一种基于纳米丝网和器官芯片技术的生物屏障模型构建的方法

1.本发明属于组织工程生物材料技术领域，运用微加工技术、静电纺丝技术和微流控技术，具体涉及一种基于纳米丝网和器官芯片技术的生物屏障模型构建方法。


背景技术：

2.生物屏障是在生物长期的进化中发展起来的一整套维持机体正常活动、阻止或抵御外来异物的机制，拥有精确的调节能力和强大的防御机能，然而这也导致了在药物开发的过程中会产生各种各样的问题。其中最明显的是，在药物输送过程中，药物因为生物屏障的存在，常常会被当作异物阻挡，从而无法顺利到达预期的作用位点，发挥其效应。传统的动物筛药模型可以一定程度上验证药效与毒性，但是其花费高、成效低、与人体存在种属差异，且在细胞分子水平研究药物作用机制存在困难。因此，在体外构建一种可以有效模拟体内生物屏障的模型用于研究药物输送等过程是目前研究的热点之一。
3.人体内的生物屏障通常是多种细胞和基底膜共同作用的结果。基底膜不仅在不同细胞之间提供物理屏障，而且会影响膜两侧细胞间相互作用，因此基底膜的仿生是体外生物屏障模型的构建过程中至关重要的一部分。
4.目前生物屏障模型构建中应用最广的是transwell小室模型。transwell小室模型最核心的部分就是其上下小室间相隔的聚碳酸酯(pc)多孔膜。但这类材料仍然存有使其难以完全模拟体内生物屏障的缺陷，例如：(1)pc膜是由高分子合成的，因其与体内基底膜的成分差异较大，因此不具备良好的生物相容性；(2)pc膜的厚度约为10μm，与体内基底膜的厚度(约40～120nm)相差了2～3个数量级，所以不能很好的模拟体内基底膜；(3)pc膜的孔隙密度不均匀，因而难以实现高孔隙率且无重叠孔，这使得膜两侧的细胞间难以实现它们在体内的相互作用。此外，transwell模型无法为细胞生长提供动态微环境，也不能与当前使用广泛的微流控装置相匹配，所以对当前生物屏障模型研究来说，transwell模型是不足以满足要求的。
5.随着材料科学的进步，越来越多膜材料的出现使生物屏障模型得到进一步发展。第一大类是无机硅类多孔膜，此类薄膜的厚度通常可低至纳米级别，但极低的厚度也会导致各种缺陷的出现，例如因其厚度极低，导致加工难度较大；其孔隙率通常较低，难以很好地模拟体内细胞的相互作用；材料本身决定了其生物相容性较差；在后续细胞培养过程中难以操控，以实现预期的目的。第二大类为静电纺丝技术制备的纳米纤维膜，其在形貌上可以很好地模拟细胞外基质，因而被用于各种各样的研究当中。纳米纤维膜虽然可采用不同材料制备，从而拥有生物相容性或可吸收性优良等优点，但传统纳米纤维膜通常较厚，孔隙率也相对较低，仍然难以很好地模拟体内屏障基底膜。
6.此外，细胞的生长还需要各种复杂的外环境与内环境的参与，因此真实地模拟外界环境也是建立高质量的体外生理学模型的重要因素之一。微流控技术作为细胞的动态培养或药物筛选等研究中的工具，可模拟体内动态微环境。其中，器官芯片技术可通过产生流
体剪切力、机械应力、生化浓度梯度等理化刺激，使细胞响应这些刺激而发生自组装，展现更加真实的生理学功能。
7.基于以上问题，我们提出了一种纳米丝网技术运用于构建生物屏障模型，其采用明胶这种天然细胞外基质材料为原料，结合微纳加工技术制备出纳米厚度的纳米纤维网，并且具备高的孔隙率以实现两侧细胞间的相互作用，其微支架也为其后续的集成提供了方便，操作更灵活。


技术实现要素：

8.有鉴于此，本发明结合纳米丝网技术和器官芯片技术的双重优势，提出一种构建体外生物屏障模型的新方法，本发明构建的生物屏障具有良好的生物相容性、纳米级膜厚、高孔隙率和灵活可操控性的特性，，形成一种可模拟体内生理特性的体外皮肤、气血和血脑三大生物屏障模型，为新药开发中药物跨越生物屏障的相关研究提供新的工具。
9.本发明提供了一种纳米丝网作为屏障基底膜，探究生物屏障的构建与其功能验证，为后续三大屏障构建体外模型奠定基础；并在此基础上利用纳米丝网技术，在纳米丝网上培养的不同种类的细胞，通过单个或多个纳米丝网组装技术实现三大屏障的初步构建；采用微流控器官芯片技术，实现屏障模型在微流控芯片中的集成和动态培养。
10.本发明的具体技术方案如下：
11.s1)将pdms预固液浇于带有蜂窝状图案的模具上，抽真空至无气泡后放在烘箱中固化，剥离得到pegda微支架的模具；将pegda微支架的模具放在载玻片上，经干燥脱气后，用配制好pegda预溶液进行填充渗透，填满后用紫外线照射pdms-载玻片组件使其固化，分离可以得到具有蜂窝状图案的pegda微支架；
12.s2)将明胶、乙酸、乙酸乙酯和蒸馏水混合均匀，得到纺丝溶液。在pegda微支架上运用静电纺丝技术进行纺丝，得到不同纤维密度的纳米丝网；
13.s3)在不同密度的纳米丝网和多层纳米纤维膜、聚碳酸酯(pc)多孔膜上培养血管内皮细胞，构建血管内皮屏障，探究纳米丝网对血管内皮屏障形成的影响机制；
14.s4)根据上述研究的基础和理论，运用纳米丝网构建人体皮肤屏障模型、人体气血屏障模型和人体血脑屏障静态模型；
15.s5)构建微流控动态屏障模型，与静态屏障模型进行研究对比，最终得到良好体外生物屏障模型。
16.作为本发明的进一步改进，步骤一具体为：将pdms预固液浇于带有蜂窝状图案的模具上，抽真空至无气泡后放在80℃烘箱中固化2小时，剥离得到微支架的pdms模具，pdms预固液优选为：a和b组分以10∶1的比例混合；将所得pdms模具放在载玻片上，经干燥脱气后，加配制好pegda预溶液进行填充渗透，填满后用紫外线照射40s使pdms-载玻片组件固化，分离可以得到具有蜂窝状图案的pegda微支架，所述pegda预溶液优选为4wt％的光引发剂和96wt％的pegda；
17.作为本发明的进一步改进，步骤二具体为：所述纳米丝网由pegda微支架与纳米纤维层构建而成，其之间还包括一层金；所述纳米丝网的纳米纤维层由纺丝溶液通过静电纺丝制备而成，纺丝溶液优选为10wt％的明胶，体积比为4∶3∶2的乙酸、乙酸乙酯和蒸馏水的混合溶液。通过控制静电纺丝工艺参数，优选为纺丝环境温度在20℃
±
3℃，湿度在65
±
5％
的范围内，纺丝速度为0.3ml/h，调节电压13～14kv，静电纺丝时间0.5min、1min、2min和5min(具体时间还要由实际环境情况而定)，制备具有不同纤维密度的纳米丝网。
18.作为本发明的进一步改进，步骤三具体为：在不同密度的纳米丝网和多层纳米纤维膜、聚碳酸酯(pc)多孔膜上接种血管内皮细胞(huvecs)，研究比较不同基底膜材料对细胞的影响。根据人体内生物屏障中细胞的分布，将细胞接种至不同的基底膜材料上，得到人体血管内皮屏障。通过细胞脱水、免疫荧光染色、cck-8等方法比较细胞粘附、形态和增殖的差异，反映细胞与细胞、细胞与基底之间的相互作用，并进一步通过测量teer和荧光分子渗透来验证内皮屏障的形成能力，研究新型仿生基底膜对血管内皮屏障形成的影响机制研究。
19.作为本发明的进一步改进，步骤四具体为：生物屏障静态模型选人体皮肤屏障模型、人体气血屏障模型或人体血脑屏障模型。
20.所述人体皮肤屏障模型的构建方法为：
21.将培养至对数期的皮肤角质细胞(hacat)和成纤维细胞(3t3)分别接种在纳米纤维丝网的丝网支架的一侧进行培养，之后再将其进行背靠背/背靠面贴合组装的方式实现皮肤角质细胞和成纤维细胞的共培养，并与特制夹具集成，通过气液培养得到静态人体皮肤屏障模型。
22.所述人体气血屏障模型的构建方法为：
23.将血管内皮细胞(huvecs)和肺泡上皮细胞(a549)分别接种至纳米纤维丝网的凹侧进行培养后，再将两个丝网进行背靠背贴合组装的方式，以实现血管内皮细胞和肺泡上皮细胞的共培养，并与特制夹具集成，得到静态人体气血屏障模型；
24.所述人体血脑屏障模型的构建方法为：
25.将脑微血管内皮细胞(bend.3)接种至纳米丝网的一侧进行培养后，再在纳米丝网另一侧接种星形胶质细胞(c8d1a)，两种细胞可通过纳米丝网上的孔洞进行充分的细胞间相互作用，从而更好地实现血脑屏障模型的构建，并与特制夹具集成，即得静态人体血脑屏障模型。
26.作为本发明的进一步改进，步骤五具体为：提供了一种微流控芯片，包括上述纳米丝网技术构建的生物屏障模型、基板和盖板，所述基板上具有与纳米丝网形状相匹配的凹槽，凹槽两侧分别开设并连通有进液流道以及出液流道；盖板与基板相匹配，其上开设有与进液流道相连通的进液口以及与出液流道相连通的出液口；微流控芯片组装后，将细胞培养液采用流动的形式通过构建好的生物屏障模型，从而可以更好的模拟生物屏障模型在体内的形态。
27.与现有技术相比，本发明提供了一种基于纳米丝网技术构建的生物屏障模型，包括一个或多个叠加的纳米丝网以及在纳米丝网的两侧分别培养的不同种类的细胞，采用纳米丝网培养技术构建生物屏障模型；该纳米丝网采用生物相容性好的明胶作为原材料，并采用静电纺丝技术制备；可实现细胞的三维培养，并将细胞与培养液的接触最大化，细胞与外界材料的接触最小化，使细胞在纳米丝网上具有充分的自由度，从而更好地模拟细胞在体内的微环境。此外，该纳米丝网为细胞生长分化提供支架，而且可允许细胞排泄物通过，建立细胞间的联系。更重要的是该纳米丝网可实现多个纳米丝网连结在一起，使生物屏障模型的构建更加便利。因此，本发明为生物屏障的构建带来新的方向，也为药物的筛选提供
有效的平台。本发明提供的用于构建生物屏障的纳米丝网的生物相容性好、纳米膜厚、孔隙率高、可操纵性强，该模型能够形成稳定性高、重复性高、生理功能接近于体内的生物屏障模型，并可以与微流控装置相匹配。
附图说明
28.图1为pegda微支架实物图(a)和纳米丝网实物图(b)。
29.图2为本发明制备的不同密度纳米丝网交联后的扫描电镜形貌图(a)、孔径分布图和孔隙率统计图(b)，以及多层纳米纤维膜扫描电镜图(c)、聚碳酸酯(pc)多孔膜扫描电镜图(d)、纳米丝网的实物图(e)。
30.图3为huvecs在不同密度纳米丝网、多层纳米纤维膜和pc多孔膜上的扫描电镜图。
31.图4为huvecs在不同密度纳米丝网、多层纳米纤维膜和pc多孔膜上的细胞骨架的染色图(a-e)以及细胞黏附面积统计图(f)。
32.图5为huvecs在不同密度纳米丝网、多层纳米纤维膜和pc多孔膜上的增殖能力的统计图。
33.图6为huvecs在不同密度纳米丝网、多层纳米纤维膜和pc多孔膜上的紧密连接蛋白的表达(a)以及结宽的定量分析图(b)。
34.图7为huvecs在不同密度纳米丝网、多层纳米纤维膜和pc多孔膜上的黏着斑(绿色)和细胞骨架(红色)的免疫荧光图以及定量分析图。
35.图8为人体皮肤屏障模型的构建示意图。
36.图9为人体气血屏障模型构建示意图。
37.图10为人体血脑屏障模型构建示意图。
具体实施方式
38.本发明提供了一种纳米丝网作为屏障仿生基底膜，探究生物屏障的构建与其功能验证，为后续三大屏障构建体外模型奠定基础；并在此基础上利用纳米丝网技术，在纳米丝网上培养不同种类的细胞，通过单个或多个纳米丝网组装技术实现三大屏障的初步构建；采用微流控器官芯片技术，实现纳米丝网屏障在微流控芯片中的集成和动态培养。
39.本发明提供了一种基于纳米丝网和器官芯片技术的生物屏障模型构建方法。该发明能够形成生物相容性好、纳米级膜厚、高孔隙率、灵活可操控性，且生理功能接近于体内的生物屏障模型，再将其与微流控芯片相融合，开发一种集仿生基底膜、动态微环境模拟于一体的新型药物透屏能力体外评价体系，对于药物研发具有重大意义。
40.与传统的生物屏障构建方法相比：第一，该方法采用的纳米丝网渗透性强，细胞在上面更容易增殖分化，细胞更接近其在体内的生存环境。第二，纳米丝网可随意组合使得该方法适合多种生物屏障模型的构建，该模型方便灵活，操作性强。第三，该方法构建的生物屏障模型可应用于微流控芯片中，为模型在动态环境下的研究提供重要依据，也拓宽了模型的应用范围。
41.为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明进行详细说明：
42.实施例1
43.1、pdms模具的制备：将pdms预固液浇于模具上，抽真空至无气泡后在80℃中固化2
小时，随后将pdms模具剥离，得到纳米丝网的pegda微支架的pdms模具。其中pdms预固液是用a和b组分以10∶1的比例混合而来。
44.2、pegda微支架的制备：将所得pdms模具放在载玻片上，然后将pdms-载玻片组件放在干燥器中脱气，加配制好pegda预溶液进行填充渗透，当pdms-载玻片组件的空隙被充分填满之后，用紫外线照射组件40s，获得具有若干个直通孔的pegda微支架，然后将支架全部浸没在异丙醇溶液中进行超声洗涤10分钟，再用去离子水超声洗涤10分钟以去除残留的未反应的pedga预溶液以及光引发剂，得到pegda微支架。所述pegda预溶液中的各成分的含量范围为：4wt％的光引发剂和96wt％的pegda。参见图1(a)为pegea微支架的实物图。
45.3、通过静电纺丝，在所述pegda微支架表面形成纳米纤维层，得到纳米丝网。静电纺丝的具体步骤为：
46.第一步：调节操作室内环境温度和湿度，确保纺丝环境温度在20℃
±
3℃，湿度在65
±
5％。
47.第二步：取铝箔一块，将铝箔包裹在金属板上，将表面镀有金层的pegda微支架固定在铝箔表面。
48.第三步：取一根0.5mm内径硅胶管，在一端嵌入0.6mm内径针头，在另一端嵌上去掉底座的0.6mm内径针头。
49.第四步：用1ml注射器吸取1ml纺丝溶液，将注射器连接有底座的针头。用手慢慢推动注射器，直到有少许的纺丝液从针头溢出且保证管子中无气泡产生即可。纺丝溶液是将10wt％的明胶溶于体积比为4∶3∶2的乙酸、乙酸乙酯和蒸馏水的混合溶液中，在磁力搅拌器上搅拌均匀。
50.第五步：将装有纺丝溶液的注射器安装在注射泵上，确保安装稳当。
51.第六步：将裹有铝箔的金属板置于注射泵和高压直流电源之间，无底座的针头距离铝箔10～15cm。高压直接电源的正极接无底座的针头，负极接滚筒收集器。
52.第七步：打开注射泵电源，调节纺丝速度为0.3ml/h。
53.第八步：打开高压直流电源，旋转调压旋钮，调节电压13～14kv。
54.第九步：静电纺丝0.5min、1min、2min和5min(具体时间还要由实际环境情况而定)分别得到不同密度的纤维。
55.第十步：纺丝结束前，先将高压直流电源的电压调到零，然后关闭高压直流电源，接着关闭注射泵，拔下二者电源插头。取出纺有纳米纤维的铝箔。
56.第十一步、静电纺丝后，将聚集了纳米纤维的纳米丝网置于真空干燥泵中过夜以除去残留的溶剂。参见图1(b)为交联后的纳米丝网的实物图。参见图2为不同密度纳米丝网交联后的形貌(a)、孔径分布图和孔隙率统计图(b)、多层纳米纤维膜扫描电镜图(c)、pc多孔膜扫描电镜图(d)。
57.4、提前配制好用edc/nhs在无水乙醇溶液中充分溶解的交联试剂(均为0.2m edc和nhs的溶于无水乙醇溶液中)。将明胶支架置于交联试剂中交联3小时。交联完成后，样品用无水乙醇漂洗三次并在真空中干燥一整夜以除去残留的化学物质。
58.5、将制备好的纳米丝网在紫外操作台中正反面各照射30min灭菌处理，之后浸泡在dpbs中，恒温培养箱中放置过夜完全浸润以备用。
59.实施例2
60.本实施例着重介绍纳米丝网对血管内皮屏障形成的影响机制探究：纳米丝网作为屏障基底膜将对屏障的形成有怎样的影响，这其中的机制又是什么，是本项目首先需要研究的关键问题，也是后续三大屏障能够成功构建的基础和理论保障。
61.1、细胞在不同样品材料上的形态(细胞脱水实验)
62.第一步：将huvecs分别接种于三种不同纤维密度的纳米丝网、多层纳米纤维膜和pc多孔膜培养24小时。
63.第二步：从培养箱中取出样品，弃掉旧培养基，加入dpbs浸洗三次，每次5min。
64.第三步：加适量4％多聚甲醛固定液浸没样品，室温放置15min，固定完吸出固定液并弃去。加入dpbs洗三次，每次5min。
65.第四步：配制浓度为30％、50％、70％、80％、90％、95％和100％的乙醇溶液，先用30％乙醇溶液浸泡样品30min，再按50％、70％、80％、90％、95％、100％的顺序将乙醇溶液分别加入并浸泡样品，每次10min，取出样品晾干，放在真空干燥泵中干燥4h。
66.2、细胞在不同样品材料上的黏附(细胞骨架染色)
67.第一步：将huvecs分别接种于三种不同纤维密度的纳米丝网、多层纳米纤维膜和pc多孔膜培养24小时，将样品拿出，弃去旧培养基，用dpbs冲洗三遍，每次5min。
68.第二步：加适量4％多聚甲醛固定液浸没样品，室温固定15min后吸出固定液并弃去。加入dpbs清洗三次，每次5min。
69.第三步：配制0.5％tritonx-100作为通透剂，加入通透剂浸没样品，室温通透10min后吸出通透剂并弃去，加入dpbs清洗三次，每次5min。
70.第四步：加入适量封闭液浸没样品，室温封闭1h后吸出封闭液并弃去，加入dpbs清洗三次，每次5min。
71.第五步：按照1∶250的比例将鬼笔环肽染料稀释，每个样品约加入100μl，将封口膜敷在样品上，室温遮光孵育2h，孵育结束后加入dpbs清洗三次，每次5min。
72.第六步：按照1∶1000的比例将dapi染料稀释，每个样品约加入100μl，将封口膜敷在样品上，室温遮光孵育10min，孵育结束后加入dpbs清洗三次，每次5min。
73.第七步：结束后将样品浸泡在dpbs中放在4℃冰箱保存。
74.3、细胞在不同样品材料上的增殖(cck-8实验)
75.第一步：按照cck-8∶完全ecm培养基＝1∶10的体积比配制cck-8的工作液。
76.第二步：将分别培养24h、72h和96h的huvecs分别接种于三种不同纤维密度的纳米丝网、多层纳米纤维膜和pc多孔膜的样品取出，吸去旧的培养基，加入dpbs冲洗。
77.第三步：把洗好的样品放在新的孔板中，加入第一步中配制好的cck-8溶液淹没样品，放入培养箱孵育2h。
78.第四步：从培养箱取出样品，轻轻晃动，每个样品各取3个100μl到96孔板中，在450nm波长下测量吸光度值进行计算分析。
79.4、细胞在不同样品材料上的细胞-细胞的相互作用(紧密连接蛋白染色)
80.第一步：将huvecs分别接种于三种不同纤维密度的纳米丝网、多层纳米纤维膜和pc多孔膜，培养48小时后将即将染色的样品拿出，弃去旧培养基，用dpbs冲洗三遍，每次5min。
81.第二步：加适量4％多聚甲醛固定液浸没样品，室温固定15min后吸出固定液并弃
去。加入dpbs清洗三次，每次5min。
82.第三步：配制0.5％tritonx-100作为通透剂，加入通透剂浸没样品，室温通透10min后吸出通透剂并弃去，加入dpbs清洗三次，每次5min。
83.第四步：加入适量封闭液浸没样品，室温封闭1h后吸出封闭液并弃去，加入dpbs清洗三次，每次5min。
84.第五步：按照1∶100的比例稀释紧密连接蛋白一抗，每个样品约加入100μl，将封口膜敷在样品上，将培养皿用封口胶封好，放在4℃冰箱孵育过夜。孵育结束后加入dpbs清洗三次，每次5min。
85.第六步：次日取出前一天样品，对一抗溶液进行收集，加入dpbs清洗三次，每次5min。按照1：200的比例稀释二抗，每个样品约加入100μl，将封口膜敷在样品上，室温孵育2h后，加入dpbs清洗三次，每次5min。
86.第七步：按照1∶1000的比例将dapi染料稀释，每个样品约加入100μl，将封口膜敷在样品上，室温遮光孵育10min，孵育结束后加入dpbs清洗三次，每次5min。结束后将样品浸泡在dpbs中放在4℃冰箱保存。
87.5、细胞在不同样品材料上的细胞-基底的相互作用(黏着斑蛋白的染色)
88.第一步：将huvecs分别接种于三种不同纤维密度的纳米丝网、多层纳米纤维膜和pc多孔膜，培养48小时后将样品取出，弃去旧培养基，用dpbs冲洗三遍，每次5min。
89.第二步：加适量4％多聚甲醛固定液浸没样品，室温固定15min后吸出固定液并弃去。加入dpbs清洗三次，每次5min。
90.第三步：配制0.5％tritonx-100作为通透剂，加入通透剂浸没样品，室温通透10min后吸出通透剂并弃去，加入dpbs清洗三次，每次5min。
91.第四步：加入适量封闭液浸没样品，室温封闭1h后吸出封闭液并弃去，加入dpbs清洗三次，每次5min。
92.第五步：按照1∶100的比例稀释黏着斑蛋白一抗，每个样品约加入100μl，将封口膜敷在样品上，将培养皿用封口胶封好，放在4℃冰箱孵育过夜。孵育结束后加入dpbs清洗三次，每次5min。
93.第六步：次日取出前一天样品，对一抗溶液进行收集，加入dpbs清洗三次，每次5min。按照1：200的比例稀释二抗，每个样品约加入100μl，将封口膜敷在样品上，室温孵育2h后，加入dpbs清洗三次，每次5min。
94.第七步：按照1∶1000的比例将dapi染料稀释，每个样品约加入100μl，将封口膜敷在样品上，室温遮光孵育10min，孵育结束后加入dpbs清洗三次，每次5min。结束后将样品浸泡在dpbs中放在4℃冰箱保存。
95.6、细胞在不同基底膜材料上的形成的内皮屏障的teer的测量
96.对不同基底膜材料上形成的内皮屏障夹在培养夹具中，放在有基础培养基的六孔板内，清除所有气泡。在电阻仪ohms模式，打开开关，把电极短端浸入培养室内部，电极长端浸入培养室外侧进行测量。短端不可以碰到培养室内部生长的细胞层，长端要接触到外侧的底部。待显示屏上的数字稳定并进行记录。
97.7、细胞在不同基底膜材料上的形成的内皮屏障的渗透实验
98.对不同基底膜材料上形成的内皮屏障夹在培养夹具中，在上室加入2mg/ml的
fitc-葡聚糖分子溶液，放入培养箱30min、60min、90min和120min，分别取100μl下室的溶液至96孔板中，在490nm波长下测量吸光度值，如图5所示代入公式：
[0099][0100]
其中，p(cm/s)是渗透系数，δc(mg/ml)是下室的fitc-葡聚糖的浓度变化，δt(s)是fitc-葡聚糖孵育的时间，v(ml)是下室培养基的体积，a(cm2)是内皮屏障的面积，c0(mg/ml)是fitc-葡聚糖在上室的初始浓度。通过计算渗透系数p，模拟不同基底材料对不同药物的屏障能力。
[0101]
实施例3
[0102]
本实施例着重介绍一种人体皮肤屏障模型的构建方法：皮肤屏障模型是由表皮层的角质细胞及真皮层的成纤维细胞构成的。
[0103]
1、hacat细胞培养
[0104]
hacat细胞用含1％双抗、10％胎牛血清的高糖dmem培养基培养，每两天换一次液。待细胞铺满瓶底85％时，用胰蛋白酶进行消化传代，在显微镜中观察细胞至细胞外形变圆时，终止消化。取细胞悬液离心，弃上清液，加入适量新鲜的培养基后放在37℃，5％co2湿度恒温培养箱中培养。
[0105]
2、3t3细胞培养
[0106]
3t3细胞用含1％双抗、10％胎牛血清的高糖dmem培养基培养，每两天换一次液。待细胞铺满瓶底85％时，用胰蛋白酶进行消化传代，在显微镜中观察细胞变圆时加入完全培养基终止消化。取细胞悬液离心，弃上清液，加入适量新鲜的培养基后放在37℃，5％co2湿度恒温培养箱中培养。
[0107]
3、皮肤屏障模型的构建
[0108]
第一步：将培养至对数期的3t3细胞分别接种在一个纳米丝网的凹面和另一个纳米丝网的平面，将所述两个纳米丝网有细胞的面相对进行叠加培养；
[0109]
第二步：将hacat细胞接种至第三个纳米丝网的凹面；
[0110]
第三步：将第二步中的纳米丝与第一步中叠加后的两个纳米丝网按照图8的方式贴合叠加，实现皮肤角质细胞和成纤维细胞的共培养，并与特制夹具集成，通过气液培养得到静态人体皮肤屏障模型，图8为人体皮肤屏障模型的截面结构示意图。待角质细胞生长至融合状态弃掉培养基(培养一周)，使细胞处于气-液交界面上。显微镜下观察共培养细胞形态。
[0111]
实施例4
[0112]
本实施例着重介绍一种人体气血屏障模型的构建方法步骤：人体气血屏障主要由内皮和上皮细胞层组成。因此，在本实例中，将人气静脉内皮细胞(huvecs)丝网上培养，上面接种肺泡ii型上皮细胞(a549)构建人体气血屏障模型来模拟正常结构组织的人体气血屏障。
[0113]
1、a549细胞培养
[0114]
a549细胞用含1％双抗，10％胎牛血清的高糖dmem培养基培养，每两天换一次液。待细胞铺满瓶底80％时，用胰蛋白酶进行消化传代，在显微镜中观察细胞呈圆状时加入完全培养基终止消化。取细胞悬液离心，弃上清液，加入适量新鲜的培养基后于在37℃、5％
co2恒温培养箱中培养。
[0115]
2、huvecs细胞培养
[0116]
huvecs细胞用含1％双抗、1％生长因子、5％胎牛血清的ecm培养基培养，每两天换一次液。待细胞铺满瓶底90％时，用胰蛋白酶进行消化传代，在显微镜中观察细胞呈圆状时加入完全培养基终止消化，吹散细胞取细胞悬液离心，弃上清液，加入适量新鲜的培养基后放在37℃、5％co2恒温培养箱中培养。
[0117]
3、人体气血屏障模型的构建
[0118]
将培养至对数期的血管内皮细胞(huvecs)和肺泡上皮细胞(a549)分别接种至纳米丝网的凹侧进行培养到长满后，再将两个基片进行背靠背贴合组装的方式，实现血管内皮细胞与肺泡上皮细胞共培养，并与特制夹具集成，得到静态人体气血屏障模型，参见图9，图9为人体气血屏障模型截面的结构示意图。观察不同阶段共培养细胞的细胞形态。
[0119]
实施例5
[0120]
本实施例着重介绍一种人体血脑屏障模型的构建方法步骤：
[0121]
研究发现，形成血脑屏障并非脑微血管内皮细胞的固有特性，而是星形胶质细胞诱导所致。星形胶质细胞可诱导非脑微血管内皮细胞在不同程度上形成血脑屏障。因此，在本实例中，我们将脑微血管内皮细胞(bend.3)和星形胶质细胞(c8d1a)在纳米丝网上培养，构建血脑上皮屏障模型来模拟正常结构组织的血脑上皮屏障。
[0122]
1、bend.3细胞培养
[0123]
bend.3细胞用含1％双抗、10％胎牛血清的高糖dmem培养基培养，每两天换一次液。待细胞铺满瓶底80％时，用胰蛋白酶进行消化传代，在显微镜中观察细胞呈椭圆状时终止消化。取细胞悬液离心，弃上清液，加入适量新鲜的培养液后放在37℃、5％co2恒温湿度培养箱中培养。
[0124]
2、c8d1a胶质细胞培养
[0125]
c8d1a胶质细胞用含1％双抗、10％胎牛血清的高糖dmem培养基培养，每两天换一次液。待细胞铺满瓶底80％时，用胰蛋白酶进行消化传代，在显微镜中观察细胞呈椭圆状时终止消化。取细胞悬液离心，弃上清液，加入适量新鲜的培养液后在37℃、5％co2恒温培养箱中培养。
[0126]
3、血脑屏障模型构建
[0127]
将培养至对数期的bend.3和c8d1a细胞分别接种到一个纳米丝网的两侧后，两种细胞可通过纳米丝网上的孔隙进行充分的细胞间相互作用，并与特制夹具集成，即得静态人体血脑屏障模型。参见图10，图10为血脑屏障模型截面的结构示意图。经过共培养之后，血管内皮细胞能形成紧密连接，形成一道生物屏障，可在体外构建一种用于药物筛选和药物输送过程研究的有效模型。
[0128]
实施例6
[0129]
本实施例提供了一种微流控芯片，所述微流控芯片包括：
[0130]
上述纳米丝网技术构建的生物屏障模型、基板和盖板，所述基板上具有与纳米丝网形状相匹配的凹槽，凹槽两侧分别开设并连通有进液流道以及出液流道；盖板与基板相匹配，其上开设有与进液流道相连通的进液口以及与出液流道相连通的出液口；微流控芯片组装后，将细胞培养液采用流动的形式通过构建好的生物屏障模型，从而可以更好的模
拟生物屏障模型在体内的形态。