发明的第三十方面，提供了一种干预方案的评价方法，所述的评价方法包括向个体施加干预方案，对施加干预方案后的个体进行调节效果检测和评价；其中，所述的个体选自上述的非人动物，上述的构建方法获得的非人动物，上述的非人动物或其子代，或者上述的疾病模型。231.优选的，所述的评价方法还包括向个体植入肿瘤细胞。232.优选的，所述的干预方案选自car-t、药物治疗，进一步优选的，所述的药物为抗原结合蛋白，所述的抗原结合蛋白为抗体。233.优选的，所述的肿瘤细胞来源于人或非人动物。234.本发明的第三十一方面，提供了一种t细胞的激活方法，所述的激活方法包括向个体施加上述方法筛选方法获得的人cd3e、cd3d和/或cd3g特异性调节剂。235.本发明所述的“肿瘤相关抗原”包括但不限于alk、bage蛋白、birc5(存活素)、birc7、ca9、calr、ccr5、cd19、cd20(ms4a1)、cd22、cd27、cd30、cd33、cd38、cd40、cd44、cd52、cd56、cd79、cdk4、ceacam3、ceacam5、clec12a、egfr、egfr变体iii、erbb2(her2)、erbb3、erbb4、epcam、epha2、epha3、fcrl5、flt3、folr1、gage蛋白、gd2、gd3、gpnmb、gm3、gpr112、il3ra、kit、kras、lgr5、ebv衍生的lmp2、l1cam、mage蛋白、mlana、msln、muc1、muc2、muc3、muc4、muc5、muc16、mum1、ankrd30a、ny-eso1(ctag1b)、ox40、pap、pax3、pax5、plac1、prlr、pmel、prame、psma(folh1)、rage蛋白、ret、rgs5、ror1、sart1、sart3、slamf7、slc39a6(liv1)、steap1、steap2、tert、tmprss2、thompson-nouvelle抗原、tnfrsf17、tyr、upk3a、vtcn1或wt1。236.本发明所述的“传染性疾病抗原”可以为病毒抗原或细菌抗原。所述的病毒抗原包括但不限于hiv、甲肝病毒、乙肝病毒、丙肝病毒、疱疹病毒例如，hsv-1、hsv-2、cmv、hav-6、vzv、eb病毒、腺病毒、流感病毒、黄热病毒、艾柯病毒、鼻病毒、柯萨基病毒、冠状病毒、呼吸道合胞病毒、流腮病毒、轮状病毒、麻疹病毒、风疹病毒、细小病毒、牛痘病毒、htlv、登革病毒、乳头状瘤病毒、软疣病毒、脊髓灰质炎病毒、狂犬病毒、jc病毒、埃博拉病毒和虫媒病毒性脑炎病毒抗原。所述的细菌抗原包括但不限于衣原体、立克次氏体、分枝杆菌、葡萄球菌、链球菌、肺炎双球菌、脑膜炎双球菌、淋菌、克雷伯氏菌、变形杆菌、变形杆菌、沙雷氏菌、假单胞菌、军团杆菌、白喉菌、沙门氏菌、芽孢杆菌、霍乱菌、破伤风杆菌、肉毒杆菌、炭疽杆菌、鼠疫、钩旋体或莱姆病细菌抗原。237.本发明所述的人cd3e、cd3d和/或cd3g特异性调节剂的筛选方法、t细胞的激活方法、干预方案的评价方法以及筛选靶向目标抗原的候选药物的方法，均非疾病的诊断或治疗目的。238.本发明所述的“肿瘤”包括但不限于淋巴瘤、b细胞肿瘤、t细胞肿瘤、骨髓/单核细胞肿瘤、非小细胞肺癌、白血病、卵巢癌、鼻咽癌、乳腺癌、子宫内膜癌、结肠癌、直肠癌、胃癌、膀胱癌、肺癌、支气管癌、骨癌、前列腺癌、胰腺癌、肝和胆管癌、食管癌、肾癌、甲状腺癌、头颈部癌、睾丸癌、胶质母细胞瘤、星形细胞瘤、黑色素瘤、骨髓增生异常综合征、以及肉瘤。其中，所述的白血病选自急性淋巴细胞性(成淋巴细胞性)白血病、急性骨髓性白血病、髓性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、多发性骨髓瘤、浆细胞白血病、以及慢性骨髓性白血病；所述淋巴瘤选自霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤，包括b细胞淋巴瘤、弥漫性大b细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、边缘区b细胞淋巴瘤、t细胞淋巴瘤、和瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症；所述肉瘤选自骨肉瘤、尤文肉瘤、平滑肌肉瘤、滑膜肉瘤、软组织肉瘤、血管肉瘤、脂肪肉瘤、纤维肉瘤、横纹肌肉瘤、及软骨肉瘤。在本发明的一个具体实施方式中，所述的肿瘤选自b细胞肿瘤、t细胞肿瘤、骨髓/单核细胞肿瘤。优选包括b或t细胞急性淋巴细胞白血病(all)、急性髓细胞白血病(aml)、非霍奇金淋巴瘤(nhl)和多发性骨髓瘤(mm)、鼻咽癌、肺癌。239.本发明所述的“自身免疫性疾病”包括但不限于过敏、哮喘、心肌炎、肾炎、肝炎、系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、硬皮病、甲状腺功能亢进、原发性血小板减少性紫癜、自身免疫性溶血性贫血、溃疡性结肠炎、自身免疫性肝病、糖尿病、疼痛或神经障碍等。240.本发明所述的“炎症”包括急性炎症，也包括慢性炎症。具体的，包括但不限于变质性炎症、渗出性炎症(浆液性炎、纤维素性炎、化脓性炎、出血性炎、坏死性炎、卡他性炎)、增生性炎症、特异性炎症(结核、梅毒、麻疯、淋巴肉芽肿等)。241.优选的，本发明保护的主题“细胞”、“细胞或细胞系或原代细胞培养物”、“组织”、“组织或器官或其培养物”均不能发育为动物，其中，所述的细胞不是干细胞或受精卵细胞，所述的细胞可以是体细胞、淋巴细胞(优选为t细胞或b细胞)或肿瘤细胞等等，所述的组织可以是脾脏、淋巴结、骨髓、肿瘤或其培养物等等。242.本发明所述的“全部或部分”，“全部”为整体，“部分”为整体中的局部，或者组成整体的个体。243.本发明所述的“包含”或“包括”为开放式写法，当在本技术中用于描述蛋白质或核酸的序列时，所述蛋白质或核酸可以是由所述序列组成，或者在所述蛋白质或核酸的一端或两端可以具有额外的氨基酸或核苷酸，但仍然具有本发明所述的活性。244.本发明所述的“人源化cd3e蛋白”，包含来源于人cd3e蛋白的部分和非人动物cd3e蛋白的部分。其中，所述的“人cd3e蛋白”同“人cd3e蛋白的全部”，即其氨基酸序列与人cd3e蛋白的全长氨基酸序列一致。所述的“人cd3e蛋白的部分”，为连续或间隔的5-207个氨基酸序列与人cd3e蛋白的氨基酸序列一致或与人cd3e蛋白的氨基酸序列具有70％以上同源性。245.本发明所述的“人源化cd3d蛋白”，包含来源于人cd3d蛋白的部分和非人动物cd3d蛋白的部分。其中，所述的“人cd3d蛋白”同“人cd3d蛋白的全部”，即其氨基酸序列与人cd3d蛋白的全长氨基酸序列一致。所述的“人cd3d蛋白的部分”，为连续或间隔的5-171个氨基酸序列与人cd3d蛋白的氨基酸序列一致或与人cd3d蛋白的氨基酸序列具有70％以上同源性。246.本发明所述的“人源化cd3g蛋白”，包含来源于人cd3g蛋白的部分和非人动物cd3g蛋白的部分。其中，所述的“人cd3g蛋白”同“人cd3g蛋白的全部”，即其氨基酸序列与人cd3g蛋白的全长氨基酸序列一致。所述的“人cd3g蛋白的部分”，为连续或间隔的5-182个氨基酸序列与人cd3g蛋白的氨基酸序列一致或与人cd3g蛋白的氨基酸序列具有70％以上同源性。247.本发明所述的“人源化cd3e基因”，包含来源于人cd3e基因的部分和非人cd3e基因的部分。248.本发明所述的“嵌合基因”，包含上述的人源化cd3e基因，或者，包含人cd3d基因的全部或部分和cd3g基因的全部或部分，或者包含人源化cd3e基因、cd3d基因的全部或部分和cd3g基因的全部或部分。249.本发明所述的“xx号至xxx号外显子”或“xx号至xxx号外显子的全部”包含外显子及其期间的内含子的核苷酸序列，例如所述的“1号至5号外显子”包含1号外显子、1-2号内含子、2号外显子、2-3号内含子、3号外显子、3-4号内含子、4号外显子、4-5号内含子和5号外显子的全部核苷酸序列。250.本发明所述的“x-xx号内含子”表示x号外显子与xx号外显子之间的内含子。例如“2-3号内含子”表示2号外显子与3号外显子之间的内含子。251.本发明所述的“基因座”广义上讲代表基因在染色体上所占的位置，狭义上讲代表某一基因上的一段dna片段，即可以是一个基因也可以是一个基因的一部分。252.本发明所述的“核苷酸序列”包含天然的或经过修饰的核糖核苷酸序列、脱氧核糖核苷酸序列。优选为dna、cdna、pre-mrna、mrna、rrna、hnrna、mirnas、scrna、snrna、sirna、sgrna、trna。253.本发明所述的“治疗”表示减缓、中断、阻止、控制、停止、减轻、或逆转一种体征、症状、失调、病症、或疾病的进展或严重性，但不一定涉及所有疾病相关体征、症状、病症、或失调的完全消除，且是指在疾病已开始发展后改善疾病或病理状态的体征、症状等等的治疗m.p.caloseds.，1987，coldspringharborlaboratory)；immunochemicalmethodsincellandmolecularbiology(mayerandwalker，eds.，academicpress，london，1987)；handbookofexperimentalimmunology，volumesv(d.m.weirandc.c.blackwell，eds.，1986)；andmanipulatingthemouseembryo，(coldspringharborlaboratorypress，coldspringharbor，n.y.，1986)。258.以上只是概括了本发明的一些方面，不是也不应该认为是在任何方面限制本发明。259.本说明书提到的所有专利和出版物都是通过参考文献作为整体而引入本发明的。本领域的技术人员应认识到，对本发明可作某些改变并不偏离本发明的构思或范围。260.下面的实施例进一步详细说明本发明，不能认为是限制本发明或本发明所说明的具体方法的范围。附图说明261.以下，结合附图来详细说明本发明的实施例，其中：262.图1：小鼠cd3e基因和人cd3e基因座对比示意图(非按比例)；263.图2：小鼠cd3d基因和人cd3d基因座对比示意图(非按比例)；264.图3：小鼠cd3g基因和人cd3g基因座对比示意图(非按比例)；265.图4：小鼠cd3e、cd3d和cd3g基因人源化改造示意图(非按比例)；266.图5：cd3e、cd3d和cd3g基因打靶策略及靶向载体设计示意图(非按比例)，其中，mcd3edg代表野生型小鼠cd3e、cd3d和cd3g基因座，chicd3edg-1代表小鼠cd3d和cd3g基因改造后的基因座，chicd3edg-2代表小鼠cd3e、cd3d和cd3g基因改造后的基因座，v1为靶向载体1，v2为靶向载体2；267.图6：cd3dg重组后细胞southernblot结果，其中wt为野生型对照；268.图7：cd3e重组后细胞southernblot结果，其中wt为野生型对照；269.图8：cd3edg人源化f1代小鼠鼠尾pcr鉴定结果，其中，m为marker，wt为野生型，h2o为水对照，pc为阳性对照；270.图9：野生型c57bl/6小鼠( / )和cd3edg基因人源化纯合子小鼠(h/h)胸腺组织rt-pcr检测结果，其中h2o为水对照，gapgh为内参；271.图10：c57bl/6野生型小鼠和cd3edg基因人源化纯合子小鼠(cd3edg(h/h))脾脏大小(a)、重量(b)和脾细胞数量(c)；272.图11：c57bl/6野生型小鼠和cd3edg基因人源化纯合子小鼠(cd3edgh/h)胸腺大小(a)、重量(b)和胸腺细胞数量(c)；273.图12：c57bl/6野生型小鼠和cd3edg基因人源化纯合子小鼠(cd3edg(h/h))胸腺中白细胞亚群占比的流式检测结果，其中，dn为双阴性对照，dp为双阳性对照；274.图13：c57bl/6野生型小鼠和cd3edg基因人源化纯合子小鼠(cd3edg(h/h))胸腺中t细胞亚群占比的流式检测结果，其中，dn为双阴性对照，dp为双阳性对照；275.图14：c57bl/6野生型小鼠和cd3edg基因人源化纯合子小鼠(cd3edg(h/h))脾脏中白细胞亚群占比的流式检测结果，其中，b为b细胞，t为t细胞，nk为nk细胞，gran为粒细胞，dc为树突状细胞，为巨噬细胞，mon为单核细胞；276.图15：c57bl/6野生型小鼠和cd3edg基因人源化纯合子小鼠(cd3edg(h/h))脾脏中t细胞亚群占比的流式检测结果；277.图16：c57bl/6野生型小鼠和cd3edg基因人源化纯合子小鼠(cd3edg(h/h))淋巴结中白细胞亚群占比的流式检测结果；278.图17：c57bl/6野生型小鼠和cd3edg基因人源化纯合子小鼠(cd3edg(h/h))淋巴结中t细胞亚群占比的流式检测结果；279.图18a：野生型c57bl/6小鼠脾脏中cd4 t细胞增殖情况，其中anti-mcd3e为抗鼠cd3e抗体，anti-hcd3e为抗人cd3e抗体，anti-mcd3e/anti-mcd28表示抗鼠cd3e抗体和抗鼠cd28抗体同时处理组，anti-hcd3e/anti-mcd28表示抗人cd3e抗体和抗鼠cd28抗体同时处理组；280.图18b：cd3edg基因人源化纯合子小鼠脾脏中cd4 t细胞增殖情况，其中anti-mcd3e为抗鼠cd3e抗体，anti-hcd3e为抗人cd3e抗体，anti-mcd3e/anti-mcd28表示抗鼠cd3e抗体和抗鼠cd28抗体同时处理组，anti-hcd3e/anti-mcd28表示抗人cd3e抗体和抗鼠cd28抗体同时处理组；281.图19a：野生型c57bl/6小鼠脾脏中cd8 t细胞增殖情况，其中anti-mcd3e为抗鼠cd3e抗体，anti-hcd3e为抗人cd3e抗体，anti-mcd3e/anti-mcd28表示抗鼠cd3e抗体和抗鼠cd28抗体同时处理组，anti-hcd3e/anti-mcd28表示抗人cd3e抗体和抗鼠cd28抗体同时处理组；282.图19b：cd3edg基因人源化纯合子小鼠脾脏中cd8 t细胞增殖情况，其中anti-mcd3e为抗鼠cd3e抗体，anti-hcd3e为抗人cd3e抗体，anti-mcd3e/anti-mcd28表示抗鼠cd3e抗体和抗鼠cd28抗体同时处理组，anti-hcd3e/anti-mcd28表示抗人cd3e抗体和抗鼠cd28抗体同时处理组；283.图20：il-2和ifn-γ表达情况，其中cd3edg(h/h)为cd3edg基因人源化纯合子小鼠，nd代表nodetectable；284.图21：ova特异性抗体血清滴度检测结果，其中cd3edg为cd3egd基因人源化小鼠，图a为免疫前c57bl/6野生型小鼠和cd3edg基因人源化小鼠血清抗体亚型分析结果，图b为第二次和第三次免疫之后小鼠的血清抗体滴度检测结果；285.图22：cd3edg基因人源化小鼠肿瘤药效验证结果(a)，以及小鼠体重变化情况(b)，其中，g1：higgab为人igg抗体，g2：mpd-1ab为抗鼠pd-1抗体，g3：hcd3eab为抗人cd3e抗体；286.图23：抗hcd3e抗体和抗mpd-1抗体处理后cd3edg基因人源化小鼠外周血中的t细胞(a)和b细胞(b)变化情况，其中，higgab为人igg抗体，mpd-1ab为抗鼠pd-1抗体，hcd3eab为抗人cd3e抗体；287.图24：抗hcd3e抗体和抗mpd-1抗体处理后cd3edg基因人源化小鼠肿瘤中t细胞(a)和b细胞(b)变化情况，其中，higgab为人igg抗体，mpd-1ab为抗鼠pd-1抗体，hcd3eab为抗人cd3e抗体；288.图25：小鼠cd3e、cd3d和cd3g基因人源化改造示意图二，具体为基因打靶策略及靶向载体设计示意图(非按比例)，其中，mcd3edg代表野生型小鼠cd3e、cd3d和cd3g基因座，chicd3edg-1代表小鼠cd3d和cd3g基因改造后的基因座，chicd3edg-3代表小鼠cd3e、cd3d和cd3g基因改造后的基因座，v1为靶向载体1，v3为靶向载体3；289.图26：cd3edg人源化小鼠体外杀伤实验的细胞毒性-浓度曲线图；290.图27：注射用生理盐水和抗人cd3/bcma抗体ab1处理后，cd3edg基因人源化小鼠体内肿瘤体积(a)和体重(b)变化情况；291.图28：人和小鼠cd3e氨基酸序列的比对结果；292.图29：人和小鼠cd3d氨基酸序列的比对结果；293.图30：人和小鼠cd3g氨基酸序列的比对结果。具体实施方式294.下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。295.在下述每一实施例中，设备和材料是从以下所指出的几家公司获得：296.c57bl/6小鼠和flp工具鼠购自中国食品药品检定研究院国家啮齿类实验动物种子中心；297.heraeustmfrescotm21microcentrifuge购自thermofisherscientific，型号fresco21；298.attunenxtacousticfocusingcytometer购自thermofisher，型号attunenxt；299.primescript1ststrandcdnasynthesiskit购自takara，型号6110a；300.heraeustmfrescotm21microcentrifuge购自thermofisher，型号fresco21；301.ndei、ecori、sspi、xbai、spei、ecorv酶购自neb，货号分别为r0111s、r0101m、r0132m、r0145m、r0133m、r0195m；302.purifiedanti-mousecd16/32antibody购自biolegend，货号101302；303.zombienirtmfixableviabilitykit(dmso)购自biolegend，货号423106；304.foxp3/transcriptionfactorstainingbufferset购自ebioscience，货号00-5523-00；305.percpanti-mousecd45antibody购自biolegend，货号103130；306.brilliantviolet711tmanti-mousetcrβchainantibody购自biolegend，货号109243；307.brilliantviolet510tmanti-mousecd4antibody购自biolegend，货号100449；308.fitcanti-mousecd8aantibody购自biolegend，货号100706；309.brilliantviolet421tmanti-mousenk1.1antibody购自biolegend，货号108732；310.brilliantviolet605tmanti-mousecd19antibody购自biolegend，货号115540；311.anti-mo/rtfoxp3pe/cytm7购自ebioscience，货号25-5773-82；312.brilliantviolet510tmanti-mousecd45antibody购自biolegend，货号103138；313.percpanti-mousely-6g/ly-6c(gr-1)antibody购自biolegend，货号108426；314.ebioscienceanti-mousecd11cpe/cy7antibody购自ebioscience，货号25-0114-81；315.v450ratanti-mousecd11b购自bdhorizon，货号560455；316.fitcanti-mousef4/80antibody购自biolegend，货号123108；317.sbaclonotypingsystem-c57bl/6-hrp购自southernbiotech，货号5300-05b；318.goatanti-mouseiggfc-hrp购自abcam，货号ab98741；319.mouseigg1,kappaisotypecontrol购自crownbio，货号c0005；320.mouseigg2b,kappaisotypecontrol购自crownbio，货号c0008。321.实施例1cd3edg基因人源化小鼠的制备322.本实施例对非人动物(如小鼠)进行改造，使该非人动物体内包含编码人cd3e蛋白、cd3d蛋白和cd3g蛋白的核苷酸序列，得到经遗传修饰的非人动物体内可表达人或人源化cd3e蛋白、cd3d蛋白和cd3g蛋白。小鼠cd3e基因(ncbigeneid：12501，primarysource：mgi：88332，uniprotid：p22646，位于9号染色体nc_000075.7的第44910033至44920961位，基于转录本nm_007648.5及其编码蛋白np_031674.1(seqidno：1))和人cd3e基因(ncbigeneid：916，primarysource：hgnc:1674，uniprotid：p07766，位于11号染色体nc_000011.10的第118304730至118316173位，基于转录本nm_000733.4及其编码蛋白np_000724.1(seqidno：2))对比示意图如图1所示。323.小鼠cd3d基因(ncbigeneid：12500，primarysource：mgi：88331，uniprotid：p04235，位于9号染色体nc_000075.7的第44893067至44898350位，基于转录本nm_013487.3及其编码蛋白np_038515.3(seqidno：3))和人cd3d基因(ncbigeneid：915，primarysource：hgnc:1673，uniprotid：p04234，位于11号染色体nc_000011.10的第118338954至118342705位，基于转录本nm_000732.6及其编码蛋白np_000723.1(seqidno：4))对比示意图如图2所示。324.小鼠cd3g基因(ncbigeneid：12502，primarysource：mgi：88333，uniprotid：p11942，位于9号染色体nc_000075.7的第44880870至44891729位，基于转录本nm_009850.2及其编码蛋白np_033980.1(seqidno：5))和人cd3g基因(ncbigeneid：917，primarysource：hgnc:1675，uniprotid：p09693，位于11号染色体nc_000011.10的第118344344至118355161位，基于转录本nm_000073.3及其编码蛋白np_000064.1(seqidno：6))对比示意图如图3所示。人和小鼠cd3e、cd3d、cd3g氨基酸序列的比对结果分别如图28-30所示。325.为了达到本发明的目的，可在小鼠内源cd3e、cd3d和cd3g基因座引入编码人cd3e、cd3d和cd3g蛋白的全部或部分核苷酸序列，使得该小鼠表达人或人源化cd3e、cd3d和cd3g蛋白。具体来说，可以通过基因编辑技术在小鼠内源cd3e基因座上用人cd3e基因核苷酸序列替换小鼠cd3e基因，如将小鼠cd3e基因的2号外显子部分序列至8号外显子部分序列用人cd3e基因的2号外显子部分序列至9号外显子部分序列的约11kb的序列进行替换，将小鼠cd3d和cd3g基因座用人cd3d和cd3g基因组约17kb的dna序列进行替换，最终得到人源化的cd3e、cd3d和cd3g基因序列(示意图如图4所示)，实现对小鼠cd3e、cd3d和cd3g基因的人源化改造。326.如图5所示的打靶策略示意图中，涉及靶向载体1(v1)和靶向载体2(v2)，其中靶向载体1上含有小鼠cd3d基因上游和cd3g下游的同源臂序列，以及包含人cd3d和cd3gdna序列的a1片段。其中，上游同源臂序列(5’同源臂1，seqidno：7)与ncbi登录号为nc_000075.7的第44898911至44903464位核苷酸序列相同，下游同源臂序列(3’同源臂1，seqidno：8)与ncbi登录号为nc_000075.7的第44875592至44880865位核苷酸序列相同；a1片段上包含人cd3d和cd3g基因组dna序列(seqidno：9)，该dna序列与ncbi登录号为nc_000011.10的第118338117至118355186位核苷酸序列相同，该序列与5’端同源臂1的连接设计为计为(seqidno：35)，其中序列“tgtga”中的“a”是5’端同源臂的最后一个核苷酸，序列的第一个“g”是人的第一个核苷酸。靶向载体1上还包括用于阳性克隆筛选的抗性基因，即潮霉素抗性基因编码序列hygr，并在抗性基因的两侧装上两个同向排列的位点特异性重组系统loxp重组位点，组成hygr表达盒(hygrcassette)。其中hygr表达盒5’端与人cd3d和cd3gdna序列的连接设计为列的连接设计为(seqidno：10)，其中序列“tttat”的最后一个“t”是人的最后一个核苷酸，序列的第一个“a”是hygr表达盒的第一个核苷酸；hygr表达盒3’端与3’同源臂1的连接设计为同源臂1的连接设计为同源臂1的连接设计为(seqidno：11)，其中序列“agctc”的最后一个“c”是hygr表达盒的最后一个核苷酸，序列的第一个“t”是3’同源臂1的第一个核苷酸。此外，还在靶向载体1的3’同源臂下游构建了具有负筛选标记的编码基因(白喉毒素a亚基的编码基因(dta))。327.靶向载体2上含有小鼠cd3e基因上游和下游的同源臂序列，以及包含人cd3edna序列的a2片段。其中，上游同源臂序列(5’同源臂2，seqidno：12)与ncbi登录号为nc_000075.7的第44925940至44920695位核苷酸序列相同，下游同源臂序列(3’同源臂2，seqidno：13)与ncbi登录号为nc_000075.7的第44906192至44909738位核苷酸序列相同；a2片段上包含人cd3edna序列(seqidno：14)，该dna序列与ncbi登录号为nc_000011.10的第118304953至118315542位核苷酸序列相同。其中，人cd3edna序列5’端与小鼠的连接设计为为(seqidno：36)，其中序列“agagg”的最后一个“g”是小鼠的最后一个核苷酸，序列的第一个“a”是人的第一个核苷酸；人cd3edna序列3’端与小鼠的连接设计为端与小鼠的连接设计为(seqidno：15)，其中序列“tctga”的“a”是人的最后一个核苷酸，序列的“c”是小鼠的第一个核苷酸。靶向载体2上还包括用于阳性克隆筛选的抗性基因，即新霉素抗性基因编码序列neor，并在抗性基因的两侧装上两个同向排列的位点特异性重组系统frt重组位点，组成neo盒(neocassette)。其中neo盒5’端与小鼠的连接设计为(seqidno：16)，其中序列“ccagg”的最后一个“g”是小鼠的最后一个核苷酸，序列的第一个“a”是neo盒的第一个核苷酸；neo盒3’端与小鼠的连接设计为接设计为(seqidno：17)，其中序列“aattc”的“c”是neo盒的最后一个核苷酸，序列的第一个“a”是小鼠的第一个核苷酸。此外，还在靶向载体2的3’同源臂下游构建了负筛选标记编码基因dta。328.改造后的人源化小鼠cd3e的mrna序列如seqidno：18所示，表达的蛋白序列如seqidno：2所示，人源化小鼠cd3d和cd3g(以下简称cd3dg)表达的蛋白序列分别如seqidno：4和seqidno：6所示。329.此外，也可将小鼠cd3e基因的2号外显子部分序列至6号外显子部分序列用人cd3e基因的2号外显子部分序列至7号外显子部分序列进行替换，将小鼠cd3d和cd3g基因座用人cd3d和cd3g基因组约17kb的dna序列进行替换，最终得到人源化的cd3e、cd3d和cd3g基因序列(示意图如图25所示)，实现对小鼠cd3e、cd3d和cd3g基因的人源化改造。330.图25所示的打靶策略示意图中，涉及靶向载体1和靶向载体3(v3)，其中靶向载体1与图5所示的靶向载体1相同，靶向载体3上含有小鼠cd3e基因上游和下游的同源臂序列，以及包含人cd3edna序列的a3片段。其中，上游同源臂序列(5’同源臂2)、下游同源臂序列(3’同源臂2)与图5中靶向载体2的上游同源臂和下游同源臂相同；a3片段中人cd3e序列(seqidno：63)与ncbi登录号为nc_000011.10的第118304953至118313732位核苷酸序列相同。其中，人cd3e序列5’端与小鼠的连接设计同seqidno：36；人cd3edna序列3’端与小鼠的连接设计为连接设计为(seqidno：64)，其中序列“tggat”的最后一个“t”是人的最后一个核苷酸，序列的第一个“c”是小鼠的第一个核苷酸。改造后的人源化小鼠cd3e的mrna序列如seqidno：65所示，表达的蛋白序列如seqidno：66所示。331.靶向载体构建可采用常规方法进行，如酶切连接等。构建好的靶向载体通过酶切进行初步验证后，再送测序公司进行测序验证。将测序验证正确的靶向载体电穿孔转染入c57bl/6小鼠或balb/c小鼠的胚胎干细胞中，利用阳性克隆筛选标记基因对得到的细胞进行筛选，并利用pcr和southernblot技术进行检测确认外源基因的整合情况，筛选出正确的阳性克隆细胞。本发明涉及两次打靶，每次打靶后分别进行pcr和southernblot鉴定。具体来说，靶向载体1转入小鼠胚胎干细胞后，经cd3dgpcr引物鉴定为阳性克隆再进行southernblot(分别用xbai或spei消化细胞dna并使用3个探针进行杂交，探针及目的片段长度如表1所示)检测，结果如图6所示，经测序验证发现除4-g11外，其余7个均为阳性克隆且无随机插入，具体编号为3-f01、3-h02、3-h09、4-a08、4-c09、4-e05、4-h03；对cd3d和cd3g重组正确的阳性克隆进行二次打靶，转入靶向载体2，对cd3e基因进行人源化改造，检测结果如图7所示，经cd3epcr引物验证为阳性的克隆再进行southernblot检测(分别用ndei、ecori或sspi消化细胞dna并使用3个探针进行杂交，探针及目的片段长度如表1所示)，经测序进一步发现编号为1-a09、2-f10、3-e05、3-g05、4-f10、4-g11的6个克隆为阳性克隆。332.表1：具体探针及目的片段长度333.限制性内切酶探针野生型片段重组序列片段xbaicd3dg-5’probe8.9kb7.3kbspeicd3dg-3’probe21.8kb10.9kbspeihygrprobe——10.9kbndeicd3e-5’probe15.0kb13.0kbecoricd3e-3’probe24.9kb8.5kbsspineoprobe——7.7kb334.其中，pcr测定包括下述引物：335.cd3dg-f1：5’‑acattgtgcaacatggttcctttatga-3’(seqidno：19)，336.cd3dg-r1：5’‑ggcaccattttagcttcctttcgcc-3’(seqidno：20)：337.cd3dg-f2：5’‑ctcgactgtgccttctagttgccag-3’(seqidno：21)，338.cd3dg-r2：5’‑acccaaattccttgttttcagttgcca-3’(seqidno：22)：339.cd3e-f1：5’‑gagctacacagtgagactaccacag-3’(seqidno：23)，340.cd3e-r1：5’‑cacagtatctgacaataaatggcaac-3’(seqidno：24)；341.cd3e-f2：5’‑gctcgactagagcttgcgga-3’(seqidno：25)，342.cd3e-r2：5’‑ctctcagtaatcaacttctcgtgtgtc-3’(seqidno：26)；343.southernblot检测包括如下探针引物：344.cd3dg-5’probe：345.cd3dg-5’probe-f：5’‑tacagaacacatggaggcacag-3’(seqidno：27)，346.cd3dg-5’probe-r：5’‑gtaacaacgctgcaacaggatc-3’(seqidno：28)；347.cd3dg-3’probe：348.cd3dg-3’probe-f：5’‑cacactctcatatcactgtacacac-3’(seqidno：29)，349.cd3dg-3’probe-r：5’‑tgatggatccaagagtgggcaac-3’(seqidno：30)；350.hygrprobe：351.hygrprobe-f：5’‑tcgatgtaggagggcgtggatatgt-3’(seqidno：31)，352.hygrprobe-r：5’‑tgtattgaccgattccttgcggtcc-3’(seqidno：32)；353.cd3e-5’probe：354.cd3e-5’probe-f：5’‑gcttcaaggatgtttaactgcaaag-3’(seqidno：33)，355.cd3e-5’probe-r：5’‑tgcaacagatgtgctggcga-3’(seqidno：34)；356.cd3e-3’probe：357.cd3e-3’probe-f：seqidno：27，358.cd3e-3’probe-r：seqidno：28；359.neoprobe：360.neoprobe-f：5’‑ggatcggccattgaacaagat-3’(seqidno：37)，361.neoprobe-r：5’‑cagaagaactcgtcaagaaggc-3’(seqidno：38)；362.将筛选出的正确阳性克隆细胞(黑色鼠)按照本领域已知的技术导入已分离好的囊胚中(白色鼠)，得到的嵌合囊胚转移至培养液中短暂培养后移植至受体母鼠(白色鼠)的输卵管，可生产f0代嵌合体鼠(黑白相间)。将f0代嵌合鼠与野生型鼠回交获得f1代鼠，再将f1代杂合小鼠互相交配即可获得f2代纯合子鼠。还可将阳性鼠与flp工具鼠或cre工具鼠交配去除阳性克隆筛选标记基因后，再通过互相交配即可得到cd3e、cd3d、cd3g三基因人源化纯合子小鼠(以下简称cd3edg人源化小鼠)。可通过pcr鉴定子代小鼠体细胞的基因型(引物如表2所示)，示例性的f1代小鼠的鉴定结果见图8，其中，编号为f1-01、f1-02、f1-03的3只小鼠经进一步测序验证为阳性杂合小鼠。363.表2：引物名称及具体序列[0364][0365]这表明使用本方法能构建出可稳定传代且无随机插入的cd3edg基因人源化小鼠。[0366]可通过常规检测方法(例如rt-pcr)确认阳性小鼠体内人cd3e、cd3d、cd3gmrna表达情况。具体来说，分别取8周龄雄性c57bl/6野生型小鼠和cd3edg基因人源化纯合子小鼠各1只，脱颈安乐死后取胸腺组织进行rt-pcr检测，gapdh作为内参，所用引物序列及片段大小如表3所示。rt-pcr检测结果如图9所示，从图中可以看出，在c57bl/6野生型小鼠胸腺组织中仅检测到鼠cd3emrna、cd3dmrna和cd3gmrna(图9a、9c、9e)，而在cd3edg基因人源化小鼠纯合子小鼠胸腺中仅检测到人源化cd3emrna、cd3dmrna和cd3gmrna(图9b、9d、9f)。[0367]表3：rt-pcr引物名称及具体序列[0368][0369][0370]实施例2cd3edg基因人源化小鼠表型鉴定[0371]选取7周龄c57bl/6野生型小鼠和实施例1制得的cd3edg基因人源化纯合子小鼠各3只，脱颈安乐死后取脾脏和胸腺并进行比较。图10为c57bl/6野生型小鼠和cd3edg基因人源化纯合子小鼠脾脏大小、脾脏重量和脾细胞数量比对结果。从图10a可以看出，从形态上看，cd3edg基因人源化纯合子小鼠的脾脏与c57bl/6野生型小鼠的脾脏均呈长椭圆形，大小一致；从图10b可以看出，cd3edg基因人源化纯合子小鼠的脾脏重量和c57bl/6野生型小鼠的脾脏重量一致；此外，cd3edg基因人源化纯合子小鼠的脾细胞数量与c57bl/6野生型小鼠基本一致，未表现出显著差异(图10c)。[0372]图11为c57bl/6野生型小鼠和cd3edg基因人源化纯合子小鼠胸腺大小、胸腺重量和胸腺细胞数量比对结果。从图11a可以看出，从形态上看，cd3edg基因人源化纯合子小鼠的胸腺与c57bl/6野生型小鼠的胸腺形状大小一致；从图11b可以看出，cd3edg基因人源化纯合子小鼠的胸腺重量比c57bl/6野生型小鼠的胸腺重量小，但没有表现出统计学显著差异；cd3edg基因人源化纯合子小鼠的胸腺细胞数量较c57bl/6野生型小鼠小，但未表现出显著差异(图11c)。[0373]进一步通过流式细胞术检测7周龄雌性c57bl/6野生型小鼠和cd3edg基因人源化纯合子小鼠的胸腺、脾脏和淋巴结等淋巴组织中白细胞亚型和t细胞亚型。胸腺中白细胞亚型和t细胞亚型检测结果分别如图12和图13所示，脾脏中白细胞亚型和t细胞亚型检测结果分别如图14和图15所示，淋巴结中白细胞亚型和t细胞亚型检测结果分别如图16和图17所示。从图中可以看出，cd3edg基因人源化纯合子小鼠胸腺、脾脏和淋巴结中t细胞(t，图14、图16)、b细胞(b，图14、图16)、nk细胞(nk，图14、图16)、dc细胞(dc，图14)、粒细胞(gran图14)、单核细胞(mon，图14)、巨噬细胞(图14)等白细胞亚型与c57bl/6野生型小鼠一致，cd4 t细胞(cd4 tcells，图12、图13、图15、图17)、cd8 t细胞(cd8 tcells，图12、图13、图15、图17)和tregs细胞(图13、图15、图17)等t细胞亚型百分比与c57bl/6野生型小鼠相似，表明cd3e、cd3d和cd3g基因的人源化改造没有影响白细胞的分化、发育和在淋巴组织中的分布。[0374]实施例3cd3edg人源化小鼠t细胞激活实验[0375]分别选取c57bl/6野生型小鼠和实施例1制得的cd3edg基因人源化纯合子小鼠(16周龄)各3只，脱颈安乐死后取脾脏组织，分离并选取t细胞(2×105个)，与2ug/ml的抗鼠cd3e抗体anti-mcd3e或抗人cd3e抗体anti-hcd3e和5ug/ml抗鼠cd28抗体anti-mcd28共同孵育，并采用流式细胞术分别检测24h、48h、72h时cd4 t细胞和cd8 t细胞的增殖情况，流式检测结果分别如图18a、图18b和图19a、图19b所示；同时采用elisa方法分别检测24h、48h、72h时c57bl/6野生型小鼠和cd3edg基因人源化纯合子小鼠脾脏组织中ifn-γ和il-2表达情况，进一步验证cd4 t细胞和cd8 t细胞的激活状态，具体检测结果如图20所示。[0376]图18a和图18b分别为c57bl/6野生型小鼠和cd3edg基因人源化纯合子小鼠脾脏中cd4 t细胞检测结果。从图18可以看出，对于c57bl/6野生型小鼠来说，经pbs、anti-mcd3e抗体、anti-hcd3e抗体、或anti-hcd3e抗体和anti-mcd28抗体(anti-hcd3e/anti-mcd28)处理后，cd4 t细胞荧光强度一致，没有发生明显的增殖改变，表现为单峰，但使用anti-mcd3e抗体和anti-mcd28抗体(anti-mcd3e/anti-mcd28)处理后，cd4 t细胞发生显著的增殖，表现为一系列csfe荧光强度对半递减的子峰，根据子峰个数推测72h时这群细胞大致经历了5次分裂；从图18b可以看出，对于cd3edg基因人源化小鼠来说，使用anti-mcd3e/anti-mcd28处理后cd4 t细胞没有发生明显的增殖改变，表现为单峰，但使用anti-hcd3e/anti-mcd28处理后，cd4 t细胞发生显著增殖。[0377]图19a和图19b分别为c57bl/6野生型小鼠和cd3edg基因人源化纯合子小鼠脾脏中cd8 t细胞检测结果。从图19a可以看出，经pbs、anti-mcd3e抗体、anti-hcd3e抗体、或anti-hcd3e/anti-mcd28处理后，c57bl/6野生型小鼠cd8 t细胞荧光强度一致，没有发生明显的增殖改变，表现为单峰，但使用anti-mcd3e/anti-mcd28处理后，cd8 t细胞显著增殖，表现出一系列csfe荧光强度对半递减的子峰，根据子峰个数推测72h时这群细胞大致经历了5次分裂；从图19b可以看出，使用anti-mcd3e/anti-mcd28处理后，cd3edg基因人源化小鼠体内cd8 t细胞没有发生明显增殖，但使用anti-hcd3e/anti-mcd28处理后，cd8 t细胞发生显著增殖。[0378]从图20可以看出，只有同时使用anti-mcd3e抗体(mcd3)和anti-mcd28抗体(mcd28)处理c57bl/6野生型小鼠，和同时使用anti-hcd3e抗体(hcd3)和anti-mcd28抗体(mcd28)处理cd3edg基因人源化小鼠时，在第24h、48h、72h时il-2和ifn-γ均可有效激活，其表达量没有显著差异。[0379]实施例4cd3edg人源化小鼠血清中ova特异性抗体滴度检测[0380]分别选取6周龄c57bl/6野生型小鼠和实施例1制得的cd3edg基因人源化小鼠各5只，眼眶采血50μl，分离血清，使用sbaclonotypingsystem-c57bl/6-hrp的goatanti-mouseig,humanads-unlb、goatanti-mouseiga-hrp、goatanti-mouseigg1,humanads-hrp、goatanti-mouseigg2b,humanads-hrp、goatanti-mouseigg2c,humanads-hrp、goatanti-mouseigg3，humanads-hrp、goatanti-mouseigm,humanads-hrp对小鼠总igg及igga、igm、igg1、igg2b、igg2c、igg3亚型进行定量检测。之后，使用50μg的ova(卵清蛋白)进行背部四个位置皮下注射免疫接种。第一次皮下注射使用完全弗氏佐剂(cfa)乳化，随后的皮下注射使用不完全弗氏佐剂(ifa)乳化。在第三次注射一周之后收集血液(血清)并使用elisa分析抗体效价，每两次免疫之间间隔14天，结果如图21所示。[0381]从图21a中可以看出，免疫前，与c57bl/6野生型小鼠相比，cd3edg基因人源化小鼠血清抗体亚型无显著差异；从图21b可以看出，第三次免疫后，c57bl/6野生型小鼠和cd3edg基因人源化小鼠血清中ova特异性抗体滴度均显著升高。结果表明，人源化cd3e、cd3d和cd3g基因的引入没有影响cd3edg基因人源化小鼠体液免疫反应。[0382]实施例5cd3edg人源化小鼠药效验证实验一[0383]选取实施例1制得的8周龄cd3edg基因人源化雌性纯合小鼠15只，皮下接种小鼠结肠癌细胞mc38(5×105个)，待肿瘤体积达到100±50mm3进行分组，分为对照组g1和治疗组g2、g3(n＝5)。对照组注射人igg抗体(higgab)，给药剂量2mg/kg；治疗组g2注射抗鼠pd-1抗体(mpd-1ab，使用常规方法免疫小鼠得到，参见janeway'simmunobiology(9thedition))，给药剂量10mg/kg；治疗组g3注射抗人cd3e抗体(hcd3eab，来源于proventionbio,inc.)，给药剂量为2mg/kg。给药方式为腹腔注射，分组当天开始给药，每周给药2次，共给药6次。每周测量肿瘤体积2次，接种后单只小鼠肿瘤体积达到3000mm3时执行安乐死。[0384]小鼠体内肿瘤变化情况和小鼠体重变化情况如图22所示。整体来看，各组实验过程中小鼠健康状态良好。在实验终点时，各组动物体重均出现一定程度的增长。所有治疗组(g2、g3)和对照组小鼠(g1)体重在整个实验周期内均无显著区别，整体呈现增长趋势(图22b)；从肿瘤体积测量结果上看(图22a)，对照组(g1)和治疗组(g2、g3)各小鼠肿瘤在实验周期内均持续生长；g2治疗组与对照组相比，肿瘤体积显著减小，而g3组肿瘤生长速度显著高于对照组，这可能是由于g3组抗人cd3e抗体治疗引起的激活诱导的细胞死亡(aicd)效应，使得t细胞耗竭，促进了肿瘤组织的生长，表明cd3edg基因人源化小鼠体内t细胞功能正常。表4中列出了各个实验的主要数据和分析结果，具体包括分组后第0天、分组后14天时、实验结束时(分组后第18天)的肿瘤体积、小鼠存活情况、肿瘤(体积)抑制率(tumorgrowthinhibitionvalue，tgitv)以及治疗组与对照组的小鼠体重、肿瘤体积之间的统计学差异(p值)。[0385]表4肿瘤体积、存活情况及肿瘤抑制率[0386][0387]从表4可见，对照组和治疗组的所有小鼠在实验终点时均存活，所有治疗组与对照组相比，动物体重无显著性差异(p＞0.05)，表明动物对抗鼠pd-1抗体mpd-1ab和抗人cd3抗体hcd3eab耐受良好，未对动物产生明显毒性作用，安全性较好。对照组g1所有小鼠在实验过程中肿瘤持续生长，在实验终点时，对照组平均肿瘤体积为1603±151mm3，治疗组(g2)为668±256mm3，治疗组(g3)为2769±465mm3，所有治疗组小鼠的肿瘤体积与对照组的肿瘤体积相比均具有显著差异(p≤0.05)，tgitv分别为62.3％和-77.8％，但g3组肿瘤体积显著高于对照组，可能是由于g3组抗人cd3e抗体治疗引起的aicd效应，使得t细胞耗竭，促进肿瘤组织生长。[0388]进一步采用流式细胞术检测给药后小鼠外周血以及肿瘤组织中b细胞和t细胞比率。给药48h后，分别从各小鼠外周血和肿瘤组织中分离淋巴细胞并检测t细胞和b细胞的变化情况，图23为外周血中的检测结果，图24为肿瘤组织中的检测结果。[0389]从图23a中可以看出，与对照组g1相比，g3组外周血中t细胞比例显著降低，这可能是由于抗人cd3e抗体治疗引起的aicd效应；g2组抗鼠pd-1抗体治疗组t细胞比例有小幅增加，但未达到统计学显著差异。从图23b中可以看出，与对照组g1相比，g2抗鼠pd-l1抗体治疗组与g3组抗人cd3e抗体治疗组小鼠外周血中b细胞比例稍有增加，但无统计学差异。[0390]从图24a中可以看出，与对照组g1相比，g3组肿瘤组织中t细胞比例显著降低；g2组抗鼠pd-1抗体治疗组由于pd-1抗体解除了免疫抑制效应，t细胞比例显著增加。从图24b中可以看出，与对照组g1相比，g2抗鼠pd-l1抗体治疗组与g3组抗人cd3e抗体治疗组b细胞比例均无显著变化。[0391]上述实验证明，cd3edg基因人源化小鼠是cd3抗体体内药理药效研究的有利工具。[0392]实施例6cd3edg人源化小鼠体外杀伤实验[0393]取高表达人bcma蛋白的mc38细胞接种到96孔板，作为靶细胞。将实施例1制备的6-8周龄雌性cd3edg基因人源化小鼠脱颈安乐死后获得脾脏细胞，作为效应细胞。实验组加入浓度分别为20.000、6.667、2.222、0.741、0.247、0.082、0.027、0.009、0.003或0.001μg/ml的抗人cd3/bcma双特异性抗体受试品ab1(使用常规方法制备获得)，对照组加入等量的受试品的稀释溶剂，37℃5％co2培养箱中孵育48h后取上清进行ldh(乳酸脱氢酶)检测。效应细胞和靶细胞计数比例(e:t)分别为20:1和40:1的检测结果如图26所示。从图中可以看出，孵育48h后，e:t＝20:1和e:t＝40:1两组都检测到ab1对靶细胞的杀伤作用，而且在e:t＝40:1时杀伤效果更明显。[0394]实施例7cd3edg人源化小鼠药效验证实验二[0395]选取实施例1制得的6周龄雌性cd3edg基因人源化纯合小鼠20只，皮下接种高表达人bcma蛋白的小鼠结肠癌细胞mc38(5×105个)，待肿瘤体积达到100±50mm3进行分组，分为对照组g1和治疗组g2、g3、g4(n＝5)。对照组注射生理盐水(0.1mg/kg)，治疗组注射抗人cd3/bcma双特异性抗体(ab1，使用常规方法制备获得)，给药方式为尾静脉注射，分组当天开始给药，每5天给药1次，共给药4次。g2、g3、g4组前3次给药剂量分别为0.001mg/kg、0.01mg/kg、0.1mg/kg，第4次给药剂量分别为0.01mg/kg、0.1mg/kg、0.1mg/kg。每周测量肿瘤体积2次，接种后单只小鼠肿瘤体积达到3000mm3时执行安乐死。[0396]小鼠体内肿瘤变化情况和小鼠体重变化情况如图27所示。整体来看，各组实验过程中小鼠健康状态良好，在实验终点时，各组动物体重均出现一定程度的增长(图27b)。从肿瘤体积测量结果上看(图27a)，对照组(g1)和治疗组(g2、g3、g4)各小鼠肿瘤在实验周期内均持续生长，但与对照组相比，治疗组小鼠肿瘤体积增长变缓，随着给药剂量的增加，g2、g3、g4组小鼠肿瘤体积增长量逐渐减少。结果表明，cd3edg基因人源化小鼠可以用于靶向人cd3蛋白的抗体药物的药效评价，是抗体体内药理药效研究的有利工具。[0397]以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。[0398]另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。[0399]此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。当前第1页12当前第1页12
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：：2.实验动物疾病模型对于研究人类疾病发生的病因、发病机制、开发防治技术和开发药物是不可缺少的研究工具。但由于动物与人类的生理结构和代谢系统本身的差异，传统的动物模型并不能很好的反映人体的真实状况，在动物体内建立更接近人类的生理特征的疾病模型是生物医药行业的迫切需求。3.随着基因工程技术的不断发展和成熟，用人类基因替代或置换动物的同源性基因已经实现，通过这种方式开发人源化实验动物模型(humanizedanimalmodel)是动物模型未来的发展方向。其中基因人源化动物模型，即，利用基因编辑技术，用人源正常或突变基因替换动物基因组的同源基因，可建立更接近人类生理或疾病特征的正常或突变基因动物模型。基因人源化动物不但本身具有重要应用价值，如通过基因人源化可改进和提升细胞或组织移植人源化动物模型，更重要的是，由于人类基因片段的插入，动物体内可表达或部分表达人源蛋白，可作为仅能识别人蛋白序列的药物的靶点，为在动物水平进行抗人抗体及其它药物的筛选提供了可能。然而，由于动物与人类在生理学及病理学方面存在差异，加上基因(即遗传因子)的复杂性，如何能构建出“有效”的人源化动物模型用于新药研发仍是最大的挑战(scheern,snaithm,wolfcr,seiblerj.generationandutilityofgeneticallyhumanizedmousemodels,drugdiscovtoday；18(23-24):1200-11,2013)。4.免疫疗法通过激活免疫系统攻击并杀死癌细胞，是肿瘤研究的一个重要领域，近十年来已经应用在临床治疗中。免疫细胞尤其是t细胞在免疫应答整个过程中处于核心地位。t细胞表面存在众多的cd分子，广泛参与了t细胞识别抗原、活化增殖或失活、凋亡及清除异体抗原或自身抗原耐受等免疫效应全过程，其中cd3与t细胞表面的t细胞受体(tcr)组成tcr-cd3复合体，在抗原识别和免疫信号传导过程中具有重要作用。cd3分子是肽链以非共价键组成的复合分子，在哺乳动物中，该复合物含有一个cd3γ链、cd3δ链和2条cd3ε链。cd3主要的分子功能为：(1)稳定tcr结构；(2)传递t细胞活化信号，当tcr特异性识别并结合抗原后，cd3参与将信号传到t细胞胞浆内，作为诱导t细胞活化的第一信号。cd3分子除分布于t细胞外，还分布于胸腺细胞和部分自然杀伤细胞。5.由于所有t细胞表面均表达有cd3分子，因此可应用cd3抗体诱导调节t细胞水平。作为最早应用于临床的单克隆抗体，早在20世纪80年代，cd3抗体莫罗单抗(moronomab，okt3)作为免疫抑制剂，就被广泛应用于抑制器官移植时的免疫排斥反应且获得了良好效果。该抗体直接靶向cd3ε链，但由于是鼠源抗体(鼠igg2a)，由此引发的免疫原性和抗体本身的丝裂原性限制了其应用。随着基因工程技术的发展，目前已经开发出多种嵌合cd3抗体、人源化cd3抗体和全人cd3抗体，降低抗体免疫原性、提高安全性。多数治疗性抗人cd3抗体均与cd3ε链结合，目前均处于临床阶段。有研究证实相比静脉注射，采取口服cd3抗体的给药方式可诱导免疫耐受且减少副反应。如通过口服给药等方式施用cd3抗体可促进t细胞增殖，抑制th1和th17应答、增加tgf-β/il-10表达，并通过树突状细胞抑制il-23/il-6表达。此外，能结合cd3和其它抗原的双特异性抗体也是研究热点，全球范围内已有双特异性抗体药获批，包括removab(catumaxomab，同时阻断epcam和cd3，用于治疗肿瘤引起的恶性腹水)和blincyto(blinatumomab，阻断cd3和cd19，用于治疗急性淋巴细胞白血病)。cd3抗体联合其他药物以提高免疫应答或降低免疫耐受也是临床中的研究热点，已有研究表明cd3与其它抗体的联用往往具有协同作用，但有研究发现cd3与其它调节剂联用，如与免疫抑制剂(如环孢菌素)联用可能会干扰抗cd3单克隆抗体的耐受性，在考虑组合之前必须进行研究(kuhncetal.,immunotherapy.2016jul；8(8):889-906)。6.上述研究表明cd3抗体在治疗慢性炎症和自身免疫性疾病治疗方面具有巨大的潜力，但cd3抗体具有高度的物种特异性(species-specific)，即人cd3抗体与其它动物的t细胞没有交叉反应，甚至不与普通非人类灵长类动物如恒河猴或食蟹猴交叉反应，以前只能在黑猩猩体内进行临床前研究(raopeetal.,transplantation.1991oct；52(4):691-7)，很难在其它动物模型体内进行包括作用机理、潜在药效在内的相关临床前研究。7.人cd3蛋白和鼠cd3蛋白之间存在显著差异，如人cd3ε肽链和cd3γ肽链序列与鼠类对应序列的一致性分别为41％和43％，所以，无法用普通小鼠来筛选和评价靶向cd3药物的药效。目前用于人cd3抗体研究的小鼠模型主要有两种。其中一种是人源化cd3ε转基因小鼠(delaheraaetal.,jexpmed.1991jan1；173(1):7-17；kuhncetal.,scitranslmed.2011feb2)。该人源化cd3ε转基因小鼠使用小鼠cd3启动子调控人cd3ε基因的表达，小鼠体内同时表达人和鼠cd3e蛋白，在一些研究如药效研究中，鼠cd3e蛋白的存在可能会对药效有影响。并且，其制备过程需要与不同背景的小鼠多次回交，制备周期长、背景复杂。此外，转基因技术制备的小鼠存在诸多缺点，如插入位点的不确定性、插入拷贝数的不确定性、蛋白表达量不稳定以及后代的转基因遗传的不稳定性，从而造成实验数据的不可重复性及基因遗传丢失等等问题，而不能被广泛使用(mangsbosmetal.clincancerres,2015mar1；21(5):1115-26，uranoketal.vetpathol,2012jan:49(1):16-23)。另一种是人源肿瘤异体移植小鼠模型。建模过程是：先使用重度免疫缺陷小鼠进行人造血干细胞重建，再进行人肿瘤异体移植。该类模型构建过程繁琐、费用高，在特定靶点研究中的靶向性和特异性不强，用这类模型研究药效的结果准确性不高。因此本领域急需更便利的动物模型，用于靶向cd3的抗体及其联用的相关研究和临床前试验。8.鉴于cd3分子在免疫治疗领域具有巨大应用价值，为了使临床前期的试验更有效，并改进现有动物模型的不足，本发明旨在制备一种非人动物模型，该动物体内可表达人或人源化cd3e、cd3d和cd3g蛋白，且表达的人或人源化cd3蛋白能识别并结合人cd3抗体/抗原，该方法在药物筛选、验证等方面有着广阔的应用前景。技术实现要素：9.本发明的第一方面，提供了一种人源化cd3e基因，所述的人源化cd3e基因包含人cd3e基因的部分。10.优选的，所述的人cd3e基因的部分包含人cd3e基因1号外显子至9号外显子中的任一种或两种以上的组合。进一步优选包含2号至9号外显子的全部或部分。更进一步优选包含2号外显子的部分、3号至8号外显子的全部和9号外显子的部分，优选还包含2-3号内含子和/或8-9号内含子，其中，2号外显子的部分至少包含20bp的核苷酸序列，例如至少包含20、30、40、45、46、47、48、49、50、70、90、100、108bp的核苷酸序列；2号外显子的部分至少包含编码人cd3e蛋白信号肽的核苷酸序列，9号外显子的部分至少包含20bp的核苷酸序列，例如至少包含20、30、40、50、55、56、57、60、80、100、300、500、600、687bp、688bp的核苷酸序列；9号外显子的部分至少包含编码人cd3e蛋白胞质区的核苷酸序列。11.优选的，所述的人cd3e基因的部分包含人cd3e基因2号至7号外显子的全部或部分。进一步优选包含2号外显子的部分、3号至6号外显子的全部和7号外显子的部分，优选还包含2-3号内含子和/或6-7号内含子。其中，2号外显子的部分至少包含20bp的核苷酸序列，例如至少包含20、30、40、45、46、47、48、49、50、70、90、100、108bp的核苷酸序列。7号外显子的部分至少包含15bp的核苷酸序列，例如至少包含15、20、25、26、27、28、29、30、40、45、50、51、52、53、54、55、56、57、60、80、100、150、167bp、168bp的核苷酸序列。12.优选的，所述的人源化cd3e基因包含编码人cd3e蛋白信号肽、胞外区、胞质区和/或跨膜区的核苷酸序列。13.在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化cd3e基因包含编码人cd3e蛋白胞外区的核苷酸序列。14.优选的，所述的人源化cd3e基因编码所述的人源化cd3e蛋白。15.在本发明的一个具体实施方式中，所述的人cd3e基因的部分核苷酸序列包含下列组中的一种：16.(a)seqidno：14或63所示核苷酸序列；17.(b)与seqidno：14或63所示核苷酸序列的同一性至少为75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的核苷酸序列；18.(c)与seqidno：14或63所示核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸的核苷酸序列；或，19.(d)具有seqidno：14或63所示核苷酸序列的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。20.所述的人源化cd3e基因包含seqidno：15、16、17、64和/或36所示核苷酸序列，或包含与seqidno:15、16、17、64和/或36具有至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％同一性的核苷酸序列。21.优选的，所述人源化cd3e基因转录的mrna包含下列组中的一种：22.(a)seqidno：18或65所示核苷酸序列；23.(b)与seqidno：18或65所示核苷酸序列的同一性至少为75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的核苷酸序列；24.(c)与seqidno：18或65所示核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸的核苷酸序列；或，25.(d)具有seqidno：18或65所示核苷酸序列的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。26.本发明的第二方面，提供了一种嵌合基因，所述的嵌合基因包含上述的人源化cd3e基因。27.优选的，所述的嵌合基因还包含人cd3d基因与人cd3g基因的全部或部分核苷酸序列。更优选包含人cd3d基因的1号外显子至5号外显子的全部和人cd3g基因的1号外显子至7号外显子的全部。28.所述的嵌合基因包含seqidno:10、11和/或35所示核苷酸序列，或包含与seqidno:10、11和/或35具有至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％同一性的核苷酸序列。29.优选的，所述的嵌合基因还包含编码人cd3d和/或cd3g蛋白信号肽、胞外区、胞质区和/或跨膜区的核苷酸序列。30.优选的，所述的嵌合基因编码所述的人源化cd3e蛋白、人源化cd3d蛋白和/或人源化cd3g蛋白。31.在本发明的一个具体实施方式中，所述的嵌合基因包含下列组中的一种：32.(a)seqidno：9所示核苷酸序列；33.(b)与seqidno：9所示核苷酸序列的同一性至少为75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的核苷酸序列；34.(c)与seqidno：9所示核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸的核苷酸序列；或，35.(d)具有seqidno：9所示核苷酸序列的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。36.在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化cd3e基因或嵌合基因还包含特异性诱导物或阻遏物，进一步优选的，所述的特异性诱导物或阻遏物可以为常规可以诱导或阻遏的物质。37.在本发明的一个具体实施方式中，所述的特异性诱导物选自四环素系统(tet-offsystem/tet-onsystem)或他莫昔芬系统(tamoxifensystem)。38.本发明的第三方面，提供了一种人源化cd3e蛋白，所述的人源化cd3e蛋白包含人cd3e蛋白的全部或部分。39.优选的，所述的人源化cd3e蛋白是由上述的人源化cd3e基因编码的。40.优选的，所述的人源化cd3e蛋白包含人cd3e蛋白的信号肽、跨膜区、胞质区和/或胞外区。优选的，所述的人源化cd3e蛋白包含人cd3e蛋白的胞外区。41.进一步优选的，所述的人源化cd3e蛋白包含人cd3e蛋白的信号肽、跨膜区、胞质区和胞外区。42.在一些实施方式中，所述的人源化cd3e蛋白还包含非人动物跨膜区和/或胞质区。43.优选的，所述的人源化cd3e蛋白包含人cd3e基因的1号至9号外显子的全部或部分编码的氨基酸序列。进一步优选包含人cd3e基因的1号至9号外显子中的一种或两种以上的组合编码的氨基酸序列。更进一步优选包含人cd3e基因的2号至9号外显子编码的氨基酸序列。44.优选的，所述的人源化cd3e蛋白包含人cd3e基因的2号至7号外显子的全部或部分编码的氨基酸序列。45.在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化cd3e蛋白的氨基酸序列包含下列组中的一种：46.a)seqidno：2或66所示的氨基酸序列；47.b)与seqidno：2或66具有60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％同一性的氨基酸序列；48.c)与seqidno：2或66所示氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；或，49.d)包含具有seqidno：2或66所示的包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。50.本发明的第四方面，提供了一种人源化cd3d蛋白，所述的人源化cd3d蛋白包含人cd3d蛋白的全部或部分。51.优选的，所述的人源化cd3d蛋白是由上述的嵌合基因的部分编码的。52.优选的，所述的人源化cd3d蛋白包含人cd3d蛋白的信号肽、跨膜区、胞质区和/或胞外区。优选的，所述的人源化cd3d蛋白包含人cd3d蛋白的胞外区。53.进一步优选的，所述的人源化cd3d蛋白包含人cd3d蛋白的信号肽、跨膜区、胞质区和胞外区。54.优选的，所述的人源化cd3d蛋白包含人cd3d基因的1号至5号外显子的全部或部分编码的氨基酸序列。进一步优选包含人cd3d基因的1号至5号外显子中的任一种或两种以上的组合编码的氨基酸序列。更进一步优选包含人cd3d基因的1号至5号外显子的全部编码的氨基酸序列。55.在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化cd3d蛋白包含seqidno:4，或包含与seqidno:4具有至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％同一性的氨基酸序列。56.本发明的第五方面，提供了一种人源化cd3g蛋白，所述的人源化cd3g蛋白包含人cd3g蛋白的全部或部分。57.优选的，所述的人源化cd3g蛋白是由上述的嵌合基因的部分编码的。58.优选的，所述的人源化cd3g蛋白包含人cd3g蛋白的信号肽、跨膜区、胞质区和/或胞外区。优选的，所述的人源化cd3g蛋白包含人cd3g蛋白的胞外区。59.进一步优选的，所述的人源化cd3g蛋白包含人cd3g蛋白的信号肽、跨膜区、胞质区和胞外区。60.优选的，所述的人源化cd3g蛋白包含人cd3g基因的1号至7号外显子的全部或部分编码的氨基酸序列。进一步优选包含人cd3g基因的1号至7号外显子中的任一种或两种以上的组合编码的氨基酸序列。更进一步优选包含人cd3g基因的1号至7号外显子的全部编码的氨基酸序列。61.在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化cd3g蛋白包含seqidno:6，或包含与seqidno:6具有至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％同一性的氨基酸序列。62.本发明的第六方面，提供了一种tcr-cd3复合物，所述的tcr-cd3复合物包含1)人或人源化cd3e蛋白、2)人或人源化cd3d蛋白和/或3)人或人源化cd3g蛋白。63.本发明的第七方面，提供了一种cd3e基因的靶向载体，所述的靶向载体包含人cd3e基因2号至9号外显子的全部或部分。优选包含人cd3e基因的2号外显子的部分、3号至8号外显子的全部和9号外显子的部分，优选还包含2-3号内含子和/或8-9号内含子，进一步优选包含seqidno：14所示的核苷酸序列。或者所述的靶向载体包含人cd3e基因的2号至7号外显子的全部或部分。优选包含人cd3e基因的2号外显子的部分、3号至6号外显子的全部和7号外显子的部分核苷酸序列。进一步优选包含seqidno：63所示的核苷酸序列。所述的靶向载体至少包含编码胞外区的全部或部分核苷酸序列。64.所述的靶向载体还包含5’臂和/或3’臂；65.所述的5’臂为与待改变的转换区5’端同源的dna片段，所述的3’臂为与待改变的转换区3’端同源的dna片段，所述的待改变的转换区位于非人动物cd3g基因的2号至8号外显子上。66.所述的5’臂选自非人动物cd3e基因基因组dna的100-10000个长度的核苷酸，优选与ncbi登录号为nc_000075.7至少具有90％同源性的核苷酸，进一步优选与seqidno:12至少具有90％同源性，或者如seqidno:12所示；67.所述的3’臂选自非人动物cd3e基因基因组dna的100-10000个长度的核苷酸，优选与ncbi登录号为nc_000075.7至少具有90％同源性的核苷酸，进一步优选与seqidno:13至少具有90％同源性，或者如seqidno:13所示。68.所述的靶向载体包含seqidno：15、16、17、64和/或36所示核苷酸序列，或包含与seqidno：15、16、17、64和/或36具有至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％同一性的核苷酸序列。69.本发明的第八方面，提供了一种靶向载体，所述的靶向载体包含人cd3d基因与人cd3g基因的核苷酸序列。优选包含人cd3d基因的1号外显子至5号外显子的全部和人cd3g基因的1号外显子至7号外显子的全部。进一步优选包含seqidno:9所示的核苷酸序列。70.所述的靶向载体还包含5’臂和/或3’臂；71.所述的5’臂为与待改变的转换区5’端同源的dna片段，所述的待改变的转换区5’端位于非人动物cd3d基因的1号至5号外显子上。72.所述的3’臂为与待改变的转换区3’端同源的dna片段，所述的待改变的转换区3’端位于非人动物cd3g基因的1号至7号外显子上。73.所述的5’臂选自非人动物cd3d基因基因组dna的100-10000个长度的核苷酸，优选与ncbi登录号为nc_000075.7至少具有90％同源性的核苷酸，进一步优选与seqidno:7至少具有90％同源性，或者如seqidno:7所示；74.所述的3’臂选自非人动物cd3g基因基因组dna的100-10000个长度的核苷酸，优选与ncbi登录号为nc_000075.7至少具有90％同源性的核苷酸，进一步优选与seqidno:8至少具有90％同源性，或者如seqidno:8所示。75.所述的靶向载体包含seqidno:10、11和/或35所示核苷酸序列，或包含与seqidno:10、11和/或35具有至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％同一性的核苷酸序列。76.本发明所述的靶向载体还包含标记基因。进一步优选的，所述标记基因为负筛选标记的编码基因，更进一步优选的，所述负筛选标记的编码基因为白喉毒素a亚基的编码基因(dta)。77.在本发明的一个具体实施方式中，所述的靶向载体中还包括阳性克隆筛选的抗性基因，进一步优选的，所述阳性克隆筛选的抗性基因为新霉素磷酸转移酶编码序列neo或潮霉素抗性基因编码序列hygr。78.在本发明的一个具体实施方式中，所述的靶向载体中还包括特异性重组系统，进一步优选的，所述特异性重组系统为frt重组位点或loxp重组系统，所述的特异性重组系统为具有两个frt或loxp重组位点，分别同向连接在抗性基因的两侧。79.本发明的第九方面，提供了一种包含上述靶向载体的细胞。80.本发明的第十方面，提供了一种上述的靶向载体或上述的细胞在cd3e、cd3d和/或cd3g基因修饰中的应用。81.本发明的第十一方面，提供了一种经遗传修饰的非人动物，所述的非人动物体内表达1)人或人源化cd3e蛋白，2)人或人源化cd3d蛋白，和/或3)人或人源化cd3g蛋白。82.优选的，所述的非人动物的内源cd3e、cd3d和/或cd3g蛋白的表达降低或缺失。83.优选的，所述的人源化cd3e蛋白为上述的人源化cd3e蛋白。84.优选的，所述的人源化cd3d蛋白为上述的人源化cd3d蛋白。85.优选的，所述的人源化cd3g蛋白为上述的人源化cd3g蛋白。86.优选的，所述的人源化cd3e蛋白包含人cd3e蛋白的信号肽、跨膜区、胞质区和/或胞外区。进一步优选的，所述的人源化cd3e蛋白包含人cd3e蛋白的信号肽、跨膜区、胞质区和胞外区。87.在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化cd3e蛋白的氨基酸序列包含下列组中的一种：88.a)seqidno：2或66所示的氨基酸序列；89.b)与seqidno：2或66具有60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％同一性的氨基酸序列；90.c)与seqidno：2或66所示氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；或，91.d)包含具有seqidno：2或66所示的包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。92.优选的，所述的人源化cd3d蛋白包含人cd3d蛋白的信号肽、跨膜区、胞质区和/或胞外区。进一步优选的，所述的人源化cd3d蛋白包含人cd3d蛋白的信号肽、跨膜区、胞质区和胞外区。93.在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化cd3d蛋白包含seqidno:4，或包含与seqidno:4具有至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％同一性的氨基酸序列。94.优选的，所述的人源化cd3g蛋白包含人cd3g蛋白的信号肽、跨膜区、胞质区和/或胞外区。进一步优选的，所述的人源化cd3g蛋白包含人cd3g蛋白的信号肽、跨膜区、胞质区和胞外区。95.在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化cd3g蛋白包含seqidno:6，或包含与seqidno:6具有至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％同一性的氨基酸序列。96.所述的非人动物的基因组中包含1)人cd3e基因的全部或部分，2)人cd3d基因的全部或部分，和/或3)人cd3g基因的全部或部分。97.优选的，所述的人cd3e基因的部分包含人cd3e基因1号外显子至9号外显子中的任一种或两种以上的组合。进一步优选包含2号至9号外显子的全部或部分，进一步优选包含2号外显子的部分、3号至8号外显子的全部和9号外显子的部分，优选还包含2-3号内含子和/或8-9号内含子。98.其中，2号外显子的部分至少包含20bp的核苷酸序列，例如至少包含20、30、40、45、46、47、48、49、50、70、90、100、108bp的核苷酸序列；2号外显子的部分至少包含编码人cd3e蛋白信号肽的核苷酸序列。99.9号外显子的部分至少包含20bp的核苷酸序列，例如至少包含20、30、40、50、55、56、57、60、80、100、300、500、600、687、688bp的核苷酸序列；9号外显子的部分至少包含编码人cd3e蛋白胞质区的核苷酸序列。100.优选的，所述的人cd3e基因的部分包含人cd3e基因2号至7号外显子的全部或部分。进一步优选包含人cd3e基因2号外显子的部分、3号至6号外显子的全部和7号外显子的部分，优选还包含2-3号内含子和/或6-7号内含子。其中，2号外显子的部分至少包含20bp的核苷酸序列，例如至少包含20、30、40、45、46、47、48、49、50、70、90、100、108bp的核苷酸序列。7号外显子的部分至少包含15bp的核苷酸序列，例如至少包含15、20、25、26、27、28、29、30、40、45、50、51、52、53、54、55、56、57、60、80、100、150、167、168bp的核苷酸序列。101.进一步优选至少包含编码胞外区的全部或部分核苷酸序列。102.在本发明的一个具体实施方式中，所述的人cd3e基因的部分核苷酸序列包含下列组中的一种：103.(a)seqidno：14或63所示核苷酸序列；104.(b)与seqidno：14或63所示核苷酸序列的同一性至少为75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的核苷酸序列；105.(c)与seqidno：14或63所示核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸的核苷酸序列；或，106.(d)具有seqidno：14或63所示核苷酸序列的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。107.优选的，所述的非人动物的基因组中包含人源化cd3e基因，所述的人源化cd3e基因包含人cd3e基因的2号外显子的部分、3号至8号外显子的全部和9号外显子的部分，优选还包含2-3号内含子和/或8-9号内含子；或者所述的人源化cd3e基因包含人cd3e基因的2号外显子的部分、3号至6号外显子的全部和7号外显子的部分，优选还包含2-3号内含子和/或6-7号内含子。108.进一步优选的，所述的人源化cd3e基因转录的mrna包含下列组中的一种：109.(a)seqidno：18或65所示核苷酸序列；110.(b)与seqidno：18或65所示核苷酸序列的同一性至少为75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的核苷酸序列；111.(c)与seqidno：18或65所示核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸的核苷酸序列；或，112.(d)具有seqidno：18或65所示核苷酸序列的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。113.优选的，所述的人cd3e基因的部分或人源化cd3e基因通过内源性调控元件调控。优选的，所述的调控元件为启动子。114.优选的，所述的人cd3d基因的部分包含人cd3d基因1号外显子至5号外显子中的任一种或两种以上的组合，优选包含1号外显子至5号外显子的全部或部分。115.优选的，所述的人cd3g基因的部分包含人cd3g基因1号外显子至7号外显子中的任一种或两种以上的组合，优选包含1号外显子至7号外显子的全部或部分。116.进一步优选的，所述的非人动物的基因组中包含人cd3d基因与人cd3g基因的核苷酸序列。更优选包含下列组中的一种：117.(a)seqidno：9所示核苷酸序列；118.(b)与seqidno：9所示核苷酸序列的同一性至少为75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的核苷酸序列；119.(c)与seqidno：9所示核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸的核苷酸序列；或，120.(d)具有seqidno：9所示核苷酸序列的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。121.优选的，所述的非人动物的基因组中包含seqidno:10、11和/或35所示核苷酸序列，或包含与seqidno:10、11和/或35具有至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％同一性的核苷酸序列。122.优选的，所述的非人动物的基因组中包含seqidno：15、16、17、64和/或36所示核苷酸序列，或包含与seqidno：15、16、17、64和/或36具有至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％同一性的核苷酸序列。123.在本发明的一个具体实施方式中，所述的非人动物的基因组中包含seqidno：15和36所示的核苷酸序列。124.在本发明的一个具体实施方式中，所述的非人动物的基因组中包含seqidno：64和36所示的核苷酸序列。125.优选的，所述的人cd3d和/cd3g基因的部分由外源调控元件调控。进一步优选为人源。126.优选的，所述的人cd3e、cd3d和/或cd3g基因连接到内源或人调控元件上。进一步优选的，所述的人cd3e基因连接到内源调控元件上，所述的人cd3d和/或cd3g基因连接到人调控元件上。127.本发明所述的cd3e蛋白、cd3d蛋白以及cd3g蛋白在非人动物体内形成功能性复合物(优选为功能性tcr-cd3复合物)，并在该非人动物体内发挥作用。其中，cd3e蛋白可以为内源、人或人源化cd3e蛋白。cd3d蛋白可以为内源、人或人源化cd3d蛋白。cd3g蛋白可以为内源、人或人源化cd3g蛋白。但是三个蛋白中至少有一个包含人cd3e、cd3d或cd3g蛋白。例如，内源cd3e蛋白、人或人源化cd3d蛋白与人或人源化cd3g蛋白形成tcr-cd3复合物；或者人或人源化cd3e蛋白、内源cd3d蛋白与人或人源化cd3g蛋白形成tcr-cd3复合物；或者人或人源化cd3e蛋白、人或人源化cd3d蛋白与内源cd3g蛋白形成tcr-cd3复合物；或者内源cd3e蛋白、内源cd3d蛋白与人或人源化cd3g蛋白形成tcr-cd3复合物；或者内源cd3e蛋白、人或人源化cd3d蛋白与内源cd3g蛋白形成tcr-cd3复合物；或者人或人源化cd3e蛋白、内源cd3d蛋白与内源cd3g蛋白形成tcr-cd3复合物。128.优选的，所述的人或人源化cd3e蛋白、人或人源化cd3d蛋白与人或人源化cd3g蛋白形成tcr-cd3复合物。129.在本发明的一个具体实施方式中，人或人源化cd3e蛋白、人cd3d蛋白与人cd3g蛋白形成tcr-cd3复合物。130.根据本发明的一些实施例，所述的非人动物进一步包含其他基因修饰，所述其他基因选自pd-1、pd-l1、4-1bb、tigit、b7-h3、cd28、cd38和cldn18.2中的至少一种。131.优选的，所述的非人动物可以选自啮齿类动物、猪、兔子、猴子等任何可以进行基因编辑制备基因人源化的非人动物。132.优选的，所述的非人动物为非人哺乳动物，进一步优选的，所述的非人哺乳动物为啮齿类动物，更进一步优选的，所述的啮齿类动物为大鼠或小鼠。133.优选的，所述的非人动物是免疫缺陷的非人哺乳动物，进一步优选的，所述的免疫缺陷的非人哺乳动物为免疫缺陷的啮齿类动物、免疫缺陷的猪、免疫缺陷的兔子或免疫缺陷的猴子，更优选的，所述的免疫缺陷的啮齿类动物为免疫缺陷的小鼠或大鼠，更进一步优选的，所述免疫缺陷鼠是nod-prkdcscidil-2rγnull小鼠、nod-rag1-/-‑il2rg-/-(nrg)小鼠、rag2-/-‑il2rg-/-(rg)小鼠、nod/scid小鼠或者裸鼠。134.在本发明的一个具体实施方式中，所述的非人动物对于经遗传修饰的内源性非人cd3基因座而言为纯合的。135.在本发明的一个具体实施方式中，所述的非人动物对于经遗传修饰的内源性非人cd3基因座而言为杂合的。136.本发明的第十二方面，提供了一种上述的非人动物的构建方法，所述的构建方法包括用包含人cd3e基因的全部或部分、人cd3d基因的全部或部分和/或人cd3g基因的全部或部分导入非人动物cd3e、cd3d和/或cd3g基因座上。优选的，利用靶向载体进行导入。137.优选的，所述的非人动物的基因组中包含上述的嵌合基因。138.优选的，所述的非人动物体内表达上述的嵌合基因编码的蛋白。139.优选的，包括用包含人cd3e基因2号至9号外显子的全部或部分导入非人动物cd3e基因座上，优选用包含人cd3e基因的2号外显子的部分、3号至8号外显子的全部和9号外显子的部分导入非人动物cd3e基因座上，优选还包含2-3号内含子和/或8-9号内含子，其中，2号外显子的部分至少包含20bp的核苷酸序列，例如至少包含20、30、40、45、46、47、48、49、50、70、90、100、108bp的核苷酸序列；2号外显子的部分至少包含编码人cd3e蛋白信号肽的核苷酸序列，9号外显子的部分至少包含20bp的核苷酸序列，例如至少包含20、30、40、50、55、56、57、60、80、100、300、500、600、687、688bp的核苷酸序列；9号外显子的部分至少包含编码人cd3e蛋白胞质区的核苷酸序列，进一步优选用包含seqidno:14所示的核苷酸序列导入非人动物cd3e基因座上。140.优选的，包括用包含人cd3e基因2号至7号外显子的全部或部分导入非人动物cd3e基因座上。进一步优选包括用包含人cd3e基因2号外显子的部分、3号至6号外显子的部分和7号外显子的部分导入非人动物cd3e基因座上，优选还包含2-3内含子和6-7内含子的全部。其中，2号外显子的部分至少包含20bp的核苷酸序列，例如至少包含20、30、40、45、46、47、48、49、50、70、90、100、108bp的核苷酸序列；7号外显子的部分至少包含15bp的核苷酸序列，例如至少包含15、20、25、26、27、28、29、30、40、45、50、51、52、53、54、55、56、57、60、80、100、150、167、168bp的核苷酸序列，更进一步优选用包含seqidno：63所示的核苷酸序列导入非人动物cd3e基因座上。141.优选的，本技术中所述的导入包括但不限于插入、替换或转基因，所述的替换优选为原位替换或插入。142.优选的，所述的导入为替换或插入，任选地，所述的导入非人动物cd3e基因座为替换非人动物相应区域，进一步优选的，所述的替换到非人动物cd3e基因座为替换非人动物cd3e基因的2号外显子至8号外显子的核苷酸序列，优选替换非人动物cd3e基因的2号外显子的部分、3号至7号外显子的全部和8号外显子的部分，其中，2号外显子的部分至少包含从2号外显子3’‑5’的长度为20-100bp的核苷酸序列，具体为至少包含从2号外显子3’‑5’的长度为20、25、30、35、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、60、70、80、90或100bp，8号外显子的部分至少包含从8号外显子5’‑3’的长度为40-844bp的核苷酸序列，具体为40、45、50、51、52、53、54、55、56、57、60、80、100、300、500、600、700或844bp的核苷酸序列，更优选替换非人动物与ncbi登录号为nc_000075.7的第44910829至44920694所示序列相同的核苷酸序列。143.优选的，所述的导入非人动物cd3e基因座为替换编码seqidno：1第1-189位的核苷酸序列。144.优选的，所述的替换到非人动物cd3e基因座为替换非人动物cd3e基因的2号外显子至6号外显子的核苷酸序列，优选替换非人动物2号外显子的部分、3号至5号外显子的全部和6号外显子的部分，其中，2号外显子的部分至少包含从2号外显子3’‑5’的长度为20-100bp的核苷酸序列，具体为至少包含从2号外显子3’‑5’的长度为20、25、30、35、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、60、70、80、90或100bp的核苷酸序列，6号外显子的部分至少包含从6号外显子的5’‑3’的长度为10-167bp的核苷酸序列，具体为至少包含从6号外显子的5’至长度为10、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、40、50、60、70、80、90、100、150、160或167bp的核苷酸序列，更优选替换非人动物与ncbi登录号为nc_000075.7的第44912419至44920694所示序列相同的核苷酸序列。145.优选的，所述的导入非人动物cd3e基因座为替换编码seqidno：1第1-108位的核苷酸序列。146.优选的，使用基因编辑技术进行非人动物的构建，所述的基因编辑技术包括利用胚胎干细胞的基因打靶技术、crispr/cas9技术、锌指核酸酶技术、转录激活子样效应因子核酸酶技术、归巢核酸内切酶或其他分子生物学技术。147.在本发明的一个具体实施方式中，使用上述的靶向载体进行非人动物的构建。148.优选的，包括用包含人cd3d基因1号外显子至5号外显子的全部或部分导入非人动物cd3d基因座上。149.优选的，包括用包含人cd3g基因1号外显子至7号外显子的全部或部分导入非人动物cd3g基因座上。150.进一步优选的，包括用包含人cd3d基因与人cd3g基因的核苷酸序列导入非人动物cd3d和/或cd3g基因座上。更进一步优选用包含seqidno：9所示核苷酸序列导入非人动物cd3d和cd3g基因座上。151.优选的，所述的导入非人动物cd3d和/或cd3g基因座为替换非人动物相应区域，进一步所述的替换到非人动物cd3d和/或cd3g基因座为替换非人动物cd3d基因的1号至5号外显子的全部和cd3g基因的1号至7号外显子的全部。更优选替换非人动物与ncbi登录号为nc_000075.7的第44880866至44898910位所示序列相同的核苷酸序列。152.在本发明的一个具体实施方式中，使用上述的靶向载体进行非人动物的构建。153.在本发明的一个具体实施方式中，所述的构建方法包括将上述靶向载体导入非人动物细胞中，培养该细胞(优选为胚胎干细胞)，然后将培养后的细胞移植至雌性非人动物输卵管内，允许其发育，鉴定筛选获得经遗传修饰的非人动物。154.优选的，为提高重组效率，还可以使用靶向cd3e、cd3d和/或cd3g基因的sgrna与上述靶向载体一起进行非人动物的构建。其中，所述的sgrna靶向非人动物cd3e、cd3d和/或cd3g基因，同时所述sgrna的序列在待改变的cd3e、cd3d和/或cd3g基因上的靶序列上。155.优选的，所述的构建方法包括：156.a)用包含人cd3e基因的全部或部分导入非人动物cd3e基因座上；157.b)用包含人cd3d基因的全部或部分和/或人cd3g基因的全部或部分导入非人动物cd3d和/或cd3g基因座上；158.或者，159.a)所述的构建方法包括用包含人cd3d基因的全部或部分和/或人cd3g基因的全部或部分导入非人动物cd3d和/或cd3g基因座上；160.b)用包含人cd3e基因的全部或部分导入非人动物cd3e基因座上。161.在本发明提供的制备方法中，优选通过二次打靶制备cd3e、cd3d和cd3g人源化非人动物。在一些实施方式中，将人cd3d和cd3g基因片段的全部或部分导入非人动物相应区域后(非人动物cd3d和cd3g基因的内源位点)，再通过二次打靶将人cd3e基因片段的全部或部分导入相应区域(非人动物cd3e基因的内源位点)。在另一些实施方式中，将人cd3e基因片段的全部或部分导入相应区域(非人动物cd3e基因的内源位点)后，再通过二次打靶将人cd3d和cd3g基因片段的全部或部分导入非人动物相应区域后(非人动物cd3d和cd3g基因的内源位点)。162.具体地，所述的制备方法包括:163.a)使用上述的cd3e基因的靶向载体获得cd3e基因人源化非人动物；164.b)使用上述的cd3d和cd3g基因的靶向载体获得cd3e、cd3d和cd3g基因人源化非人动物；165.或者，166.a)使用上述的cd3d和cd3g基因的靶向载体获得cd3d和cd3g基因人源化非人动物；167.b)使用上述的cd3e基因的靶向载体获得cd3e、cd3d和cd3g基因人源化非人动物。168.在本发明的一个具体实施方式中，所述的构建方法包括：169.a)用包含seqidno：14或63所示的核苷酸序列导入非人动物cd3e基因座上；170.b)用包含seqidno：9所示核苷酸序列导入非人动物cd3d和cd3g基因座上；或者，171.a)用包含seqidno：9所示核苷酸序列导入非人动物cd3d和cd3g基因座上；172.b)用包含seqidno：14或63所示的核苷酸序列导入非人动物cd3e基因座上。173.所述的构建方法包括用包含编码人cd3e、cd3d和/或cd3g蛋白的全部或部分核苷酸序列导入非人动物cd3e、cd3d和/或cd3g基因座上。174.优选的，包括用包含编码人cd3e蛋白的全部或部分核苷酸序列导入非人动物cd3e基因座。进一步优选的，包括用包含编码人cd3e蛋白的信号肽、跨膜区、胞质区和/或胞外区的全部或部分核苷酸序列导入非人动物cd3e基因座。175.优选的，包括用包含编码人cd3d蛋白的全部或部分核苷酸序列导入非人动物cd3d基因座。进一步优选的，包括用包含编码人cd3d蛋白的信号肽、跨膜区、胞质区和/或胞外区的全部或部分核苷酸序列导入非人动物cd3d基因座。176.优选的，用包含编码人cd3g蛋白的全部或部分核苷酸序列导入非人动物cd3g基因座。进一步优选的，包括用包含编码人cd3g蛋白的信号肽、跨膜区、胞质区和/或胞外区的全部或部分核苷酸序列导入非人动物cd3g基因座。177.优选的，所述的插入为首先破坏非人动物内源cd3e、cd3d和/或cd3g基因的编码框，随后进行插入操作，或者所述的插入步骤既可以给内源cd3e、cd3d和/或cd3g基因造成移码突变又可以实现插入人源序列的步骤。178.优选的，所述的插入或替换的位点为cd3e基因的内源调控元件之后。179.优选的，所述非人动物的基因组中至少一个染色体上包含cd3e、cd3d和/或cd3g基因的部分。180.优选的，所述的非人动物中至少一个细胞表达人cd3e、cd3d和/或cd3g蛋白或人源化cd3e、cd3d和/或cd3g蛋白。181.本发明涉及三种基因的遗传修饰，其在非人动物基因组中修饰的个数或顺序均不受限制。既可以每个基因单独修饰，例如依次修饰非人动物cd3e、cd3d、cd3g基因，或者依次修饰非人动物cd3d、cd3g、cd3e，或者依次修饰非人动物cd3g、cd3e、cd3d，或者，依次修饰非人动物cd3e、cd3g、cd3d基因，或者依次修饰非人动物cd3d、cd3e、cd3g，或者，依次修饰非人动物cd3g、cd3d、cd3e。也可以先修饰一个基因后再进行修饰后两个基因，或者先修饰两个基因后再修饰另一个基因，例如先修饰cd3e基因，再一并修饰cd3g、cd3d，或者，先修饰cd3d基因，再一并修饰cd3e、cd3g，或者，先修饰cd3g基因，再一并修饰cd3e、cd3d。当然也可以同时修饰cd3d、cd3g、cd3e三个基因。182.根据本发明的一些实施例，该构建方法进一步包括：将cd3edg基因人源化的非人动物与其他基因修饰的非人动物交配、体外受精或直接进行基因编辑，并进行筛选，得到多基因修饰的非人动物。183.优选的，所述的其他基因为pd-1、pd-l1、4-1bb、tigit、b7-h3、cd28、cd38和cldn18.2中的至少一种基因修饰的非人动物。184.优选的，所述的非人动物还表达人或人源化的pd-1、pd-l1、4-1bb、tigit、b7-h3、cd28、cd38和cldn18.2蛋白中的至少一种。185.优选的，所述的多基因修饰的非人动物的基因组中修饰的多个基因中的每一个基因均对于内源被替换基因座为纯合或杂合的。186.优选的，所述的非人动物可以选自啮齿类动物、猪、兔子、猴子等任何可以进行基因编辑制备基因人源化的非人动物。187.优选的，所述的非人动物为非人哺乳动物。进一步优选的，所述的非人哺乳动物为啮齿类动物。更进一步优选的，所述的啮齿类动物为大鼠或小鼠。188.优选的，所述的非人动物是免疫缺陷的非人哺乳动物。进一步优选的，所述的免疫缺陷的非人哺乳动物为免疫缺陷的啮齿类动物、免疫缺陷的猪、免疫缺陷的兔子或免疫缺陷的猴子。更进一步优选的，所述的免疫缺陷的啮齿类动物为免疫缺陷的小鼠或大鼠。最为优选的，所述免疫缺陷鼠是nod-prkdcscidil-2rγnull小鼠、nod-rag1-/-‑il2rg-/-(nrg)小鼠、rag2-/-‑il2rg-/-(rg)小鼠、nod/scid小鼠或者裸鼠。189.本发明的第十三方面，提供了一种多基因修饰的非人动物的构建方法，包括如下步骤：190.i)提供上述的经遗传修饰的非人动物或上述构建方法获得的经遗传修饰的非人动物；191.ii)将步骤i)提供的非人动物与其他基因修饰的非人动物交配、体外受精或直接进行基因编辑，并进行筛选，得到多基因修饰的非人动物。192.优选的，所述的其他基因修饰的非人动物包括但不限于基因pd-1、pd-l1、4-1bb、tigit、b7-h3、cd28、cd38或cldn18.2修饰的非人动物。193.优选的，所述的多基因修饰的非人动物为双基因人源化非人动物、三基因人源化非人动物、四基因人源化非人动物、五基因人源化非人动物、六基因人源化非人动物、七基因人源化非人动物、八基因人源化非人动物或九基因人源化非人动物。194.优选的，所述的多基因修饰的非人动物相对于人源化的多个基因中的每一个基因均可以是纯合或杂合的。195.本发明的第十四方面，提供了一种上述构建方法获得的非人动物或其子代。196.本发明的第十五方面，提供了一种cd3e、cd3d和/或cd3g基因敲除的非人动物。优选的，所述的非人动物缺失cd3e基因的2号至8号外显子。优选的，所述的非人动物缺失cd3d基因的1号至5号外显子。优选的，所述的非人动物缺失cd3g基因的1号至7号外显子。197.本发明的第十六方面，提供了一种cd3e、cd3d和/或cd3g基因敲除的细胞。优选的，所述的细胞基因组中缺失cd3e基因的2号至8号外显子。优选的，所述的细胞基因组中缺失cd3d基因的1号至5号外显子。优选的，所述的细胞基因组中缺失cd3g基因的1号至7号外显子。198.本发明的第十七方面，提供了一种动物的疾病模型，所述的疾病模型来源于上述的经遗传修饰的非人动物或上述构建方法获得的经遗传修饰的非人动物或上述构建方法获得的多基因修饰的非人动物或上述的非人动物或其子代。优选的，所述的疾病包括自身免疫性疾病、肿瘤或炎症。199.本发明的第十八方面，提供了来源于上述的经遗传修饰的非人动物或上述构建方法获得的经遗传修饰的非人动物或上述构建方法获得的多基因修饰的非人动物或上述的非人动物或其子代在制备动物的疾病模型中的应用，优选的，所述的疾病包括自身免疫性疾病、肿瘤或炎症。200.本发明的第十九方面，提供了来源于上述的经遗传修饰的非人动物或上述构建方法获得的经遗传修饰的非人动物或上述构建方法获得的多基因修饰的非人动物或上述的非人动物或其子代在制备治疗自身免疫性疾病、肿瘤和/或炎症的药物中的应用，或者在制备人cd3e、cd3d和/或cd3g特异性调节剂中的应用，或者在筛选人cd3e、cd3d和/或cd3g特异性调节剂中的应用。201.本发明的第二十方面，提供了一种细胞或细胞系或原代细胞培养物，所述细胞或细胞系或原代细胞培养物来源于上述的经遗传修饰的非人动物或上述构建方法获得的经遗传修饰的非人动物或上述构建方法获得的多基因修饰的非人动物或上述的非人动物或其子代或上述的动物的疾病模型。优选的，所述的细胞或细胞系或原代细胞培养物不能发育为动物个体。202.本发明的第二十一方面，提供了一种组织或器官或其培养物，所述组织或器官或其培养物来源于上述的经遗传修饰的非人动物或上述构建方法获得的经遗传修饰的非人动物或上述构建方法获得的多基因修饰的非人动物或上述的非人动物或其子代或上述的动物的疾病模型。优选的，所述的组织或器官或其培养物不能发育为动物个体。203.本发明的第二十二方面，提供了一种荷瘤后的瘤组织，所述的瘤组织来源于上述的经遗传修饰的非人动物或上述构建方法获得的经遗传修饰的非人动物或上述构建方法获得的多基因修饰的非人动物或上述的非人动物或其子代或上述的动物的疾病模型。优选的，所述的荷瘤后的瘤组织不能发育为动物个体。204.本发明的第二十三方面，提供了一种经遗传修饰的细胞，述的细胞表达1)人或人源化cd3e蛋白，2)人或人源化cd3d蛋白，和/或3)人或人源化cd3g蛋白。205.优选的，所述的细胞的基因组中包含1)人cd3e基因的全部或部分，2)人cd3d基因的全部或部分，和/或3)人cd3g基因的全部或部分。优选的，所述的细胞不能发育为动物个体。206.本发明的第二十四方面，提供了一种包含上述的人源化cd3e基因或上述的嵌合基因的构建体。207.本发明的第二十五方面，提供了一种包含上述构建体的细胞。优选的，所述的细胞不能发育为动物个体。208.本发明的第二十六方面，提供了一种包含上述细胞的组织。优选的，所述的组织不能发育为动物个体。209.本发明的第二十七方面，提供了来源于上述的经遗传修饰的非人动物、上述构建方法获得的经遗传修饰的非人动物、上述的人源化cd3e基因、上述的嵌合基因、上述构建方法获得的多基因修饰的非人动物、上述的非人动物或其子代、上述的动物的疾病模型、上述的细胞或细胞系或原代细胞培养物、上述的组织或器官或其培养物、上述的荷瘤后的瘤组织或者上述的细胞的应用，所述的应用包括：210.a)涉及人类细胞的与cd3e、cd3d和/或cd3g相关的免疫过程的产品开发中的应用；211.b)作为药理学、免疫学、微生物学和医学研究的与cd3e、cd3d和/或cd3g相关的模型系统中的应用；212.c)涉及生产和利用动物实验疾病模型用于与cd3e、cd3d和/或cd3g相关的病原学研究和/或用于开发诊断策略和/或用于开发治疗策略中的应用；213.d)在体内研究人cd3e、cd3d和/或cd3g信号通路调节剂的筛选、药效检测、评估疗效、验证或评价中的应用；或者，214.e)研究cd3e、cd3d和/或cd3g基因功能，研究针对人cd3e、cd3d和/或cd3g靶位点的药物、药效，研究与cd3e、cd3d和/或cd3g相关的免疫相关疾病药物、炎症以及抗肿瘤药物方面的应用。215.优选的，所述应用不是疾病的治疗和/或诊断方法。216.本发明的第二十八方面，提供了一种筛选靶向目标抗原的候选药物的方法，所述的方法包括向个体引入目标抗原，使候选药物与个体接触，其中，所述的候选药物针对所述的人cd3和/或目标抗原，进行检测；其中，所述的个体选自上述的经遗传修饰的非人动物或上述构建方法获得的经遗传修饰的非人动物或上述构建方法获得的多基因修饰的非人动物或上述的非人动物或其子代或上述的动物的疾病模型。217.优选的，所述的引入包括在所述个体中表达所述目标抗原。优选向个体移入表达目标抗原的细胞。其中，所述的细胞可以是肿瘤细胞、细菌细胞。218.优选的，所述的引入包括用所述的目标抗原感染所述个体。其中，所述的感染可以为病毒感染或细菌感染。219.优选的，所述的目标抗原为肿瘤相关抗原或传染性疾病抗原。220.优选的，所述的候选药物为抗体或抗原结合蛋白。221.在本发明的一个具体实施方式中，所述的候选药物为双特异性抗体或双特异性抗原结合蛋白。其可以同时结合人cd3蛋白和所述的目标抗原。222.本发明的第二十九方面，提供了一种人cd3e、cd3d和/或cd3g特异性调节剂的筛选方法，所述的筛选方法包括向个体施加调节剂，检测调节效果；其中，所述的个体选自上的非人动物、上述的构建方法获得的非人动物、上述的非人动物或其子代，上述的疾病模型。223.优选的，所述的调节剂选自car-t、药物；优选的，所述的药物为抗体。优选的，所述的调节剂为单抗或双特异性抗体或两种及两种以上药物的联合使用。224.优选的，所述的筛选方法还包括向个体植入肿瘤的步骤。225.优选的，所述检测包括测定肿瘤细胞的大小和/或增殖速率。226.优选的，所述检测的方法包括游标卡尺测量、流式细胞检测和/或动物活体成像检测。227.优选的，所述的检测包括评估个体体重、脂肪量、活化途径、神经保护活性或代谢变化，所述的代谢变化包括食物消耗或水消耗的变化。228.优选的，所述的肿瘤细胞来源于人或非人动物。229.优选的，所述的筛选方法还包括向个体植入肿瘤的步骤。230.本发明的第三十方面，提供了一种干预方案的评价方法，所述的评价方法包括向个体施加干预方案，对施加干预方案后的个体进行调节效果检测和评价；其中，所述的个体选自上述的非人动物，上述的构建方法获得的非人动物，上述的非人动物或其子代，或者上述的疾病模型。231.优选的，所述的评价方法还包括向个体植入肿瘤细胞。232.优选的，所述的干预方案选自car-t、药物治疗，进一步优选的，所述的药物为抗原结合蛋白，所述的抗原结合蛋白为抗体。233.优选的，所述的肿瘤细胞来源于人或非人动物。234.本发明的第三十一方面，提供了一种t细胞的激活方法，所述的激活方法包括向个体施加上述方法筛选方法获得的人cd3e、cd3d和/或cd3g特异性调节剂。235.本发明所述的“肿瘤相关抗原”包括但不限于alk、bage蛋白、birc5(存活素)、birc7、ca9、calr、ccr5、cd19、cd20(ms4a1)、cd22、cd27、cd30、cd33、cd38、cd40、cd44、cd52、cd56、cd79、cdk4、ceacam3、ceacam5、clec12a、egfr、egfr变体iii、erbb2(her2)、erbb3、erbb4、epcam、epha2、epha3、fcrl5、flt3、folr1、gage蛋白、gd2、gd3、gpnmb、gm3、gpr112、il3ra、kit、kras、lgr5、ebv衍生的lmp2、l1cam、mage蛋白、mlana、msln、muc1、muc2、muc3、muc4、muc5、muc16、mum1、ankrd30a、ny-eso1(ctag1b)、ox40、pap、pax3、pax5、plac1、prlr、pmel、prame、psma(folh1)、rage蛋白、ret、rgs5、ror1、sart1、sart3、slamf7、slc39a6(liv1)、steap1、steap2、tert、tmprss2、thompson-nouvelle抗原、tnfrsf17、tyr、upk3a、vtcn1或wt1。236.本发明所述的“传染性疾病抗原”可以为病毒抗原或细菌抗原。所述的病毒抗原包括但不限于hiv、甲肝病毒、乙肝病毒、丙肝病毒、疱疹病毒例如，hsv-1、hsv-2、cmv、hav-6、vzv、eb病毒、腺病毒、流感病毒、黄热病毒、艾柯病毒、鼻病毒、柯萨基病毒、冠状病毒、呼吸道合胞病毒、流腮病毒、轮状病毒、麻疹病毒、风疹病毒、细小病毒、牛痘病毒、htlv、登革病毒、乳头状瘤病毒、软疣病毒、脊髓灰质炎病毒、狂犬病毒、jc病毒、埃博拉病毒和虫媒病毒性脑炎病毒抗原。所述的细菌抗原包括但不限于衣原体、立克次氏体、分枝杆菌、葡萄球菌、链球菌、肺炎双球菌、脑膜炎双球菌、淋菌、克雷伯氏菌、变形杆菌、变形杆菌、沙雷氏菌、假单胞菌、军团杆菌、白喉菌、沙门氏菌、芽孢杆菌、霍乱菌、破伤风杆菌、肉毒杆菌、炭疽杆菌、鼠疫、钩旋体或莱姆病细菌抗原。237.本发明所述的人cd3e、cd3d和/或cd3g特异性调节剂的筛选方法、t细胞的激活方法、干预方案的评价方法以及筛选靶向目标抗原的候选药物的方法，均非疾病的诊断或治疗目的。238.本发明所述的“肿瘤”包括但不限于淋巴瘤、b细胞肿瘤、t细胞肿瘤、骨髓/单核细胞肿瘤、非小细胞肺癌、白血病、卵巢癌、鼻咽癌、乳腺癌、子宫内膜癌、结肠癌、直肠癌、胃癌、膀胱癌、肺癌、支气管癌、骨癌、前列腺癌、胰腺癌、肝和胆管癌、食管癌、肾癌、甲状腺癌、头颈部癌、睾丸癌、胶质母细胞瘤、星形细胞瘤、黑色素瘤、骨髓增生异常综合征、以及肉瘤。其中，所述的白血病选自急性淋巴细胞性(成淋巴细胞性)白血病、急性骨髓性白血病、髓性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、多发性骨髓瘤、浆细胞白血病、以及慢性骨髓性白血病；所述淋巴瘤选自霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤，包括b细胞淋巴瘤、弥漫性大b细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、边缘区b细胞淋巴瘤、t细胞淋巴瘤、和瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症；所述肉瘤选自骨肉瘤、尤文肉瘤、平滑肌肉瘤、滑膜肉瘤、软组织肉瘤、血管肉瘤、脂肪肉瘤、纤维肉瘤、横纹肌肉瘤、及软骨肉瘤。在本发明的一个具体实施方式中，所述的肿瘤选自b细胞肿瘤、t细胞肿瘤、骨髓/单核细胞肿瘤。优选包括b或t细胞急性淋巴细胞白血病(all)、急性髓细胞白血病(aml)、非霍奇金淋巴瘤(nhl)和多发性骨髓瘤(mm)、鼻咽癌、肺癌。239.本发明所述的“自身免疫性疾病”包括但不限于过敏、哮喘、心肌炎、肾炎、肝炎、系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、硬皮病、甲状腺功能亢进、原发性血小板减少性紫癜、自身免疫性溶血性贫血、溃疡性结肠炎、自身免疫性肝病、糖尿病、疼痛或神经障碍等。240.本发明所述的“炎症”包括急性炎症，也包括慢性炎症。具体的，包括但不限于变质性炎症、渗出性炎症(浆液性炎、纤维素性炎、化脓性炎、出血性炎、坏死性炎、卡他性炎)、增生性炎症、特异性炎症(结核、梅毒、麻疯、淋巴肉芽肿等)。241.优选的，本发明保护的主题“细胞”、“细胞或细胞系或原代细胞培养物”、“组织”、“组织或器官或其培养物”均不能发育为动物，其中，所述的细胞不是干细胞或受精卵细胞，所述的细胞可以是体细胞、淋巴细胞(优选为t细胞或b细胞)或肿瘤细胞等等，所述的组织可以是脾脏、淋巴结、骨髓、肿瘤或其培养物等等。242.本发明所述的“全部或部分”，“全部”为整体，“部分”为整体中的局部，或者组成整体的个体。243.本发明所述的“包含”或“包括”为开放式写法，当在本技术中用于描述蛋白质或核酸的序列时，所述蛋白质或核酸可以是由所述序列组成，或者在所述蛋白质或核酸的一端或两端可以具有额外的氨基酸或核苷酸，但仍然具有本发明所述的活性。244.本发明所述的“人源化cd3e蛋白”，包含来源于人cd3e蛋白的部分和非人动物cd3e蛋白的部分。其中，所述的“人cd3e蛋白”同“人cd3e蛋白的全部”，即其氨基酸序列与人cd3e蛋白的全长氨基酸序列一致。所述的“人cd3e蛋白的部分”，为连续或间隔的5-207个氨基酸序列与人cd3e蛋白的氨基酸序列一致或与人cd3e蛋白的氨基酸序列具有70％以上同源性。245.本发明所述的“人源化cd3d蛋白”，包含来源于人cd3d蛋白的部分和非人动物cd3d蛋白的部分。其中，所述的“人cd3d蛋白”同“人cd3d蛋白的全部”，即其氨基酸序列与人cd3d蛋白的全长氨基酸序列一致。所述的“人cd3d蛋白的部分”，为连续或间隔的5-171个氨基酸序列与人cd3d蛋白的氨基酸序列一致或与人cd3d蛋白的氨基酸序列具有70％以上同源性。246.本发明所述的“人源化cd3g蛋白”，包含来源于人cd3g蛋白的部分和非人动物cd3g蛋白的部分。其中，所述的“人cd3g蛋白”同“人cd3g蛋白的全部”，即其氨基酸序列与人cd3g蛋白的全长氨基酸序列一致。所述的“人cd3g蛋白的部分”，为连续或间隔的5-182个氨基酸序列与人cd3g蛋白的氨基酸序列一致或与人cd3g蛋白的氨基酸序列具有70％以上同源性。247.本发明所述的“人源化cd3e基因”，包含来源于人cd3e基因的部分和非人cd3e基因的部分。248.本发明所述的“嵌合基因”，包含上述的人源化cd3e基因，或者，包含人cd3d基因的全部或部分和cd3g基因的全部或部分，或者包含人源化cd3e基因、cd3d基因的全部或部分和cd3g基因的全部或部分。249.本发明所述的“xx号至xxx号外显子”或“xx号至xxx号外显子的全部”包含外显子及其期间的内含子的核苷酸序列，例如所述的“1号至5号外显子”包含1号外显子、1-2号内含子、2号外显子、2-3号内含子、3号外显子、3-4号内含子、4号外显子、4-5号内含子和5号外显子的全部核苷酸序列。250.本发明所述的“x-xx号内含子”表示x号外显子与xx号外显子之间的内含子。例如“2-3号内含子”表示2号外显子与3号外显子之间的内含子。251.本发明所述的“基因座”广义上讲代表基因在染色体上所占的位置，狭义上讲代表某一基因上的一段dna片段，即可以是一个基因也可以是一个基因的一部分。252.本发明所述的“核苷酸序列”包含天然的或经过修饰的核糖核苷酸序列、脱氧核糖核苷酸序列。优选为dna、cdna、pre-mrna、mrna、rrna、hnrna、mirnas、scrna、snrna、sirna、sgrna、trna。253.本发明所述的“治疗”表示减缓、中断、阻止、控制、停止、减轻、或逆转一种体征、症状、失调、病症、或疾病的进展或严重性，但不一定涉及所有疾病相关体征、症状、病症、或失调的完全消除，且是指在疾病已开始发展后改善疾病或病理状态的体征、症状等等的治疗m.p.caloseds.，1987，coldspringharborlaboratory)；immunochemicalmethodsincellandmolecularbiology(mayerandwalker，eds.，academicpress，london，1987)；handbookofexperimentalimmunology，volumesv(d.m.weirandc.c.blackwell，eds.，1986)；andmanipulatingthemouseembryo，(coldspringharborlaboratorypress，coldspringharbor，n.y.，1986)。258.以上只是概括了本发明的一些方面，不是也不应该认为是在任何方面限制本发明。259.本说明书提到的所有专利和出版物都是通过参考文献作为整体而引入本发明的。本领域的技术人员应认识到，对本发明可作某些改变并不偏离本发明的构思或范围。260.下面的实施例进一步详细说明本发明，不能认为是限制本发明或本发明所说明的具体方法的范围。附图说明261.以下，结合附图来详细说明本发明的实施例，其中：262.图1：小鼠cd3e基因和人cd3e基因座对比示意图(非按比例)；263.图2：小鼠cd3d基因和人cd3d基因座对比示意图(非按比例)；264.图3：小鼠cd3g基因和人cd3g基因座对比示意图(非按比例)；265.图4：小鼠cd3e、cd3d和cd3g基因人源化改造示意图(非按比例)；266.图5：cd3e、cd3d和cd3g基因打靶策略及靶向载体设计示意图(非按比例)，其中，mcd3edg代表野生型小鼠cd3e、cd3d和cd3g基因座，chicd3edg-1代表小鼠cd3d和cd3g基因改造后的基因座，chicd3edg-2代表小鼠cd3e、cd3d和cd3g基因改造后的基因座，v1为靶向载体1，v2为靶向载体2；267.图6：cd3dg重组后细胞southernblot结果，其中wt为野生型对照；268.图7：cd3e重组后细胞southernblot结果，其中wt为野生型对照；269.图8：cd3edg人源化f1代小鼠鼠尾pcr鉴定结果，其中，m为marker，wt为野生型，h2o为水对照，pc为阳性对照；270.图9：野生型c57bl/6小鼠( / )和cd3edg基因人源化纯合子小鼠(h/h)胸腺组织rt-pcr检测结果，其中h2o为水对照，gapgh为内参；271.图10：c57bl/6野生型小鼠和cd3edg基因人源化纯合子小鼠(cd3edg(h/h))脾脏大小(a)、重量(b)和脾细胞数量(c)；272.图11：c57bl/6野生型小鼠和cd3edg基因人源化纯合子小鼠(cd3edgh/h)胸腺大小(a)、重量(b)和胸腺细胞数量(c)；273.图12：c57bl/6野生型小鼠和cd3edg基因人源化纯合子小鼠(cd3edg(h/h))胸腺中白细胞亚群占比的流式检测结果，其中，dn为双阴性对照，dp为双阳性对照；274.图13：c57bl/6野生型小鼠和cd3edg基因人源化纯合子小鼠(cd3edg(h/h))胸腺中t细胞亚群占比的流式检测结果，其中，dn为双阴性对照，dp为双阳性对照；275.图14：c57bl/6野生型小鼠和cd3edg基因人源化纯合子小鼠(cd3edg(h/h))脾脏中白细胞亚群占比的流式检测结果，其中，b为b细胞，t为t细胞，nk为nk细胞，gran为粒细胞，dc为树突状细胞，为巨噬细胞，mon为单核细胞；276.图15：c57bl/6野生型小鼠和cd3edg基因人源化纯合子小鼠(cd3edg(h/h))脾脏中t细胞亚群占比的流式检测结果；277.图16：c57bl/6野生型小鼠和cd3edg基因人源化纯合子小鼠(cd3edg(h/h))淋巴结中白细胞亚群占比的流式检测结果；278.图17：c57bl/6野生型小鼠和cd3edg基因人源化纯合子小鼠(cd3edg(h/h))淋巴结中t细胞亚群占比的流式检测结果；279.图18a：野生型c57bl/6小鼠脾脏中cd4 t细胞增殖情况，其中anti-mcd3e为抗鼠cd3e抗体，anti-hcd3e为抗人cd3e抗体，anti-mcd3e/anti-mcd28表示抗鼠cd3e抗体和抗鼠cd28抗体同时处理组，anti-hcd3e/anti-mcd28表示抗人cd3e抗体和抗鼠cd28抗体同时处理组；280.图18b：cd3edg基因人源化纯合子小鼠脾脏中cd4 t细胞增殖情况，其中anti-mcd3e为抗鼠cd3e抗体，anti-hcd3e为抗人cd3e抗体，anti-mcd3e/anti-mcd28表示抗鼠cd3e抗体和抗鼠cd28抗体同时处理组，anti-hcd3e/anti-mcd28表示抗人cd3e抗体和抗鼠cd28抗体同时处理组；281.图19a：野生型c57bl/6小鼠脾脏中cd8 t细胞增殖情况，其中anti-mcd3e为抗鼠cd3e抗体，anti-hcd3e为抗人cd3e抗体，anti-mcd3e/anti-mcd28表示抗鼠cd3e抗体和抗鼠cd28抗体同时处理组，anti-hcd3e/anti-mcd28表示抗人cd3e抗体和抗鼠cd28抗体同时处理组；282.图19b：cd3edg基因人源化纯合子小鼠脾脏中cd8 t细胞增殖情况，其中anti-mcd3e为抗鼠cd3e抗体，anti-hcd3e为抗人cd3e抗体，anti-mcd3e/anti-mcd28表示抗鼠cd3e抗体和抗鼠cd28抗体同时处理组，anti-hcd3e/anti-mcd28表示抗人cd3e抗体和抗鼠cd28抗体同时处理组；283.图20：il-2和ifn-γ表达情况，其中cd3edg(h/h)为cd3edg基因人源化纯合子小鼠，nd代表nodetectable；284.图21：ova特异性抗体血清滴度检测结果，其中cd3edg为cd3egd基因人源化小鼠，图a为免疫前c57bl/6野生型小鼠和cd3edg基因人源化小鼠血清抗体亚型分析结果，图b为第二次和第三次免疫之后小鼠的血清抗体滴度检测结果；285.图22：cd3edg基因人源化小鼠肿瘤药效验证结果(a)，以及小鼠体重变化情况(b)，其中，g1：higgab为人igg抗体，g2：mpd-1ab为抗鼠pd-1抗体，g3：hcd3eab为抗人cd3e抗体；286.图23：抗hcd3e抗体和抗mpd-1抗体处理后cd3edg基因人源化小鼠外周血中的t细胞(a)和b细胞(b)变化情况，其中，higgab为人igg抗体，mpd-1ab为抗鼠pd-1抗体，hcd3eab为抗人cd3e抗体；287.图24：抗hcd3e抗体和抗mpd-1抗体处理后cd3edg基因人源化小鼠肿瘤中t细胞(a)和b细胞(b)变化情况，其中，higgab为人igg抗体，mpd-1ab为抗鼠pd-1抗体，hcd3eab为抗人cd3e抗体；288.图25：小鼠cd3e、cd3d和cd3g基因人源化改造示意图二，具体为基因打靶策略及靶向载体设计示意图(非按比例)，其中，mcd3edg代表野生型小鼠cd3e、cd3d和cd3g基因座，chicd3edg-1代表小鼠cd3d和cd3g基因改造后的基因座，chicd3edg-3代表小鼠cd3e、cd3d和cd3g基因改造后的基因座，v1为靶向载体1，v3为靶向载体3；289.图26：cd3edg人源化小鼠体外杀伤实验的细胞毒性-浓度曲线图；290.图27：注射用生理盐水和抗人cd3/bcma抗体ab1处理后，cd3edg基因人源化小鼠体内肿瘤体积(a)和体重(b)变化情况；291.图28：人和小鼠cd3e氨基酸序列的比对结果；292.图29：人和小鼠cd3d氨基酸序列的比对结果；293.图30：人和小鼠cd3g氨基酸序列的比对结果。具体实施方式294.下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。295.在下述每一实施例中，设备和材料是从以下所指出的几家公司获得：296.c57bl/6小鼠和flp工具鼠购自中国食品药品检定研究院国家啮齿类实验动物种子中心；297.heraeustmfrescotm21microcentrifuge购自thermofisherscientific，型号fresco21；298.attunenxtacousticfocusingcytometer购自thermofisher，型号attunenxt；299.primescript1ststrandcdnasynthesiskit购自takara，型号6110a；300.heraeustmfrescotm21microcentrifuge购自thermofisher，型号fresco21；301.ndei、ecori、sspi、xbai、spei、ecorv酶购自neb，货号分别为r0111s、r0101m、r0132m、r0145m、r0133m、r0195m；302.purifiedanti-mousecd16/32antibody购自biolegend，货号101302；303.zombienirtmfixableviabilitykit(dmso)购自biolegend，货号423106；304.foxp3/transcriptionfactorstainingbufferset购自ebioscience，货号00-5523-00；305.percpanti-mousecd45antibody购自biolegend，货号103130；306.brilliantviolet711tmanti-mousetcrβchainantibody购自biolegend，货号109243；307.brilliantviolet510tmanti-mousecd4antibody购自biolegend，货号100449；308.fitcanti-mousecd8aantibody购自biolegend，货号100706；309.brilliantviolet421tmanti-mousenk1.1antibody购自biolegend，货号108732；310.brilliantviolet605tmanti-mousecd19antibody购自biolegend，货号115540；311.anti-mo/rtfoxp3pe/cytm7购自ebioscience，货号25-5773-82；312.brilliantviolet510tmanti-mousecd45antibody购自biolegend，货号103138；313.percpanti-mousely-6g/ly-6c(gr-1)antibody购自biolegend，货号108426；314.ebioscienceanti-mousecd11cpe/cy7antibody购自ebioscience，货号25-0114-81；315.v450ratanti-mousecd11b购自bdhorizon，货号560455；316.fitcanti-mousef4/80antibody购自biolegend，货号123108；317.sbaclonotypingsystem-c57bl/6-hrp购自southernbiotech，货号5300-05b；318.goatanti-mouseiggfc-hrp购自abcam，货号ab98741；319.mouseigg1,kappaisotypecontrol购自crownbio，货号c0005；320.mouseigg2b,kappaisotypecontrol购自crownbio，货号c0008。321.实施例1cd3edg基因人源化小鼠的制备322.本实施例对非人动物(如小鼠)进行改造，使该非人动物体内包含编码人cd3e蛋白、cd3d蛋白和cd3g蛋白的核苷酸序列，得到经遗传修饰的非人动物体内可表达人或人源化cd3e蛋白、cd3d蛋白和cd3g蛋白。小鼠cd3e基因(ncbigeneid：12501，primarysource：mgi：88332，uniprotid：p22646，位于9号染色体nc_000075.7的第44910033至44920961位，基于转录本nm_007648.5及其编码蛋白np_031674.1(seqidno：1))和人cd3e基因(ncbigeneid：916，primarysource：hgnc:1674，uniprotid：p07766，位于11号染色体nc_000011.10的第118304730至118316173位，基于转录本nm_000733.4及其编码蛋白np_000724.1(seqidno：2))对比示意图如图1所示。323.小鼠cd3d基因(ncbigeneid：12500，primarysource：mgi：88331，uniprotid：p04235，位于9号染色体nc_000075.7的第44893067至44898350位，基于转录本nm_013487.3及其编码蛋白np_038515.3(seqidno：3))和人cd3d基因(ncbigeneid：915，primarysource：hgnc:1673，uniprotid：p04234，位于11号染色体nc_000011.10的第118338954至118342705位，基于转录本nm_000732.6及其编码蛋白np_000723.1(seqidno：4))对比示意图如图2所示。324.小鼠cd3g基因(ncbigeneid：12502，primarysource：mgi：88333，uniprotid：p11942，位于9号染色体nc_000075.7的第44880870至44891729位，基于转录本nm_009850.2及其编码蛋白np_033980.1(seqidno：5))和人cd3g基因(ncbigeneid：917，primarysource：hgnc:1675，uniprotid：p09693，位于11号染色体nc_000011.10的第118344344至118355161位，基于转录本nm_000073.3及其编码蛋白np_000064.1(seqidno：6))对比示意图如图3所示。人和小鼠cd3e、cd3d、cd3g氨基酸序列的比对结果分别如图28-30所示。325.为了达到本发明的目的，可在小鼠内源cd3e、cd3d和cd3g基因座引入编码人cd3e、cd3d和cd3g蛋白的全部或部分核苷酸序列，使得该小鼠表达人或人源化cd3e、cd3d和cd3g蛋白。具体来说，可以通过基因编辑技术在小鼠内源cd3e基因座上用人cd3e基因核苷酸序列替换小鼠cd3e基因，如将小鼠cd3e基因的2号外显子部分序列至8号外显子部分序列用人cd3e基因的2号外显子部分序列至9号外显子部分序列的约11kb的序列进行替换，将小鼠cd3d和cd3g基因座用人cd3d和cd3g基因组约17kb的dna序列进行替换，最终得到人源化的cd3e、cd3d和cd3g基因序列(示意图如图4所示)，实现对小鼠cd3e、cd3d和cd3g基因的人源化改造。326.如图5所示的打靶策略示意图中，涉及靶向载体1(v1)和靶向载体2(v2)，其中靶向载体1上含有小鼠cd3d基因上游和cd3g下游的同源臂序列，以及包含人cd3d和cd3gdna序列的a1片段。其中，上游同源臂序列(5’同源臂1，seqidno：7)与ncbi登录号为nc_000075.7的第44898911至44903464位核苷酸序列相同，下游同源臂序列(3’同源臂1，seqidno：8)与ncbi登录号为nc_000075.7的第44875592至44880865位核苷酸序列相同；a1片段上包含人cd3d和cd3g基因组dna序列(seqidno：9)，该dna序列与ncbi登录号为nc_000011.10的第118338117至118355186位核苷酸序列相同，该序列与5’端同源臂1的连接设计为计为(seqidno：35)，其中序列“tgtga”中的“a”是5’端同源臂的最后一个核苷酸，序列的第一个“g”是人的第一个核苷酸。靶向载体1上还包括用于阳性克隆筛选的抗性基因，即潮霉素抗性基因编码序列hygr，并在抗性基因的两侧装上两个同向排列的位点特异性重组系统loxp重组位点，组成hygr表达盒(hygrcassette)。其中hygr表达盒5’端与人cd3d和cd3gdna序列的连接设计为列的连接设计为(seqidno：10)，其中序列“tttat”的最后一个“t”是人的最后一个核苷酸，序列的第一个“a”是hygr表达盒的第一个核苷酸；hygr表达盒3’端与3’同源臂1的连接设计为同源臂1的连接设计为同源臂1的连接设计为(seqidno：11)，其中序列“agctc”的最后一个“c”是hygr表达盒的最后一个核苷酸，序列的第一个“t”是3’同源臂1的第一个核苷酸。此外，还在靶向载体1的3’同源臂下游构建了具有负筛选标记的编码基因(白喉毒素a亚基的编码基因(dta))。327.靶向载体2上含有小鼠cd3e基因上游和下游的同源臂序列，以及包含人cd3edna序列的a2片段。其中，上游同源臂序列(5’同源臂2，seqidno：12)与ncbi登录号为nc_000075.7的第44925940至44920695位核苷酸序列相同，下游同源臂序列(3’同源臂2，seqidno：13)与ncbi登录号为nc_000075.7的第44906192至44909738位核苷酸序列相同；a2片段上包含人cd3edna序列(seqidno：14)，该dna序列与ncbi登录号为nc_000011.10的第118304953至118315542位核苷酸序列相同。其中，人cd3edna序列5’端与小鼠的连接设计为为(seqidno：36)，其中序列“agagg”的最后一个“g”是小鼠的最后一个核苷酸，序列的第一个“a”是人的第一个核苷酸；人cd3edna序列3’端与小鼠的连接设计为端与小鼠的连接设计为(seqidno：15)，其中序列“tctga”的“a”是人的最后一个核苷酸，序列的“c”是小鼠的第一个核苷酸。靶向载体2上还包括用于阳性克隆筛选的抗性基因，即新霉素抗性基因编码序列neor，并在抗性基因的两侧装上两个同向排列的位点特异性重组系统frt重组位点，组成neo盒(neocassette)。其中neo盒5’端与小鼠的连接设计为(seqidno：16)，其中序列“ccagg”的最后一个“g”是小鼠的最后一个核苷酸，序列的第一个“a”是neo盒的第一个核苷酸；neo盒3’端与小鼠的连接设计为接设计为(seqidno：17)，其中序列“aattc”的“c”是neo盒的最后一个核苷酸，序列的第一个“a”是小鼠的第一个核苷酸。此外，还在靶向载体2的3’同源臂下游构建了负筛选标记编码基因dta。328.改造后的人源化小鼠cd3e的mrna序列如seqidno：18所示，表达的蛋白序列如seqidno：2所示，人源化小鼠cd3d和cd3g(以下简称cd3dg)表达的蛋白序列分别如seqidno：4和seqidno：6所示。329.此外，也可将小鼠cd3e基因的2号外显子部分序列至6号外显子部分序列用人cd3e基因的2号外显子部分序列至7号外显子部分序列进行替换，将小鼠cd3d和cd3g基因座用人cd3d和cd3g基因组约17kb的dna序列进行替换，最终得到人源化的cd3e、cd3d和cd3g基因序列(示意图如图25所示)，实现对小鼠cd3e、cd3d和cd3g基因的人源化改造。330.图25所示的打靶策略示意图中，涉及靶向载体1和靶向载体3(v3)，其中靶向载体1与图5所示的靶向载体1相同，靶向载体3上含有小鼠cd3e基因上游和下游的同源臂序列，以及包含人cd3edna序列的a3片段。其中，上游同源臂序列(5’同源臂2)、下游同源臂序列(3’同源臂2)与图5中靶向载体2的上游同源臂和下游同源臂相同；a3片段中人cd3e序列(seqidno：63)与ncbi登录号为nc_000011.10的第118304953至118313732位核苷酸序列相同。其中，人cd3e序列5’端与小鼠的连接设计同seqidno：36；人cd3edna序列3’端与小鼠的连接设计为连接设计为(seqidno：64)，其中序列“tggat”的最后一个“t”是人的最后一个核苷酸，序列的第一个“c”是小鼠的第一个核苷酸。改造后的人源化小鼠cd3e的mrna序列如seqidno：65所示，表达的蛋白序列如seqidno：66所示。331.靶向载体构建可采用常规方法进行，如酶切连接等。构建好的靶向载体通过酶切进行初步验证后，再送测序公司进行测序验证。将测序验证正确的靶向载体电穿孔转染入c57bl/6小鼠或balb/c小鼠的胚胎干细胞中，利用阳性克隆筛选标记基因对得到的细胞进行筛选，并利用pcr和southernblot技术进行检测确认外源基因的整合情况，筛选出正确的阳性克隆细胞。本发明涉及两次打靶，每次打靶后分别进行pcr和southernblot鉴定。具体来说，靶向载体1转入小鼠胚胎干细胞后，经cd3dgpcr引物鉴定为阳性克隆再进行southernblot(分别用xbai或spei消化细胞dna并使用3个探针进行杂交，探针及目的片段长度如表1所示)检测，结果如图6所示，经测序验证发现除4-g11外，其余7个均为阳性克隆且无随机插入，具体编号为3-f01、3-h02、3-h09、4-a08、4-c09、4-e05、4-h03；对cd3d和cd3g重组正确的阳性克隆进行二次打靶，转入靶向载体2，对cd3e基因进行人源化改造，检测结果如图7所示，经cd3epcr引物验证为阳性的克隆再进行southernblot检测(分别用ndei、ecori或sspi消化细胞dna并使用3个探针进行杂交，探针及目的片段长度如表1所示)，经测序进一步发现编号为1-a09、2-f10、3-e05、3-g05、4-f10、4-g11的6个克隆为阳性克隆。332.表1：具体探针及目的片段长度333.限制性内切酶探针野生型片段重组序列片段xbaicd3dg-5’probe8.9kb7.3kbspeicd3dg-3’probe21.8kb10.9kbspeihygrprobe——10.9kbndeicd3e-5’probe15.0kb13.0kbecoricd3e-3’probe24.9kb8.5kbsspineoprobe——7.7kb334.其中，pcr测定包括下述引物：335.cd3dg-f1：5’‑acattgtgcaacatggttcctttatga-3’(seqidno：19)，336.cd3dg-r1：5’‑ggcaccattttagcttcctttcgcc-3’(seqidno：20)：337.cd3dg-f2：5’‑ctcgactgtgccttctagttgccag-3’(seqidno：21)，338.cd3dg-r2：5’‑acccaaattccttgttttcagttgcca-3’(seqidno：22)：339.cd3e-f1：5’‑gagctacacagtgagactaccacag-3’(seqidno：23)，340.cd3e-r1：5’‑cacagtatctgacaataaatggcaac-3’(seqidno：24)；341.cd3e-f2：5’‑gctcgactagagcttgcgga-3’(seqidno：25)，342.cd3e-r2：5’‑ctctcagtaatcaacttctcgtgtgtc-3’(seqidno：26)；343.southernblot检测包括如下探针引物：344.cd3dg-5’probe：345.cd3dg-5’probe-f：5’‑tacagaacacatggaggcacag-3’(seqidno：27)，346.cd3dg-5’probe-r：5’‑gtaacaacgctgcaacaggatc-3’(seqidno：28)；347.cd3dg-3’probe：348.cd3dg-3’probe-f：5’‑cacactctcatatcactgtacacac-3’(seqidno：29)，349.cd3dg-3’probe-r：5’‑tgatggatccaagagtgggcaac-3’(seqidno：30)；350.hygrprobe：351.hygrprobe-f：5’‑tcgatgtaggagggcgtggatatgt-3’(seqidno：31)，352.hygrprobe-r：5’‑tgtattgaccgattccttgcggtcc-3’(seqidno：32)；353.cd3e-5’probe：354.cd3e-5’probe-f：5’‑gcttcaaggatgtttaactgcaaag-3’(seqidno：33)，355.cd3e-5’probe-r：5’‑tgcaacagatgtgctggcga-3’(seqidno：34)；356.cd3e-3’probe：357.cd3e-3’probe-f：seqidno：27，358.cd3e-3’probe-r：seqidno：28；359.neoprobe：360.neoprobe-f：5’‑ggatcggccattgaacaagat-3’(seqidno：37)，361.neoprobe-r：5’‑cagaagaactcgtcaagaaggc-3’(seqidno：38)；362.将筛选出的正确阳性克隆细胞(黑色鼠)按照本领域已知的技术导入已分离好的囊胚中(白色鼠)，得到的嵌合囊胚转移至培养液中短暂培养后移植至受体母鼠(白色鼠)的输卵管，可生产f0代嵌合体鼠(黑白相间)。将f0代嵌合鼠与野生型鼠回交获得f1代鼠，再将f1代杂合小鼠互相交配即可获得f2代纯合子鼠。还可将阳性鼠与flp工具鼠或cre工具鼠交配去除阳性克隆筛选标记基因后，再通过互相交配即可得到cd3e、cd3d、cd3g三基因人源化纯合子小鼠(以下简称cd3edg人源化小鼠)。可通过pcr鉴定子代小鼠体细胞的基因型(引物如表2所示)，示例性的f1代小鼠的鉴定结果见图8，其中，编号为f1-01、f1-02、f1-03的3只小鼠经进一步测序验证为阳性杂合小鼠。363.表2：引物名称及具体序列[0364][0365]这表明使用本方法能构建出可稳定传代且无随机插入的cd3edg基因人源化小鼠。[0366]可通过常规检测方法(例如rt-pcr)确认阳性小鼠体内人cd3e、cd3d、cd3gmrna表达情况。具体来说，分别取8周龄雄性c57bl/6野生型小鼠和cd3edg基因人源化纯合子小鼠各1只，脱颈安乐死后取胸腺组织进行rt-pcr检测，gapdh作为内参，所用引物序列及片段大小如表3所示。rt-pcr检测结果如图9所示，从图中可以看出，在c57bl/6野生型小鼠胸腺组织中仅检测到鼠cd3emrna、cd3dmrna和cd3gmrna(图9a、9c、9e)，而在cd3edg基因人源化小鼠纯合子小鼠胸腺中仅检测到人源化cd3emrna、cd3dmrna和cd3gmrna(图9b、9d、9f)。[0367]表3：rt-pcr引物名称及具体序列[0368][0369][0370]实施例2cd3edg基因人源化小鼠表型鉴定[0371]选取7周龄c57bl/6野生型小鼠和实施例1制得的cd3edg基因人源化纯合子小鼠各3只，脱颈安乐死后取脾脏和胸腺并进行比较。图10为c57bl/6野生型小鼠和cd3edg基因人源化纯合子小鼠脾脏大小、脾脏重量和脾细胞数量比对结果。从图10a可以看出，从形态上看，cd3edg基因人源化纯合子小鼠的脾脏与c57bl/6野生型小鼠的脾脏均呈长椭圆形，大小一致；从图10b可以看出，cd3edg基因人源化纯合子小鼠的脾脏重量和c57bl/6野生型小鼠的脾脏重量一致；此外，cd3edg基因人源化纯合子小鼠的脾细胞数量与c57bl/6野生型小鼠基本一致，未表现出显著差异(图10c)。[0372]图11为c57bl/6野生型小鼠和cd3edg基因人源化纯合子小鼠胸腺大小、胸腺重量和胸腺细胞数量比对结果。从图11a可以看出，从形态上看，cd3edg基因人源化纯合子小鼠的胸腺与c57bl/6野生型小鼠的胸腺形状大小一致；从图11b可以看出，cd3edg基因人源化纯合子小鼠的胸腺重量比c57bl/6野生型小鼠的胸腺重量小，但没有表现出统计学显著差异；cd3edg基因人源化纯合子小鼠的胸腺细胞数量较c57bl/6野生型小鼠小，但未表现出显著差异(图11c)。[0373]进一步通过流式细胞术检测7周龄雌性c57bl/6野生型小鼠和cd3edg基因人源化纯合子小鼠的胸腺、脾脏和淋巴结等淋巴组织中白细胞亚型和t细胞亚型。胸腺中白细胞亚型和t细胞亚型检测结果分别如图12和图13所示，脾脏中白细胞亚型和t细胞亚型检测结果分别如图14和图15所示，淋巴结中白细胞亚型和t细胞亚型检测结果分别如图16和图17所示。从图中可以看出，cd3edg基因人源化纯合子小鼠胸腺、脾脏和淋巴结中t细胞(t，图14、图16)、b细胞(b，图14、图16)、nk细胞(nk，图14、图16)、dc细胞(dc，图14)、粒细胞(gran图14)、单核细胞(mon，图14)、巨噬细胞(图14)等白细胞亚型与c57bl/6野生型小鼠一致，cd4 t细胞(cd4 tcells，图12、图13、图15、图17)、cd8 t细胞(cd8 tcells，图12、图13、图15、图17)和tregs细胞(图13、图15、图17)等t细胞亚型百分比与c57bl/6野生型小鼠相似，表明cd3e、cd3d和cd3g基因的人源化改造没有影响白细胞的分化、发育和在淋巴组织中的分布。[0374]实施例3cd3edg人源化小鼠t细胞激活实验[0375]分别选取c57bl/6野生型小鼠和实施例1制得的cd3edg基因人源化纯合子小鼠(16周龄)各3只，脱颈安乐死后取脾脏组织，分离并选取t细胞(2×105个)，与2ug/ml的抗鼠cd3e抗体anti-mcd3e或抗人cd3e抗体anti-hcd3e和5ug/ml抗鼠cd28抗体anti-mcd28共同孵育，并采用流式细胞术分别检测24h、48h、72h时cd4 t细胞和cd8 t细胞的增殖情况，流式检测结果分别如图18a、图18b和图19a、图19b所示；同时采用elisa方法分别检测24h、48h、72h时c57bl/6野生型小鼠和cd3edg基因人源化纯合子小鼠脾脏组织中ifn-γ和il-2表达情况，进一步验证cd4 t细胞和cd8 t细胞的激活状态，具体检测结果如图20所示。[0376]图18a和图18b分别为c57bl/6野生型小鼠和cd3edg基因人源化纯合子小鼠脾脏中cd4 t细胞检测结果。从图18可以看出，对于c57bl/6野生型小鼠来说，经pbs、anti-mcd3e抗体、anti-hcd3e抗体、或anti-hcd3e抗体和anti-mcd28抗体(anti-hcd3e/anti-mcd28)处理后，cd4 t细胞荧光强度一致，没有发生明显的增殖改变，表现为单峰，但使用anti-mcd3e抗体和anti-mcd28抗体(anti-mcd3e/anti-mcd28)处理后，cd4 t细胞发生显著的增殖，表现为一系列csfe荧光强度对半递减的子峰，根据子峰个数推测72h时这群细胞大致经历了5次分裂；从图18b可以看出，对于cd3edg基因人源化小鼠来说，使用anti-mcd3e/anti-mcd28处理后cd4 t细胞没有发生明显的增殖改变，表现为单峰，但使用anti-hcd3e/anti-mcd28处理后，cd4 t细胞发生显著增殖。[0377]图19a和图19b分别为c57bl/6野生型小鼠和cd3edg基因人源化纯合子小鼠脾脏中cd8 t细胞检测结果。从图19a可以看出，经pbs、anti-mcd3e抗体、anti-hcd3e抗体、或anti-hcd3e/anti-mcd28处理后，c57bl/6野生型小鼠cd8 t细胞荧光强度一致，没有发生明显的增殖改变，表现为单峰，但使用anti-mcd3e/anti-mcd28处理后，cd8 t细胞显著增殖，表现出一系列csfe荧光强度对半递减的子峰，根据子峰个数推测72h时这群细胞大致经历了5次分裂；从图19b可以看出，使用anti-mcd3e/anti-mcd28处理后，cd3edg基因人源化小鼠体内cd8 t细胞没有发生明显增殖，但使用anti-hcd3e/anti-mcd28处理后，cd8 t细胞发生显著增殖。[0378]从图20可以看出，只有同时使用anti-mcd3e抗体(mcd3)和anti-mcd28抗体(mcd28)处理c57bl/6野生型小鼠，和同时使用anti-hcd3e抗体(hcd3)和anti-mcd28抗体(mcd28)处理cd3edg基因人源化小鼠时，在第24h、48h、72h时il-2和ifn-γ均可有效激活，其表达量没有显著差异。[0379]实施例4cd3edg人源化小鼠血清中ova特异性抗体滴度检测[0380]分别选取6周龄c57bl/6野生型小鼠和实施例1制得的cd3edg基因人源化小鼠各5只，眼眶采血50μl，分离血清，使用sbaclonotypingsystem-c57bl/6-hrp的goatanti-mouseig,humanads-unlb、goatanti-mouseiga-hrp、goatanti-mouseigg1,humanads-hrp、goatanti-mouseigg2b,humanads-hrp、goatanti-mouseigg2c,humanads-hrp、goatanti-mouseigg3，humanads-hrp、goatanti-mouseigm,humanads-hrp对小鼠总igg及igga、igm、igg1、igg2b、igg2c、igg3亚型进行定量检测。之后，使用50μg的ova(卵清蛋白)进行背部四个位置皮下注射免疫接种。第一次皮下注射使用完全弗氏佐剂(cfa)乳化，随后的皮下注射使用不完全弗氏佐剂(ifa)乳化。在第三次注射一周之后收集血液(血清)并使用elisa分析抗体效价，每两次免疫之间间隔14天，结果如图21所示。[0381]从图21a中可以看出，免疫前，与c57bl/6野生型小鼠相比，cd3edg基因人源化小鼠血清抗体亚型无显著差异；从图21b可以看出，第三次免疫后，c57bl/6野生型小鼠和cd3edg基因人源化小鼠血清中ova特异性抗体滴度均显著升高。结果表明，人源化cd3e、cd3d和cd3g基因的引入没有影响cd3edg基因人源化小鼠体液免疫反应。[0382]实施例5cd3edg人源化小鼠药效验证实验一[0383]选取实施例1制得的8周龄cd3edg基因人源化雌性纯合小鼠15只，皮下接种小鼠结肠癌细胞mc38(5×105个)，待肿瘤体积达到100±50mm3进行分组，分为对照组g1和治疗组g2、g3(n＝5)。对照组注射人igg抗体(higgab)，给药剂量2mg/kg；治疗组g2注射抗鼠pd-1抗体(mpd-1ab，使用常规方法免疫小鼠得到，参见janeway'simmunobiology(9thedition))，给药剂量10mg/kg；治疗组g3注射抗人cd3e抗体(hcd3eab，来源于proventionbio,inc.)，给药剂量为2mg/kg。给药方式为腹腔注射，分组当天开始给药，每周给药2次，共给药6次。每周测量肿瘤体积2次，接种后单只小鼠肿瘤体积达到3000mm3时执行安乐死。[0384]小鼠体内肿瘤变化情况和小鼠体重变化情况如图22所示。整体来看，各组实验过程中小鼠健康状态良好。在实验终点时，各组动物体重均出现一定程度的增长。所有治疗组(g2、g3)和对照组小鼠(g1)体重在整个实验周期内均无显著区别，整体呈现增长趋势(图22b)；从肿瘤体积测量结果上看(图22a)，对照组(g1)和治疗组(g2、g3)各小鼠肿瘤在实验周期内均持续生长；g2治疗组与对照组相比，肿瘤体积显著减小，而g3组肿瘤生长速度显著高于对照组，这可能是由于g3组抗人cd3e抗体治疗引起的激活诱导的细胞死亡(aicd)效应，使得t细胞耗竭，促进了肿瘤组织的生长，表明cd3edg基因人源化小鼠体内t细胞功能正常。表4中列出了各个实验的主要数据和分析结果，具体包括分组后第0天、分组后14天时、实验结束时(分组后第18天)的肿瘤体积、小鼠存活情况、肿瘤(体积)抑制率(tumorgrowthinhibitionvalue，tgitv)以及治疗组与对照组的小鼠体重、肿瘤体积之间的统计学差异(p值)。[0385]表4肿瘤体积、存活情况及肿瘤抑制率[0386][0387]从表4可见，对照组和治疗组的所有小鼠在实验终点时均存活，所有治疗组与对照组相比，动物体重无显著性差异(p＞0.05)，表明动物对抗鼠pd-1抗体mpd-1ab和抗人cd3抗体hcd3eab耐受良好，未对动物产生明显毒性作用，安全性较好。对照组g1所有小鼠在实验过程中肿瘤持续生长，在实验终点时，对照组平均肿瘤体积为1603±151mm3，治疗组(g2)为668±256mm3，治疗组(g3)为2769±465mm3，所有治疗组小鼠的肿瘤体积与对照组的肿瘤体积相比均具有显著差异(p≤0.05)，tgitv分别为62.3％和-77.8％，但g3组肿瘤体积显著高于对照组，可能是由于g3组抗人cd3e抗体治疗引起的aicd效应，使得t细胞耗竭，促进肿瘤组织生长。[0388]进一步采用流式细胞术检测给药后小鼠外周血以及肿瘤组织中b细胞和t细胞比率。给药48h后，分别从各小鼠外周血和肿瘤组织中分离淋巴细胞并检测t细胞和b细胞的变化情况，图23为外周血中的检测结果，图24为肿瘤组织中的检测结果。[0389]从图23a中可以看出，与对照组g1相比，g3组外周血中t细胞比例显著降低，这可能是由于抗人cd3e抗体治疗引起的aicd效应；g2组抗鼠pd-1抗体治疗组t细胞比例有小幅增加，但未达到统计学显著差异。从图23b中可以看出，与对照组g1相比，g2抗鼠pd-l1抗体治疗组与g3组抗人cd3e抗体治疗组小鼠外周血中b细胞比例稍有增加，但无统计学差异。[0390]从图24a中可以看出，与对照组g1相比，g3组肿瘤组织中t细胞比例显著降低；g2组抗鼠pd-1抗体治疗组由于pd-1抗体解除了免疫抑制效应，t细胞比例显著增加。从图24b中可以看出，与对照组g1相比，g2抗鼠pd-l1抗体治疗组与g3组抗人cd3e抗体治疗组b细胞比例均无显著变化。[0391]上述实验证明，cd3edg基因人源化小鼠是cd3抗体体内药理药效研究的有利工具。[0392]实施例6cd3edg人源化小鼠体外杀伤实验[0393]取高表达人bcma蛋白的mc38细胞接种到96孔板，作为靶细胞。将实施例1制备的6-8周龄雌性cd3edg基因人源化小鼠脱颈安乐死后获得脾脏细胞，作为效应细胞。实验组加入浓度分别为20.000、6.667、2.222、0.741、0.247、0.082、0.027、0.009、0.003或0.001μg/ml的抗人cd3/bcma双特异性抗体受试品ab1(使用常规方法制备获得)，对照组加入等量的受试品的稀释溶剂，37℃5％co2培养箱中孵育48h后取上清进行ldh(乳酸脱氢酶)检测。效应细胞和靶细胞计数比例(e:t)分别为20:1和40:1的检测结果如图26所示。从图中可以看出，孵育48h后，e:t＝20:1和e:t＝40:1两组都检测到ab1对靶细胞的杀伤作用，而且在e:t＝40:1时杀伤效果更明显。[0394]实施例7cd3edg人源化小鼠药效验证实验二[0395]选取实施例1制得的6周龄雌性cd3edg基因人源化纯合小鼠20只，皮下接种高表达人bcma蛋白的小鼠结肠癌细胞mc38(5×105个)，待肿瘤体积达到100±50mm3进行分组，分为对照组g1和治疗组g2、g3、g4(n＝5)。对照组注射生理盐水(0.1mg/kg)，治疗组注射抗人cd3/bcma双特异性抗体(ab1，使用常规方法制备获得)，给药方式为尾静脉注射，分组当天开始给药，每5天给药1次，共给药4次。g2、g3、g4组前3次给药剂量分别为0.001mg/kg、0.01mg/kg、0.1mg/kg，第4次给药剂量分别为0.01mg/kg、0.1mg/kg、0.1mg/kg。每周测量肿瘤体积2次，接种后单只小鼠肿瘤体积达到3000mm3时执行安乐死。[0396]小鼠体内肿瘤变化情况和小鼠体重变化情况如图27所示。整体来看，各组实验过程中小鼠健康状态良好，在实验终点时，各组动物体重均出现一定程度的增长(图27b)。从肿瘤体积测量结果上看(图27a)，对照组(g1)和治疗组(g2、g3、g4)各小鼠肿瘤在实验周期内均持续生长，但与对照组相比，治疗组小鼠肿瘤体积增长变缓，随着给药剂量的增加，g2、g3、g4组小鼠肿瘤体积增长量逐渐减少。结果表明，cd3edg基因人源化小鼠可以用于靶向人cd3蛋白的抗体药物的药效评价，是抗体体内药理药效研究的有利工具。[0397]以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。[0398]另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。[0399]此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。当前第1页12当前第1页12
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