包含修饰mRNA的分子的组合物及其使用方法

fibroblasts toward a cardiomyocyte-like state,”stem cell reports 1:235-47(2013)；hirai等人，“accelerated direct reprogramming of fibroblasts into cardiomyocyte-like cells with the myod transactivation domain,”cardiovasc res.100:105-13(2013)；ifkovits等人，“inhibition of tgfβsignaling increases direct conversion of fibroblasts to induced cardiomyocytes,”plos one.9:e89678(2014)；mohamed等人，“chemical enhancement of in vitro and in vivo direct cardiac reprogramming,”circulation 135:978-995(2017)；muraoka等人，“mir-133promotes cardiac reprogramming by directly repressing snai1 and silencing fibroblast signatures,”embo j.33:1565-81(2014)；nam等人，“induction of diverse cardiac cell types by reprogramming fibroblasts with cardiac transcription factors,”development141:4267-78(2014)；nam等人，“reprogramming of human fibroblasts toward a cardiac fate,”proc.natl.acad.sci.u s a 110:5588-93(2013)；qian等人，“in vivo reprogramming of murine cardiac fibroblasts into induced cardiomyocytes,”nature 485:593-8(2012)；singh等人，“mir-590promotes transdifferentiation of porcine and human fibroblasts toward a cardiomyocyte-like fate by directly repressing specificity protein 1,”j.am.heart assoc.5(2016)；song等人，“heart repair by reprogramming non-myocytes with cardiac transcription factors,”nature 485:599-604(2012)；wada等人，“induction of human cardiomyocyte-like cells from fibroblasts by defined factors,”proc.natl.acad.sci.u s a.110:12667-72(2013)；yamakawa等人，“fibroblast growth factors and vascular endothelial growth factor promote cardiac reprogramming under defined conditions,”stem cell reports 5:1128-1142(2015)；和zhao等人，“high-efficiency reprogramming of fibroblasts into cardiomyocytes requires suppression of pro-fibrotic signalling,”nat.commun.6:8243(2015)。几个研究小组已经表明，对于人类心脏重编程，向gmt添加心肌素(myocd)对于成功的重编程是必要的。christoforou等人，“transcription factors myocd,srf,mesp1 and smarcd3 enhance the cardio-inducing effect of gata4,tbx5,and mef2cduring direct cellular reprogramming,”plos one 8:e63577(2013)；fu等人，“direct reprogramming of human fibroblasts toward a cardiomyocyte-like state,”stem cell reports 1:235-47(2013)；mohamed等人，“chemical enhancement of in vitro and in vivo direct cardiac reprogramming,”circulation 135:978-995(2017)；muraoka等人，“mir-133promotes cardiac reprogramming by directly repressing snai1 and silencing fibroblast signatures,”embo j.33:1565-81(2014)；nam等人，“induction of diverse cardiac cell types by reprogramming fibroblasts with cardiac transcription factors,”development 141:4267-78(2014)；wada等人，“induction of human cardiomyocyte-like cells from fibroblasts by defined factors,”proc.natl.acad.sci.u s a.110:12667-72(2013)；和addis等人，“optimization of direct fibroblast reprogramming to cardiomyocytes using calcium activity as a functional measure of success,”j.mol.cell cardiol.60:97-106(2013)。此外，其他研
究表明，将碱性螺旋-环-螺旋转录因子hand2加入gmt(gmth)导致更高的重编程效率。abad等人，“notch inhibition enhances cardiac reprogramming by increasing mef2c transcriptional activity,”stem cell reports 8:548-560(2017)；hirai等人，“accelerated direct reprogramming of fibroblasts into cardiomyocyte-like cells with the myod transactivation domain,”cardiovasc res.100:105-13(2013)；ifkovits等人，“inhibition of tgfβsignaling increases direct conversion of fibroblasts to induced cardiomyocytes,”plos one.9:e89678(2014)；nam等人，“induction of diverse cardiac cell types by reprogramming fibroblasts with cardiac transcription factors,”development 141:4267-78(2014)；nam等人，“reprogramming of human fibroblasts toward a cardiac fate,”proc.natl.acad.sci.u s a 110:5588-93(2013)；song等人，“heart repair by reprogramming non-myocytes with cardiac transcription factors,”nature485:599-604(2012)；yamakawa等人，“fibroblast growth factors and vascular endothelial growth factor promote cardiac reprogramming under defined conditions,”stem cell reports 5:1128-1142(2015)；和zhao等人，“high-efficiency reprogramming of fibroblasts into cardiomyocytes requires suppression of pro-fibrotic signalling,”nat.commun.6:8243(2015)。
9.迄今为止，心脏重编程存在两个主要障碍：一个障碍是gmt和gmth的效率差，另一个障碍是使用病毒转染(主要是逆转录病毒或慢病毒)和小分子，这可能导致有害的副作用和监管安全问题。用gmt进行cm重编程的最初研究表明体外4.8％重编程效率(ctnt

细胞)(ieda等人，“direct reprogramming of fibroblasts into functional cardiomyocytes by defined factors,”cell 142:375-86(2010))和体内12％转化成cm样细胞(α-肌球蛋白重链(αmhc)

细胞)，如通过谱系追踪小鼠mi模型所示。qian等人，“in vivo reprogramming of murine cardiac fibroblasts into induced cardiomyocytes,”nature 485:593-8(2012)。此外，将hand2与notch抑制剂和akt激酶一起添加到gmt中将小鼠胚胎成纤维细胞(mef)的重编程效率提高至70％(abad等人，“notch inhibition enhances cardiac reprogramming by increasing mef2c transcriptional activity,”stem cell reports 8:548-560(2017))，同时gmth与几种不同的微rna(mir)和小分子的组合导致约60％的重编程效率。zhao等人，“high-efficiency reprogramming of fibroblasts into cardiomyocytes requires suppression of pro-fibrotic signalling,”nat.commun.6:8243(2015)。用gmt或gmth进行体内重编程表明，12％或6.5％的非cm转化成cm样细胞(qian等人，“in vivo reprogramming of murine cardiac fibroblasts into induced cardiomyocytes,”nature 485:593-8(2012)和song等人，“heart repair by reprogramming non-myocytes with cardiac transcription factors,”nature 485:599-604(2012))，尽管在这两种情况下，这种中等效率确实改善了mi结果。qian等人，“in vivo reprogramming of murine cardiac fibroblasts into induced cardiomyocytes,”nature 485:593-8(2012)和song等人，“heart repair by reprogramming non-myocytes with cardiac transcription factors,”nature 485:599-604(2012)。然而，迄今为止，重编程研究已经使用慢病毒或逆转录病毒递送系统将重
编程基因递送至非cm。ieda等人，“direct reprogramming of fibroblasts into functional cardiomyocytes by defined factors,”cell 142:375-86(2010)；abad等人，“notch inhibition enhances cardiac reprogramming by increasing mef2ctranscriptional activity,”stem cell reports 8:548-560(2017)；christoforou等人，“transcription factors myocd,srf,mesp1 and smarcd3 enhance the cardio-inducing effect of gata4,tbx5,and mef2c during direct cellular reprogramming,”plos one 8:e63577(2013)；fu等人，“direct reprogramming of human fibroblasts toward a cardiomyocyte-like state,”stem cell reports 1:235-47(2013)；hirai等人，“accelerated direct reprogramming of fibroblasts into cardiomyocyte-like cells with the myod transactivation domain,”cardiovasc res.100:105-13(2013)；ifkovits等人，“inhibition of tgfβsignaling increases direct conversion of fibroblasts to induced cardiomyocytes,”plos one.9:e89678(2014)；mohamed等人，“chemical enhancement of in vitro and in vivo direct cardiac reprogramming,”circulation 135:978-995(2017)；muraoka等人，“mir-133promotes cardiac reprogramming by directly repressing snai1 and silencing fibroblast signatures,”embo j.33:1565-81(2014)；nam等人，“induction of diverse cardiac cell types by reprogramming fibroblasts with cardiac transcription factors,”development 141:4267-78(2014)；nam等人，“reprogramming of human fibroblasts toward a cardiac fate,”proc.natl.acad.sci.u s a 110:5588-93(2013)；qian等人，“in vivo reprogramming of murine cardiac fibroblasts into induced cardiomyocytes,”nature 485:593-8(2012)；singh等人，“mir-590promotes transdifferentiation of porcine and human fibroblasts toward a cardiomyocyte-like fate by directly repressing specificity protein 1,”j.am.heart assoc.5(2016)；song等人，“heart repair by reprogramming non-myocytes with cardiac transcription factors,”nature485:599-604(2012)；wada等人，“induction of human cardiomyocyte-like cells from fibroblasts by defined factors,”proc.natl.acad.sci.u s a.110:12667-72(2013)；yamakawa等人，“fibroblast growth factors and vascular endothelial growth factor promote cardiac reprogramming under defined conditions,”stem cell reports 5:1128-1142(2015)；zhao等人，“high-efficiency reprogramming of fibroblasts into cardiomyocytes requires suppression of pro-fibrotic signalling,”nat.commun.6:8243(2015)；和addis等人，“optimization of direct fibroblast reprogramming to cardiomyocytes using calcium activity as a functional measure of success,”j.mol.cell cardiol.60:97-106(2013)。使用这些病毒基因递送方法进入心脏的根本问题是心肌炎症和插入诱变的可能性。wasala等人，“the evolution of heart gene delivery vectors,”j.gene med.13:557-65(2011)。此外，现有方法引起心脏发育基因的长期增加，该基因在正常条件下瞬时表达，因此可能在较长时期内产生不利的影响。gata4过表达可能诱导心脏肥大(liang等人，“the transcription factors gata4 and gata6 regulate cardiomyocyte hypertrophy in vitro and in vivo,”j.biol.chem.276:30245-53(2001))，并且增加的
hand2表达与心脏缺陷相关(tamura等人，“overdosage of hand2 causes limb and heart defects in the human chromosomal disorder partial trisomy distal 4q,”hum.mol.genet.22:2471-81(2013))。因此，在不损害基因组完整性的情况下，瞬时的、非免疫原性基因递送重编程方法具有优于现有方法的优点。
10.修饰mrna(modrna)是安全的、非免疫原性的、瞬时基因递送方法，其不具有基因组整合的风险。这个小组和其他组已经使用modrna来将基因递送到损伤后心脏中。carlsson等人，“biocompatible,purified vegf-a mrna improves cardiac function after intracardiac injection 1 week post-myocardial infarction in swine,”mol.ther.methods clin.dev.9:330-346(2018)；magadum等人，“ablation of a single n-glycosylation site in human fstl 1induces cardiomyocyte proliferation and cardiac regeneration,”mol.ther.nucleic acids 13:133-143(2018)；zangi等人，“modified mrna directs the fate of heart progenitor cells and induces vascular regeneration after myocardial infarction,”nat.biotechnol.31:898-907(2013)；和zangi等人，“insulin-like growth factor 1receptor-dependent pathway drives epicardial adipose tissue formation after myocardial injury,”circulation 135:59-72(2017)。心脏中的modrna的药代动力学允许基因表达在递送后迅速启动并持续多达10天。sultana等人，“optimizing cardiac delivery of modified mrna,”mol.ther.25:1306-1315(2017)。modrna已在体外直接用于将人成纤维细胞重编程为肝细胞并将间充质干细胞重编程为神经样细胞(kim等人，“single-factor sox2 mediates direct neural reprogramming of human mesenchymal stem cells via transfection of in vitro transcribed mrna,”cell transplant.27:1154-1167(2018)和simeonov等人，“direct reprogramming of human fibroblasts to hepatocyte-like cells by synthetic modified mrnas,”plos one.9:e100134(2014))，然而，尚未报告任何研究使用modrna进行体内直接重编程。
11.本公开旨在克服本领域中的这些和其他缺陷。


技术实现要素：

12.第一方面涉及组合物，其包括以下分子：编码gata结合蛋白4的修饰mrna(modrna)(g)、编码肌细胞增强因子2c的modrna(m)、编码t-box 5的modrna(t)、编码心脏和神经嵴衍生物表达蛋白2的modrna(h)、编码显性负性转化生长因子β的modrna(dnt)和编码显性负性无翼相关整合位点8a的modrna(dnw)，其中所述modrna的分子以g:m:t:h:dnt:dnw的比例存在于所述组合物中。
13.在实例中，所述比例为1:1:1:1:1:1。在另一实例中，所述比例为2:2:2:2:0.7:0.7。在另一实例中，所述比例为2:1:1:1:0.7:0.7。在另一实例中，所述比例为1:2:1:1:0.7:0.7。在另一实例中，所述比例为1:1:2:1:0.7:0.7。在另一实例中，所述比例为1:1:1:2:0.7:0.7。在另一实例中，所述比例为1:2:1:2:0.5:0.5。在一种实例中，当组合物包括g:m:t:h:dnt:dnw的比例时，m以高于所述组合物中存在的其他modrna的量存在。在一种实例中，当组合物包括g:m:t:h:dnt:dnw的比例时，h以高于所述组合物中存在的其他modrna的量存在。
14.另一方面涉及药物组合物，其包括前述组合物或其实例以及药学上可接受的载体。
15.另一方面涉及增加细胞群内心肌细胞数与非心肌细胞数的比例的方法，包括使所述细胞群与前述组合物或其实例接触。在实例中，所述非心肌细胞包括心脏成纤维细胞。
16.另一方面涉及治疗心脏损伤的方法，其包括向需要此类治疗的患者给药治疗有效量的前述组合物或其实例。在实例中，心脏损伤包括心肌梗死。在另一实例中，心脏损伤包括再灌注损伤。
17.另一方面涉及在缺血性损害后刺激血管再生的方法，其包括使缺血性损害所损害的组织与前述组合物或其实例接触。
18.另一方面涉及治疗卒中的方法，其包括向需要此类治疗的患者给药治疗有效量的前述组合物或其实例。
19.另一方面涉及增强伤口愈合的方法，其包括向需要此类增强的患者给药治疗有效量的前述组合物或其实例。
20.另一方面涉及刺激骨骼肌再生的方法，其包括向需要此类刺激的患者给药治疗有效量的前述组合物或其实例。
21.另一方面涉及组合物，其包括以下分子：编码gata结合蛋白4的修饰mrna(modrna)(g)、编码肌细胞增强因子2c的modrna(m)、编码t-box 5的modrna(t)、编码心脏和神经嵴衍生物表达蛋白2的modrna(h)、编码酸性神经酰胺酶的modrna(a)、编码显性负性转化生长因子β的modrna(dnt)和编码显性负性无翼相关整合位点8a的modrna(dnw)，其中所述modrna的分子以g:m:t:h:a:dnt:dnw的比例存在于所述组合物中。
22.在实例中，所述比例为1:1:1:1:1:1:1。在另一实例中，所述比例为2:2:2:2:0.7:0.7:0.7。在另一实例中，所述比例为2:1:1:1:0.7:0.7:0.7。在另一实例中，所述比例为1:2:1:1:0.7:0.7:0.7。在另一实例中，所述比例为1:1:2:1:0.7:0.7:0.7。在另一实例中，所述比例为1:1:1:2:0.7:0.7:0.7。在另一实例中，所述比例为1:2:1:2:0.5:0.5:0.5。在一种实例中，当组合物包括g:m:t:h:a:dnt:dnw的比例时，m以高于所述组合物中存在的其他modrna的量存在。在一种实例中，当组合物包括g:m:t:h:a:dnt:dnw的比例时，h以高于所述组合物中存在的其他modrna的量存在。
23.另一方面涉及药物组合物，其包括前述组合物或其实例以及药学上可接受的载体。
24.另一方面涉及增加细胞群内心肌细胞数与非心肌细胞数的比例的方法，包括使所述细胞群与前述组合物或其实例接触。在实例中，所述非心肌细胞包括心脏成纤维细胞。
25.另一方面涉及治疗心脏损伤的方法，其包括向需要此类治疗的患者给药治疗有效量的前述组合物或其实例。在实例中，心脏损伤包括心肌梗死。在另一实例中，心脏损伤包括再灌注损伤。
26.另一方面涉及在缺血性损害后刺激血管再生的方法，其包括使缺血性损害所损害的组织与前述组合物或其实例接触。
27.另一方面涉及治疗卒中的方法，其包括向需要此类治疗的患者给药治疗有效量的前述组合物或其实例。
28.另一方面涉及增强伤口愈合的方法，其包括向需要此类增强的患者给药治疗有效
量的前述组合物或其实例。
29.另一方面涉及刺激骨骼肌再生的方法，其包括向需要此类刺激的患者给药治疗有效量的前述组合物或其实例。
30.缺血性心脏病在工业化世界仍然是发病率和死亡率的主要原因，引起重大的社会和经济负担。在体内将非心肌细胞(非cm)重编程为心肌细胞(cm)样细胞是有前景的心脏再生策略。然而，现有的基于病毒的基因转移递送方法具有低且无规律的转导效率，这使这些技术难以应用于临床。在此，修饰mrna(modrna)基因递送平台用于递送4种心脏重编程基因(gata4(g)、mef2c(m)、tbx5(t)和hand2(h))以及3种重编程辅助基因(显性负性(dn)-tgfβ、dn-wnt8a和酸性神经酰胺酶(ac))以诱导心脏重编程。已经表明，与常规的单独的gata4、mef2c和tbx5(gmt)(28％)相比，称为7g的心脏重编程基因和辅助基因的modrna混合物使心脏重编程效率加倍(57％)。重要的是，重复的7g modrna转染导致在体外提高cm并且完成心脏重编程。然而，使用谱系追踪心肌梗死(mi)小鼠模型，确定了在mi时7g modrna混合物的一次递送部分地重编程约25％的瘢痕区域中的非cm。令人感兴趣的是，在患有mi的小鼠中递送7g-modrna混合物显著改善了心脏功能、瘢痕大小和长期存活率，以及毛细血管密度。从机理上讲，显示了在mi后28天，7g modrna导致了在部分重编程的细胞中的15个关键血管生成因子的显著上调。此外，显示了7g modrna混合物导致apoe-/-小鼠后肢缺血性模型中的新生血管形成，表明7g-modrna混合物给药促进心肌和骨骼肌缺血性损伤后的血管再生。这种方法不仅具有高效率，而且具有高安全范围用于临床。
31.在本公开中，评估了组合modrna混合物在缺血性条件下直接心脏重编程非cm的功效。还评估了在体内心脏和骨骼肌中部分心脏重编程的有益效果。
附图说明
32.当参考附图阅读以下具体实施方式时，本公开的这些和其他的特征、方面和优点将变得更好理解，其中：
33.图1示出了根据本公开的方面的一些实例组合物。
34.图2示出了根据本公开的方面的不同组合物对肌细胞样细胞数的影响。
35.图3示出了根据本公开的方面的不同组合物对心脏射血分数的影响。
36.图4示出了根据本公开的方面的不同组合物对心输出量的影响。
37.图5示出了根据本公开的方面的不同组合物对每搏量(每搏输出量)的影响。
38.图6示出了根据本公开的方面的不同组合物对缩短分数的百分比变化的影响。
39.图7示出了根据本公开的方面的不同组合物对心肌梗死尺寸百分比的影响。
40.图8示出了根据本公开的方面的不同组合物对心脏毛细血管密度的影响。
41.图9示出了根据本公开的方面的不同组合物对心脏vegf-a表达的影响。
42.图10a-图10p例示了重编程策略和筛选诱导心肌细胞重编程的基因。图10a显示了用于测试候选心肌细胞诱导因子的方法的策略说明。从转基因小鼠分离的心脏细胞分选mcherry阴性细胞以消除心肌细胞。图10b显示蛋白质印迹(wb)的实验时间线。图10c显示用gfp、gata4、mef2c、tbx5 modrna转染的mcherry阴性细胞的wb分析来了解将非心肌细胞重编程为心肌细胞的转染策略。图10d是用不同的重编程基因转染mcherry阴性细胞的时间线的示意图。图10e和图10f是显示通过从用gata4、mef2c和tbx5(gmt)或gmt加hand2(gmth)或
gmth加ac(gmtha)和小分子抑制剂(smi)(a n＝10,b n＝7,c n＝5并且d n＝6)重编程14天的非cm提取的rna的定量聚合酶链反应(qpcr)测定的主要心脏基因(ctnt和α-mhc)的表达的图形。图10g显示了用重编程基因加smi转染的细胞的心脏标志物α-mhc/α-辅肌动蛋白的代表性免疫染色图像。图10h显示10g的百分比定量。图10i和图10j显示通过qpcr(a n＝10,d n＝6,e n＝8,f n＝4,g n＝4和h n＝4)测定的在gmtha smi和gmtha加smi替代基因转染后14天评估的mcherry阴性细胞中ctnt和α-mhc的mrna表达。图10k显示在用gmtha smi和gmtha加smi替代基因第一次转染后14天，mcherry阴性细胞中α-辅肌动蛋白的免疫荧光染色。图10l显示10k的百分比定量。图10m显示在7g转染14天后，非cm中的成纤维细胞标志物的相对表达(luc n＝4,7g n＝4)。图10n显示14天后mcherry阴性细胞的7g转染策略。图10o和图10p显示mcherry阴性细胞的代表性免疫染色图像，显示用7g转染(分别)21天和28天后α-辅肌动蛋白的条纹。图10e和图10f、图10i和图10j、图10h和图10l是单向anova、tukey多重比较检验。对于m进行非配对双尾t检验。****,p《0.0001,**,p《0.01,n.s,不显著。比例尺＝10μm。
43.图11a-图11f显示7种基因中不同的化学计量影响体外心脏成纤维细胞的重编程效率。图11a是使用facs分选从α-mhc转基因小鼠中分离mcherry阴性细胞，并以不同比例的7种基因以3天间隔转染它们用于心脏重编程实验的示意图。图11b是显示具有不同比例的7种基因的转染组的表。图11c和图11d显示在用不同的基因比例转染后14天分别评估的mcherry阴性细胞中ctnt和αmhc的mrna相对表达，通过qpcr测定(a n＝10,b n＝8,c n＝2,d n＝2,e n＝2,f n＝2,g n＝2,h n＝2,i n＝2并且j n＝4)。图11e显示了用重编程基因转染2周后显示出αmhc-mcherry和α-辅肌动蛋白的mcherry阴性细胞的免疫染色图像。图11f显示e的百分比定量。单向anova、tukey多重比较检验用于c&d和f。***,p《0.001,**,p《0.01,n.s,不显著。比例尺＝10μm。
44.图12a-图120例示了7g改善心脏功能和mi后的结果。图12a是在急性mi小鼠模型中递送luc和7g modrna后评估心血管功能的实验时间线。图12b显示在mi后28天进行的左心室收缩和舒张功能的磁共振成像(mri)评估。代表性图像显示了舒张期和收缩期期间的左心室腔室(以红色描绘)。图12c、图12d、图12e和图12f显示在b(luc n＝3,7g n＝3)中通过mri实验测量的射血分数(ef)、心输出量(co)和心肌梗死(mi)大小的百分比评价。图12g显示了在mi后第2天(基线)和第28天(luc n＝17,7g n＝8)之间通过超声心动图获得的缩短分数差异的百分比。图12h和图12i显示在mi后第2天(基线)和第28天(luc n＝17,7g n＝8)之间通过超声心动图评估的左心室内径舒张期(lvidd)和收缩期(lvids)的差异的测量。图12j显示了分离心脏用于瘢痕组织评估以及纤维化标志物的qpcr分析的实验计划。图12k显示了在mi后28天用masson三色染色评估瘢痕大小的代表性组织学切片。图12l显示基于j(luc n＝3,7g n＝3)，在mi后28天由瘢痕与活组织所占据的左心室面积的百分比定量。图12m是显示在mi后28天，比较luc处理与7g modrna的纤维化标志物的相对表达的qpcr图片。图12n和图12o显示与luc治疗相比，心肌梗死和7g和7g modrna后的长期存活曲线(luc n＝12,7g n＝12)。对于c-g和l&m进行未配对双尾t检验。对于图12h和图12i进行双向anova、bonferroni事后检验。对于o进行mantel-cox对数秩检验。****,p《0.0001,***,p《0.001,**,p《0.01,*,p《0.05,n.s,不显著。比例尺＝1mm(b&k)。
45.图13a-图13j显示7g通过促进血管生成来改善心脏功能。图13a显示了他莫昔芬注
射、lad结扎和modrna递送，然后从转基因小鼠中分离心脏的实验计划。图13b显示从注射luc和7g modrna的小鼠收集的体内cm样细胞(以黄色呈现)的代表性免疫染色图像，显示心肌细胞标志物ctnt(绿色)和tdtomato-cre的阳性染色。图13c显示在b(luc n＝3,7g n＝3)中通过免疫染色描绘的cm样细胞的定量。图13d是用于分析内皮细胞的实验模型。图13e显示了代表性免疫荧光，显示在递送luc和7g modrna后28天瘢痕区域中存在腔结构(绿色)。图13f显示了基于e(luc n＝5,7g n＝4)的毛细血管密度的百分比定量。图13g显示了在mi后注射modrna和收集心脏用于mrna和蛋白质分析的策略计划。图13h显示了由modrna处理(n＝2)后28天从心脏组织提取的rna评估中确定的主要血管生成基因的表达的qpcr定量。图13i显示了示例性蛋白质印迹图像，显示mi和随后luc和7g的modrna注射后4周分离的心脏组织中存在的vegfa蛋白。图13j显示蛋白质印迹(n＝2)的定量。对于c、f、j、h进行未配对双尾t检验。****,p《0.0001,***,p《0.001,**,p《0.01,n.s,不显著。比例尺＝50μm(b)、25μm(e)。
46.图14a-图14e例示出在apoe-/-小鼠后肢缺血模型中7g增强血液灌注和血管生成。图14a是股动脉结扎和modrna递送，然后从apoe-/-小鼠进行血液灌注分析的实验计划。图14b是代表性激光多普勒灌注成像(ldpi)，显示在第0、1、7、14和21天，在股动脉结扎后接受luc和7gmodrna的小鼠足部区域中血液灌注的动态变化。图14c显示了基于图14c的通过ldpi测量的足灌注的定量，其中ldpi的比例通过比较缺血性肢体与其对侧后肢的血液灌注来计算(luc n＝5,7g n＝5)。图14d显示在小鼠腓肠肌上进行qpcr和免疫染色的实验时间线。图14e是qpcr图片，显示在严重肢体缺血后从注射luc和7g的小鼠分离的缺血性肌肉中血管生成基因的上调。对于图14c进行双向anova、bonferroni事后检验。对于图14e进行非配对双尾t检验。****,p《0.0001,**,p《0.01,*,p《0.05,n.s,不显著。
47.图15显示缺血性损伤后7g modrna诱导心脏和肢体模型中血管再生的建议模型。
48.图16a-图16k显示通过modrna递送的7种基因 心肌素的混合物在成人心脏成纤维细胞中诱导心脏基因表达。图16a是在用不同modrna转染的正常人心室心脏成纤维细胞(nhcf-v)中进行蛋白质分析的实验时间线。图16b显示在不同时间点(第1天-第6天)gfp、gata4、mef2c、tbx5modrna转染的nhcf-v的蛋白质印迹分析以确定蛋白质表达长度。图16c显示nhcf-v转染和细胞收集以确定不同转染试剂的效率的实验计划。图16d显示对nhcf-v进行的免疫染色的代表性图像，显示用各种转染试剂转染的ngfp表达。图16e显示基于图16d的免疫染色的ngfp阳性细胞的百分比定量分析。图16f显示转染和收集sv40-t预处理的nhcf-v的实验计划。图16g、图16h和图16i分别显示ctnt、α-mhc和cola1的相对表达，通过对用不同的重编程基因混合物重复转染14天后收集的nhcf-v的qpcr分析测定(a n＝3,b n＝3,c n＝2,d n＝2,e n＝2,f n＝2)。图16j显示代表性免疫荧光图像，显示了用不同的基因混合物重编程的nhcf-v中的心肌细胞标志物(α-辅肌动蛋白)的出现。(绿色：α-辅肌动蛋白，蓝色：dapi；比例尺，50μm)。图16k显示用重编程基因转染2周后表现出α-辅肌动蛋白的细胞的百分比的定量。对于图16e、图16g、图16h、图16i、图16k进行单向anova、tukey多重比较检验。****,p《0.0001,***,p《0.001,**,p《0.01,*,p《0.05,n.s,不显著。比例尺＝10μm。
49.图17a-图17f显示将其他候选物添加到7g不能使心脏重编程更有效。图17a显示了实验计划的代表图解，证明使用facs分选从转基因小鼠中分离mcherry阴性细胞，将细胞铺板并每3天用不同添加的7-基因混合物转染。图17b显示除7种基因和它们用于转染mcherry
阴性细胞的比例外筛选的基因列表，以鉴定用于将成纤维细胞重编程为心肌细胞的最佳混合物。图17c和图17d显示qpcr结果，分别比较在用7种基因或7种基因加附加候选物转染后14天的mcherry阴性细胞中ctnt和αmhc的相对基因表达(a n＝10,b n＝8,c n＝4,d n＝4,e n＝4,f n＝4,g n＝2,h n＝2,i n＝2并且jn＝2,k n＝4,l n＝4,m n＝4,n＝4并且o n＝4)。图17e显示在不同基因组的重复转染后14天获取的mcherry阴性分选细胞中的α-辅肌动蛋白和αmhc-mcherry阳性细胞的代表性图像。图17f显示基于图17e的百分比定量。对于图17d、图17e和图17f进行单向anova、tukey多重比较检验。****,p《0.0001,***,p《0.001,**,p《0.01,*,p《0.05,n.s,不显著。比例尺＝20μm。
50.图18a-图18d显示不同化学计量的7g对心肌功能和mi后结果的影响。图18a显示评估mi后心血管功能的实验设计。在lad结扎时将luc、7g gmt(hx2)和7g g(mx2)th modrna注射到心肌中。图18b显示在用7g gmt(hx2)和7g g(mx2)th modrna注射的小鼠中基于超声心动图的缩短分数的δ(第28天-第2天)的百分比定量。图18c显示在mi后28天用代表性masson三色染色评估瘢痕大小。图18d显示基于c(luc n＝3,7ggmt(hx2)n＝3,7g g(mx2)th n＝3)中所示的图像的瘢痕大小的定量。对于图18c和图18d进行单向anova、tukey多重比较检验。****,p《0.0001,**,p《0.01,n.s,不显著。对于b，比例尺＝1mm。
51.图19a-图19b显示用于鉴定体内cm样细胞形成的谱系追踪小鼠模型。图19a显示用于谱系追踪实验的小鼠模型中的杂交的概况。图19b显示从tnnt2
mercremer/
/r26
mtmg/
小鼠心脏收集的tnnt2
mercremer/
/r26
mtmg/
的代表性免疫染色图像，比较假处理与他莫昔芬处理的小鼠的tnnt2-阳性细胞中膜绿色的出现。对于b，比例尺＝50μm。
52.图20a-图20h显示7g gmt(hx2)增强成纤维细胞分化成cm样细胞并促进mi后小鼠心脏中的血管生成。图20a显示在谱系追踪小鼠模型中评估cm重编程的实验设计。图20b显示在mi后从luc和7g gmt(hx2)modrna注射小鼠收集的体内重编程细胞(以黄色呈现)的免疫染色图像。图20c显示基于图20b的cm样细胞定量。图20d显示用于分析内皮细胞的实验模型。图20e显示在经历mi和随后的luc和7g gmt(hx2)modrna处理的心脏的瘢痕区域中的cd31阳性细胞的代表性免疫染色图像。图20f显示cd31阳性细胞的百分比定量。图20g显示modrna注射和收集心脏用于qpcr分析的策略计划。图20h是qpcr图片，显示在28天在严重mi小鼠模型中比较luc处理与7g gmt(hx2)modrna的血管生成标志物的相对表达(luc n＝2和7g gmt(hx2)n＝2)。对于图20c、图20f和图20h进行非配对双尾t检验。****,p《0.0001,***,p《0.001,**,p《0.01,n.s,不显著。比例尺＝50μm(b&e)。
53.图21a-图21g显示心脏内递送modrna后血管生成和成纤维细胞标志物的每周评估结果。图21a显示lad结扎，随后modrna注射和心脏分离用于qpcr和蛋白质印迹的实验设计。图21b、图21c和图21d显示qpcr图片，显示在第7、14和21天在严重mi小鼠模型中比较luc处理与7g和7g gmt(hx2)modrna的血管生成标志物的相对表达(luc n＝2,7gn＝2,7g gmt(hx2)n＝2)。图21e、图21f和图21g显示通过qpcr在第7、14和21天测定的已知纤维化标志物(luc n＝2,7g n＝2,7g gmt(hx2)n＝2)。图21h是在第21天收集的小鼠心脏样品中的vegfa蛋白水平的蛋白质印迹分析。图21i显示图21h的定量。对于图21b至图21i进行单向anova、tukey多重比较检验。****,p《0.0001,***,p《0.001,**,p《0.01,*,p《0.05,n.s,不显著。
54.图22a-图22e显示增加的vegfa水平与心脏中的渗漏血管或血管瘤无关。图22a显示研究增加的vegfa水平与组织灌注和渗漏血管的关联的实验时间线。图22b是显示对3个
处理组定量的身高体重/体重比的每周评估的图形。图22c显示评估用luc、7g或7g gmt(hx2)modrna处理的心脏的心脏大小和心肌水肿的完整心脏图像。图22d是h&e染色的代表性图像，显示mi后28天没有与luc、7g或7g gmt(hx2)处理相关的血管瘤。图22e显示小鼠心脏的代表性免疫染色图像，在lad结扎时进行假处理或者用luc、7g和7g gmt(hx2)处理，以评估处理与全身脉管系统(同工凝集素b4)或血管通透性(fitc-葡聚糖珠(70kda))之间的相关性。对于b进行单向anova、tukey多重比较检验。n.s，不显著。比例尺＝1mm(图22c、图22d),10μm(图22e)。
55.图23a-图23d显示小鼠和人cm样细胞显著上调vegfa(关键血管生成基因)的表达。图23a显示使用facs分选从α-mhc转基因小鼠分离mcherry阴性细胞，并使用或不使用不同的心脏重编程混合物(7g,7ggmt(hx2))以3天间隔转染它们的程序的示意图。图23b显示在使用或不使用7g或7g gmt(hx2)转染后14天通过mcherry阴性细胞的qpcr评估的vegfa的相对mrna表达(luc n＝3,7g n＝3,7g gmt(hx2)n＝3)。图23c显示治疗和收集nhcf-v进行qpcr的实验时间线。图23d是表示vegfa表达的图形，其通过从使用或不使用7g myocd重编程14天的人心脏成纤维细胞中提取的rna的qpcr测定。对于b进行单向anova、tukey多重比较检验。对于d进行非配对双尾t检验。***,p《0.001,*,p《0.05,n.s,不显著。
具体实施方式
56.第一方面涉及组合物，其包括以下分子：编码gata结合蛋白4的修饰mrna(modrna)(g)、编码肌细胞增强因子2c的modrna(m)、编码t-box 5的modrna(t)、编码心脏和神经嵴衍生物表达蛋白2的modrna(h)、编码显性负性转化生长因子β的modrna(dnt)和编码显性负性无翼相关整合位点8a的modrna(dnw)，其中所述modrna的分子以g:m:t:h:dnt:dnw的比例存在于所述组合物中。
57.另一方面涉及组合物，其包括以下分子：编码gata结合蛋白4的修饰mrna(modrna)(g)、编码肌细胞增强因子2c的modrna(m)、编码t-box 5的modrna(t)、编码心脏和神经嵴衍生物表达蛋白2的modrna(h)、编码酸性神经酰胺酶的modrna(a)、编码显性负性转化生长因子β的modrna(dnt)和编码显性负性无翼相关整合位点8a的modrna(dnw)，其中所述modrna的分子以g:m:t:h:a:dnt:dnw的比例存在于所述组合物中。
58.应理解，本发明的某些方面、模式、实施方式、变化和特征在下面以各种详细程度进行描述，以便提供对本发明技术的充分理解。本说明书中使用的某些术语的定义提供如下。除非另外定义，否则本文使用的所有技术术语和科学术语通常具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
59.如本文所用，术语“约”意指数值是近似值，并且小变化将不会显著影响所公开的实施方式的实践。在使用数值限制的情况下，除非上下文另外说明，否则“约”意指数值可以变化
±
10％并且保持在所公开的实施方式的范围内。
60.如本文所用，可互换使用的术语“受试者”、“个体”或“患者”意指任何动物，包括哺乳动物，例如小鼠、大鼠、其他啮齿类动物、兔、狗、猫、猪、牛、绵羊、马或灵长类动物，例如人。
61.如本文所用，术语“纯的”是指当分离时，分离物含有按分离物的重量计至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的本文所述的化合物。
62.如本文所用，短语“基本上分离的”意指从其形成或检测的环境中至少部分地或基本上分离的化合物。
63.还应理解，本文描述的某些特征(为清楚起见，在单独实施方式的上下文中描述)也可以在单个实施方式中组合提供。相反，为简洁起见，在单个实施方式的上下文中描述的各种特征也可以单独提供或以任何合适的子组合提供。
64.术语“细胞或细胞群”旨在包括悬浮液或单层中的单细胞以及多细胞。全组织也构成细胞群。
65.可以通过选择基因递送方法来针对特定情况调整表达的持续时间。术语“短期表达”例如是指在数天而非数周的持续时间内表达所需的蛋白质。因此，例如，使用modrna作为基因递送方法实现所选择的鞘脂代谢蛋白的瞬时表达，持续长达约11或12天。短持续时间的快速、瞬时表达可以足以例如延长卵母细胞和胚胎在ivf之前的存活率和质量。
66.术语“modrna”是指可用于表达目标基因的合成的修饰rna。在modrna中进行化学修饰，例如用假尿苷代替尿苷，稳定分子并增强转录。另外，与将蛋白质剂直接递送到细胞(其可以激活免疫系统)不同，modrna的递送可以在没有免疫影响的情况下实现。在例如wo 2012/138453中更详细地描述了modrna用于体内和体外表达的用途，其通过援引整体据此并入。
67.kariko等人“incorporation of pseudouridine into mrna yields superior nonimunogenic vector with increased translational capacity and biological stability,”mol.ther.16(11):1833-1840(2008)，其通过援引整体据此并入)发现，分别用假尿苷和5-甲基胞苷取代尿苷和胞苷显著降低了由外源rna引起的免疫应答，这为实现了治疗蛋白瞬时表达的新型基因递送奠定了基础。
68.修饰mrna(modrna)是相对新的基因递送系统，其可以在体外或体内用于实现治疗蛋白在异质细胞群中的瞬时表达。掺入特异性修饰核苷使得modrna能够有效地翻译而不触发抗病毒和先天免疫应答。在本公开中，modrna显示出在递送“存活基因”的短期稳健基因表达方面是有效的，并且其在基因治疗领域中的用途正在扩大。在例如kondrat等人，“synthesis of modified mrna for myocardial delivery,”cardiac gene therapy1521:127-138(2017)中公开了用于递送治疗蛋白的modrna的逐步合成方案，其通过援引整体据此并入。
69.modrna(相对新生的技术)具有相当大的作为疾病的疗法的潜力。例如，编码人血管内皮生长因子-a的合成的修饰rna的递送导致小鼠心肌梗死模型中的内源性心脏祖细胞的扩增和定向分化(zangi等人，“modified mrna directs the fate of heart progenitor cells and induces vascular regeneration after myocardial infarction,”nature biotechnology 31:898-907(2013)，其通过援引整体据此并入)。在另一实例中，糖尿病性神经病可以通过递送编码神经生长因子的基因的能力而减轻。另外，随着基因组编辑技术、crispr/cas9或转录激活因子样效应物核酸酶(talen)的出现，如果以瞬时且细胞特异性方式递送，转染将更安全。
70.在根据本公开的实例中，编码可影响心肌细胞发育或采用心肌细胞样表型的蛋白质的基因递送分子包括modrna。尽管存在用于实现外源蛋白表达的各种基因递送方法，例如使用质粒、病毒或mrna，但在某些情况下modrna作为基因递送工具提供了诸多优点。
defined factors,”cell 142:375-386(2010)，其通过援引整体据此并入。此外，用小分子抑制剂如sb431542抑制tgfb增强心肌细胞的分化，用小分子抑制剂xav939抑制wnt信号传导也是如此。asah1表达的增加也可以促进心肌细胞的健康、生长或存活。
78.然而，这些因子活性的改变之间可能存在复杂的相互关系，这阻碍了用于增强心肌细胞形成或发育的组合方法的发展，例如在心脏损伤或损害后，或用于增加细胞群内的心肌细胞水平。
79.hand2也被证明促进心肌细胞形成，例如在斑马鱼中。schindler等人，“hand2 elevates cardiomyocyte production during zebrafish heart development and regeneration,”development 141:3112-3122(2014)，其通过援引整体据此并入。然而，是否hand2可以与一种或多种上述细胞蛋白质协同促进心肌细胞的发育，或非心肌细胞转化为心肌细胞或具有心肌细胞样表型的细胞是未知的。并且与上述对心肌细胞发育的细胞影响一样，对于组合治疗以促进损伤或损害后的心肌细胞发育和心脏健康，刺激这些因子来促进心肌细胞发育或存活和/或抑制这些因子来促进心肌细胞发育或存活的相对比例是未知的。
80.如本文所公开的，包括编码gata4、mef2c、tbx5和hand2的modrna以及编码抑制tgfb和wnt8a活性的肽，所谓的“显性负性”tgfb和“显性负性”wnt8a(分别为dntgfb和dnwnt8a)的modrna的组合物增加了包括非心肌细胞在内的细胞群内的心肌细胞数。在实例中，非心肌细胞包括心脏成纤维细胞。在另一实例中，这样的组合物包括编码asah1的modrna。在实例中，可以将组合物施用于包括非心肌细胞的细胞，导致细胞群中存在的心肌细胞数增加。
81.在一种实施方式中，gata4 modrna分子:mef2c modrna分子:tbx5modrna分子:hand2 modrna分子:dntgfb modrna分子:dnwnt8amodrna分子的比例为1:1:1:1:1:1，或2:1:1:1:0.7:0.7，或1:2:1:1:0.7:0.7，或1:1:2:1:0.7:0.7，或1:1:1:2:0.7:0.7，或1:2:1:2:0.5:0.5，或2:2:2:2:0.7:0.7。在另一种实施方式中，gata4 modrna分子:mef2c modrna分子:tbx5modrna分子:hand2 modrna分子:asah1 modrna分子:dntgfb modrna分子:dnwnt8a modrna分子的比例为1:1:1:1:1:1:1，或2:1:1:1:0.7:0.7:0.7，或1:2:1:1:0.7:0.7:0.7，或1:1:2:1:0.7:0.7:0.7，或1:1:1:2:0.7:0.7:0.7，或1:2:1:2:0.5:0.5:0.5，或2:2:2:2:0.7:0.7:0.7。
82.在一种实施方式中，当组合物包括g:m:t:h:dnt:dnw的比例时，m以高于所述组合物中存在的其他modrna的量存在。在另一种实施方式中，当组合物包括g:m:t:h:dnt:dnw的比例时，h以高于所述组合物中存在的其他modrna的量存在。在一种实施方式中，当组合物包括g:m:t:h:a:dnt:dnw的比例时，m以高于所述组合物中存在的其他modrna的量存在。在另一种实施方式中，当组合物包括g:m:t:h:a:dnt:dnw的比例时，h以高于所述组合物中存在的其他modrna的量存在。
83.对应于本文公开的modrna分子的有义dna序列呈现在表1中。
84.表1：有义dna序列
85.86.87.88.89.90.91.92.93.94.95.96.97.98.99.100.101.102.103.104.105.106.107.108.109.[0110][0111]
根据已知的密码子简并性，rna分子或modrna分子可以具有可翻译成给定氨基酸序列的核苷酸序列。任何这样的rna或modrna分子可以根据本公开使用，其中涉及通过编码的多肽鉴定的rna或modrna。本文公开的由rna或modrna分子编码的多肽的氨基酸序列的实
例示于表2中。
[0112]
表2：氨基酸序列
[0113]
[0114]
[0115]
[0116][0117]
另一方面涉及药物组合物，其包括任何前述组合物或其实例以及药学上可接受的载体。
[0118]
该方面根据上文描述的方面进行。
[0119]
如本文所述的组合物可以施用于受试者，例如哺乳动物，并且在心脏损伤或损害后，与经受这种损伤或损害但未用该组合物治疗的受试者相比，受试者心脏中存在的心肌细胞的数量增加。损伤或损害可包括心肌梗死、再灌注损伤、缺血性损伤或卒中。经历这种损伤或损害的受试者可能需要增加心肌细胞数的治疗，例如用于预防、减少、最小化或以其他方式抵消对心脏健康、结构或功能的有害影响。将组合物施用于受试者还可以促进伤口愈合，这种受试者在心脏损伤或损害后可能需要这种治疗。
[0120]
组合物可以作为制剂与一种或多种药学上可接受的载体、赋形剂或添加剂组合给药。载体、赋形剂或添加剂可以在与制剂的其他成分相容并且对其接受者无害的意义上是“可接受的”。制剂包括适于口服、肠胃外(包括皮下、皮内、肌内、静脉内和关节内)、直肠和局部(包括真皮、口腔、舌下和眼内)给药的制剂。最合适的途径可取决于接受者的病症和疾患。制剂可以方便地以单位剂型存在，并且可以通过药学领域熟知的任何方法制备。
[0121]
在一种实施方式中，组合物还包括药学上可接受的载体。如本文使用的“药学上可
接受的载体”是指常规的药学上可接受的载体。参见e.w.martin的remington's pharmaceutical sciences,mack publishing co.,easton,pa.,15th edition(1975)，其通过援引整体据此并入(描述了适于本文所述的本发明组合物的药物递送的组合物)。特别地，如本文所用的药学上可接受的载体是指涉及将目标化合物从身体的一个组织、器官或部分携带或运输至身体的另一个组织、器官或部分的药学上可接受的材料、组合物或媒介物。例如，载体可以是液体或固体填充剂、稀释剂、赋形剂、溶剂或包封材料或其组合。每种载体组分必须是“药学上可接受的”，因为它必须与制剂的其他成分相容。它还必须适合用于与它可能接触的任何组织或器官接触，这意味着它必须不携带毒性、刺激、过敏响应、免疫原性的风险，或过度超过其治疗益处的任何其他并发症。在一种实施方式中，药学上可接受的载体选自由以下组成的组：液体填充剂、固体填充剂、稀释剂、赋形剂、溶剂和包封材料。
[0122]
药学上可接受的载体(例如，添加剂，例如稀释剂、免疫刺激剂、佐剂、抗氧化剂、防腐剂和增溶剂)在所使用的剂量和浓度下对暴露于其的细胞或受试者是无毒的。药学上可接受的载体的实例包括水，例如用磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸的缓冲的水。可用于本公开的药学上可接受的赋形剂的代表性实例包括抗氧化剂，例如抗坏血酸；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，例如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；佐剂(选择以避免佐剂诱导的毒性，如美国专利no.6,355,625中所述的β-葡聚糖，其通过援引整体据此并入，或粒细胞集落刺激因子(gcsf))；亲水性聚合物，例如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，例如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖及其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，例如edta；糖醇，例如甘露糖醇或山梨糖醇；成盐抗衡离子，例如钠；和/或非离子表面活性剂，例如聚乙二醇(peg)和
[0123]
在各种实施方式中，根据本公开的组合物可以被配制用于经由任何给药途径递送。给药途径可以是指本领域已知的任何给药途径，包括但不限于心内、气溶胶、鼻腔、口腔、经粘膜、经皮、皮下或肠胃外。肠胃外是指通常与注射有关的给药途径，包括眶内、输注、动脉内、囊内、心内、皮内、肌内、腹膜内、肺内、脊柱内、胸骨内、鞘内、子宫内、静脉内、蛛网膜下、囊下、皮下、经粘膜或经气管。经由肠胃外途径，组合物可以呈用于输注或用于注射的溶液或悬浮液的形式，或冻干粉末的形式。
[0124]
在一种实施方式中，组合物可以还包括佐剂。合适的佐剂是本领域已知的，包括但不限于鞭毛蛋白、弗氏完全或不完全佐剂、氢氧化铝、溶血卵磷脂、普朗尼克多元醇、聚阴离子、肽、油乳剂、二硝基苯酚、iscomatrix和脂质体聚阳离子dna颗粒。在一种实施方式中，组合物被配制用于增加心肌细胞数与非心肌细胞数的比例，治疗心脏损伤，刺激缺血性损伤后的血管再生，治疗卒中和/或增强伤口愈合。
[0125]
根据本公开的方法可以包括使所公开的组合物(“活性成分”)与构成一种或多种辅助成分的载体结合。通常，可以通过使活性成分与液体载体或细分的固体载体或两者均匀且紧密地结合，然后，如果需要，使产物成型为所需制剂来制备制剂。适于口服给药的本公开的制剂可以作为离散单元提供，例如各自含有预定量的活性成分的胶囊、扁囊剂或片剂；作为粉末或颗粒；作为在水性液体或非水性液体中的溶液或悬浮液；或者作为水包油液体乳液或油包水液体乳液。活性成分也可以以大丸剂、冲剂或糊剂的形式存在。
[0126]
在一些实例中，有效化合物可以与赋形剂结合并且以可摄入片剂、口含片、锭剂、
胶囊、酏剂、悬浮剂、糖浆剂、糯米纸囊剂等的形式使用。片剂、锭剂、丸剂、胶囊剂等还可含有以下：粘合剂，诸如例如黄芪胶、阿拉伯胶、玉米淀粉、明胶或其组合；赋形剂，诸如例如磷酸二钙、甘露糖醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁或其组合；崩解剂，诸如例如玉米淀粉、马铃薯淀粉、海藻酸或其组合；润滑剂，诸如例如硬脂酸镁；甜味剂，诸如例如蔗糖、乳糖、糖精或其组合；调味剂，诸如例如薄荷油、冬青油、樱桃调味剂、橙子调味剂等。当剂量单位形式是胶囊时，除了上述类型的材料之外，它还可以含有液体载体。各种其他材料可以作为包衣存在或以其他方式改变剂量单位的物理形式。例如，片剂、丸剂或胶囊可以用虫胶、糖或两者包衣。当剂量形式是胶囊时，除了上述类型的材料之外，它可以含有载体，例如液体载体。明胶胶囊、片剂或丸剂可以是肠溶包衣的。肠溶包衣防止组合物在ph是酸性的胃或上肠中变性。到达小肠后，其中的碱性ph溶解包衣并允许组合物被释放并且被特化细胞例如肠上皮细胞和派尔斑m细胞吸收。酏剂的糖浆可以含有作为甜味剂的活性化合物蔗糖，作为防腐剂的对羟基苯甲酸甲酯和对羟基苯甲酸丙酯，染料和调味剂，例如樱桃或橙子调味品。当然，用于制备任何剂量单位形式的任何材料应该是药物纯的并且在所使用的量下基本上是无毒的。此外，可以将有效化合物掺入缓释配制剂和制剂。
[0127]
片剂可以任选地与一种或多种辅助成分一起通过压制或模制制造。压制片剂可以通过在合适的机器中压制任选地与粘合剂、润滑剂(lubricant)、惰性稀释剂、润滑剂(lubricating agent)、表面活性剂或分散剂混合的自由流动形式如粉末或颗粒的活性成分来制备。模制片剂可以通过在合适的机器中模制用惰性液体稀释剂润湿的粉末状化合物的混合物来制造。片剂可以任选地被包衣或刻痕，并且可以被配制以提供其中的活性成分的持续、延迟或控制释放。
[0128]
用于肠胃外给药的制剂包括水性和非水性无菌注射溶液，其可含有抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂和使制剂与预期接受者的血液等渗的溶质。用于肠胃外给药的制剂还可以包括水性和非水性无菌悬浮液，其可以包括悬浮剂和增稠剂。制剂可以以多剂量容器中的单位剂量存在，例如密封的安瓿和小瓶，并且可以在冷冻干燥(冻干)条件下储存，仅需要在临使用前加入无菌液体载体，例如盐水、磷酸盐缓冲盐水(pbs)等。即时注射溶液和悬浮液可以由前述类型的无菌粉末、颗粒和片剂制备。
[0129]
如本文所用，术语“药学上可接受的载体”是指无菌水性或非水性溶液、分散液、悬浮液或乳液，以及用于在即将使用之前重构成无菌注射溶液或分散液的无菌粉末。合适的水性和非水性载体、稀释剂、溶剂或媒介物的实例包括水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)、羧甲基纤维素及其合适的混合物、植物油(例如橄榄油)和可注射的有机酯(例如油酸乙酯)。例如，可以通过使用包衣材料如卵磷脂，通过在分散体的情况下维持所需的粒度以及通过使用表面活性剂来维持适当的流动性。这些组合物还可以含有佐剂，例如防腐剂、润湿剂、乳化剂和分散剂。通过包含各种抗细菌剂和抗真菌剂(例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸等)可以确保防止微生物的作用。还可以期望包括等渗剂，例如糖、氯化钠等。注射药物形式的延长吸收可以通过包含延迟吸收的剂(例如单硬脂酸铝和明胶)来实现。通过在可生物降解的聚合物(例如聚丙交酯-聚乙交酯、聚(原酸酯)和聚(酸酐))中形成药物的微囊基质来制备可注射的贮库形式。根据药物与聚合物的比例和所用的特定聚合物的性质，可以控制药物释放的速率。贮库注射制剂也可以通过将药物包埋在与身体组织相容的脂质体或微乳剂中来制备。注射制剂可以例如通过经细菌截留过滤器过滤或通过
掺入无菌固体组合物形式的灭菌剂来灭菌，所述无菌固体组合物可以在即将使用之前溶解或分散在无菌水或其他无菌注射介质中。合适的惰性载体可以包括糖，例如乳糖。
[0130]
制剂可以包括不同类型的载体，这取决于制剂是否将以固体、液体或气溶胶形式给药，以及对于这种给药途径如注射是否需要是无菌的。作为制剂的组合物可以静脉内、皮内、经皮、鞘内、动脉内、腹膜内、鼻内、阴道内、直肠内、外用、肌内、皮下、粘膜、口服、外用、局部、吸入(例如，气溶胶吸入)、注射、输注、持续输注、直接靶向细胞的局部灌注浴、经由导管、经由灌洗、在乳膏中、在脂质组合物(例如，脂质体)中，或通过其他方法或前述方法的任何组合给药，如本领域普通技术人员已知的(参见，例如，remington’s pharmaceutical sciences,18th ed.mack printing company,1990，其通过援引整体据此并入)。
[0131]
载体、赋形剂或添加剂可以包括有助于modrna跨细胞膜的细胞摄取、转运或转移以允许从细胞内翻译蛋白质产物的组合物。可以使用各种细胞穿透肽、纳米颗粒、脂质复合物构型和用于增强细胞摄取的其他载体。商购实例包括rna imax
tm
、messenger max
tm
、jet messenger
tm
和trans it
tm
。
[0132]
组合物可以给药于受试者，所述组合物包括一定量的给定modrna，或者编码彼此不同的肽的多个modrna分子之间的相对量以治疗有效剂量或量结合应用于组合物中。即，组合物中彼此不同物质的量或相对量可以足以对心脏功能、心脏健康、心脏结构、伤口愈合或者指示或被认为或已知对应于积极的健康结果或积极的心脏健康或功能的心输出量的测量产生有益效果。实例可以包括受试者心脏中心肌细胞的增加，或心输出量的测量的改善，例如增加的射血分数(随着每次心跳被排出的左心室中血液总量的百分比)、增加的心输出量(心脏每分钟每心室泵出的血液量)、增加的每搏量(由于心脏收缩而从每心室射出的血液体积)或缩短分数(舒张末期与收缩末期之间左心室直径的缩短程度)。在实例中，可以给药多种独立的组合物，每种组合物包括待给药的一种或仅子集类型的modrna，其中独立的组合物组合给药。在实例中，这种组合物的组合产生了施用于细胞或受试者的相对比例的各种类型的modrna，就像所有这种子集在单一组合物中组合一样。
[0133]
另一方面涉及增加细胞群内心肌细胞数与非心肌细胞数的比例的方法，包括使所述细胞群与前述组合物或其实例接触。在一种实施方式中，非心肌细胞包括心脏成纤维细胞。
[0134]
该方面根据上文描述的方面进行。
[0135]
另一方面涉及治疗心脏损伤的方法，其包括向需要此类治疗的患者给药治疗有效量的前述组合物或其实例。在一种实施方式中，心脏损伤包括心肌梗死。在另一种实施方式中，心脏损伤包括再灌注损伤。
[0136]
该方面根据上文描述的方面进行。
[0137]
另一方面涉及在缺血性损伤后刺激血管再生的方法，其包括使缺血性损伤所损伤的组织与前述组合物或其实例接触。
[0138]
该方面根据上文描述的方面进行。
[0139]
另一方面涉及治疗卒中的方法，其包括向需要此类治疗的患者给药治疗有效量的前述组合物或其实例。
[0140]
该方面根据上文描述的方面进行。
[0141]
另一方面涉及增强伤口愈合的方法，其包括向需要此类增强的患者给药治疗有效
量的前述组合物或其实例。
[0142]
该方面根据上文描述的方面进行。
[0143]
另一方面涉及刺激骨骼肌再生的方法，其包括向需要此类刺激的患者给药治疗有效量的前述组合物或其实例。
[0144]
如本文所用，术语“参考水平”是指可以出于比较目的而成为目标的物质的量，例如，特定细胞类型(例如，干细胞)。在一些实施方式中，参考水平可以是细胞类型的群体的水平或浓度，表示为来自健康(无疾病和/或无病原体)受试者的对照群体的样品的水平或浓度的平均值。在其他实施方式中，参考水平可以是在不同时间(例如，在使用本发明之前)在同一受试者中的水平，例如在受试者出现疾病、疾病状况和/或致病性感染之前，在开始治疗(诸如例如，干细胞疗法)之前或在疗法早期时确定的水平。根据本发明的这个方面的哺乳动物受试者包括，例如，人类受试者、马受试者、猪受试者、猫受试者和犬受试者。人类受试者是特别优选的。
[0145]
出于本公开的这个和其他方面的目的，靶标“受试者”包括任何脊椎动物，例如动物、优选哺乳动物，更优选人。在给药本公开的组合物用于增加心肌细胞数与非心肌细胞数的比例、治疗心脏损伤、刺激血管再生、治疗卒中和/或增强伤口愈合的目的的背景下，靶标受试者包括具有或处于患有缺血性心脏病的风险中、心肌细胞与非心肌细胞的比例较低(与参考水平相比)、心脏损伤、血管变性、卒中和/或由本文所述的任何病症引起的一个或多个伤口的任何受试者。特别易感的受试者包括成人和老年人。然而，具有或处于患有本文所述的任何病症的风险的任何婴儿、青少年、成人或老年人可以根据本公开的方法治疗。在一种实施方式中，受试者是婴儿、青少年或成人。
[0146]
如本文所用，短语“治疗有效量”是指引起研究人员、兽医、医生或其他临床医师在组织、系统、动物、个体或人类中寻求的生物或医学响应的有效化合物或药剂的量。治疗效果取决于所治疗的疾患或所需的生物效果。如此，治疗效果可以是与疾患相关的症状的严重程度的降低和/或疾患进展的抑制(部分或完全)，或改善疾患的治疗、治愈、预防或消除，或改善副作用。引起治疗响应所需的量可以基于受试者的年龄、健康、大小和性别来确定。最佳量也可以基于监测受试者对治疗的响应来确定。术语“治疗(treatment)”或“治疗(treat)”可以包括缺血性心脏病的有效抑制、压制或停止，较低比例的心肌细胞与非心肌细胞(与参考水平相比)，心脏损伤，血管变性，卒中和/或由本文所述的任何病症引起的一个或多个伤口，以便预防或延迟发作、延缓进展或减轻缺血性心脏病的症状，较低比例的心肌细胞与非心肌细胞(与参考水平相比)，心脏损伤，血管变性，卒中和/或由本文所述的任何病症引起的一个或多个伤口。
[0147]
如本文所用，样品可以包括从活体系统或受试者获得的任何样品，包括例如血液、血清和/或组织。在一种实施方式中，通过微创或无创方法(例如，通过尿液收集、粪便收集、抽血、针吸和涉及最小风险、不适或努力的其他程序)取样来获得样品。替代地，样品可以是气态(例如，已经呼出的呼吸)或液态流体。液体样品可以包括，例如，尿液、血液、血清、组织间液、水肿液、唾液、泪液、炎性渗出物、滑液、脓肿、脓胸或其他感染液、脑脊液、汗液、肺分泌物(痰)、精液、粪便、胆汁、肠道分泌物、鼻腔排泄物和其他液体。样品还可以包括临床样品，例如血清、血浆、其他生物流体或组织样品，并且还包括培养物中的细胞、细胞上清液和细胞裂解物。在一种实施方式中，样品选自由以下组成的组：全血、血清、尿液和鼻腔排泄
物。样品可以是体内的或离体的。
[0148]
在一种实施方式中，该方法包括给药一种或多种治疗受试者的缺血性心脏病、较低比例的心肌细胞与非心肌细胞(与参考水平相比)、心脏损伤、血管变性，卒中和/或由本文所述的任何病症引起的一个或多个伤口的附加剂。
[0149]
如本文所用，术语“同时”治疗用途是指任选地通过相同途径并且同时或基本上同时给药至少一种除本文所述的组合物以外的附加剂。如本文所用，术语“单独”治疗用途是指通过不同的途径同时或基本上同时给药至少一种除本文所述的组合物以外的附加剂。如本文所用，术语“顺序的”治疗用途是指在不同时间给药至少一种除本文所述的组合物以外的附加剂，给药途径相同或不同。更具体地，顺序使用是指在给药本文所述的组合物之前全部给药附加剂。因此，可以在施用本文所述的组合物之前几分钟、几小时或几天内给药附加剂。
[0150]
在一种实施方式中，附加剂可以包括，例如，一种或多种抗生素化合物；一种或多种抗微生物化合物；一种或多种抗体；一种或多种杀生物剂；一种或多种纳米颗粒；一种或多种自组装纳米颗粒；一种或多种病毒颗粒；一种或多种噬菌体颗粒；一种或多种噬菌体dna；遗传物质，包括但不限于质粒、rna、mrna、sirna和适配体；一种或多种化学治疗剂；一种或多种生长因子；一种或多种合成支架，包括但不限于水凝胶等；一种或多种天然支架，包括但不限于胶原凝胶和去细胞化组织(完整的、溶解的、变性的或粉末状的)；一种或多种电极，一种或多种药物或药物化合物，包括但不限于抗炎剂、炎症剂、止痛剂和麻木剂；一种或多种微生物以及一种或多种细菌。
[0151]
在以下描述中，参考构成其一部分的附图，并且在附图中通过例示的方式示出了可以实践的具体实施方式。详细描述这些实施方式以使所属领域的技术人员能够实践本公开，并且应了解，在不背离本公开的范围的情况下，可以采用其他实施方式并且可以进行结构、逻辑和电气上的改变。因此，以下对示例性实施方式的描述不应被认为是限制性的。
[0152]
可以通过参考以下实施例进一步说明本公开。
[0153]
实施例
[0154]
以下实施例旨在说明，但决不旨在限制如所附权利要求书中所阐述的本公开的范围。
[0155]
实施例1-材料和方法。
[0156]
小鼠-所有动物程序根据由icahn school of medicine at mount sinai institutional animal care and use committee(西奈山伊坎医学院动物护理和使用委员会)(iacuc)批准的方案进行。对于体外实验，从p0-p4α-肌球蛋白重链-mcherry(α-mhc-mcherry)转基因新生儿心脏(小鼠购自jackson laboratories)分离心脏成纤维细胞。对于谱系追踪研究，通过杂交tnnt-cre小鼠(由dr.chen-leng cai赠予)和rosa26mtmg(jackson laboratory)小鼠产生tnnt2mercremer/ /r26mtmg/ 小鼠。在11周龄时，将溶解在芝麻油中的他莫昔芬以0.1mg他莫昔芬/1g体重连续3天注射。注射他莫昔芬后一周通过永久结扎左前降支(lad)动脉诱发心肌梗死(mi)。将雄性和雌性小鼠随机分成四个不同的组(luc、7g、7g gmt(hx2)和7g g(mx2)th)，并且在开胸手术期间将modrna直接注射到心肌中。对于echo、mri和长期存活分析，8-10周龄的cfw小鼠在诱导mi后用四种modrna类型治疗，并使其在动物设施中恢复6个月。监测并记录死亡情况。对于肢体缺血性研究，使用4月龄的
apoe-/-小鼠(雄性和雌性)。通过将股动脉与股神经和静脉分离，经由左股动脉的结扎诱导单侧后肢缺血，然后在髂内动脉和腘动脉水平处切割。在动脉结扎后，随机小鼠在腓肠肌中的3个不同位点接受luc和7g的注射。
[0157]
modrna合成-通过质粒模板(geneart,thermo fisher scientific)的体外转录产生所有modrna。用于制备本研究的modrna的开放阅读框序列的完整列表可见于本文所示的表1中。转录步骤涉及抗反向帽类似物的定制核糖核苷酸共混物；30-o-me-m7g(50)ppp(50)g(6mm,trilink biotechnologies)；鸟苷三磷酸(1.5mm,life technologies)；腺苷三磷酸(7.5mm,life technologies)；胞苷三磷酸(7.5mm,life technologies)和n1-甲基假尿苷-5-三磷酸(7.5mm,trilink biotechnologies)。接着，用megaclear试剂盒(life technologies)纯化modrna，并用antarctic phosphatase(new england biolabs)处理。为了消除任何剩余的杂质，用megaclear试剂盒再纯化modrna，并使用nanodrop光谱仪(thermo scientificc)定量。最后，用乙醇和乙酸铵沉淀modrna并重悬在10mm tris-hcl和1mm edta中。
[0158]
modrna转染-对于体外转染，按照由rnaimax制造商提供的说明书，将铺在24孔板和6孔板中的细胞分别使用编码各种基因的2.5ug的mrna和10ug的mrna，使用rnaimax转染试剂(life technologies)转染。根据先前公开的方法进行体内基因递送。simeonov等人，“direct reprogramming of human fibroblasts to hepatocyte-like cells by synthetic modified mrnas,”plos one.9:e100134(2014)，其通过援引整体据此并入。使用蔗糖柠檬酸盐缓冲液递送modrna，所述缓冲液含有在无核酸酶的水(0.3g/ml)中的20μl蔗糖和20μl柠檬酸盐(0.1m ph＝7；sigma)与20μl的不同modrna浓度的盐水混合至总体积为60μl。将转染混合物直接注射到mi周围的心肌中(两个在结扎的两侧，一个在顶端)，每个位点20μl。
[0159]
细胞培养：小鼠心脏成纤维细胞培养-将从新生小鼠分离的心脏切成约1mm3大小的小块并在摇床上用在pbs和0.25％(wt/vol)胰蛋白酶中的ii型胶原酶消化20分钟。消化后，将块状心脏组织在600g下离心2分钟，并在37℃下将成纤维细胞外植体培养基(iscove改良dulbecco培养基(imdm)，含20％fbs)铺板于10cm培养皿中(每皿3-5只心脏)。孵育30分钟后，将板用pbs洗涤，并将细胞用新鲜培养基淬灭。当汇合时，用pbs洗涤附着的细胞，用5分钟0.05％胰蛋白酶处理收集并用成纤维细胞外植体培养基淬灭。然后通过70-μm过滤器过滤细胞并收集沉淀。然后，将细胞通过荧光激活细胞分选(facs)分选mcherry阴性细胞，以10000个细胞/cm2的浓度铺板到6孔明胶包被的板上，并新鲜用于所有重编程研究。用rnaimax转染modrna 6小时后，用包含dmem:m199(4:1)、10％fbs、1x非必需氨基酸(neaa)和1x青霉素/链霉素的心肌细胞诱导培养基(icm)替换培养基。然后，分别在感染后24小时和48小时添加smi sb431542(2.6μm)和xav939(5μm)。
[0160]
细胞培养：人细胞系-正常人心脏成纤维细胞-心室(nhcf-v)购自lonza(cc-2904)并且生长在心脏成纤维细胞生长培养基(lonza,cc-4526)中。一旦半汇合，在用重编程基因转染之前3天用sv40-大t modrna转染细胞以获得稳定的永生化细胞系。将细胞用不同的modrna和smi(无论何处提及)连续6天转染以进行wb，并连续14天转染以进行心肌细胞重编程测定。对于wb实验，在第1-6天期间每天收集细胞，而在第14天进行重编程分析(qpcr和icc)。
[0161]
免疫荧光
–
mi后28天，收获小鼠心脏，并通过在右心室腔室中注射1ml pbs除去过量的血液。通过在4％pfa中孵育过夜来固定心脏，随后用pbs洗涤至少1小时。然后将心脏置于4℃的30％蔗糖溶液中过夜。第二天，将心脏固定在oct中并在-80℃冷冻。通过低温恒温器制备横向10μm厚的切片，并在pbs中再水合5分钟来进行免疫染色。所有染色以3-8只心脏/组进行，其中2-3个切片/心脏。为了在modrna处理后免疫染色mcherry阴性的新生小鼠非cm，在室温下将细胞固定在含有4％pfa的盖玻片上15分钟，然后用pbst洗涤3次。用含0.1％triton x100的pbs(pbst)将细胞/组织透化7分钟，然后用第一抗体过夜染色。使用在pbst、gfp(abcam,#13970)和tdtomato(origene,#8181-200)中稀释的推荐浓度的肌节型α-辅肌动蛋白(abcam,#9465)、心肌肌钙蛋白i(abcam,#7003)和cd31(r&dsystems,#3628)。第二天，用pbst(5次，每次4分钟)洗涤载玻片，然后与在pbst中稀释的第二抗体(invitrogen,1:200)在室温下孵育2小时。为了除去第二抗体，将样品进一步用pbst洗涤(3次，每次5分钟)，并用在pbst中稀释的hoechst 33342(1μg/ml)染色7分钟。在用pbst洗涤5次，每次4分钟后，用封固剂(vectashield)固定载玻片用于成像。将染色的载玻片储存在4℃下。在zeiss荧光显微镜上以10x、20x和40x放大倍率拍摄荧光图像。
[0162]
masson三色染色-进行masson三色染色以评估在mi和modrna处理后lv中的瘢痕大小。将oct冷冻的横向心脏切片在室温下风干30分钟至1小时，然后进行染色。将载玻片用bouin溶液在55c预染色45分钟。然后，将载玻片保持在weigert铁苏木精、biebrich scarlet-acid fucshin、磷钨酸/磷钼酸溶液和苯胺蓝溶液中，持续制造商建议的时间。然后，组织样品用乙酸分化2分钟，并用95％乙醇和无水乙醇脱水。在用二甲苯清除后，用permount封固剂(fisher scientific)固定载玻片。使用明视野显微镜采集图像，并使用imagej软件进行瘢痕大小分析。
[0163]
h&e染色
–
h&e染色根据标准方案进行。将oct冷冻的横向心脏切片在室温下风干30分钟至1小时，然后在pbs中水合10分钟。将载玻片保持在苏木精溶液中2分钟并用自来水洗涤5分钟。然后，用伊红溶液将切片染色1分钟，并用自来水洗涤5分钟。将载玻片转移到pbs中5分钟。然后将切片分别在100％乙醇和二甲苯中脱水1分钟。最后，用permount封固剂(fisher scientific)固定切片。在明视场显微镜上拍摄图像。
[0164]
蛋白质印迹-在给定的时间点从相应的细胞或解冻的组织分离总蛋白。使用sds-pag电泳系统在4％-15％mini-protean tgx无染色凝胶(bio-rad)中解析来自每个样品的20μg蛋白质。将所得条带转移到聚偏二氟乙烯(pvdf)膜(bio-rad)上。将膜在室温下封闭(5％bsa在tris-缓冲盐水tween 20(tbs；50mm tris-hcl[ph 7.4],150mm nacl,0.1％tween 20)1小时，然后与在tbst中的5％bsa中稀释的第一抗体在4c下孵育过夜。使用抗-flag(1:1,000,sigma,#a8592)；抗-vegfa(1:1,000,abcam,#51745)；抗-gapdh(辣根过氧化物酶[hrp]偶联物1:3,000,cell signaling,#8884)和小鼠单克隆抗-β-肌动蛋白(辣根过氧化物酶[hrp]偶联物1:3,000,cell signaling,#12262)抗体。抗兔和抗小鼠hrp偶联的第二抗体购自cell signaling。抗原或抗体复合物用chemidoc touch成像系统(bio-rad)可视。
[0165]
使用实时pcr进行rna分离和基因表达分析-将quick rna试剂盒(zymo research)用于在上述时间点从细胞和缺血性小鼠组织分离总rna，并根据制造商的说明书使用iscript
tm cdna合成试剂盒(bio rad)进行逆转录。在mastercycler realplex 4序列检测
器(eppendorf)上使用sybr green(perfecta sybr green fastmix,quantabio)进行实时qpcr分析。将数据归一化为gapdh(体外实验和体内肢体组织实验)、18s(心脏组织的体内实验)和b2m(人体实验)。基因表达的倍数变化通过方法测定并相对于内部对照呈现。pcr引物序列显示在表3中。
[0166]
表3：本研究中用于qpcr的引物序列
[0167]
[0168]
[0169][0170]
超声心动图(echo)-在mi后2天和28天进行经胸廓二维超声心动图，以使用配备有40mhz小鼠超声探针的ge cares insite(v7r5049)评估lv尺寸和功能。在双盲研究中(即，外科医生和超声心动图技术人员都不知道治疗)，将luc、7g或7g gmt(hx2)注射到cfw小鼠(8至12周龄)中。用空气中的1-2％异氟醚麻醉小鼠，并进行成像。射血分数和缩短分数计算为基于m型超声扫描的舒张期体积(edv)和收缩末期体积(esv)尺寸的百分比。％缩短分数计算为＝(舒张末期左心室内部尺寸(lvidd)-收缩末期左心室内部尺寸(lvids))/lvidd*100。对3-10个心脏/治疗组进行超声心动图检查。
[0171]
磁共振成像(mri)-在双盲研究中，在lad结扎后第28天，对用luc、7g或7g gmt(hx2)modrna处理的cfw小鼠(8周龄)进行mri评估。在具有心脏和呼吸门控(sa instruments)的7-t bruker pharmascan上获得延迟增强cine图像。为了成像，用空气中的1-2％异氟醚麻醉小鼠。为了监测ecg期间的最佳温度，将呼吸和温度探针置于小鼠上。在iv注射0.3mmol/kg钆-二亚乙基三胺五乙酸后10至20分钟进行成像。用ecg触发和呼吸门控的flash序列获取从顶点到底部的8至10个短轴切片的堆叠，参数如下：回波时间(te)为2.7msec，分辨率为200μm
×
200μm；切片厚度为1mm；每r-r间隔16帧；4次激发，具有60
°
的翻转角。成像后，分析获得的数据以计算％射血分数、心输出量、每搏量和％mi大小。
[0172]
免疫检测方法-在mi和modrna注射后28天对从小鼠分离的心脏组织进行渗漏血管检测。同工凝集素b4(0.5mg/ml,vector lab)用于在冷冻切片中染色内皮细胞以确定毛细血管密度。为了评估血管渗漏，将250μl同工凝集素b4和250μl 70kd fitc-葡聚糖珠(50mg/ml,sigma)的混合物注射到小鼠尾静脉中。注射后30分钟收集心脏并使用4％pfa固定过夜。用pbs洗涤4次后，将心脏置于30％蔗糖中过夜，第二天在oct中冷冻。在显微镜下评估切片的心脏组织的血管泄漏。
[0173]
缺血肢体模型中的血流分析-使用激光多普勒灌注成像(ldpi)分析仪(moor instruments,axminster,uk)，在预定时间点在结扎和对照肢体中进行血流测量。除去后肢毛发并将动物保持在37℃的加热垫上以最小化温度变化。在缺血和给药modrna后第0天(结扎前)、1天、7天、14天和21天记录血流。通过比较缺血肢体与对照后肢的血流来计算血液灌注％。
[0174]
统计分析-通过非配对双尾t检验、单向anova、tukey多重比较检验、单向anova、bonferroni事后检验或存活曲线的log-rank(mantel-cox)检验来确定统计显著性，如各自图例中所详述。p-值《0.05被视为是显著的。所有的图形表示平均值，并且值被报告为平均值
±
平均值的标准误差。非配对双尾t检验基于假定的正态分布。****,p《0.0001***,p《0.001,**,p《0.01,*,p《0.05,n.s，不显著。
[0175]
实施例2-modrna组合物将成纤维细胞重编程为心肌细胞样细胞。
[0176]
从携带转基因的小鼠中分离出心脏成纤维细胞，其中α-肌球蛋白重链(α-mhc)启动子是富含心肌细胞的蛋白质，可驱动标记蛋白mcherry的表达并用不同的modrna组合转染，包括gata4加mef2c加tbx5(gmt)、gmt加hand2(gmth)、gmt加asah1(gmta)、或gmt、gmth、
或gmtha加tgfb小分子抑制剂sb431542和wnt8a小分子抑制剂xav939)(smi)。modrna包括代替尿苷的假尿苷并用试剂处理以形成5'utr cap 1结构(cleancap
tm
)。所有处理都增加了也表达mcherry的α-辅肌动蛋白阳性细胞数，表明采用了心肌细胞表型。在用gmtha smi处理后，观察到这种细胞的最高数量。处理还增加了心肌肌钙蛋白(ctnt)表达，进一步表明心肌成纤维细胞采用心肌细胞表型，在包括hand2 modrna的组合中观察到最高水平。在其他处理条件下，包含dntgfb modrna代替sb431542或dnwnt8a modrna代替xav939也增加mcherry表达和ctnt表达。
[0177]
在用所有七种gata4、mef2c、tbx5、hand2、asah1、dntgfb和dnwnt8a modrna处理后，观察到最高水平的mcherry表达。转染后三周，接受这种处理的细胞也显示自主收缩，进一步证实了心肌细胞样表型。细胞接受不同相对量的不同modrna分子，如表4所示：
[0178]
表4：不同处理中的modrna分子的比例
[0179][0180]
图1中例示出一些实例。所有处理引起ctnt和α-mhc表达的增加。有趣且令人惊奇的是，将gata4、mef2c、tbx5或hand2增加50％(由剩余的gata4、mef2c、tbx5或hand2 modrna减少30％抵消，取决于实施例)消除了心肌细胞蛋白表达的增加。用附加modrna分子转染不会进一步增加。
[0181]
实施例3-小鼠中的modrna组合物增加心肌细胞样细胞并改善心脏健康。
[0182]
将具有驱动他莫昔芬诱导的cre重组酶表达的心肌肌钙蛋白t启动子的小鼠与携带由rosa26启动子驱动的mt/mg报告基因的转基因小鼠杂交。用他莫昔芬处理的双转基因小鼠表达细胞膜定位的tdtomato(mt)荧光，但表达cre重组酶的细胞(和将来衍生自这些细胞的细胞谱系)(在这种情况下是心肌细胞)具有细胞膜定位的egfp(mg)荧光。因此可以通过细胞膜定位的egfp的表达来鉴定心肌细胞。
[0183]
在8周龄时用他莫昔芬治疗小鼠。在10周龄时，它们被给予心肌梗死(mi)事件(左前降支动脉的结扎)。在12和13周龄时发生modrna注射。在15周龄时，测试心脏功能和细胞表达。如图2所示，在具有mi事件的小鼠中，用单独的7g gmt(hx2)、7g或gmt处理都引起梗死中心肌细胞样细胞的增加。如图3所示，与荧光素酶转染的对照小鼠相比，7g和7ggmt(hx2)处理显著增加了射血分数，表明改善了心脏功能。图4显示与对照相比，7g gmt(hx2)显著增加了心输出量，再次表明改善了心脏健康。图5显示与对照相比，7g gmt(hx2)显著增加了每搏量，再次表明改善了心脏健康。图6显示与对照相比，7g gmt(hx2)显著增加了缩短分数，再次表明改善了心脏健康。图7显示7g和7g gmt(hx2)引起梗死大小的显著减小。图8和图9显示在7g处理后增加的毛细血管密度和vegf-a表达。
[0184]
实施例4-七种基因modrna混合物(7g)可以在体外诱导小鼠或人非cm的高效心脏重编程。
[0185]
为了证明modrna技术可用于将成年小鼠非cm重编程为cm样细胞，产生了先前公开的基于αmhc-mcherry转基因小鼠的体外谱系追踪模型(ieda等人，“direct reprogramming of fibroblasts into functional cardiomyocytes by defined factors,”cell 142:375-86(2010)和qian等人，“in vivo reprogramming of murine cardiac fibroblasts into induced cardiomyocytes,”nature 485:593-8(2012)，两者通过援引整体据此并入)。在该模型中，携带αmhc-mcherry的小鼠的cm表达mcherry，而非cm是mcherry阴性的。使用酶解离方法，从新生小鼠心脏分离心脏细胞并培养3天，然后使用facs分选mcherry阴性细胞。将分离的mcherry阴性细胞铺板，并且一旦细胞达到部分汇合就开始modrna转染。通过mcherry报告基因在上调αmhc(cm-特异性细胞标志物)的非cm亚组中的表达证实了体外成功的心脏重编程(图10a)。由于modrna导致瞬时基因表达，重复转染可以补充转染细胞中的基因表达。为了优化重编程的gmt转染效率，用gfp或gmt modrna(flag标签)转染非cm细胞，并使用蛋白质印迹在不同的时间点(第1天至第6天)测量它们的表达(图10b)。观察到gmt表达直到modrna转染后第3天，而不是4天(图10c)。因此，从αmhc-mcherry小鼠分离的非cm每3天用gmt modrna转导，持续14天，然后用qpcr和免疫染色评估心脏重编程(图10d)。
[0186]
gmt或gmth驱动的心脏重编程可以通过抑制tgfβ和/或wnt途径来增强。abad等人，“notch inhibition enhances cardiac reprogramming by increasing mef2c transcriptional activity,”stem cell reports 8:548-560(2017)；ifkovits等人，“inhibition of tgfβsignaling increases direct conversion of fibroblasts to induced cardiomyocytes,”plos one.9:e89678(2014)；和mohamed等人，“chemical enhancement of in vitro and in vivo direct cardiac reprogramming,”circulation 135:978-995(2017)，所有文献通过援引整体据此并入。此外，由于重编程过程和重复使用转染试剂可导致增加的细胞死亡率，设计了降低细胞凋亡和应激的modrna主链。strelow等人已经表明酸性神经酰胺酶(ac)过表达保护细胞免于细胞死亡升高并减少细胞应激。strelow等人，“overexpression of acid ceramidase protects from tumor necrosis factor-induced cell death,”j.exp.med.192:601-12(2000)，其通过援引整体据此并入。因此，如图10d所示，将未处理的非cm与仅用gmt或用gmt与hand2或ac(gmth或gmtha)modrna混合物以及抑制tgfβ和wnt途径的小分子(smi)处理的组(分别为sb431542和xav939)或者用gmtha与抑制tgfβ(tgfβ或ccn5的显性负性(dn))和wnt途径(dn-wnt8或wnt5a)的基因modrna处理的组进行比较。用gmt、gmth或gmtha modrna混合物以及sb431542和xav939处理的组在第一次转染后14天显示心脏重编程活性，通过上调的肌钙蛋白t(ctnt)和αmhc所示(图10e和图10f)。值得注意，gmtha产生最高的重编程速率：48％cm样细胞(αmhc

和α辅肌动蛋白

细胞，图10g和图10h)。
[0187]
此外，显示了重编程辅助小分子sb431542和xav939都可以被重编程辅助modrna(分别为dn-tgfβ或ccn5以及dn-wnt8或wnt5a modrna)替代，而不损失重编程效率(图10i-图10l)。该数据表明，7种基因(7g)modrna混合物(具有dn-tgfβ和dn-wnt8的gmtha)显著提高了ctnt和αmhc(图10i和图10j)，在体外第一次转染后14天产生57％的cm样细胞(图10k和图10l)。此外，重编程的cm样细胞中的胶原和纤连蛋白基因表达水平显著低于体外未处理
的非cm中的表达水平(图10m)。重要的是，重复转染28天而不是21天导致形成少量具有成熟肌节结构和完全心脏重编程的收缩性cm样细胞(图10n-图10p)。
[0188]
然后，评估7g modrna是否在人心室心脏成纤维细胞中诱导心脏重编程。首先，进行蛋白质表达分析以证实gmt modrna动力学与小鼠非cm中的动力学相似(图16a-图16b)。研究了不同的转染试剂，发现也与小鼠非cm类似，rnaimax转染试剂与其他市售转染试剂相比具有最高的转染效率(～80％)(图16c-图16e)。由于先前的报告表明sv40预处理(fu等人，“direct reprogramming of human fibroblasts toward a cardiomyocyte-like state,”stem cell reports 1:235-47(2013)；nam等人，“reprogramming of human fibroblasts toward a cardiac fate,”proc.natl.acad.sci.u s a110:5588-93(2013)；singh等人，“mir-590promotes transdifferentiation of porcine and human fibroblasts toward a cardiomyocyte-like fate by directly repressing specificity protein 1,”j.am.heart assoc.5(2016)；和wada等人，“induction of human cardiomyocyte-like cells from fibroblasts by defined factors,”proc.natl.acad.sci.u s a.110:12667-72(2013)，所有文献通过援引整体据此并入)和myocd添加(fu等人，“direct reprogramming of human fibroblasts toward a cardiomyocyte-like state,”stem cell reports 1:235-47(2013)；nam等人，“reprogramming of human fibroblasts toward a cardiac fate,”proc.natl.acad.sci.u s a 110:5588-93(2013)；wada等人，“induction of human cardiomyocyte-like cells from fibroblasts by defined factors,”proc.natl.acad.sci.u s a.110:12667-72(2013)，所有文献通过援引整体据此并入)产生更好的心脏重编程，因此在用或不用6种基因modrna(gmt myocd hand2 ac(gmtmha))以及重编程辅助小分子sb431542和xav939或者可以抑制tgfβ和wnt途径的不同基因modrna转染之前第3天用sv40 modrna预处理人心室心脏成纤维细胞(图16f)。这些体外结果表明，在第一次心脏重编程转染后14天，gmtmha dn-tgfβ和dn-wnt8或gmtmha dn-tgfβ和wnt5a modrna混合物显著增加ctnt和αmhc(图16g-图16h)，降低胶原表达(图16i)并且产生30-40％cm样细胞(图16j和图16k)。
[0189]
实施例5
–
筛查附加基因以提高7g的重编程效率。
[0190]
由于7g modrna可在体外产生有效的心脏重编程，因此接下来评估是否添加一个或多个选择的候选基因可以增强7g心脏重编程。预先选择具有增加心脏重编程潜力的基因(zfpm2(fu等人，“direct reprogramming of human fibroblasts toward a cardiomyocyte-like state,”stem cell reports1:235-47(2013)，其通过援引整体据此并入)、tbx6(sadahiro等人，“tbx6induces nascent mesoderm from pluripotent stem cells and temporally controls cardiac versus somite lineage diversification,”cell stem cell.23:382-395e5(2018)，其通过援引整体据此并入)、dn-snai1(muraoka等人，“mir-133promotes cardiac reprogramming by directly repressing snai1 and silencing fibroblast signatures,”embo j.33:1565-81(2014)，其通过援引整体据此并入)、mesp1(christoforou等人，“transcription factors myocd,srf,mesp1 and smarcd3 enhance the cardio-inducing effect of gata4,tbx5,and mef2c during direct cellular reprogramming,”plos one 8:e63577(2013)，其通过援引整体据此并入)、ets1
(islas等人，“transcription factors ets2 and mesp1 transdifferentiate human dermal fibroblasts into cardiac progenitors,”proc.natl.acad.sci.u s a109:13016-21(2012)，其通过援引整体据此并入)、ets2(islas等人，“transcription factors ets2 and mesp1 transdifferentiate human dermal fibroblasts into cardiac progenitors,”proc.natl.acad.sci.u s a 109:13016-21(2012)，其通过援引整体据此并入)、esrrg(fu等人，“direct reprogramming of human fibroblasts toward a cardiomyocyte-like state,”stem cell reports1:235-47(2013)，其通过援引整体据此并入)、smarcd3(christoforou等人，“transcription factors myocd,srf,mesp1 and smarcd3 enhance the cardio-inducing effect of gata4,tbx5,and mef2c during direct cellular reprogramming,”plos one 8:e63577(2013)，其通过援引整体据此并入)或srf(christoforou等人，“transcription factors myocd,srf,mesp1 and smarcd3 enhance the cardio-inducing effect of gata4,tbx5,and mef2cduring direct cellular reprogramming,”plos one 8:e63577(2013)，其通过援引整体据此并入)或者其在心脏收缩性(sumo1)、细胞存活率(ad52e4)、新生儿心脏代谢(pkm2)或端粒大小(htert)具有已知功能。尽管所有的7gmodrna混合物与附加候选modrna基因产生显著的心脏重编程(图17a-图17d)，但它们中没有一个提供了与单独的7g相似或显著更高的心脏重编程活性(图17e-图17f)。
[0191]
实施例6-具有相等比例或更高浓度的hand2或mef2c的7g modrna混合物在体外小鼠非cm中产生高心脏重编程活性。
[0192]
modrna基因递送方法相对于病毒的一个优点是能够控制被递送到细胞中的mrna的量。因此，探讨了7g modrna混合物中不同比例的重编程基因modrna(gmth)在驱动心脏重编程中的潜力(图11a-图11b)。如图11a-图11f所示，与tbx5或gata4相比，hand2或mef2c的两倍但非三倍浓度在体外产生与7g相似的心脏重编程活性(图11e-图11f)。因此，推断7g modrna混合物或增强的hand2 7g modrna混合物(7g gmt(hx2))或增强的mef2c 7g modrna混合物(7g g(mx2)th)在体外转染后14天具有～50％的心脏重编程效率。
[0193]
实施例7-7g或7g gmt(hx2)modrna混合物改善mi后的结果。
[0194]
除了在体外评估心脏重编程之外，还评估了7g modrna混合物改善mi后的功能结果的能力。为此，使用mi的小鼠模型，并在mi后2天和28天测量心脏功能(图12a-图12o和图18a-图18d)。mi后luc或7gmodrna递送后28天的mri评估(图12b-图12f)表明，在以下方面显著改善：射血分数百分比(％ef，7g为48％)与对照modrna(萤光素酶(luc))的22％相比；在心输出量(co，7g为14％)与对照的11％相比；每搏量(sv，7g为38％，与对照的28％相比)和mi大小(7g为10％，与对照的24％相比)。为了证实这些改善不是由于mi诱导的差异，在mi并用不同modrna混合物处理后2天和28天测量％缩短分数(％fs)以及舒张末期(lvidd)和收缩末期(lvids)的左心室内部尺寸(lvid)。百分比fs显著较高(7g为2.5％，与对照的-2.4％相比(图12g)。此外，虽然在对照组的第2天和第28天之间lvidd和lvids都显著不同(图12h和图12i)，但当递送7g modrna混合物时，这些差异并不显著。还评估了mi和不同处理后28天的心脏瘢痕形成和细胞外标志物如胶原和纤连蛋白的表达(图12j-图12m)。显示用7gmodrna混合物处理的小鼠中的心脏瘢痕与对照的21％相比明显更小(10％)(图3j-图3l)，并且具有更低的胶原和纤连蛋白的表达(图3m)。
tgf-alpha signaling,”mol.cell biol.21:7218-30(2001)，其通过援引整体据此并入)、hgf(kaga等人，“hepatocyte growth factor stimulated angiogenesis without inflammation:differential actions between hepatocyte growth factor,vascular endothelial growth factor and basic fibroblast growth factor,”vascul.pharmacol.57:3-9(2012)，其通过援引整体据此并入)、areg(wang等人，“amphiregulin enhances vegf-a production in human chondrosarcoma cells and promotes angiogenesis by inhibiting mir-206via fak/c-src/pkcδpathway,”cancer lett.385:261-270(2017)，其通过援引整体据此并入)、fgfa(murakami等人，“fibroblast growth factor regulation of neovascularization,”curr.opin.hematol.15:215-20(2008)，其通过援引整体据此并入)、fgfb(murakami等人，“fibroblast growth factor regulation of neovascularization,”curr.opin.hematol.15:215-20(2008)，其通过援引整体据此并入)、egf(mehta等人，“hb-egf promotes angiogenesis in endothelial cells via pi3-kinase and mapk signaling pathways,”growth factors 25:253-63(2007)，其通过援引整体据此并入)、tb4(lv等人，“thymosin beta4 induces angiogenesis through notch signaling in endothelial cells,”mol.cell biochem.381:283-90(2013)，其通过援引整体据此并入)和pdgf(xie等人，“pdgf-bb secreted by preosteoclasts induces angiogenesis during coupling with osteogenesis,”nat.med.20:1270-8(2014)，其通过援引整体据此并入)(图13g、图13h)。在mi后1周至4周，16个(fgf-2除外)中有15个血管生成因子显著上调。当在mi后递送7g gmt(hx2)modrna混合物时，可以看到类似的结果(图20a-图20h)。这表明7g和7g gmt(hx2)modrna混合物递送可能在mi背景后诱导血管生成机制。此外，这种作用在modrna递送后1周开始(图21a-图21g)，并持续至少4周，在modrna翻译停止后很长时间(约第10天)。
[0198]
由于vegfa蛋白是心脏血管形成的关键调节因子(zangi等人，“modified mrna directs the fate of heart progenitor cells and induces vascular regeneration after myocardial infarction,”nat.biotechnol.31:898-907(2013)和kikuchi等人，“an antiangiogenic isoform of vegf-a contributes to impaired vascularization in peripheral artery disease,”nat.med.20:1464-71(2014)，两者通过援引整体据此并入)，蛋白质印迹分析用于评估在mi和不同modrna处理后21天或28天的vegfa水平。显示mi后28天而非21天vegfa水平在lv中明显较高(图13g-13j以及图21h和图21i)。此外，在mi以及各种处理后不同时间点lv的qpcr评估表明，7g或7g gmt(hx2)modrna混合物降低了col1a2和纤连蛋白的水平(图21e-图21f)，特别是在mi后第2周时。由于mi后心脏中高的不受调节的vegfa水平可能会产生有害的副作用，例如水肿和血管瘤，并且可能导致血管渗漏(zangi等人，“modified mrna directs the fate of heart progenitor cells and induces vascular regeneration after myocardial infarction,”nat.biotechnol.31:898-907(2013)和lee等人，“vegf gene delivery to myocardium:deleterious effects of unregulated expression,”circulation 102:898-901(2000)，两者通过援引整体据此并入)，在mi以及不同modrna混合物处理后的不同时间点评估心脏中这些因子(图22a-图22e)。根据图21a-图21g可以看出，在mi后28天，与luc对照modrna相比，7g和7g gmt(hx2)modrna混合物没有显著改变心脏重量与体重比例(图22b)或心脏大小(图22c)，并且没有在
心肌中诱导血管瘤形成(图22d)或渗漏血管(图22e)。得出结论，尽管7g和7g gmt(hx2)modrna混合物都提高了mi后lv中的vegfa蛋白水平(图13i、图13j)，但这种提高与vegfa的有害作用无关(图22a-图22e)。此外，还确定了在使用或不使用modrna混合物转染后14天，来自小鼠或人心脏的非cm的心脏重编程是否还可以诱导较高的vegfa表达。小鼠(图23a、图23b)和人(图23c、图23d)心脏重编程导致显著增加的vegfa表达，证明非cm细胞向cm样细胞的转化可以开启促血管生成程序，促进该修复过程。
[0199]
为了进一步评估非cm中的这种促血管生成程序，试图检测在非心肌(例如，骨骼肌)的缺血条件下注射7g modrna是否可以导致损伤后增强血管形成。将先前示出的apoe-/-小鼠后肢缺血模型用作骨骼肌的血管再生的优选模型。kang等人，“apolipoprotein e-/-mice have delayed skeletal muscle healing after hind limb ischemia-reperfusion,”j.vasc.surg.48:701-8(2008)，其通过援引整体据此并入。在股动脉结扎后立即注射7gmodrna混合物或luc modrna。使用激光多普勒灌注成像评估损伤后第0、1、7、14和21天足部区域中的血液灌注(图14a)。数据显示，与luc modrna相比，7g modrna混合物显著促进血液灌注的改善(图14b和图14c)。此外，表明在肌肉缺血性损伤并且递送7g modrna混合物后，与luc对照modrna相比，与心脏组织类似，关键血管生成因子表达显著不受调节。总而言之，该数据表明，7g modrna混合物在心脏和骨骼肌中的细胞中诱导促血管生成程序(图15)。
[0200]
实施例9-讨论。
[0201]
哺乳动物心脏含有～50％的cm，而余者是非cm。心脏缺血性损伤后，大量的cm死亡并被非cm细胞类型替代。克服这种cm比例不平衡的一种方法是将非cm重编程为cm，由此从头生成cm。使用这种重编程用于心脏修复的主要障碍是心脏重编程的低效力以及使用病毒递送方法和小分子的可能的有害的副作用。在本公开中，表明通过modrna技术递送重编程基因和辅助基因消除了对病毒转染或小分子的需求，并且在体外和体内产生大量的cm样细胞。迄今为止，在转染后14天报告的最高重编程效率产生～30％cm样细胞。mohamed等人，“chemical enhancement of in vitro and in vivo direct cardiac reprogramming,”circulation 135:978-995(2017)和nam等人，“induction of diverse cardiac cell types by reprogramming fibroblasts with cardiac transcription factors,”development 141:4267-78(2014)，两者通过援引整体据此并入。在此，证明了使用7g或7g gmt(hx2)modrna混合物增加了重编程活性并在体外产生了～50％cm样细胞(图10a-图10p、图11a-图11f)。还表明使用7g myocd或gmtmha dn-tgfβ和wnt5a modrna混合物在人心室心脏成纤维细胞中产生30％或40％的重编程效率(图16a-图16j)。这些结果与先前用ghtm、mir-1和mir133a进行人心脏重编程的报告相似。nam等人，“reprogramming of human fibroblasts toward a cardiac fate,”proc.natl.acad.sci.u s a110:5588-93(2013)，其通过援引整体据此并入。另外，重复转染28天产生成熟样收缩cm的事实得到以下结论：modrna是用于体外诱导cm样细胞的有效且安全的基因递送系统(图10n-图10p)。在重编程基因modrna比例中的任何附加基因或改变不能被鉴定为提供更高的重编程水平。然而，显示将任何心脏重编程基因升高三倍，消除了重编程过程(图11a-11f)。这表明每种重编程基因都起到重要作用，并且它们中任何一个的缺乏或低水平都阻止重编程。
[0202]
使用谱系追踪体内模型可以证实，在mi并且递送7g modrna混合物后第28天，
modrna成功地促进lv中形成～25％cm样细胞(图13a-图13c)。这是比先前公开的在体内12％心脏重编程更高的心脏重编程效率。jayawardena等人，“microrna induced cardiac reprogramming in vivo:evidence for mature cardiac myocytes and improved cardiac function,”circ.res.116：418-24(2015)，其通过援引整体据此并入。尽管如此，在cm样细胞群中没有检测到具有成熟肌节的cm。这可能是由于以下发现：短期(约10天)使用modrna递送平台不足以有效地将非cm重编程为成熟的收缩cm，如先前使用具有长期表达模式的病毒递送系统所显示的。song等人，“heart repair by reprogramming non-myocytes with cardiac transcription factors,”nature 485:599-604(2012)，其通过援引整体据此并入。即使没有从头形成成年cm，该方案也导致在mi并且递送7g或7g gmt(hx2)modrna混合物后28天心脏功能、瘢痕大小和长期存活率的显著改善(图12a-图12和图18a-图18d)。还证明了这种改善是由于modrna部分心脏重编程过程中血管生成因子的诱导(图13a-图13j、图20a-图20h、图21a-图21g)。由于modrna基因递送保持了dna完整性并且还没有显示出诱导插入诱变，因此希望对于临床基因递送而言，modrna比慢病毒或逆转录病毒系统更优选。然而，这些基因转移病毒方法在lv中生成少量的功能性cm，并且它们的临床应用具有严重的不利副作用。此外，还表明modrna可以在重编程过程中消除对抑制tgfβ和wnt途径的小分子的需求。这使得所有-modrna混合物的组合物能够增强心脏重编程并导致mi后更高的毛细血管密度和心血管再生。
[0203]
重要的是，这种modrna重编程混合物不会导致异常的结果，例如心脏血管瘤或水肿(图22a-图22e)。这表明分泌的血管生成因子的modrna上调被严格调节。因此，modrna指导的心脏重编程对成熟的cm没有贡献；相反，通过旁分泌效应促进mi后的心脏保护和心血管再生。在这点上，这些发现与先前将血管生成因子分泌细胞(大多数是骨髓源细胞)递送至lv以促进心血管再生的尝试(gong等人，“exosomes derived from sdf1-overexpressing mesenchymal stem cells inhibit ischemic myocardial cell apoptosis and promote cardiac endothelial microvascular regeneration in mice with myocardial infarction,”j.cell physiol.234:13878-13893(2019)；leong等人，“cardiac stem cells for myocardial regeneration:they are not alone,”front cardiovasc med.4:47(2017)；lader等人，“cardiac stem cells for myocardial regeneration:promising but not ready for prime time,”curr.opin.biotechnol.47:30-35(2017)；beltrami等人，“adult cardiac stem cells are multipotent and support myocardial regeneration,”cell 114:763-76(2003)；yoon等人，“clonally expanded novel multipotent stem cells from human bone marrow regenerate myocardium after myocardial infarction,”j.clin.invest.115:326-38(2005)，所有文献通过援引整体据此并入)类似，益处微不足道。因此，modrna方法可以为改进先前无效的细胞因子递送方法以激发心脏修复奠定基础。此外，表明7g modrna能够促进心脏组织外的促血管生成程序(例如，骨骼肌，图14a-图14e)的能力，表明7g，其中4个基因(gata4、mef2c、tbx5和hand2)是心脏发育基因，可能不只在心脏组织中起作用，还可以促进心脏外的非cm中的促血管生成程序。这一数据揭示了部分心脏重编程的有益作用机制，其可以促进缺血性肌肉损伤后的血管再生。此外，报告了7g modrna混合物在心脏外的其他缺血性器官中诱导血管生成的显著性能，为此采用了后肢缺血模型。尽管之前已经表明vegfa modrna在缺
血性心脏或骨骼肌小鼠模型中增强了血管再生(zangi等人，“modified mrna directs the fate of heart progenitor cells and induces vascular regeneration after myocardial infarction,”nat.biotechnol.31:898-907(2013)和witman等人，“cell-mediated delivery of vegf modified mrna enhances blood vessel regeneration and ameliorates murine critical limb ischemia,”j.control release 310:103-114(2019)，其通过援引整体据此并入),但在此确定了7g混合物在modrna翻译完成后很久增强非cm在生理水平上分泌血管生成因子，并且诱导体内血管再生，为缺血性损伤的治疗提供了先进的策略。
[0204]
自2002年以来，骨髓源细胞已经在许多临床试验中被用于在患有急性mi和慢性缺血性心脏病或慢性危重肢体缺血性疾病的患者中诱导血管再生。leong等人，“cardiac stem cells for myocardial regeneration:they are not alone,”front cardiovasc med.4:47(2017)和ponemone等人，“safety and effectiveness of bone marrow cell concentrate in the treatment of chronic critical limb ischemia utilizing a rapid point-of-care system,”stem cells int.4137626(2017)，其通过援引整体据此并入。多年的临床试验表明，这种治疗是安全的并产生生理和解剖参数的适度改善，超过常规治疗。leong等人，“cardiac stem cells for myocardial regeneration:they are not alone,”front cardiovasc med.4:47(2017)和ponemone等人，“safety and effectiveness of bone marrow cell concentrate in the treatment of chronic critical limb ischemia utilizing a rapid point-of-care system,”stem cells int.4137626(2017)，其通过援引整体据此并入。然而，这种方法的根本问题是注射细胞的存活率差，并且需要增加离体培养细胞的数量，通常来自相同的供体。gong等人，“exosomes derived from sdf1-overexpressing mesenchymal stem cells inhibit ischemic myocardial cell apoptosis and promote cardiac endothelial microvascular regeneration in mice with myocardial infarction,”j.cell physiol.234:13878-13893(2019)；leong等人，“cardiac stem cells for myocardial regeneration:they are not alone,”front cardiovasc med.4:47(2017)；lader等人，“cardiac stem cells for myocardial regeneration:promising but not ready for prime time,”curr.opin.biotechnol.47:30-35(2017)；beltrami等人，“adult cardiac stem cells are multipotent and support myocardial regeneration,”cell 114:763-76(2003)；yoon等人，“clonally expanded novel multipotent stem cells from human bone marrow regenerate myocardium after myocardial infarction,”j.clin.invest.115:326-38(2005)，所有文献通过援引整体据此并入。因此，这种方法是使用现成的modrna混合物，其可以将来自瘢痕区域的非cm转化为血管生成因子分泌细胞(类似于骨髓源细胞)而没有移植问题或没有离体培养细胞的需求。
[0205]
尽管表明modrna血管生成作用也在人心脏重编程中产生(图23a-图23d)，但需要定量modrna混合物在大动物模型(例如猪)中诱导血管再生中的作用。总之，本研究的实验揭示了7g modrna混合物在缺血性肌肉损伤后的治疗血管生成功能，并且可以鼓励其他人创建不同的、新的modrna混合物用于部分或完全重编程或其他类型的多组分药物发现。
[0206]
虽然已经在附图和上文的描述中详细地说明和描述了新技术，但应将其视为说明
性的而非限制性的，应理解，仅示出并描述了优选实施方式，并且希望保护落入新技术的精神内的所有改变和修改。同样，尽管使用具体的实例、理论论证、说明和插图来说明新技术，但这些说明和所附讨论决不应被解释为限制该技术。本技术中引用的所有专利、专利申请以及对文本、科学论文、出版物等的引用都通过援引整体并入本文。
[0207]
尽管在本文已经详细地描绘和描述了优选实施方式，但对于相关领域技术人员而言，在不背离本发明的精神的情况下，可以进行各种修改、添加、替换等，并且因此这些都被视为落入所附权利要求所限定的本发明的范围内。