一种糖尿病肾病用超声诊疗系统及其应用的制作方法

1.本发明涉及医疗技术领域，具体地说，是一种新型治疗系统在治疗糖尿病肾病中的应用。


背景技术：

2.以细胞外基质(ecm)成分的过度沉积为特征的肾脏纤维化，是多种慢性肾脏病的共有病理改变，是判断慢性肾脏疾病转归的关键病理指标。据统计，美国和中国慢性肾脏病发病率分别达14％、10％，并有逐年升高趋势。慢性肾脏疾病常导致慢性肾心综合征，表现为继发于慢性肾脏疾病的心脏损伤或心脏功能异常。因此以肾纤维化为特征的慢性肾脏病是危害人类健康的全球性重大疾病。随着肾脏纤维化的发生发展，出现肾脏结构的改变和肾功能的降低，如果不能阻止或逆转其发展，最终将导致肾脏组织功能衰竭，甚至威胁生命。目前临床治疗肾脏纤维化，一般是在早期用免疫抑制剂(环孢素-a、他克莫司)或细胞毒性药物(环磷酰胺)来抑制纤维母细胞的增生和分泌，对已经发生的肾脏纤维化尚缺乏有效的干预方法。糖尿病肾病(diabeticnephropathy，dn)是糖尿病严重的并发症之一，其最重要的特征性改变是肾脏纤维化，现已成为终末期肾脏病(esrd)的首要原因，其致死率远远高于糖尿病本身。
3.超声波(ultrasound,us)是一种物理性声波，其频率在20khz以上。目前在医学领域被广泛用于辅助诊断以及治疗疾病，根据超声波的波频、振动幅度、脉冲发放时间等物理参数的不同，医学上将其分为诊断性超声波(diagnostic ultrasound，dus)和治疗性超声波(therapeutic ultrasound，tus)两大类。诊断性超声波是借助组织器官部位的细胞对超声波发生透射、反射以及散射的现象，采集、捕捉超声信号，来显示组织部位的形态等；而治疗性超声波则是运用超声波对组织局部的物理生物效应来治疗疾病。超声波的物理生物效应主要包括：热效应和非热效应。热效应：超声波可以引起组织局部的生物分子震动及相互摩擦，随即转为热能，当热能不能及时被散出时则会导致局部温度上升。当组织局部温度升高到40-45℃持续5分钟，可以产生具有生物学意义的热效应，临床上主要用于缓解组织疼痛、改善局部血液循环；温度继续升高可以导致血液凝固、组织蒸发等，主要用于临床心血管领域的心律失常的消融治疗。非热效应：目前研究主要聚焦于，1)声空化作用：借助血液中的小气泡传递超声波能量，来增加血流切应力以及血管通透性的空化作用，临床上主要用于辅助治疗缺血性疾病的血管再生、提高心肌收缩能力；2)机械效应：发放的超声波可以对组织细胞表面形成机械性的压迫，进而激活细胞牵张感受器类型的阳离子通道，升高胞内阳离子水平，通过影响胞内信号来改变基因的表达水平；3)弥散作用：超声波的机械振动及热效应可以加速声波区域的分子扩散、促进局部物质交换，加快新陈代谢；4)触变作用：超声波可以促使组织从凝胶态向溶胶态转化，临床上被用于软化肌肉、肌腱、修复组织功能等。
4.低强度连续超声波(low-intensity continuous ultrasound)属于治疗性超声波的一种，由恒定的周期性振幅波组成。低强度连续超声波产生的“热效应”很小，临床应用主
要基于其“非热效应”引发的物理生物效应。课题组前期开展了一系列关于低强度连续超声波促进小鼠缺血下肢血管新生的研究。
5.关于低强度连续超声波在糖尿病肾病致肾脏纤维化中的应用目前还未见报道。


技术实现要素：

6.本发明提供了一种改善糖尿病肾病尿蛋白的方法，可以解决现有技术中的上述缺陷。
7.本发明的技术方案如下：
8.一种改善糖尿病肾病尿蛋白的方法，包括：超声发生装置和控制装置，所述控制装置与所述超声发生装置连接，所述控制装置控制所述超声发生装置输出的超声频率为0.2mhz-3mhz，强度为0.1w/cm
2-2 w/cm2，作用时间为6-12min/次；所述系统输出低强度连续超声波，能抑制肾间质小管损伤、肉芽组织形成、炎细胞侵润或纤维化形成，从而达到减少尿蛋白、改善肾功能的作用。
9.较佳的，所述超声发生装置包括信号发射装置、信号接收装置、背衬材料、匹配层，所述信号发射装置，所述信号发射装置设置在背衬材料上，所述信号接收装置设置在所述信号发射装置上，所述匹配层设置在所述信号接收装置上。
10.较佳的，超声频率为0.5mhz-2mhz,输出强度为0.2w/cm
2-1 w/cm2。
11.较佳的，作用时间为7-10min/次，作用周期为12-16天。
12.较佳的，超声频率为1mhz，强度为0.3w/cm2，作用时间为9min/天，作用周期为连续14天。
13.较佳的，还包括一向体内输入化学治疗制剂的输送装置。
14.较佳的，所述化学治疗制剂包括免疫抑制剂，具体选自：环孢素-a、他克莫司或细胞毒性药物中的至少一种，如环磷酰胺。
15.与现有技术相比，本发明的有益效果如下：
16.本发明的糖尿病肾病的治疗系统输出的低强度连续超声波，对单肾切除联合链脲佐菌素(stz)诱导的糖尿病肾病肾脏损伤具有显著的抑制作用，主要表现为减少24h尿蛋白量，改善肾功能，能抑制肾间质小管损伤、肉芽组织形成，炎细胞侵润、纤维化形成等病理表型。运用蛋白免疫印迹western blot和免疫组化，在蛋白水平揭示并进一步证实了本发明的低强度连续超声波抗肾脏纤维化形成的作用，特别是体现在低强度连续超声波对细胞外基质包括胶原蛋白表达具有显著的抑制作用。
17.当然，实施本发明的任一产品并不一定需要同时达到以上所述的所有优点。
附图说明
18.图1是实施例1的糖尿病肾病用超声诊疗系统的原理示意图；
19.图2是实施例1的超声发生装置的结构示意图；
20.图3是实施例2的scr的测试结果示意图；
21.图4是实施例2的bun的测试结果示意图；
22.图5是实施例2的ua的测试结果示意图；
23.图6是实施例2的acr的测试结果示意图；
24.图7是本发明实施例2的内生肌酐清除率的测试结果示意图；
25.图8是本发明实施例3中肾脏的组织形态光镜图，其中a为模型组，b为实验组，c为对照组。
26.图9是本发明实施例4的masson三色胶原染色测试结果示意图；
27.图10是本发明实施例4的masson三色胶原染色的光镜图，其中，a为模型组，b为实验组，c为对照组；
28.图11是本发明实施例4的免疫组织化学检测的光镜图；
29.图12是本发明实施例5的蛋白免疫印迹显影结果示意图；
30.图13是本发明实施例5中α-sma/gapdh测试结果示意图；
31.图14是本发明实施例5中e-cadherin/gapdh测试结果示意图；
32.图15是本发明实施例5中klotho/gapdh测试结果示意图。
具体实施方式
33.在本文中，由「一数值至另一数值」表示的范围，是一种避免在说明书中一一列举该范围中的所有数值的概要性表示方式。因此，某一特定数值范围的记载，涵盖该数值范围内的任意数值以及由该数值范围内的任意数值界定出的较小数值范围，如同在说明书中明文写出该任意数值和该较小数值范围一样。
34.本发明通过病理形态学及分子生物学的研究手段，探讨并明确了低强度连续超声波对单肾切除 stz诱导的大鼠糖尿病肾病模型的干预效应。
35.免疫组织化学检测及蛋白免疫印迹western blot实验中应用的一抗与二抗，其中，一抗包括collagen 1(col1)和collagen 3(col3)(sigma,usa)。二抗均购自solarbio(china)，包括山羊抗兔igg用来检测col1及col3的水平。
36.关于数据部分，采用统计学分析，实验结果重复至少三次，数据表达为mean
±
s.e.m,数据分析采用student’s t-test。p《0.05定义为统计学显著差异。
37.关于机理，申请人推测一种可能的机理为，低强度连续的超声波能够抑制肾脏微小血管，从而改善肾功能，降低尿蛋白。
38.下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应该理解，这些实施例仅用于说明本发明，而不用于限定本发明的保护范围。在实际应用中本领域技术人员根据本发明做出的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。
39.实施例1
40.本实施例提供一种糖尿病肾病用超声诊疗系统，参见图1，包括超声发生装置1和控制装置2，控制装置3与超声发生装置1通信连接，也可以是电连接，控制装置2控制超声发生装置1输出超声频率为0.2mhz-3mhz，强度为0.1w/cm
2-2 w/cm2，作用时间为6-12min/次。
41.本实施例的糖尿病肾病用超声诊疗系统输出的低强度连续超声波，通过抑制肾间质小管损伤、肉芽组织形成、炎细胞侵润或纤维化形成，从而达到减少尿蛋白、改善肾功能的作用。
42.参见图2，所述超声发生装置包括设置在背衬材料4上的信号发射装置3，设置在信号发射装置3上的信号接收装置2和2'，设置在信号接收装置2和2'上的匹配层1，其中，信号发射装置3为压电陶瓷(pzt)，信号接收装置2和2'为压电薄膜(pvdf)，背衬材料4为环氧材
料。
43.其中，控制装置用于控制超声发生装置输出的超声频率、强度、作用时间等参数，可以根据实际的需求进行选择，具体型号并不用于限制本发明的保护范围。
44.实施例2
45.构建大鼠糖尿病肾病致肾脏纤维化动物模型，并采用实施例1所述的糖尿病肾病用超声诊疗系统进行干预。
46.大鼠：6-8周龄，体重200-250g的雄性清洁级sd大鼠，购自上海吉辉实验动物饲养有限公司，常规摄食及饮水喂养。
47.模型组(model)：采用单肾切除 链脲佐菌素(stz)腹腔内注射建立糖尿病肾病模型。stz(stz溶于柠檬酸缓冲液，ph＝4.2-4.5，终浓度为0.1mol/l)，按照60mg/kg的剂量进行一次性腹腔内注射，3天后检测空腹血糖≥16.7mmol/l为模型制备成功。
48.实验组(us)：模型制备成功后次日予低强度连续超声波治疗持续8周。连续型超声波，频率为1mhz，能量为0.3w/cm2，照射时间为9min/天，连续14天。
49.正常对照组(control)：采用单肾切除，并接受同体积的柠檬酸缓冲液作为溶剂对照。
50.全自动生化分析仪检测模型组、实验组与对照组的血尿样本，实验结果参见图3至图7。
51.结果表明：1.相对于正常对照组，模型组的(scr、bun、ua)和acr(malb/ucr)显著升高(**p《0.01)，内生肌酐清除率显著降低(**p《0.01)。2.相对于模型组，实验组肾功能(scr、bun、ua)和acr(malb/ucr)显著降低(**p《0.01)，内生肌酐清除率显著升高(**p《0.01)。
52.实施例3.大鼠心脏组织形态学
53.给药结束后24小时处死大鼠，采集肾脏，固定于4％多聚甲醛后进行组织包埋及切片处理。组织形态学分析主要采用4μm厚度的石蜡切片进行苏木素-伊红染色，光镜(leica，germany)下观察肾脏的组织形态学改变。胶原纤维染色采用masson三色染色后光镜下进行观察。
54.实验结果如图8所示，其中a、b、c分别表示正常对照组、模型组和实验组，与正常对照组(a)相比较，单肾切除 stz模型组(b)大鼠肾脏呈现广泛的坏死，伴炎细胞侵润，肉芽组织形成；而实验组(c)接受低强度连续超声波治疗的大鼠肾脏见轻度组织坏死。
55.实施例4.大鼠肾脏免疫组织化学检测
56.模型组、实验组与正常对照组石蜡切片(厚度4μm)或冰冻切片(厚度10μm)进一步进行免疫组织化学研究，免疫反应性最终采用3,3-二氨基联丙胺(dab，sigma，usa)显色并于光镜(leica，germany)下观察记录。
57.大鼠肾脏切片进行masson三色胶原染色，结果如图9所示，与正常对照组相比，模型组masson三色阳性的区域显著增加(*p《0.01)，与模型组相比，实验组显著减少masson三色阳性的区域(#p《0.01)。
58.参见图10，大鼠肾脏masson三色胶原染色代表性图片：正常对照组(a)，单肾切除 stz组(b)及实验组低强度连续超声波治疗组(c)。
59.参见图11，免疫组织化学检测表明纤维化形成相关的重要分子标志物如col-i及
col-iii在单肾切除 stz组大鼠肾脏受损部位表达增强(b,e)，这些分子标志物在实验组大鼠肾脏组织的表达明显减少(c,f)。
60.实施例5.蛋白免疫印迹western blot
61.待检组织低温充分匀浆后，加入胰酶及ripa缓冲液，冰浴，4℃12000g离心15分钟，取上清。以bsa为标准，用bca法对上清进行蛋白质定量。取20μg蛋白样品，10％sds-page电泳，4℃转膜，放入封闭液中37℃封闭1小时，一抗4℃过夜，反复洗膜后，将膜与二抗孵育，室温轻摇1小时，洗膜后，ecl发光显色，使用bio-rad成像仪nc膜曝光，显影、定影后观察结果。
62.采用蛋白免疫印迹western blot对参与肾脏纤维化形成的相关蛋白的表达进行分析，参见图12至图15，其中，图12中的条带从左至右分别表示对照组、模型组与实验组。结果表明模型组大鼠肾脏e-cadherin、α-sma及klotho的表达，与正常对照组相比较显著升高，实验组与模型组相比，这些蛋白的表达呈显著的下降。
63.实施例2至实施例5的结果表明：低强度连续超声波可有效地抑制单肾切除 stz诱导的大鼠糖尿病肾病肾脏实质细胞坏死变性，炎细胞侵润，肉芽组织形成及纤维化形成，并显著抑制肾脏纤维化形成过程中关键分子的表达。这一研究首次揭示了低强度连续超声波对糖尿病肾病肾脏损伤的治疗干预作用，提示低强度连续超声波对于肾脏损伤及损伤后纤维化形成具有重要的干预价值。
64.以上公开的仅为本发明优选实施例。优选实施例并没有详尽叙述所有的细节，也不限制该发明仅为所述的具体实施方式。显然，根据本说明书的内容，可作很多的修改和变化。本说明书选取并具体描述这些实施例，是为了更好地解释本发明的原理和实际应用，从而使所属领域技术人员能很好地利用本发明。本发明仅受权利要求书及其全部范围和等效物的限制。
65.在本发明及上述实施例的教导下，本领域技术人员很容易预见到，本发明所列举或例举的各原料或其等同替换物、各加工方法或其等同替换物都能实现本发明，以及各原料和加工方法的参数上下限取值、区间值都能实现本发明，在此不一一列举实施例。