使用由脂质纳米颗粒递送的CRISPR/CAS系统在动物中进行的转录调控的制作方法

技术特征：
1.一种用于将负荷物递送至靶基因以增加所述靶基因在动物或细胞中的表达的脂质纳米颗粒，其中所述负荷物包含：(a)编码嵌合规律间隔成簇短回文重复序列(crispr)相关联(cas)蛋白的核酸，所述蛋白包含与一个或多个转录激活域融合的无核酸酶活性的cas蛋白；(b)编码嵌合衔接蛋白的核酸，所述嵌合衔接蛋白包含与一个或多个转录激活域融合的衔接蛋白；以及(c)一个或多个向导rna或编码所述一个或多个向导rna的一个或多个核酸，每个向导rna包含所述嵌合衔接蛋白能够特异性结合的一个或多个衔接结合元件，并且其中所述一个或多个向导rna中的每一个能够与所述cas蛋白形成复合物并将其导向至所述靶基因内的靶序列，从而增加所述靶基因的表达。2.根据权利要求1所述的脂质纳米颗粒，其中多顺反子或双顺反子核酸包含(a)和(b)。3.根据权利要求2所述的脂质纳米颗粒，其中(a)和(b)通过所述多顺反子或双顺反子核酸中的2a蛋白编码序列链接。4.根据权利要求1所述的脂质纳米颗粒，其中(a)和(b)是单独的核酸。5.根据任一前述权利要求所述的脂质纳米颗粒，其中(a)和(b)各自均为信使rna(mrna)的形式。6.根据权利要求5所述的脂质纳米颗粒，其中所述mrna被修饰为被假尿苷完全取代。7.根据权利要求5或6所述的脂质纳米颗粒，其中所述mrna是包含(a)和(b)的多顺反子或双顺反子核酸，其中所述mrna包含seq id no:61所示的序列。8.根据任一前述权利要求所述的脂质纳米颗粒，其中(c)为rna的形式。9.根据权利要求8所述的脂质纳米颗粒，其中所述一个或多个向导rna中的每一个被修饰以在5'末端和/或3'末端包含一个或多个稳定末端修饰。10.根据权利要求9所述的脂质纳米颗粒，其中所述一个或多个向导rna中的每一个的所述5'末端和/或所述3'末端被修饰以包含一个或多个硫代磷酸酯键。11.根据权利要求9或10所述的脂质纳米颗粒，其中所述一个或多个向导rna中的每一个的所述5'末端和/或所述3'末端被修饰以包含一个或多个2'-o-甲基修饰。12.根据任一前述权利要求所述的脂质纳米颗粒，其中所述靶序列包含所述靶基因内的调控序列。13.根据权利要求12所述的脂质纳米颗粒，其中所述调控序列包含启动子或增强子。14.根据任一前述权利要求所述的脂质纳米颗粒，其中所述靶序列在所述靶基因的转录起始位点的200个碱基对内。15.根据权利要求14所述的脂质纳米颗粒，其中所述靶序列在所述转录起始位点上游200个碱基对和所述转录起始位点下游1个碱基对的区域内。16.根据任一前述权利要求所述的脂质纳米颗粒，其中所述一个或多个向导rna中的每一个均包含所述嵌合衔接蛋白能够特异性结合的两个衔接结合元件。17.根据权利要求16所述的脂质纳米颗粒，其中第一衔接结合元件处于所述一个或多个向导rna中的每一个的第一环内，并且第二衔接结合元件处于所述一个或多个向导rna中的每一个的第二环内。18.根据权利要求17所述的脂质纳米颗粒，其中所述一个或多个向导rna中的每一个是
包含与反式激活crispr rna(tracrrna)部分融合的crispr rna(crrna)部分的单个向导rna，并且其中所述第一环是对应于seq id no:12、14、52或53的残基13至16的四环，并且所述第二环是对应于seq id no:12、14、52或53的残基53至56的茎环2。19.根据任一前述权利要求所述的脂质纳米颗粒，其中所述衔接结合元件包含seq id no:16所示的序列。20.根据权利要求19所述的脂质纳米颗粒，其中所述一个或多个向导rna中的每一个包含seq id no:40、45、56或57所示的序列。21.根据任一前述权利要求所述的脂质纳米颗粒，其中所述一个或多个向导rna中的至少一个靶向ttr基因，任选地，其中靶向ttr的向导rna靶向包含seq id no:34至36中任一个所示的序列的序列，或者任选地，其中所述靶向ttr的向导rna包含seq id no:37至39和55中任一个所示的序列。22.根据任一前述权利要求所述的脂质纳米颗粒，其中所述一个或多个向导rna靶向两个或更多个靶基因。23.根据任一前述权利要求所述的脂质纳米颗粒，其中所述一个或多个向导rna包含靶向单个靶基因的多个向导rna。24.根据任一前述权利要求所述的脂质纳米颗粒，其中所述一个或多个向导rna包含靶向单个靶基因的至少三个向导rna。25.根据权利要求24所述的脂质纳米颗粒，其中所述至少三个向导rna靶向小鼠ttr基因座，并且其中第一向导rna靶向包含seq id no:34的序列或者包含seq id no:37所示的序列，第二向导rna靶向包含序列seq id no:35的序列或者包含seq id no:38所示的序列，并且第三向导rna靶向包含seq id no:36的序列或者包含seq id no:39或55所示的序列。26.根据任一前述权利要求所述的脂质纳米颗粒，其中所述cas蛋白是cas9蛋白。27.根据权利要求26所述的脂质纳米颗粒，其中所述cas9蛋白为酿脓链球菌cas9蛋白、空肠弯曲杆菌cas9蛋白或金黄色葡萄球菌cas9蛋白。28.根据权利要求26或27所述的脂质纳米颗粒，其中当与酿脓链球菌cas9蛋白最佳比对时，所述cas9蛋白包含对应于d10a和n863a或d10a和h840a的突变。29.根据任一前述权利要求所述的脂质纳米颗粒，其中编码所述cas蛋白的序列经过密码子优化以在所述动物或细胞中表达。30.根据任一前述权利要求所述的脂质纳米颗粒，其中所述嵌合cas蛋白中的一个或多个转录激活子域选自：vp16、vp64、p65、myod1、hsf1、rta、set7/9及其组合。31.根据权利要求30所述的脂质纳米颗粒，其中所述嵌合cas蛋白中的所述一个或多个转录激活子域包含vp64。32.根据权利要求31所述的脂质纳米颗粒，其中所述嵌合cas蛋白从n端到c端包含：无催化活性的cas蛋白；核定位信号；以及vp64转录激活子域。33.根据权利要求32所述的脂质纳米颗粒，其中所述嵌合cas蛋白包含与seq id no:1所示的序列至少90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的序列。34.根据权利要求33所述的脂质纳米颗粒，其中编码所述嵌合cas蛋白的核酸包含与seq id no:25所示的序列至少90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的序列。
35.根据任一前述权利要求所述的脂质纳米颗粒，其中所述衔接蛋白位于所述嵌合衔接蛋白的n末端，并且所述一个或多个转录激活域位于所述嵌合衔接蛋白的c末端。36.根据任一前述权利要求所述的脂质纳米颗粒，其中所述衔接蛋白包含ms2外壳蛋白或其功能片段或变体。37.根据任一前述权利要求所述的脂质纳米颗粒，其中所述嵌合衔接蛋白中的所述一个或多个转录激活域选自：vp16、vp64、p65、myod1、hsf1、rta、set7/9及其组合。38.根据权利要求37所述的脂质纳米颗粒，其中所述嵌合衔接蛋白中的所述一个或多个转录激活域包含p65和hsf1。39.根据权利要求38所述的脂质纳米颗粒，其中所述嵌合衔接蛋白从n端到c端包含：ms2外壳蛋白；核定位信号；p65转录激活域；以及hsf1转录激活域。40.根据权利要求39所述的脂质纳米颗粒，其中所述嵌合衔接蛋白包含与seq id no:6所示的序列至少90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的序列。41.根据权利要求40所述的脂质纳米颗粒，其中编码所述嵌合衔接蛋白的核酸包含与seq id no:27所示的序列至少90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的序列。42.根据任一前述权利要求所述的脂质纳米颗粒，其中所述动物是非人动物。43.根据任一前述权利要求所述的脂质纳米颗粒，其中所述动物是哺乳动物。44.根据权利要求43所述的脂质纳米颗粒，其中所述哺乳动物是啮齿动物。45.根据权利要求44所述的脂质纳米颗粒，其中所述啮齿动物是大鼠或小鼠。46.根据权利要求45所述的脂质纳米颗粒，其中所述啮齿动物是所述小鼠。47.根据权利要求1至42中任一项所述的脂质纳米颗粒，其中所述动物是人。48.根据任一前述权利要求所述的脂质纳米颗粒，其中所述靶基因是在肝脏中表达的基因。49.根据任一前述权利要求所述的脂质纳米颗粒，其中所述靶基因是疾病相关联基因。50.根据任一前述权利要求所述的脂质纳米颗粒，其中所述靶基因的表达或活性降低与疾病、病症或综合征相关联或者成为疾病、病症或综合征的病因。51.根据任一前述权利要求所述的脂质纳米颗粒，其中所述靶基因是单倍体不足基因或者是otc、hbg1或hbg2。52.根据权利要求51所述的脂质纳米颗粒，其中所述靶基因是选自表3所列基因的单倍体不足基因。53.根据权利要求51或52所述的脂质纳米颗粒，其中所述单倍体不足基因是kcnq4、pink1、tp73、glut1、myh、abca4、lrh-1、pax8、slc40a1、bmpr2、pkd2、pik3r1、hmga1、gck、eln、gtf3、gata3、bub3、pax6、fli1、hnf1a、pkd1、mc4r、dmpk或myh9。54.根据权利要求1至49中任一项所述的脂质纳米颗粒，其中所述靶基因的表达或活性增加与疾病、病症或综合征相关联或者成为疾病、病症或综合征的病因。55.根据任一前述权利要求所述的脂质纳米颗粒，其中所述脂质纳米颗粒包含阳离子脂质、中性脂质、辅助脂质和隐形脂质。56.根据权利要求55所述的脂质纳米颗粒，其中所述阳离子脂质是mc3和/或所述中性脂质是dspc和/或所述辅助脂质是胆固醇和/或所述隐形脂质是peg-dmg。57.根据权利要求56所述的脂质纳米颗粒，其中所述脂质纳米颗粒包含摩尔比为约50:
10:38.5:1.5的mc3、dspc、胆固醇和peg-dmg。58.一种用于在动物体内增加靶基因的表达的方法，所述方法包含向所述动物中引入：(a)编码嵌合规律间隔成簇短回文重复序列(crispr)相关联(cas)蛋白的核酸，所述蛋白包含与一个或多个转录激活域融合的无核酸酶活性的cas蛋白；(b)编码嵌合衔接蛋白的核酸，所述嵌合衔接蛋白包含与一个或多个转录激活域融合的衔接蛋白；以及(c)一个或多个向导rna或编码所述一个或多个向导rna的一个或多个核酸，每个向导rna包含所述嵌合衔接蛋白能够特异性结合的一个或多个衔接结合元件，并且其中所述一个或多个向导rna中的每一个能够与所述cas蛋白形成复合物并将其导向至所述靶基因内的靶序列，从而增加所述靶基因的表达，其中(a)、(b)和(c)一起在同一脂质纳米颗粒(lnp)中递送。59.根据权利要求58所述的方法，其中多顺反子或双顺反子核酸包含(a)和(b)。60.根据权利要求59所述的方法，其中(a)和(b)通过所述多顺反子或双顺反子核酸中的2a蛋白编码序列链接。61.根据权利要求58所述的方法，其中(a)和(b)是单独的核酸。62.根据权利要求58至61中任一项所述的方法，其中(a)和(b)各自均以信使rna(mrna)的形式引入。63.根据权利要求62所述的方法，其中所述mrna被修饰为被假尿苷完全取代。64.根据权利要求62或63所述的方法，其中所述mrna是包含(a)和(b)的多顺反子或双顺反子核酸，其中所述mrna包含seq id no:61所示的序列。65.根据权利要求58至64中任一项所述的方法，其中(c)以rna的形式引入。66.根据权利要求65所述的方法，其中所述一个或多个向导rna中的每一个被修饰以在5'末端和/或3'末端包含一个或多个稳定末端修饰。67.根据权利要求66所述的方法，其中所述一个或多个向导rna中的每一个的所述5'末端和/或所述3'末端被修饰以包含一个或多个硫代磷酸酯键。68.根据权利要求66或67所述的方法，其中所述一个或多个向导rna中的每一个的所述5'末端和/或所述3'末端被修饰以包含一个或多个2'-o-甲基修饰。69.根据权利要求58至68中任一项所述的方法，其中所述靶序列包含所述靶基因内的调控序列。70.根据权利要求69所述的方法，其中所述调控序列包含启动子或增强子。71.根据权利要求58至70中任一项所述的方法，其中所述靶序列在所述靶基因的转录起始位点的200个碱基对内。72.根据权利要求71所述的方法，其中所述靶序列在所述转录起始位点上游200个碱基对和所述转录起始位点下游1个碱基对的区域内。73.根据权利要求58至72中任一项所述的方法，其中所述一个或多个向导rna中的每一个均包含所述嵌合衔接蛋白能够特异性结合的两个衔接结合元件。74.根据权利要求73所述的方法，其中第一衔接结合元件处于所述一个或多个向导rna中的每一个的第一环内，并且第二衔接结合元件处于所述一个或多个向导rna中的每一个的第二环内。
75.根据权利要求74所述的方法，其中所述一个或多个向导rna中的每一个是包含与反式激活crispr rna(tracrrna)部分融合的crispr rna(crrna)部分的单个向导rna，并且其中所述第一环是对应于seq id no:12、14、52或53的残基13至16的四环，并且所述第二环是对应于seq id no:12、14、52或53的残基53至56的茎环2。76.根据权利要求58至75中任一项所述的方法，其中所述衔接结合元件包含seq id no:16所示的序列。77.根据权利要求76所述的方法，其中所述一个或多个向导rna中的每一个包含seq id no:40、45、56或57所示的序列。78.根据权利要求58至77中任一项所述的方法，其中所述一个或多个向导rna中的至少一个靶向ttr基因，任选地，其中靶向ttr的向导rna靶向包含seq id no:34至36中任一个所示的序列的序列，或者任选地，其中所述靶向ttr的向导rna包含seq id no:37至39和55中任一个所示的序列。79.根据权利要求58至78中任一项所述的方法，其中所述一个或多个向导rna靶向两个或更多个靶基因。80.根据权利要求58至79中任一项所述的方法，其中所述一个或多个向导rna包含靶向单个靶基因的多个向导rna。81.根据权利要求58至80中任一项所述的方法，其中所述一个或多个向导rna包含靶向单个靶基因的至少三个向导rna。82.根据权利要求81所述的方法，其中所述至少三个向导rna靶向小鼠ttr基因座，并且其中第一向导rna靶向包含seq id no:34的序列或者包含seq id no:37所示的序列，第二向导rna靶向包含序列seq id no:35的序列或者包含seq id no:38所示的序列，并且第三向导rna靶向包含seq id no:36的序列或者包含seq id no:39或55所示的序列。83.根据权利要求58至82中任一项所述的方法，其中所述cas蛋白是cas9蛋白。84.根据权利要求83所述的方法，其中所述cas9蛋白为酿脓链球菌cas9蛋白、空肠弯曲杆菌cas9蛋白或金黄色葡萄球菌cas9蛋白。85.根据权利要求83或84所述的方法，其中当与酿脓链球菌cas9蛋白最佳比对时，所述cas9蛋白包含对应于d10a和n863a或d10a和h840a的突变。86.根据权利要求58至85中任一项所述的方法，其中编码所述cas蛋白的序列经过密码子优化以在所述动物中表达。87.根据权利要求58至86中任一项所述的方法，其中所述嵌合cas蛋白中的一个或多个转录激活子域选自：vp16、vp64、p65、myod1、hsf1、rta、set7/9及其组合。88.根据权利要求87所述的方法，其中所述嵌合cas蛋白中的所述一个或多个转录激活子域包含vp64。89.根据权利要求88所述的方法，其中所述嵌合cas蛋白从n端到c端包含：无催化活性的cas蛋白；核定位信号；以及vp64转录激活子域。90.根据权利要求89所述的方法，其中所述嵌合cas蛋白包含与seq id no:1所示的序列至少90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的序列。91.根据权利要求90所述的方法，其中编码所述嵌合cas蛋白的核酸包含与seq id no:25所示的序列至少90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的序列。
92.根据权利要求58至91中任一项所述的方法，其中所述衔接蛋白位于所述嵌合衔接蛋白的n末端，并且所述一个或多个转录激活域位于所述嵌合衔接蛋白的c末端。93.根据权利要求58至92中任一项所述的方法，其中所述衔接蛋白包含ms2外壳蛋白或其功能片段或变体。94.根据权利要求58至93中任一项所述的方法，其中所述嵌合衔接蛋白中的所述一个或多个转录激活域选自：vp16、vp64、p65、myod1、hsf1、rta、set7/9及其组合。95.根据权利要求94所述的方法，其中所述嵌合衔接蛋白中的所述一个或多个转录激活域包含p65和hsf1。96.根据权利要求95所述的方法，其中所述嵌合衔接蛋白从n端到c端包含：ms2外壳蛋白；核定位信号；p65转录激活域；以及hsf1转录激活域。97.根据权利要求96所述的方法，其中所述嵌合衔接蛋白包含与seq id no:6所示的序列至少90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的序列。98.根据权利要求97所述的方法，其中编码所述嵌合衔接蛋白的核酸包含与seq id no:27所示的序列至少90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的序列。99.根据权利要求58至98中任一项所述的方法，其中所述动物是人。100.根据权利要求58至99中任一项所述的方法，其中所述动物是哺乳动物。101.根据权利要求100所述的方法，其中所述哺乳动物是啮齿动物。102.根据权利要求101所述的方法，其中所述啮齿动物是大鼠或小鼠。103.根据权利要求102所述的方法，其中所述啮齿动物是所述小鼠。104.根据权利要求58至99中任一项所述的方法，其中所述动物是人。105.根据权利要求58至104中任一项所述的方法，其中所述动物是需要增加所述靶基因表达的对象，其中所述靶基因在所述对象中低表达，并且所述低表达与所述对象中的疾病、病症或综合征相关联或者成为疾病、病症或综合征的病因。106.根据权利要求58至105中任一项所述的方法，其中所述靶基因是在肝脏中表达的基因。107.根据权利要求58至106中任一项所述的方法，其中所述靶基因是疾病相关联基因。108.根据权利要求58至107中任一项所述的方法，其中所述靶基因的表达或活性降低与疾病、病症或综合征相关联或者成为疾病、病症或综合征的病因。109.根据权利要求58至108中任一项所述的方法，其中所述靶基因是单倍体不足基因或者是otc、hbg1或hbg2。110.根据权利要求109所述的方法，其中所述靶基因是选自表3所列基因的单倍体不足基因。111.根据权利要求109或110所述的方法，其中所述单倍体不足基因是kcnq4、pink1、tp73、glut1、myh、abca4、lrh-1、pax8、slc40a1、bmpr2、pkd2、pik3r1、hmga1、gck、eln、gtf3、gata3、bub3、pax6、fli1、hnf1a、pkd1、mc4r、dmpk或myh9。112.根据权利要求58至107中任一项所述的方法，其中所述靶基因的表达或活性增加与疾病、病症或综合征相关联或者成为疾病、病症或综合征的病因。113.根据权利要求58至112中任一项所述的方法，其中所述脂质纳米颗粒包含阳离子脂质、中性脂质、辅助脂质和隐形脂质。
114.根据权利要求113所述的方法，其中所述阳离子脂质是mc3和/或所述中性脂质是dspc和/或所述辅助脂质是胆固醇和/或所述隐形脂质是peg-dmg。115.根据权利要求114所述的方法，其中所述脂质纳米颗粒包含摩尔比为约50:10:38.5:1.5的mc3、dspc、胆固醇和peg-dmg。116.根据权利要求58至115中任一项所述的方法，其中将所述一个或多个向导rna施用于所述动物的途径是静脉内注射、实质内注射、腹膜内注射、经鼻安装或玻璃体内注射。117.根据权利要求58至116中任一项所述的方法，其中所述靶基因的表达增加相对于对照动物高出至少0.5倍、1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍或20倍。118.根据权利要求58至117中任一项所述的方法，其中所述靶基因表达增加的持续时间为至少约1天、至少约2天、至少约3天、至少约4天、至少约5天、至少约6天、至少约1周、至少约2周、至少约3周、至少约4周、至少约1个月或至少约2个月。119.根据权利要求58至118中任一项所述的方法，其中将包含(a)、(b)和(c)的所述脂质纳米颗粒循序引入所述动物中两次或更多次。120.根据权利要求119所述的方法，其中将包含(a)、(b)和(c)的所述脂质纳米颗粒循序引入所述动物中三次或更多次。121.根据权利要求119或120所述的方法，其中在每次循序引入所述脂质纳米颗粒后，所述靶基因的表达增加至至少相同的水平。122.根据权利要求119至121中任一项所述的方法，其中与仅引入所述脂质纳米颗粒一次的方法相比，所述靶基因的表达增加至更高的水平。123.一种用于增加靶基因在细胞中表达的方法，所述方法包含向所述细胞中引入：(a)编码嵌合规律间隔成簇短回文重复序列(crispr)相关联(cas)蛋白的核酸，所述蛋白包含与一个或多个转录激活域融合的无核酸酶活性的cas蛋白；(b)编码嵌合衔接蛋白的核酸，所述嵌合衔接蛋白包含与一个或多个转录激活域融合的衔接蛋白；以及(c)一个或多个向导rna或编码所述一个或多个向导rna的一个或多个核酸，每个向导rna包含所述嵌合衔接蛋白能够特异性结合的一个或多个衔接结合元件，并且其中所述一个或多个向导rna中的每一个能够与所述cas蛋白形成复合物并将其导向至所述靶基因内的靶序列，从而增加所述靶基因的表达，其中(a)、(b)和(c)一起在同一脂质纳米颗粒(lnp)中递送。

技术总结
提供了在同一脂质纳米颗粒中一起包含CRISPR/Cas协同激活介体系统组分的脂质纳米颗粒，以及使用此类脂质纳米颗粒来增加体内和离体靶基因表达和评估CRISPR/Cas协同激活介体系统增加体内和离体靶基因表达的能力的方法。法。法。


技术研发人员：查琳
受保护的技术使用者：瑞泽恩制药公司
技术研发日：2020.09.11
技术公布日：2022/6/10