用于治疗疾病或病症的方法和组合物

用于治疗疾病或病症的方法和组合物
1.相关申请的交叉引用
2.本技术要求2019年9月26日提交的美国临时申请第62/906,282号的优先权，其公开内容通过引用以其整体并入本文。
3.序列表
4.本技术包含序列表，该序列表已经通过efs网站以ascii格式提交，并且据此通过引用以其整体并入本文。所述ascii副本创建于2020年9月22日，命名为251609_000034_sl.txt，大小为11,372字节。
技术领域
5.本发明涉及牵涉阻断cd93/igfbp7信号传导通路的药剂的方法和组合物。
技术背景
6.病理性血管生成—由促血管生成和抗血管生成的信号传导的不平衡驱动的—是许多疾病(包括恶性和良性疾病)的标志。与血管生成受到严格调控的健康成人不同，此类疾病的特征在于不受控制的新血管形成，导致特征在于血管不成熟，具有严重的结构和功能异常的微血管网络。这些异常的后果是微环境的进一步改变，通常会加速疾病进展和削弱对常规疗法的反应。
7.因此，需要开发用于使这些疾病(诸如癌症)中的脉管系统正常化或促进其成熟的方法或组合物。


技术实现要素：

8.本技术提供了在有此需要的受试者中治疗肿瘤(诸如癌症)的方法，其包括向受试者施用有效量的cd93/igfbp7阻断剂，其特异性抑制igfbp7/cd93信号传导途径。在一些实施方案中，所述cd93/igfbp7阻断剂阻断cd93与igfbp7之间的相互作用。
9.在一些实施方案中，所述cd93/igfbp7阻断剂包含特异性识别cd93的抗cd93抗体。在一些实施方案中，所述抗cd93抗体与mab mm01或mab 7c10竞争与cd93的结合。在一些实施方案中，所述抗cd93抗体结合与mab mm01或mab 7c10的表位重叠或基本重叠的表位。在一些实施方案中，所述抗cd93抗体也阻断cd93与多聚素2(mmrn2)之间的相互作用。在一些实施方案中，所述抗cd93抗体不阻断cd93与mmrn2之间的相互作用。在一些实施方案中，所述抗cd93抗体与cd93上的igfbp7结合位点结合。在一些实施方案中，所述抗cd93抗体与cd93上igfbp7结合位点之外的区域结合。在一些实施方案中，所述抗cd93抗体与cd93的胞外区结合。在一些实施方案中，所述cd93的胞外区包含seq id no:1的氨基酸序列的残基22-580。在一些实施方案中，所述抗cd93抗体与cd93的egf样区域结合。在一些实施方案中，所述cd93的egf样区域由seq id no:1所示氨基酸序列的残基257-469和/或260-468组成。在一些实施方案中，所述抗cd93抗体与cd93的c型凝集素结构域结合。在一些实施方案中，所述cd93的c型凝集素结构域包含seq id no:1所示氨基酸序列的残基22-174。在一些实施
方案中，所述抗cd93抗体与cd93的长环区结合。在一些实施方案中，所述cd93的长环区包含seq id no:1的氨基酸序列的残基96-141。在一些实施方案中，所述抗cd93抗体是抗人cd93抗体。在一些实施方案中，所述抗人cd93抗体是mab mm01或其人源化形式。在一些实施方案中，所述抗cd93抗体是全长抗体、单链fv(scfv)、fab、fab’、f(ab’)2、fv片段、二硫键稳定化的fv片段(dsfv)、(dsfv)2、vhh、fv-fc融合物、scfv-fc融合物、scfv-fv融合物、双抗体、三抗体或四抗体。在一些实施方案中，所述cd93包含在融合蛋白中。
10.在一些实施方案中，cd93/igfbp7阻断剂是多肽。在一些实施方案中，所述多肽是抑制性cd93多肽。在一些实施方案中，所述抑制性cd93多肽是cd93的片段或包含cd93胞外结构域的cd93的变体。在一些实施方案中，所述多肽是可溶性多肽。在一些实施方案中，所述多肽是膜结合的。在一些实施方案中，所述抑制性cd93多肽包含cd93的胞外结构域的变体。在一些实施方案中，所述多肽与igfbp7的结合亲和力大于与mmnr2的结合亲和力。在一些实施方案中，所述多肽不与mmnr2结合。在一些实施方案中，所述多肽与igfbp7的结合亲和力大于cd93与gfbp7的结合亲和力。在一些实施方案中，所述抑制性cd93多肽包含f238残基，其中氨基酸编号是基于seq id no:1.在一些实施方案中，所述抑制性cd93多肽还包含稳定化结构域。在一些实施方案中，所述稳定化结构域是fc结构域。在一些实施方案中，所述多肽的长度为约50至约200个氨基酸。
11.在一些实施方案中，所述cd93/igfbp7阻断剂包含特异性识别igfbp7的抗igfbp7抗体。在一些实施方案中，所述抗igfbp7抗体与mab r003或mab 2c6竞争与igfbp7的结合。在一些实施方案中，所述抗igfbp7抗体与和mab r003或mab 2c6的表位重叠的表位结合。在一些实施方案中，所述抗igfbp7抗体还阻断igfbp7与igf-1、igf-2和/或igf1r之间的相互作用。在一些实施方案中，所述抗igfbp7抗体不阻断igfbp7与igf-1、igf-2和/或igf1r之间的相互作用。在一些实施方案中，所述抗igfbp7抗体与igfbp7上的cd93结合位点结合。在一些实施方案中，所述抗igfbp7抗体与igfbp7上cd93结合位点之外的区域结合。在一些实施方案中，所述抗igfbp7抗体与igfbp7的n-末端结构域(残基28-106)结合。在一些实施方案中，所述igfbp7的n-末端结构域由seq id no:2的氨基酸序列的残基28-106组成。在一些实施方案中，所述抗igfbp7抗体与igfbp7的kazal样结构域结合。在一些实施方案中，所述igfbp7的kazal样结构域由seq id no:2的氨基酸序列的残基105-158组成。在一些实施方案中，所述抗igfbp7抗体与igfbp7的ig样c2型结构域结合。在一些实施方案中，所述igfbp7的ig样c2型结构域由seq id no:2的氨基酸序列的残基160-264组成。在一些实施方案中，所述抗igfbp7抗体与igfbp7的胰岛素结合(ib)结构域结合。在一些实施方案中，所述抗igfbp7抗体是抗人igfbp7抗体。在一些实施方案中，所述抗人igfbp7抗体是mab r003或其人源化形式。在一些实施方案中，所述抗igfbp7抗体是全长抗体、单链fv(scfv)、fab、fab’、f(ab’)2、fv片段、二硫键稳定的fv片段(dsfv)、(dsfv)2、vhh、fv-fc融合体、scfv-fc融合物、scfv-fv融合物、双抗体、三抗体或四抗体。在一些实施方案中，所述抗igfbp7抗体包含在融合蛋白中。
12.在一些实施方案中，所述cd93/igfbp7阻断剂是多肽，并且所述多肽是包含igfbp7变体的抑制性igfbp7多肽。在一些实施方案中，所述抑制性igfbp7多肽与cd93结合，但不激活cd93。在一些实施方案中，所述抑制性igfbp7多肽与cd93的结合亲和力大于与igf-1、igf-2和/或igf1r的结合亲和力。在一些实施方案中，所述多肽与cd93的结合亲和力大于
igfbp7与cd93的结合亲和力。在一些实施方案中，所述抑制性igfbp7多肽包含igfbp7的ib结构域。在一些实施方案中，所述抑制性igfbp7多肽还包含稳定化结构域。在一些实施方案中，所述稳定化结构域是fc结构域。在一些实施方案中，所述抑制性igfbp7多肽的长度为约50至约200个氨基酸。
13.在一些实施方案中，所述cd93/igfbp7阻断剂包含融合蛋白、肽类似物、适体、avimer、anticalin、speigelmer或小分子化合物。
14.在上述任一种方法的一些实施方案中，所述cd93/igfbp7阻断剂降低cd93或igfbp7的表达。在一些实施方案中，所述cd93/igfbp7阻断剂包含sirna、shrna、mirna、反义rna或基因编辑系统。
15.在上述任一种方法的一些实施方案中，其中所述方法还包括向受试者施用第二药剂。在一些实施方案中，所述第二药剂是免疫检查点抑制剂。在一些实施方案中，所述免疫检查点抑制剂选自抗pd1抗体、抗pd-l1抗体和抗ctla4抗体。在一些实施方案中，所述第二药剂是化学治疗剂。在一些实施方案中，所述第二药剂是免疫细胞。在一些实施方案中，所述第二药剂是抗血管生成抑制剂。在一些实施方案中，所述抗血管生成抑制剂是抗vegf抑制剂。
16.在上述任一种方法的一些实施方案中，所述癌症的特征在于异常的肿瘤脉管系统。
17.在上述任一种方法的一些实施方案中，所述癌症的特征在于vegf的高表达。
18.在上述任一种方法的一些实施方案中，所述癌症的特征在于cd93的高表达。
19.在上述任一种方法的一些实施方案中，所述癌症的特征在于igfbp7的高表达。
20.在上述任一种方法的一些实施方案中，所述癌症是实体瘤。在一些实施方案中，癌症是结直肠癌、非小细胞肺癌、胶质母细胞瘤、肾细胞癌、宫颈癌、卵巢癌、输卵管癌、腹膜癌、乳腺癌、前列腺癌、膀胱癌、口腔鳞状细胞癌、头颈部鳞状细胞癌、脑肿瘤、骨癌、黑色素瘤。在一些实施方案中，所述癌症富集了血管。在一些实施方案中，所述癌症是三阴性乳腺癌(tnbc)。在一些实施方案中，所述癌症是黑色素瘤。在一些实施方案中，所述患者对先前的疗法具有抗性，所述疗法包括施用免疫检查点抑制剂，例如抗pd1抗体、抗pd-l1抗体、抗ctla4抗体或其组合。在一些实施方案中，本文所用的“富集的”是指与未患癌症的受试者的相应组织中血管的量或密度相比，肿瘤组织中血管的量更大或密度更高(例如，大或高至少10％、20％、30％、40％或50％)。
21.在一些实施方案中，还提供了确定候选药剂是否可用于治疗癌症的方法，其包括：确定候选药剂是否破坏cd93/igfbp7相互作用，其中如果显示所述候选药剂特异性破坏cd93/igfbp7相互作用，则该候选药剂可用于治疗癌症。在一些实施方案中，该方法包括确定候选药剂是否破坏细胞表面上cd93与igfbp7的相互作用。在一些实施方案中，该方法包括确定候选药剂是否特异性破坏体外测定系统中cd93与igfb7的相互作用。在一些实施方案中，所述体外系统是酵母双杂交系统。在一些实施方案中，所述体外系统是基于elisa的测定。在一些实施方案中，所述体外系统是基于facs的测定。在一些实施方案中，所述候选药剂是抗体、肽、融合肽、肽类似物、多肽、适体、avimer、anticalin、镜像寡核苷酸(speigelmer)或小分子化合物。在一些实施方案中，该方法包括使候选药剂与cd93/igfbp7复合物接触。在一些实施方案中，提供了通过上述任何方法鉴定的药剂。
22.在一些实施方案中，还提供了非天然存在的多肽，其中非天然存在的多肽是包含cd93的胞外结构域的变体抑制性cd93多肽，其中所述多肽阻断cd93与igfbp7之间的相互作用。在一些实施方案中，所述变体抑制性cd93多肽是膜结合的。在一些实施方案中，所述变体抑制性cd93多肽是可溶的。在一些实施方案中，所述变体抑制性cd93多肽与igfbp7的结合亲和力大于与mmnr2的结合亲和力。在一些实施方案中，所述变体抑制性cd93多肽与igfbp7的结合亲和力大于cd93与igfbp7的结合亲和力。在一些实施方案中，所述抑制性cd93多肽包含f238残基，其中氨基酸编号是基于seq id no:1。在一些实施方案中，所述抑制性cd93多肽还包含稳定化结构域。在一些实施方案中，所述稳定化结构域是fc结构域。在一些实施方案中，所述抑制性多肽的长度为约50至约200个氨基酸。
23.在一些实施方案中，还提供了包含igfbp7变体的非天然变体抑制性igfbp7多肽，其中所述多肽阻断cd93与igfbp7之间的相互作用。在一些实施方案中，所述变体抑制性igfbp7多肽与cd93结合，但不激活cd93。在一些实施方案中，所述变体抑制性igfbp7多肽与cd93的结合亲和力大于与igf-1、igf-2和/或igf1r的结合亲和力。在一些实施方案中，所述变体抑制性igfbp7多肽与cd93的结合亲和力大于igfbp7与cd93的结合亲和力。在一些实施方案中，所述变体抑制性igfbp7多肽包含igfbp7的ib结构域。在一些实施方案中，所述变体抑制性igfbp7多肽还包含稳定化结构域。在一些实施方案中，所述稳定化结构域是fc结构域。在一些实施方案中，所述变体抑制剂的长度为约50至约200个氨基酸。
24.在一些实施方案中，还提供了药物组合物，其包含如上所述的药剂、非天然存在的多肽或非天然存在的变体抑制性igfbp7多肽以及药学上可接受的载体和/或赋形剂。
附图说明
25.图1a-图1g显示了cd93作为受vegf信号传导调节的肿瘤脉管系统上的受体蛋白的鉴定。图1a显示了描述肿瘤血管基因的重叠的文氏图，所述肿瘤血管基因被来自4个不同的公开的rna-seq数据集的vegf抑制剂显著降低(log2倍数变化＜-0.5)。cd93是所有数据集中唯一被现下调的基因，另外10个基因(列表，右侧)在4个数据集中的3个中被下调。图1b描述了分别敲低指定基因后huvec细胞中的管形成。图1c描述了对cd93转录的tcga正常和gtex数据集的分析。图1d描述了人胰腺、pda和pnet肿瘤的cd93表达的ihc染色的代表。图1e描述了在vegf存在或不存在的情况下培养的小鼠主动脉内皮细胞(maec)中表面cd93的免疫荧光(“if”)染色。图1f描述了对来自正常胰腺和原位kpc肿瘤组织的样品的cd93和cd31进行了免疫荧光染色。图1g描述了对来自正常皮肤和皮下植入的b16小鼠肿瘤的样品的cd93和cd31进行了免疫荧光染色。比例尺为50μm。
26.图2a-图2e显示，阻断igfbp7/cd93相互作用可抑制肿瘤生长，并促进血管成熟。图2a描述了对照或小鼠cd93单克隆抗体(“mab”)治疗后肿瘤体积的变化。用kpc肿瘤细胞攻击b6小鼠，并开始用对照或小鼠cd93 mab治疗，每周两次。随着时间的推移监测肿瘤生长。n＝10只小鼠/组。图2b描述了来自对照和mcd93 mab 7c10治疗的小鼠的肿瘤切片中cd31的if染色。比较各组间血管密度、圆形血管百分比和总血管长度。箭头表示圆形血管。比例尺为50μm。图2c描述了对冷冻的肿瘤切片的cd31和αsma进行了共染色，并对每个视野中αsma 血管的百分比进行定量。比例尺为50μm。图2d描述了对肿瘤切片的cd31和ng2进行共染色，并对每个视野中ng2 血管的百分比进行定量。每个点代表一只动物的平均值，其中分析了至
少五个随机视野。比例尺为50μm。图2e描述了一周两次用对照或cd93 mab治疗荷有kpc肿瘤的小鼠，然后通过静脉内凝集素-fitc注射评估肿瘤灌注。用凝集素-fitc覆盖cd31 血管描绘了灌注和未灌注的肿瘤血管。右侧显示了灌注肿瘤血管的定量。每个点代表一只动物的平均值，每只动物至少取5个随视野(n＝5)。*p《0.05，**p《0.01。通过未配对学生氏t检验确定p值。所有数据代表平均值
±
sem。
27.图3a-图3f显示cd93阻断促进肿瘤中免疫细胞浸润。图3a描述了在开始对照或抗cd93治疗后第8天和第15天植入的kpc肿瘤中cd3和cd31免疫染色以及dapi核染色的代表性图像。图3b描述了通过对照或抗cd93治疗的肿瘤组织中cd3 t细胞的定量。每个点代表一只动物的平均值，每只动物取至少五个随机视野。图3c-图3e显示了15天抗体处理后的流式细胞术分析。进行流式细胞术分析以确定肿瘤中cd45 白细胞浸润的百分比(图3c)，cd45 白细胞、cd3 t细胞、cd4 和cd8 t细胞亚群的数量(图3d)，以及cd45 白细胞中粒细胞cd3-cd11c-cd11b ly6g ly6c-)和单核细胞(cd3-cd11c-cd11b ly6g-ly6c )mdsc的百分比(图3e)。每个点表示一个肿瘤。图3f显示了抗体治疗14天后皮下b16小鼠肿瘤中cd3和cd31免疫染色的代表性图像。每个点代表一只动物的平均值，其中分析了至少五个随机视野。*p《0.05，**p《0.01，*＊*p《0.001。通过未配对学生氏t检验确定p值。所有数据代表平均值
±
sem。
28.图4a-图4g显示igfbp7被鉴定为cd93的结合配偶体。图4a描述了在人基因组规模受体阵列(gsra)筛选系统中具有cd93-ig的阳性命中(igfbp7)的受试孔的图示。含有fc受体(fcr)的表达构建体(fcr)的孔用作阳性对照。图4b描述了在如所指示的对照、抗cd93或抗igfbp7 ma存在的情况下，用igfbp7-ig染色对其结合进行了染色的用对照或cd93基因转导的hek293t细胞。图4c描述了在针对hcd93的mab存在或不存在的情况下，用对照或igfbp7-ig染色的huvec细胞。图4d用对照igg或cd93 mab免疫沉淀huvec细胞裂解物，并用cd93和igfbp7抗体对其进行印迹。图4e描述了人igfbp7与cd93的微量热泳(microscale thermophoresis)(mst)结合曲线。显示了kd值。图4f描述了用小鼠igfbp7-ig对其结合进行了染色的用对照或小鼠cd93基因转导的hek293t细胞。加入针对小鼠cd93和igfbp7的单克隆抗体以评估其阻断能力。图4g描述了代表一系列嵌合蛋白结构的示意图，所述嵌合蛋白是通过用来自igfbpl1(bpl1)的相应部分替换igfbp7(bp7)的每个结构域而产生的。通过流式细胞术测试每种嵌合蛋白与cd93转染子的结合。结合指数是指cd93转染子的平均荧光强度(mfi)除以对照的mfi。
29.图5a-图5e显示了igfbp7在肿瘤血管内皮上的表达。图5a描述了人胰腺和pda癌中igfbp7和cd31的h&e染色和if共染色。对胰腺导管腺癌(pdac)和正常胰腺中igfbp7阳性血管的百分比进行定量。每个点代表一个组织的平均值，其中分析了至少五个随机视野。i：胰岛。比例尺为50μm。图5b描述了对植入的kpc肿瘤组织的igfbp7和cd31进行了共染色，其中虚线将肿瘤的中心区域(c)与边缘(e)分开。比例尺为100μm。图5c描述了用dmog处理(0小时、10小时和24小时)的huvec细胞的hif-1α和igfbp7表达的代表性蛋白质印迹。l：蛋白质梯(protein ladder)。图5d显示了通过免疫荧光法检测的小鼠主动脉内皮细胞(maec)上igfbp7的表达。在小鼠vegfr封闭mab存在或不存在的情况下将maec细胞与二甲基草酰甘氨酸(dmog)一起孵育以诱导缺氧。对igfbp7表达细胞的百分比进行了定量。点表示随机选取的视野中的值。比例尺为50μm。图5e描述了显示来自异种移植结肠癌模型的肿瘤内皮细胞
中igfbp7表达的小提琴图(violin plot)(参见zhao q.,cancer research 2018；78(9):2370-82.)。阿柏西普治疗后24小时。*p《0.05，*＊*p《0.001。通过未配对学生氏t检验确定了p值。所有数据代表平均值
±
sem。
30.图6a-图6d显示，靶向igfbp7/cd93途径可以改善药物递送，并促进化学疗法。图6a显示了在用对照或cd93 mab治疗的kpc荷瘤小鼠中多柔比星和低氧(低氧探针)的免疫荧光染色。给每周两次用对照或cd93 mab治疗的kpc荷瘤小鼠注射多柔比星和哌莫硝唑，分别用于评估药物递送和缺氧。对肿瘤内多柔比星和低氧(低氧探针)区域的渗透进行定量。每个点代表一只动物，对其整个肿瘤组织进行分析。图6b和图6c显示了利用对照、单独的mcd93 mab、单独的5-fu以及mcd93 mab与5-fu的组合治疗的组的肿瘤体积曲线(图6b)和kaplan-meier存活分析(图6c)，n＝7。*p＝0.045**p＝0.0163。在b6小鼠皮下植入2x105个b16小鼠黑色素瘤细胞，并在第6天肿瘤变得可触知时开始用抗体和5-fu治疗。图6d显示了用单独的5-fu以及用5-fu与mcd93 mab的组合治疗的b16小鼠肿瘤组织中ki-67和裂解的胱天蛋白酶3(cc3)的免疫荧光染色。对肿瘤组织中ki-67阳性和cc3阳性细胞的百分比进行定量。每个点代表一只动物，对其整个肿瘤组织进行分析。比例尺为50μm。*p《0.05，**p《0.01。通过未配对学生氏t检验确定p值。所有数据代表平均值
±
sem。
31.图7a-图7g显示cd93阻断使肿瘤对抗pd-1疗法敏感。图7a显示了抗体治疗14天后的肿瘤重量。开始用对照或抗cd93治疗kpc荷瘤小鼠。在一些组中，在抗cd93治疗前，cd4 t细胞或cd8 t细胞被各自的抗体耗尽。图7b描述了皮下kpc小鼠肿瘤中b7-h1和cd31免疫染色的代表性图像。图7c描述了肿瘤组织的单细胞悬液物的b7-h1表达的流式细胞术分析。测定肿瘤细胞、cd45 白细胞和cd31 ec中b7-h1阳性细胞的百分比。图7d-图7e显示了kpc荷瘤小鼠中用如所指示的抗体治疗后16天的肿瘤生长曲线(图7d)和肿瘤重量(图7e)。kpc肿瘤接种后7天开始治疗。图7f-图7g显示了通过流式细胞术测定的肿瘤内免疫细胞的数量(图7f)和免疫细胞的组成(图7g)。(d-g)*p《0.05,**p《0.01。p值由未配对学生氏t检验确定。所有数据代表平均值
±
sem。每个点代表一个肿瘤(图7a、图7c和图7e-图7g)。
32.图8a-图8b显示抗cd93治疗不影响肿瘤内t细胞亚群的比例。图8a描述了在15天的抗体治疗后浸润肿瘤的t细胞亚群的facs分析。图8b显示了在4小时pma 肌霉素刺激后，来自新鲜分离的肿瘤浸润性淋巴细胞(til)的cd8 t细胞亚群中细胞内细胞因子ifn-γ和tnf-的分析。
33.图9a-图9b显示抗cd93增加肿瘤血管上icam1的表达。图9a显示了在抗体治疗14天后，来自皮下kpc小鼠肿瘤的肿瘤组织中icam-1和cd31免疫染色的代表性图像。图9b显示了在14天的抗体治疗后，来自皮下b16小鼠肿瘤的肿瘤组织中cd45、cd31和icam1免疫染色的代表性图像。
34.图10a-图10b显示了igfbp7上cd93的结合结构域的鉴定。使用pcr克隆将igfbp7的每个胞外结构域(包括胰岛素结合(ib)、kazal和ig)与igfbpl1上的相应结构域交换并与c-末端ig融合。这些嵌合突变体在hek293t细胞中瞬时表达，并将上清液用于对cd93转染子进行染色。图10a描述了多种嵌合igfbp7突变体是否与cd93结合。图10b描述了构建在含有fc-tag的表达载体上的含有i b-结构域的各种人基因。将构建体瞬时转导入hek293t细胞，以在上清液中产生带有fc标签的融合蛋白。将上清液用于通过流式细胞术对cd93转染子进行了染色。结合指数表示cd93转染子与对照细胞的结合mfi的比率。
35.图11a-图11b显示了人pda癌中igfbp7的转录。图11a描述了人pda中的igfbp7转录物相较于正常胰腺中增加。图11b描述了tcga pda数据集的facs分析，表明了igfbp7的转录与已知的内皮细胞标志物(包括pecam1、cd34、vwf和kdr(vegfr2))相关。
36.图12a-图12b显示了igfbp7在小鼠肿瘤脉管系统上的选择性表达。图11a描述了来自原初b6小鼠的正常胰腺和来自原位kpc小鼠肿瘤的组织的标本中igfbp7和cd31的if染色。i指的是胰岛。图11b描述了来自原初b6小鼠的正常皮肤和来自皮下植入的kpc和b16小鼠肿瘤的组织的样本中igfbp7和cd31的if染色。比例尺为50μm。
37.图13a-图13c显示了阻断igfbp7/cd93相互作用抑制血管生成和肿瘤生长。图13a描述了在igfbp7敲除和对照huvec细胞中进行的管形成测定的结果。图13b-图13c描述了wt或cd93敲低huvec细胞中在外源igfbp7蛋白存在或不存在的情况下进行的管形成测定(图13b)和跨孔迁移测定(图13c)的结果。
38.图14a-图14f显示了igfbp7阻断延缓肿瘤生长并促进肿瘤血管成熟。图14a显示了小鼠igfbp7与maec细胞结合，并且这种相互作用可以被igfbp7 mab(克隆2c6)阻断。图14b显示了用igfbp7抗体治疗后肿瘤体积的变化。用对照或migfbp7 mab(克隆2c6)每周两次治疗具有可触知的kpc肿瘤的c57bl/6小鼠。随时间推移监控肿瘤生长(n＝10只小鼠/组)。图14c描述了冷冻的肿瘤切片上cd31的if染色。比较各组间血管密度、圆形血管百分比和总血管长度。箭头表示圆形血管。比例尺为50μm。图14d-图14e描述了冷冻的kpc小鼠肿瘤切片上cd31和αsma(图14d)或cd31和ng2(图14e)的if染色的代表性图像。每个点代表三只动物的随机视野，每只动物取至少三个随机视野。图14f描述了kpc小鼠肿瘤切片上cd31和活化的整联蛋白β1(9eg7)的if染色的代表性图像，以及9eg7 血管的定量(占总血管的％)。每个点代表一只动物的平均值，每只动物取至少五个随机视野。比例尺为50μm。
39.图15显示了人igfbp7不能结合人igf1r转染子。对野生型cho和igf1r转染的cho细胞的人igf1r染色抗体进行染色，以确认表面igf1r表达。同时，将细胞与igfbp7-ig一起孵育，以通过流式细胞术分析可能的相互作用。
40.图16显示了各种商业抗人igfbp7 mab和抗cd93 mab阻断cd93/igfbp7相互作用的能力。
41.图17a-图17b显示非造血细胞上的cd93通过阻断cd93介导抗肿瘤作用。图17a描述了在肿瘤血管系统(cd31 )上通过注射的抗cd93检测到的b16肿瘤的if染色的代表性图像。图17b显示了抗cd93抗体治疗后cd93嵌合小鼠中的肿瘤生长。将用来自wt或cd93ko小鼠的骨髓(bm)细胞重建的wt b6小鼠接种b16肿瘤细胞，然后进行抗体治疗。*＊*p《0.001。
42.图18a-图18c显示cd93阻断抑制小鼠肿瘤生长。cd93(图18a)和igfbp7(图18b)在皮下b16肿瘤的肿瘤脉管系统中均被上调。图18c显示了抗cd93抗体治疗后的肿瘤生长。具有可触知的b16肿瘤的小鼠接受对照或抗cd93(7c10)治疗。n＝10。**p《0.01。
43.图19a-图19g显示cd93阻断促进了有利的肿瘤免疫微环境。图19a描述了抗体治疗两周之后b16肿瘤的cd3和cd3免疫染色的代表性图像。图19b和图19b显示了b16肿瘤中浸润的cd45 白细胞亚群(图19b)和免疫细胞亚群(图19c)的流式细胞术分析。抗cd93增加了t
em
(cd44hi cd62l-)、pd1 和粒酶b 细胞(图19d)以及cd8 til中的细胞因子产生细胞(图19e)的百分比。图19f显示了抗cd93治疗对pd1 细胞、t
em
细胞和treg细胞的影响。相同治疗引起pd1 细胞和t
em
细胞的增加，伴随着cd4 t细胞区室中treg细胞的减少。图19g显示了b16肿瘤
组织的if染色的代表性图像。if染色显示，在抗cd93治疗的肿瘤中，缺氧区域减少，并且cd11b 抑制剂减少。*p《0.05,**p《0.01,*＊*p《0.001。
44.图20a-图20e显示了cd93阻断使b16黑色素瘤对免疫检查点阻断(icb)疗法敏感。图20a显示了处于抗体治疗下的b16肿瘤的pd-l1、cd31和cd45染色的代表性图像。图20b显示了不同细胞类型上的pd-l1的流式细胞术分析。用指定的抗体每周两次治疗具有可触知的b16肿瘤的b6小鼠。图20c描述了肿瘤生长和存活曲线。图20d显示了肿瘤内免疫细胞的定量。图20e显示了不同t细胞亚群中tem细胞(cd44hicd62l-)的定量。*p《0.05,**p《0.01,*＊*p《0.001。
45.图21a-图21d显示了igfbp7/cd93途径在三阴性乳腺癌(tnbc)脉管系统中被上调。人tnbc(图21a，21b)和小鼠4t1(图中21c，21d)肿瘤中cd93(图21a，21c)和igfbp7(图21b，21d)的if染色的代表性图像。cd31用于血管染色。
46.图22显示了igfbp7表达与tnbc的不良预后相关。
47.图23a-图23b显示了抗cd93抑制体内原位bc肿瘤生长。小鼠原位植入了4t1(图23a)或py8119(图23b)。当可触知时，用对照或抗cd93 mab(克隆7c10，10mg/kg)每周两次治疗小鼠。
48.图24a-图24c显示阻断cd93信号传导在原位4t1中促进肿瘤血管成熟。抗cd93治疗后10天，对4t1肿瘤组织的asma(图24a)和ng2(图24b)进行了染色以检查cd31 血管上的周细胞覆盖度。通过cd31染色计数血管。图24c显示抗cd93治疗显著减少了肿瘤缺氧并增加了灌注，这分别由吡莫尼唑和凝集素-fitc染色揭示。
49.图25a-图25c显示了cd93阻断促进了有利的tme。基于if分析(图25a，25b)和facs分析(图25c)，在抗cd93治疗下的4t1肿瘤显示出更多的cd3 t细胞浸润，伴有较少的瘤内mdsc。
50.图26a-图26c显示igfbp7和cd93在人癌症的血管中被上调。igfbp7(图26a)和cd93(图26b)在人癌症(包括肾癌、头颈癌以及结肠癌)内的血管中被上调。图26c显示cd93和igfbp7在黑色素瘤相关内皮细胞中均被上调。
51.图27a-图27b显示了igfbp7/cd93途径在对抗pd疗法具有抗性的人癌症中的富集。图27a显示了转移性尿路上皮癌患者中igfbp7和cd93的表达水平。在用抗pd-l1治疗的转移性尿路上皮癌患者的ii期试验中(77)，比较了非应答者(sd/pd)与应答者(cr/pr)之间igfbp7和cd93的表达水平。使用wilcoxon秩和检验进行统计分析。图27b显示黑色素瘤患者中igfbp7和cd93的表达水平。在接受抗pd-1疗法的黑色素瘤患者队列中(78)，测定了有应答者和非反应者中igfbp7和cd93的表达。使用未配对学生氏t检验进行统计分析。
52.图28a-图28e证明igfbp7和mmrn2与cd93上的不同基序结合。在图28a中，针对igfbp7-ig和mmrn2-ig的结合对经转染表达第14组c-型凝集素分子的hek293t细胞的结合进行了染色。在图28b中，在igfbp7-his蛋白存在或不存在的情况下，用对照或mmrn2-ig对稳定表达cd93的cho细胞进行染色。在图28c中，将用igfbp7-his蛋白涂覆盖的孔与cd93-his蛋白一起孵育，然后通过elisa检测mmrn2-ig结合。用cd93-his蛋白涂覆的孔用作阳性对照。在图28d中，在抗-mcd93(7c10)存在或不存在的情况下，用mmrn-ig对用对照或cd93构建体转染的hek293t细胞的结合进行染色。在图28e中，用抗cd93(7c10)、igfbp7-ig和mmrn2-ig对经转染以表达不同小鼠cd93突变体的hek293t细胞进行了染色。
具体实施方案
53.本技术提供了用于促进有利于治疗干预的肿瘤微环境的方法和组合物。实体瘤内渗漏和不规则的血管网络对药物递送造成巨大障碍，并损害免疫细胞浸润。本技术的发明人的新型发现是，胰岛素生长因子结合蛋白7(igfbp7)通过cd93传递信号，该信号对于这种异常是关键的。受vegf信号传导控制的cd93和igfbp7的表达在肿瘤组织中均被上调。令人惊讶地发现，igfbp7或cd93单克隆抗体对igfbp7和cd93相互作用的破坏减弱了肿瘤生长并促进了血管成熟。cd93阻断增加肿瘤灌注，减少缺氧，促进化学疗法。此外，靶向cd93促进肿瘤内t细胞浸润，从而使肿瘤对抗pd1抗体疗法敏感。因此，本技术鉴定了导致异常肿瘤血管形成的新型分子相互作用，并提供了癌症治疗的新型方法。
54.本技术提供了特异性抑制igfbp7/cd93信号传导途径的药剂，诸如特异性阻断cd93与igfbp7之间相互作用的药剂。合适的药剂包括特异性识别cd93的封闭抗体、特异性识别ifgbp7的封闭抗体、包含cd93或其变体的胞外结构域的至少一部分的抑制性cd93多肽、包含igfbp7变体的抑制性多肽以及其它剂，诸如肽、肽类似物、融合肽、适体、avimer、anticalin、speigelmer、小分子化合物、sirna、shrna、mirna、反义rna和基因编辑系统。这些药剂可用于治疗癌症或有助于癌症治疗的一个或多个方面，诸如阻断异常肿瘤血管生成、使未成熟和渗漏的血管正常化、促进肿瘤中功能性血管网络的形成、促进血管成熟、促进有利的肿瘤微环境、增加肿瘤中免疫细胞的浸润、增加肿瘤灌注和减少肿瘤中的缺氧。本文所述的药剂也可用于使肿瘤对第二疗法敏感或促进第二治疗剂的递送。因此，本文所述的药剂特别适用于联合治疗，例如与化学治疗剂和免疫调节剂的组合。
55.因此，一方面，提供了治疗受试者的癌症或癌症治疗的一个或多个方面的方法，包括向受试者施用有效量的特异性抑制igfbp7/cd93信号传导途径的药剂(诸如特异性阻断cd93与igfbp7之间的相互作用的药剂)。
56.另一方面，提供了特异性阻断cd93与igfbp7之间相互作用的新型药剂(诸如抗cd93、抗igfbp7、抑制性cd93多肽和抑制性igfbp7多肽)。
57.另一方面，提供了例如在高通量筛选背景下鉴定用于癌症治疗的药剂(诸如特异性阻断cd93与igfbp7之间相互作用的药剂)的方法。
58.还提供了可用于本文所述方法的试剂盒、药剂(诸如本文所述的任何药剂)、编码所述药剂(诸如本文所述的任何药剂)的多核苷酸和试剂(诸如分离的cd93/igfbp7复合物)。
59.定义
60.除非特别指出，否则本文中使用的所有技术和科学术语具有与本技术所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。另外，在本技术的实践中，可以使用与本文描述的方法或材料类似或等同的任何方法或材料。出于本技术的目的，定义了以下术语。
61.应当理解，本文中本技术描述的术语“包含”的实施方案包括“由实施方案组成”和/或“基本上由实施方案组成”。
62.抑制cd93与igfbp7之间相互作用的药剂是指与不存在所述药剂时cd93与igfbp7之间的结合水平相比，降低cd93与igfbp7之间结合水平的任何药剂。在一些实施方案中，所述药剂是将cd93与igfbp7之间的结合水平降低至少约10％、20％、30％、40％或50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％的药剂。在一些实施方案中，所述药剂是将cd93与igfbp7之间
的结合水平降低至检测不到的水平，或消除cd93与igfbp7之间的结合的药剂。检测和/或测量(定量)cd93与igfbp7结合的合适方法是本领域技术人员熟知的，包括本文所述的那些方法。
[0063]“血管生成”是指新血管从现有血管中长出的过程。
[0064]
术语“抗体”以其最广泛的意义使用，涵盖各种抗体结构，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)、人源化抗体、嵌合抗体、全长抗体及其抗原结合片段，只要它们表现出所需的抗原结合活性即可。抗体和/或抗体片段可源自鼠抗体、兔抗体、人抗体、完全人源化抗体、骆驼科动物抗体可变结构域和人源化形式、鲨鱼抗体可变结构域和人源化形式以及骆驼化抗体可变结构域。
[0065]“fv”是包含完整抗原识别和结合位点的最小抗体片段。该片段由紧密非共价缔合的一个重链可变区结构域和一个轻链可变区结构域的二聚体组成。从这两个结构域的折叠中发出六个高变环(重链和轻链各3个环)，其为抗原结合贡献氨基酸残基并赋予抗体抗原结合特异性。然而，即使单个可变结构域(或仅包含3个对抗原特异的cdr的fv的一半)也具有识别抗原并结合其的能力，尽管亲和力低于完整结合位点。
[0066]“单链fv”，也缩写为“sfv”或“scfv”，是包含连接成单个多肽链的vh和vl抗体结构域的抗体片段。在一些实施方案中，scfv多肽还包含位于vh与vl结构域之间的多肽接头，其使得scfv能够形成抗原结合所需的结构。关于scfv的综述，参见pl
ü
ckthun in the pharmacology of monoclonal antibodies，第113卷，rosenburg和moore编辑，springer-verlag,new york，第269-315页(1994)，所述文献出于所有目的通过引用以其整体并入本文。
[0067]
本文所述的“双抗体(diabody)”是指包含两种scfv多肽的复合物。在一些实施方案中，实现了vh与vl结构域的链间配对而非链内配对，产生了二价片段，即具有两个抗原结合位点的片段。
[0068]
非人(例如，啮齿类动物)抗体的“人源化”形式是包含源自非人抗体的最少序列的嵌合抗体。在大多数情况下，人源化抗体是具有所需的抗体特异性、亲和力和能力的人免疫球蛋白(受者抗体)，在所述免疫球蛋白中来自受者的高变区(hvr)的残基被来自诸如小鼠、大鼠、兔或非人类灵长类动物等非人物种(供体抗体)的高变区的残基替代，具有所需的抗体特异性、亲和力和能力。在一些情况下，人免疫球蛋白的框架区(fr)残基被相应的非人残基替取代。此外，人源化抗体可以包含未在受者抗体或供者抗体中发现的残基。进行这些修饰以进一步改进抗体的性能。一般而言，人源化抗体将包含基本上所有的至少一个、通常两个可变结构域，其中所有或基本上所有的高变环对应于非人类免疫球蛋白的高变环，并且所有或基本上所有的fr是人类免疫球蛋白序列的fr。人源化抗体任选地还包含免疫球蛋白恒定区(fc)(通常是人免疫球蛋白的恒定区)的至少一部分。关于进一步的细节，参见jones等人，nature 321:522-525(1986)；riechmann等人，nature 332:323-329(1988)；和presta,curr.op.struct.biol.2:593-596(1992)，所述文献中的每一篇均出于所有目的通过引用以其整体并入本文。
[0069]
如本文中所用，当在等摩尔浓度的第一抗体存在的情况下，第一抗体抑制第二抗体的靶结合至少约50％(诸如至少约55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％中的任一个)时，第一抗体与第二抗体“竞争”与靶标(例如，cd93或igfbp7)的结
合，反之亦然。在pct公布第wo 03/48731号(出于所有目的通过引用以其整体并入本文)中描述了基于其交叉竞争的“分仓(binning)”抗体的高通量方法。
[0070]
关于本文鉴定的多肽和抗体序列的“氨基酸序列同一性百分比(％)”或“同源性”被定义为在将任何保守取代视为序列同一性的一部分来比对序列之后，候选序列中与所比较的多肽中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分比。用于确定氨基酸序列同一性百分比的比对可以以本领域技术人员熟知的各种方法实现，例如，使用可公开获得的计算机软件，诸如blast、blast-2、align、megalign(dnastar)或muscle软件来实现。本领域技术人员可以确定用于测量比对的合适参数，包括在被比较的序列全长上实现最大比对所需的任何算法。然而，为了本文的目的，使用序列比较计算机程序muscle(edgar,r.c.,nucleic acids research 32(5):1792-1797,2004；edgar,r.c.,bmc bioinformatics 5(1):113,2004，其每一篇均出于所有目的通过引用以其整体并入本文)来生成氨基酸序列同一性百分比值。
[0071]“同源的”是指两个多肽之间或两个核酸分子之间的序列相似性或序列同一性。当两个比较序列中的一个位置被相同的碱基或氨基酸单体亚单位占据时，例如，如果两个dna分子中的每一个中的一个位置被腺嘌呤占据，那么该分子在该位置是同源的。两个序列之间的同源性百分比是两个序列共有的匹配或同源位置数除以比较位置数乘以100的函数。例如，如果两个序列中10个位置中有6个是匹配的或同源的，那么这两个序列是60％同源的。举例来说，attgcc和tatggc的dna序列共享50％的同源性。通常，当将两个序列对齐以给出最大同源性时，就进行了比较。
[0072]
如本文中所用，术语“表位”是指抗体或双抗体所结合的抗原上的原子或氨基酸的特定组。如果两种抗体或抗体部分对抗原表现出竞争性结合，则它们可以结合抗原中的相同表位。
[0073]
如本文中所用，当在等摩尔浓度的第一抗体存在的情况下，第一抗体抑制第二抗体的靶抗原结合至少约50％(例如至少约55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％中的任一个)时，第一抗体(诸如双抗体)与第二抗体(诸如双抗体)“竞争”与靶抗原的结合，或反之亦然。在pct公布第wo 03/48731号(出于所有目的通过引用以其整体并入本文)中描述了基于其交叉竞争的“分仓(binning)”抗体的高通量方法。
[0074]
术语“多肽”或“肽”在本文中用于涵盖所有种类的天然存在的和合成的蛋白质，包括所有长度的蛋白质片段、融合蛋白和经修饰的蛋白质，包括但不限于糖蛋白，以及所有其它类型的经修饰的蛋白质(例如，由磷酸化、乙酰化、豆蔻酰化、棕榈酰化、糖基化、氧化、甲酰化、酰胺化、多谷氨酰化、adp-核糖基化、聚乙二醇化、生物素化等产生的蛋白质)。
[0075]
如本文中所用，术语“特异性结合”、“特异性识别”和“特异于”是指可测量和可重现的相互作用，诸如靶标与抗体(诸如双抗体)之间的结合。在某些实施方案中，在异质分子(包括生物分子(例如，细胞表面受体))群存在的情况下，特异性结合决定靶标的存在。例如，特异性识别靶标(其可以是表位)的抗体是与其与其它分子的结合相比以更大的亲和力、亲合力、更容易和/或以更长的持续时间结合该靶标的抗体(例如双抗体)。在一些实施方案中，如例如通过放射免疫测定法(ria)所测量的，抗体与不相关分子的结合程度小于抗体与靶标的结合的约10％。在一些实施方案中，特异性结合靶标的抗体具有≤10-5
m,≤10-6
m,≤10-7
m,≤10-8
m,≤10-9
m,≤10-10
m,≤10-11
m或≤10-12
m的解离常数(kd)。在一些实施方案中，抗体特异性结合蛋白质上的表位，所述表位在来自不同物种的所述蛋白质间是保守
的。在一些实施方案中，特异性结合可以包括但不要求排它性结合。抗体或抗原结合结构域的结合特异性可以通过本领域已知的方法来实验性确定。此类方法包括但不限于蛋白质印迹、elisa、ria、ecl、irma、eia、biacoretm和肽扫描。
[0076]
如本文中所用，“组合物”包括并适用于本技术的组合物。本技术还提供了包含本文所述组分的药物组合物。
[0077]
如本文中所用，“治疗”是用于获得有益的或期望的结果(包括临床结果)的方法。出于本技术的目的，有益的或期望的临床结果包括但不限于以下的一种或多种：缓和由疾病引起的一种或多种症状，减轻疾病的程度，稳定疾病(例如，阻止或延迟疾病的恶化)，预防或延迟疾病的扩散(例如，转移)，阻止或延迟疾病的复发，延迟或减缓疾病的进展，改善疾病状态，缓解(部分或全部)疾病，减少治疗疾病所需的一种或多种其它药物的药剂量，延缓疾病的进展，提高生活质量并且/或者延长生存期。“治疗”还涵盖减少增生诸如肿瘤(例如，癌症)、再狭窄或肺动脉高压的病理后果。本技术的方法考虑了治疗的这些方面的任一个或多个方面。对待治疗的受试者的益处在统计学上是显著的，或者至少对于患者或医生是可察觉的。
[0078]
本文所用的术语“有效量”是指足以治疗指定状态、病症、疾患或疾病，诸如改善、减轻、减少并且/或者延迟其症状(例如，临床或亚临床症状)中的一种或多种的药剂或组合物的量。对于治疗性用途，有益的或期望的结果包括，例如，减少由疾病引起的一种或多种症状(生物化学的、组织学的和/或行为的)，包括其在疾病发展过程中出现的并发症和中间病理表型，提高患有所述疾病的人的生活质量，减少治疗所述疾病所需的其它药物的药剂量，增强另一种药物的效果，延缓疾病的进展，并且/或者延长患者的生存期。关于增生(例如，癌症、再狭窄或肺动脉高压)，有效量包括足以引起增生组织(诸如肿瘤)收缩并且/或者降低增生组织的生长速率(诸如抑制增生或肿瘤生长)或者防止或延迟增生中其它不想要的细胞增殖的量。在一些实施方案中，有效量是足以延迟增生(例如，癌症、再狭窄或肺动脉高血压)发展的量。在一些实施方案中，有效量是足以防止或延迟复发的量。可将有效量一次或多次施用。在癌症的情况下，药物或组合物的有效量可以：(i)减少肿瘤细胞的数量；(ii)减小肿瘤的尺寸；(iii)抑制、阻滞、在一定程度上减缓并优选停止肿瘤细胞向外周器官的浸润；(iv)抑制(即，在一定程度上减缓并优选停止)肿瘤转移；(v)抑制肿瘤生长；(vi)防止或延缓肿瘤的发生和/或复发；并且/或者(vii)在一定程度上缓解一种或多种与癌症相关的症状。注意，当施用活性成分的组合时，该组合的有效量可以包括或可以不包括单独施用时有效的每种成分的量。所需的确切量因受试者而异，取决于受试者的物种、年龄和一般状况、所治疗疾病的严重程度、所用的一种或多种特定药物、施用方式等。
[0079]
如本文中所用，术语“同时施用”意指联合治疗中的第一疗法和第二疗法的施用时间间隔不超过约15分钟，诸如不超过约10分钟、5分钟或1分钟中的任一种。当同时施用第一疗法和第二疗法时，第一疗法和第二疗法可以包含在相同的组合物(例如，包含第一疗法和第二疗法的组合物)中或者包含在单独的组合物(例如，第一疗法包含在一种组合物中，第二疗法包含在另一种组合物中)中。
[0080]
如本文中所用，术语“依次施用”意指联合治疗中的第一疗法和第二疗法的施用时间间隔超过约15分钟，诸超过约20分钟、30分钟、40分钟、50分钟、60分钟或更多分钟。可以首先施用第一疗法或第二疗法。第一疗法和第二疗法包含在单独的组合物中，所述组合物
可以包含在相同或不同的包装或试剂盒中。
[0081]
如本文中所用，术语“并行施用”(concurrent administration)是指在联合治疗中第一种疗法的施用和第二疗法的施用相互重叠。
[0082]
如本文中所用，“药学上可接受的”或“药理学上可相容的”是指不是生物学上或其它方面不希望的物质，例如，可以将所述物质掺入到向患者施用的药物组合物中，而不会引起任何显著的不希望的生物效应或以有害的方式与含有其的组合物的任何另外组分相互作用。药学上可接受的载体或赋形剂优选满足毒理学和生产测试的要求标准，并且/或者包括在由美国食品和药物管理局或其它州/联邦政府制定的非活性成分指南中，或列在美国药典或其它公认的用于哺乳动物，尤其是人的药典中。
[0083]
术语“载体”是指与化合物一起施用的稀释剂、佐剂、赋形剂或媒介物。此类药物载体可以是无菌液体，诸如水和油，包括石油、动物、植物或合成来源的液体，诸如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。水或水溶液盐水溶液以及葡萄糖和甘油水溶液优选用作载体，特别是对于注射溶液。或者，载体可以是固体剂型载体，包括但不限于粘合剂(对于压制药丸)、助流剂、包封剂、调味剂和着色剂中的一种或多种。e.w.martin的“remington’s pharmaceutical sciences”中描述了合适的药物载体，所述文献出于所有目的通过引用以其整体并入。
[0084]
术语“肿瘤”是指或描述哺乳动物的生理状况，其典型特征在于不受控制的细胞生长，并且包括良性或恶性的组织异常生长。术语“肿瘤”包括癌症。
[0085]
术语“受试者”、“个体”和“患者”在本文中可互换使用，指哺乳动物，包括但不限于人、牛、马、猫、犬、啮齿类动物或灵长类动物。在一些实施方案中，受试者是人。在一个优选实施方案中，受试者是人。
[0086]
本文中提到的“约”一个值或参数包括(和描述)针对该值或参数本身的变化。例如，提及“约x”的描述包括“x”的描述。在某些实施方案中，范围可以在给定值或范围的数量级内，优选在50％内，更优选在20％内，还更优选在10％内，甚至更优选在5％内。术语“约”或“大致”所包含的可容许的变化取决于所研究的特定系统，并且可以被本领域普通技术人员容易地理解。
[0087]
本文所用的术语“约x-y”具有与“约x至约y”相同的含义
[0088]
如本文和所附权利要求中所用，除非上下文另有明确规定，否则单数形式“一个/种(a)”、“一个/种(an)”、“或(or)”和“该(the)”包括复数指示物。因此，例如，对“方法”的引用包括本文所述类型的和/或对于本领域技术人员而言在阅读本公开内容后将变得显而易见的一种或多种方法和/或步骤。如对于本领域技术人员显而易见的是，被评估、选择用于治疗和/或接受治疗的受试者是需要此类活动的受试者。
[0089]
除非另有说明，否则本公开的实践采用统计分析、分子生物学(包括重组技术)、微生物学、细胞生物学和生物化学的常规技术，所述技术都在本领域的技术范围内。此类工具和技术详细地描述于例如以下文献中：sambrook等人(2001)molecular cloning:a laboratory manual.第3版cold spring harbor laboratory press:cold spring harbor,new york；ausubel等人编辑(2005)current protocols in molecular biology.john wiley和sons,inc.:hoboken,nj；bonifacino等人编辑(2005)current protocols in cell biology.john wiley和sons,inc.:hoboken,nj；coligan等人编辑
(2005)current protocols in immunology,john wiley和sons,inc.:hoboken,nj；coico等人编辑(2005)current protocols in microbiology,john wiley和sons,inc.:hoboken,nj；coligan等人编辑(2005)current protocols in protein science,john wiley和sons,inc.:hoboken,nj；和enna等人编辑(2005)current protocols in pharmacology,john wiley和sons,inc.:hoboken,nj。其它技术在例如美国专利第7,912,698号和美国专利申请公布第2011/0202322号和第2011/0307437号(所述每个专利出于所有目的通过引用以其整体并入)中进行了解释。
[0090]
已经采用的术语和表达用作描述性术语而非限制性术语，并且此类术语和表达的使用不排除所示出和描述的特征或其部分的任何等同物，并且在所要求保护的技术范围内各种修改是可能的。
[0091]
治疗方法
[0092]
本技术一方面提供了治疗受试者的肿瘤(诸如癌症)或肿瘤(诸如癌症)治疗的一个或多个方面的方法，其包括向受试者施用有效量的特异性抑制igfbp7/cd93信号传导途径的药剂(诸如阻断cd93与igfbp7之间相互作用的药剂)。如果与在剂不存在的情况下cd93与igfbp7之间的结合水平相比，所述药剂降低了cd93与igfbp7之间的结合，则所述药剂“阻断了cd93与igfbp7之间的相互作用”。在一些实施方案中，所述药剂将cd93与igfbp7的结合减少至少约10％、20％、30％、40％或50％。在一些实施方案中，所述药剂将cd93与igfbp7的结合减少至少约60％、70％、80％、90％或更多。在一些实施方案中，所述药剂将cd93/igfbp7相互作用阻断至不可检测的水平，或消除cd93与igfbp7之间的结合。
[0093]
用于确定cd93与igfbp7的结合的合适方法是本领域已知的，并且可以包括例如elisa、下拉测定、表面等离子体共振测定、基于芯片的测定、facs、酵母双杂交系统、噬菌体展示和fret。
[0094]
本文所述的药剂可以直接施用，或者可以以编码所述药剂的多核苷酸的形式施用。因此，如本文中所用，术语“向受试者施用”包括直接向受试者施用剂和施用编码所述药剂的多核苷酸，例如通过载体施用。
[0095]
在一些实施方案中，提供了治疗受试者的肿瘤(诸如癌症)的方法，其包括向受试者施用有效量的特异性抑制igfbp7/cd93信号传导途径的药剂(诸如阻断cd93与igfbp7之间相互作用的药剂)。在一些实施方案中，所述药剂是抗体、肽、多肽、肽类似物、融合肽、适体、avimer、anticalin、speigelmer、小分子化合物、sirna、shrna、mirna、反义rna或基因编辑系统。在一些实施方案中，所述药剂是特异性识别cd93的封闭抗体。在一些实施方案中，所述药剂是特异性识别ifgbp7的封闭抗体。在一些实施方案中，所述药剂是抑制性cd93多肽，其包含cd93或其变体的胞外结构域的至少一部分。在一些实施方案中，所述药剂是包含igfbp7的变体的抑制性多肽。在一些实施方案中，所述方法还包括向受试者施用第二治疗剂(诸如化学治疗剂、免疫调节剂或免疫细胞)。
[0096]
在一些实施方案中，提供了阻断受试者中的异常肿瘤血管生成的方法，其包括向受试者施用有效量的特异性抑制igfbp7/cd93信号传导途径的药剂(例如阻断cd93与igfbp7之间相互作用的药剂)。在一些实施方案中，所述药剂选自抗体、肽、多肽、肽类似物、融合肽、适体、avimer、anticalin、speigelmer、小分子化合物、sirna、shrna、mirna、反义rna和基因编辑系统。在一些实施方案中，所述药剂是特异性识别cd93的封闭抗体。在一些
实施方案中，所述药剂是特异性识别ifgbp7的封闭抗体。在一些实施方案中，所述药剂是抑制性cd93多肽，其包含cd93或其变体的胞外结构域的至少一部分。在一些实施方案中，所述药剂是包含igfbp7的变体的抑制性多肽。在一些实施方案中，所述方法还包括向受试者施用第二治疗剂(诸如化学治疗剂、免疫调节剂或免疫细胞)。
[0097]
在一些实施方案中，提供了使受试者中未成熟血管和渗漏血管正常化的方法，其包括向受试者施用有效量的特异性抑制igfbp7/cd93信号传导途径的药剂(诸如阻断cd93与igfbp7之间相互作用的药剂)。在一些实施方案中，所述药剂选自抗体、肽、多肽、肽类似物、融合肽、适体、avimer、anticalin、speigelmer、小分子化合物、sirna、shrna、mirna、反义rna和基因编辑系统。在一些实施方案中，所述药剂是特异性识别cd93的封闭抗体。在一些实施方案中，所述药剂是特异性识别ifgbp7的封闭抗体。在一些实施方案中，所述药剂是抑制性cd93多肽，其包含cd93或其变体的胞外结构域的至少一部分。在一些实施方案中，所述药剂是包含igfbp7的变体的抑制性多肽。在一些实施方案中，所述方法还包括向受试者施用第二治疗剂(诸如化学治疗剂、免疫调节剂或免疫细胞)。
[0098]
在一些实施方案中，提供了促进受试者的肿瘤中功能性血管网络形成的方法，其包括向受试者施用有效量的特异性抑制igfbp7/cd93信号传导途径的药剂(诸如阻断cd93与igfbp7之间相互作用的药剂)。在一些实施方案中，所述药剂选自抗体、肽、多肽、肽类似物、融合肽、适体、avimer、anticalin、speigelmer、小分子化合物、sirna、shrna、mirna、反义rna和基因编辑系统。在一些实施方案中，所述药剂是特异性识别cd93的封闭抗体。在一些实施方案中，所述药剂是特异性识别ifgbp7的封闭抗体。在一些实施方案中，所述药剂是抑制性cd93多肽，其包含cd93或其变体的胞外结构域的至少一部分。在一些实施方案中，所述药剂是包含igfbp7的变体的抑制性多肽。在一些实施方案中，所述方法还包括向受试者施用第二治疗剂(诸如化学治疗剂、免疫调节剂或免疫细胞)。
[0099]
在一些实施方案中，提供了促进受试者的肿瘤中血管成熟的方法，其包括向受试者施用有效量的特异性抑制igfbp7/cd93信号传导途径的药剂(诸如阻断cd93与igfbp7之间相互作用的药剂)。在一些实施方案中，提供了促进受试者的肿瘤中血管正常化的方法，其包括向受试者施用有效量的特异性抑制igfbp7/cd93信号传导途径的药剂(诸如阻断cd93与igfbp7之间相互作用的药剂)。在一些实施方案中，所述药剂选自抗体、肽、多肽、肽类似物、融合肽、适体、avimer、anticalin、speigelmer、小分子化合物、sirna、shrna、mirna、反义rna和基因编辑系统。在一些实施方案中，所述药剂是特异性识别cd93的封闭抗体。在一些实施方案中，所述药剂是特异性识别ifgbp7的封闭抗体。在一些实施方案中，所述药剂是抑制性cd93多肽，其包含cd93或其变体的胞外结构域的至少一部分。在一些实施方案中，所述药剂是包含igfbp7的变体的抑制性多肽。在一些实施方案中，所述方法还包括向受试者施用第二治疗剂(诸如化学治疗剂、免疫调节剂或免疫细胞)。在一些实施方案中，血管正常化的特征在于周细胞和/或平滑肌细胞与衬在血管壁上的内皮细胞的联系增加，形成更正常的基底膜(例如，具有更大的生理厚度)和/或血管与基底膜的更紧密联系。在一些实施方案中，本文所述的血管的正常化不涉及血管数量的减少(例如，密集度更低的网络)。
[0100]
在一些实施方案中，提供了在受试者中促进有利的肿瘤微环境的方法，其包括向受试者施用有效量的特异性抑制igfbp7/cd93信号传导途径的药剂(诸如阻断cd93与
igfbp7之间相互作用的药剂)。在一些实施方案中，所述药剂选自抗体、肽、多肽、肽类似物、融合肽、适体、avimer、anticalin、speigelmer、小分子化合物、sirna、shrna、mirna、反义rna和基因编辑系统。在一些实施方案中，所述药剂是特异性识别cd93的封闭抗体。在一些实施方案中，所述药剂是特异性识别ifgbp7的封闭抗体。在一些实施方案中，所述药剂是抑制性cd93多肽，其包含cd93或其变体的胞外结构域的至少一部分。在一些实施方案中，所述药剂是包含igfbp7的变体的抑制性多肽。在一些实施方案中，所述方法还包括向受试者施用第二治疗剂(诸如化学治疗剂、免疫调节剂或免疫细胞)。
[0101]
在一些实施方案中，提供了增加受试者的肿瘤中免疫细胞浸润的方法，其包括向受试者施用有效量的特异性抑制igfbp7/cd93信号传导途径的药剂(诸如阻断cd93与igfbp7之间相互作用的药剂)。在一些实施方案中，所述方法增加cd3 细胞(诸如肿瘤浸润性白细胞(“til”))的浸润。在一些实施方案中，所述方法增加cd45 细胞(诸如til)的浸润。在一些实施方案中，所述方法增加cd8 细胞(诸如nk细胞或t细胞)的浸润。在一些实施方案中，所述方法将免疫细胞对肿瘤的浸润增加至少约20％、30％、40％、50％或更多中的任一种。在一些实施方案中，所述药剂选自抗体、肽、多肽、肽类似物、融合肽、适体、avimer、anticalin、speigelmer、小分子化合物、sirna、shrna、mirna、反义rna和基因编辑系统。在一些实施方案中，所述药剂是特异性识别cd93的封闭抗体。在一些实施方案中，所述药剂是特异性识别ifgbp7的封闭抗体。在一些实施方案中，所述药剂是抑制性cd93多肽，其包含cd93或其变体的胞外结构域的至少一部分。在一些实施方案中，所述药剂是包含igfbp7的变体的抑制性多肽。在一些实施方案中，所述方法还包括向受试者施用第二治疗剂(诸如化学治疗剂、免疫调节剂或免疫细胞)。
[0102]
在一些实施方案中，提供了增加受试者中肿瘤灌注的方法，其包括向受试者施用有效量的特异性抑制igfbp7/cd93信号传导途径的药剂(诸如阻断cd93与igfbp7之间相互作用的药剂)。在一些实施方案中，肿瘤灌注增加至少约20％、30％、40％、50％或更多中的任一种。在一些实施方案中，所述药剂选自抗体、肽、多肽、肽类似物、融合肽、适体、avimer、anticalin、speigelmer、小分子化合物、sirna、shrna、mirna、反义rna和基因编辑系统。在一些实施方案中，所述药剂是特异性识别cd93的封闭抗体。在一些实施方案中，所述药剂是特异性识别ifgbp7的封闭抗体。在一些实施方案中，所述药剂是抑制性cd93多肽，其包含cd93或其变体的胞外结构域的至少一部分。在一些实施方案中，所述药剂是包含igfbp7的变体的抑制性多肽。在一些实施方案中，所述方法还包括向受试者施用第二治疗剂(诸如化学治疗剂、免疫调节剂或免疫细胞)。
[0103]
在一些实施方案中，提供了减少受试者的肿瘤中缺氧的方法，其包括向受试者施用有效量的特异性抑制igfbp7/cd93信号传导途径的药剂(诸如阻断cd93与igfbp7之间相互作用的药剂)。在一些实施方案中，肿瘤缺氧减少至少约20％、30％、40％、50％或更多中的任一种。在一些实施方案中，所述药剂选自抗体、肽、多肽、肽类似物、融合肽、适体、avimer、anticalin、speigelmer、小分子化合物、sirna、shrna、mirna、反义rna和基因编辑系统。在一些实施方案中，所述药剂是特异性识别cd93的封闭抗体。在一些实施方案中，所述药剂是特异性识别ifgbp7的封闭抗体。在一些实施方案中，所述药剂是抑制性cd93多肽，其包含cd93或其变体的胞外结构域的至少一部分。在一些实施方案中，所述药剂是包含igfbp7的变体的抑制性多肽。在一些实施方案中，所述方法还包括向受试者施用第二治疗
剂(诸如化学治疗剂、免疫调节剂或免疫细胞)。
[0104]
在一些实施方案中，提供了减少受试者中免疫抑制细胞(诸如treg细胞、粒细胞髓样衍生抑制细胞(gmdsc)和肿瘤相关巨噬细胞(mac))的方法，其包括向受试者施用有效量的特异性抑制igfbp7/cd93信号传导途径的药剂(诸如阻断cd93与igfbp7之间相互作用的药剂)。在一些实施方案中，所述方法减少了肿瘤微环境中的免疫抑制细胞。在一些实施方案中，免疫抑制细胞减少至少约20％、30％、40％、50％或更多中的任一种。在一些实施方案中，所述药剂选自抗体、肽、多肽、肽类似物、融合肽、适体、avimer、anticalin、speigelmer、小分子化合物、sirna、shrna、mirna、反义rna和基因编辑系统。在一些实施方案中，所述药剂是特异性识别cd93的封闭抗体。在一些实施方案中，所述药剂是特异性识别ifgbp7的封闭抗体。在一些实施方案中，所述药剂是抑制性cd93多肽，其包含cd93或其变体的胞外结构域的至少一部分。在一些实施方案中，所述药剂是包含igfbp7的变体的抑制性多肽。在一些实施方案中，所述方法还包括向受试者施用第二治疗剂(诸如化学治疗剂、免疫调节剂或免疫细胞)。
[0105]
在一些实施方案中，提供了使肿瘤对第二疗法敏感的方法，其包括向受试者施用有效量的特异性抑制igfbp7/cd93信号传导途径的药剂(诸如阻断cd93与igfbp7之间相互作用的药剂)。在一些实施方案中，所述药剂选自抗体、肽、多肽、肽类似物、融合肽、适体、avimer、anticalin、speigelmer、小分子化合物、sirna、shrna、mirna、反义rna和基因编辑系统。在一些实施方案中，所述药剂是特异性识别cd93的封闭抗体。在一些实施方案中，所述药剂是特异性识别ifgbp7的封闭抗体。在一些实施方案中，所述药剂是抑制性cd93多肽，其包含cd93或其变体的胞外结构域的至少一部分。在一些实施方案中，所述药剂是包含igfbp7的变体的抑制性多肽。在一些实施方案中，所述方法还包括对受试者进行第二疗法(诸如化学疗法、免疫疗法、细胞疗法、放射疗法等)。在一些实施方案中，第二疗法是免疫疗法。在一些实施方案中，第二疗法包括施用免疫检查点抑制剂，包括例如抗pd1抗体、抗pd-l1抗体、抗ctla4抗体或其组合，诸如抗pd1抗体和抗ctla4抗体。
[0106]
在一些实施方案中，提供了促进第二治疗剂(诸如化学治疗剂或免疫调节剂)递送的方法，其包括向受试者施用有效量的特异性抑制igfbp7/cd93信号传导途径的药剂(诸如阻断cd93与igfbp7之间相互作用的药剂)。在一些实施方案中，提供了提高第二治疗剂(诸如化学治疗剂或免疫调节剂)的功效的方法，其包括向受试者施用有效量的特异性抑制igfbp7/cd93信号传导途径的药剂(诸如阻断cd93与igfbp7之间相互作用的药剂)。在一些实施方案中，所述药剂选自抗体、肽、多肽、肽类似物、融合肽、适体、avimer、anticalin、speigelmer、小分子化合物、sirna、shrna、mirna、反义rna和基因编辑系统。在一些实施方案中，所述药剂是特异性识别cd93的封闭抗体。在一些实施方案中，所述药剂是特异性识别ifgbp7的封闭抗体。在一些实施方案中，所述药剂是抑制性cd93多肽，其包含cd93或其变体的胞外结构域的至少一部分。在一些实施方案中，所述药剂是包含igfbp7的变体的抑制性多肽。在一些实施方案中，所述方法还包括依次、同时并且/或者并行地(concurrently)向受试者施用第二治疗剂(诸如化学治疗剂、免疫调节剂或免疫细胞)。在一些实施方案中，第二治疗剂是免疫检查点抑制剂，包括例如抗pd1抗体、抗pd-l1抗体、抗ctla4抗体或其组合，例如抗pd1抗体和抗ctla4抗体。
[0107]
本文所述的药剂也可用于以下情况的一种或多种：1)增加周细胞覆盖的血管；2)
增加圆形血管的血管长度；3)增加与血管相关的α平滑肌肌动蛋白(α-sma)阳性细胞；以及4)减少β1整联蛋白的激活。在一些实施方案中，提供了增加周细胞覆盖的血管的方法，其包括向受试者施用有效量的特异性抑制igfbp7/cd93信号传导途径的药剂(诸如阻断cd93与igfbp7之间相互作用的药剂)。在一些实施方案中，提供了增加圆形血管的血管长度的方法，其包括向受试者施用有效量的特异性抑制igfbp7/cd93信号传导途径的药剂(诸如阻断cd93与igfbp7之间相互作用的药剂)。在一些实施方案中，提供了增加与血管相关联的α平滑肌肌动蛋白(α-sma)-阳性细胞的方法，其包括向受试者施用有效量的特异性抑制igfbp7/cd93信号传导途径的药剂(诸如阻断cd93与igfbp7之间相互作用的药剂)。在一些实施方案中，提供了减少β1整联蛋白激活的方法，其包括向受试者施用有效量的特异性抑制igfbp7/cd93信号传导途径的药剂(诸如阻断cd93与igfbp7之间相互作用的药剂)。在一些实施方案中，所述药剂选自抗体、肽、多肽、肽类似物、融合肽、适体、avimer、anticalin、speigelmer、小分子化合物、sirna、shrna、mirna、反义rna和基因编辑系统。在一些实施方案中，所述药剂是特异性识别cd93的封闭抗体。在一些实施方案中，所述药剂是特异性识别ifgbp7的封闭抗体。在一些实施方案中，所述药剂是抑制性cd93多肽，其包含cd93或其变体的胞外结构域的至少一部分。在一些实施方案中，所述药剂是包含igfbp7的变体的抑制性多肽。在一些实施方案中，所述方法还包括依次、同时并且/或者并行地向受试者施用第二治疗剂(诸如化学治疗剂、免疫调节剂或免疫细胞)。
[0108]
在一些实施方案中，本文所述的方法包括向受试者施用有效量的抗cd93抗体，所述抗cd93抗体特异性识别cd93并阻断cd93与igfbp7之间的相互作用。在一些实施方案中，抗cd93抗体还阻断cd93与mmnr2之间的相互作用。在一些实施方案中，抗cd93抗体不阻断cd93与mmnr2之间的相互作用。在一些实施方案中，抗cd93抗体与cd93上的igfbp7结合位点结合。在一些实施方案中，抗cd93抗体与cd93的在igfbp7结合位点(例如,稳定相互作用所需的位点)之外的区域结合，因此结合间接影响与igfbp7的结合。在一些实施方案中，抗cd93抗体与mab mm01或mab 7c10竞争与cd93的结合。在一些实施方案中，抗cd93抗体与和mab mm01或mab 7c10的表位重叠或基本重叠的表位结合。在一些实施方案中，抗cd93抗体与和mab mm01或mab 7c10的表位基本不重叠的表位结合。在一些实施方案中，上述“基本重叠”是指cd93上抗cd93抗体所结合的残基的至少约50％、60％、70％、80％或90％与mab mm01或mab 7c10所结合的残基重叠。在一些实施方案中，抗cd93抗体是mab mm01或其人源化形式。在一些实施方案中，所述方法还包括向受试者施用第二治疗剂(诸如化学治疗剂、免疫调节剂或免疫细胞)。在一些实施方案中，第二治疗剂是免疫检查点抑制剂(诸如抗pd1抗体、抗pd-l1抗体、抗ctla4抗体或其组合，例如抗pd1抗体与抗ctla4抗体的组合)。
[0109]
在一些实施方案中，本文所述的方法包括向受试者施用有效量的多肽，所述多肽包含cd93或其变体的胞外结构域的至少一部分，所述多肽特异性阻断cd93与igfbp7之间的相互作用(抑制性cd93多肽)。在一些实施方案中，所述方法还包括向受试者施用第二治疗剂(诸如化学治疗剂、免疫调节剂或免疫细胞)。在一些实施方案中，第二治疗剂是免疫检查点抑制剂(诸如抗pd1抗体、抗pd-l1抗体、抗ctla-4抗体或其组合，诸如抗pd1抗体与抗ctla4抗体的组合)。在一些实施方案中，抑制性cd93多肽还包含稳定化结构域(诸如fc)。在一些实施方案中，抑制性cd93多肽的长度为约50至约100个氨基酸。在一些实施方案中，抑制性cd93多肽的cd93部分(即对应于cd93的胞外结构域或其部分并传递阻断cd93与igfbp7
的结合的功能的部分)的长度为约50至约100个氨基酸。在一些实施方案中，抑制性cd93多肽包含f238残基，其中氨基酸编号是基于seq id no:1。
[0110]
在一些实施方案中，抑制性cd93多肽是可溶性多肽。在一些实施方案中，抑制性cd93多肽是膜结合的，例如通过gpi键联结合。在某些实施方案中，在施用前将膜结合的抑制性cd93多肽从膜上切割下来。可以通过诸如静脉内途径等任何施用途径向受试者施用这些抑制性cd93多肽。或者，可通过施用编码抑制性cd93多肽的多核苷酸(例如通过载体平台)向受试者施用抑制性多肽。
[0111]
在一些实施方案中，抑制性cd93多肽通过跨膜结构域与膜结合。这种抑制性cd93多肽可以通过将编码该抑制性多肽的多核苷酸(诸如cdna或mrna)引入受试者的细胞中，并使抑制性cd93多肽在细胞表面上表达来引入受试者。例如，膜结合抑制性cd93多肽可以是与igfbp7结合但不能向下游传递信号的cd93的显性阴性形式。cd93的显性阴性形式可以包含一个或多个使cd93的胞内信号传导结构域失活的突变。或者，cd93的显性阴性形式缺乏cd93的胞内结构域。
[0112]
本文还设想了在胞外结构域中包含一个或多个突变(诸如允许抑制性cd93多肽显示出相对于cd93的其它结合配偶体诸如mmnr2优先结合igfbp7的突变)的抑制性cd93多肽。在一些实施方案中，抑制性cd93多肽与igfbp7的结合亲和力大于与mmnr2的结合亲和力。在一些实施方案中，与野生型cd93相比，抑制性cd93多肽以更大的亲和力与igfbp7结合。
[0113]
在一些实施方案中，本文所述的方法包括向受试者施用有效量的抗igfbp7抗体，所述抗igfbp7抗体特异性识别igfbp7并阻断cd93与igfbp7之间的相互作用。在一些实施方案中，抗igfbp7抗体还阻断igfbp7与其一种或多种其它结合配偶体诸如igf-1、igf-2和igf1r之间的相互作用。在一些实施方案中，抗igfbp7抗体不阻断igfbp7与其一种或多种结合配偶体之间的相互作用。在一些实施方案中，抗igfbp7抗体与igfbp7上的cd93结合位点结合。在一些实施方案中，抗igfbp7抗体与igfbp7的在cd93结合位点(例如稳定相互作用所需的位点)之外的区域结合，因此该结合间接影响与cd93的结合。在一些实施方案中，抗igfbp7抗体与igfbp7的胰岛素结合(ib)结构域结合。在一些实施方案中，抗igfbp7抗体与mab r003或mab 2c6竞争与igfbp7的结合。在一些实施方案中，抗igfbp7抗体与和mab r003或mab 2c6的表位重叠或基本重叠的表位结合。在一些实施方案中，上述“基本重叠”是指igfbp7上抗igfbp7抗体所结合的残基的至少约50％、60％、70％、80％或90％与mab r003或mab 2c6所结合的残基重叠的情况。在一些实施方案中，抗igfbp7抗体是mab r003或其人源化形式。在一些实施方案中，所述方法还包括向受试者施用第二治疗剂(诸如化学治疗剂、免疫调节剂或免疫细胞)。在一些实施方案中，第二治疗剂是免疫检查点抑制剂(例如抗pd1抗体或抗pd-l1抗体)。
[0114]
在一些实施方案中，本文所述的方法包括向受试者施用有效量的多肽，所述多肽包含特异性阻断cd93与igfbp7之间的相互作用的igfbp7的变体(抑制性igfbp7多肽)，其包括但不限于igfbp7的突变形式和igfbp7的片段(部分)。在一些实施方案中，所述方法还包括向受试者施用第二治疗剂(诸如化学治疗剂、免疫调节剂或免疫细胞)。在一些实施方案中，第二治疗剂是免疫检查点抑制剂(例如抗pd1抗体或抗pd-l1抗体)。在一些实施方案中，抑制性igfbp7多肽还包含稳定化结构域(诸如fc)。在一些实施方案中，抑制性igfbp多肽的长度为约50至约100个氨基酸。在一些实施方案中，抑制性igfbp7多肽的igfbp部分(即对应
于igfbp7或其部分并传递阻断cd93与igfbp7的结合的功能的部分)的长度为约50至约100个氨基酸。在一些实施方案中，抑制性igfbp7多肽包含igfbp7的ib结构域。在一些实施方案中，抑制性igfbp7多肽不包含除ib结构域外的igfbp7的任何结构域。
[0115]
可通过诸如静脉内途径等的任何施用途径向受试者施用抑制性igfbp7多肽。或者，可通过施用编码抑制性igfbp7多肽的多核苷酸向受试者施用抑制性多肽。
[0116]
本文还设想了包含一个或多个突变(所述突变允许抑制性igfbp7多肽显示出相对igfbp7的一种或多种其它结合配偶体诸如igf-1、igf-2和igf1r优选与cd93结合)的抑制性igfbp7多肽。在一些实施方案中，抑制性igfbp7多肽与cd93的结合亲和力大于与igfbp7的一种或多种其它结合配偶体诸如igf-1、igf-2和igf1r的结合亲和力。在一些实施方案中，与野生型igfbp7相比，抑制性igfbp7多肽以更大的亲和力与cd93结合。
[0117]
在一些实施方案中，本文所述的方法包括向受试者施用有效量的降低cd93或igfbp7表达的药剂。在一些实施方案中，所述药剂选自sirna、shrna、mirna、反义rna和基因编辑系统。
[0118]
在一些实施方案中，适用于本文所述方法的受试者是人。在一些实施方案中，受试者的特征在于异常的肿瘤脉管系统。在一些实施方案中，受试者的特征在于密集或富集的血管。在一些实施方案中，受试者接受在先治疗，诸如包括施用vegf信号传导途径的抑制剂的在先治疗，所述抑制剂包括抗vegf抗体或包含一个或多个vegfr结构域的抑制性多肽。在一些实施方案中，受试者的特征在于cd93的高表达。在一些实施方案中，受试者的特征在于igfbp7的高表达。在一些实施方案中，受试者的特征在于vegf的高表达。在一些实施方案中，本文论述的肿瘤是实体瘤，诸如实体瘤可以是：结直肠癌、非小细胞肺癌、胶质母细胞瘤、肾细胞癌、宫颈癌、卵巢癌、输卵管癌、腹膜癌、乳腺癌、前列腺癌、膀胱癌、口腔鳞状细胞癌、头颈部鳞状细胞癌、脑肿瘤、骨癌、黑色素瘤。
[0119]
在一些实施方案中，在施用cd93/igfbp7阻断剂之前，将评估受试者组织的血管(诸如肿瘤血管)上cd93或igfbp7的存在和分布，例如，以确定受试者血管上cd93或igfbp7的相对水平和活性。其组织血管(诸如肿瘤血管)表达cd93或igfbp7(诸如那些血管表达或高水平表达cd93或igfbp7)的受试者可以是用cd93/igfbp7阻断剂治疗的候选过程中。这可通过获得样品组织(诸如肿瘤组织)并例如使用免疫测定进行测试以确定cd93或igfbp7以及任选地其它标志物在细胞上的相对显著性来实现。体内成像也可用于检测cd93或igfbp7的表达。其它方法也可用于检测cd93和igfbp7的表达，包括基于rna的方法，例如rt-pcr或northern印迹。
[0120]
该方法可涉及cd93/igfbp7阻断剂的多轮施用。在一些实施方案中，在初始轮施用后，可以重新测量受试者中cd93或igfbp7的水平和/或活性，如果仍然升高，则可以进行另一轮施用。这样，可以进行多轮cd93/igfbp7阻断剂施用。
[0121]
抑制igfbp7/cd93信号传导途径的药剂
[0122]
所述药剂可以是抗体、多肽、肽、多核苷酸、肽模拟物、天然产物、碳水化合物、适体、avimer、anticalin、speigelmer或小分子中的任一种。下面描述了所述药剂可以是什么的特定实例，并且在本技术的后续方面中描述了用于鉴定合适剂的方法。在一些实施方案中，所述药剂是融合蛋白(诸如包含半衰期延长结构域(例如fc结构域)的融合蛋白)。
[0123]
cd93
[0124]
cd93是属于c型凝集素基因家族的i型跨膜蛋白，并且被称为补体c1q受体(c1qrp)。cd93由一个型凝集素样结构域(d1)、五个egf样重复序列(d2)、一个粘蛋白样结构域(d3)、一个跨膜结构域(d4)、一个胞质结构域(d5)和一个位于d1与d2之间的79个氨基酸的dx结构域组成[9]。cd93主要在内皮细胞(ec)上表达，并作为可溶性生长因子和ec粘附分子参与促进血管生成。先前的研究表明，多聚蛋白2(mmrn2)与cd93相互作用，促进ec粘附、迁移和体外血管生成。mmrn2，也称为endoglyx-1，是eden蛋白家族的内皮特异性成员，也是ecm的组分。在肿瘤组织中，发现mmrn2沿肿瘤毛细血管表达，并在肿瘤新生血管中与cd93共表达。参见galvagni等人，matrix biol.(2017)64,112-127，出于所有目的通过引用以其整体并入本文。
[0125]
人cd93基因位于20p11.21，编码652个氨基酸残基的多肽。术语“cd93多肽”包括人cd93的基因产物(包括其天然存在的变体)的含义。人cd93多肽包括在genbank登录号np_036204.2中发现的氨基酸序列及其天然存在的变体。“天然变体”包括例如等位基因变体。通常，这些与给定序列的差异仅为一个或两个或三个，通常不超过10或20个氨基酸残基。通常，变体具有保守取代。来自np_036204.2的cd93多肽序列显示为seq id no:1。人cd93的天然变体包括具有a220v突变、v318a突变或p541突变的那些。
[0126]
本技术中描述的cd93包括任何天然存在的cd93或其具有cd93功能的变体。还包括在其他物种中，诸如在马、牛、黑猩猩、鸡、斑马鱼、狗、猪、牛、绵羊、大鼠、小鼠、豚鼠或灵长类动物中发现的cd93直向同源物。
[0127]
igfbp7
[0128]
胰岛素样生长因子(igf)-结合蛋白(igfbp)7，也称为mac25、igfbp-rp1、肿瘤衍生粘附因子(taf)、前列环素刺激因子(psf)和血管调节素(agm)，是一种属于igfbp家族的分泌型细胞外基质(ecm)蛋白(57,58)。igfbp家族的成员在n-末端包含一个igf结合(ib)结构域，该结构域与igf1结合并有助于调节igf1在血液中的生物利用度。igfbp7缺乏起稳定igf1结合作用的c-末端结构域，因此其对igf-1的亲和力明显低于igfbp1-6的对igf-1的亲和力(59)。发现igfbp7在许多正常组织和癌细胞中表达；然而，igfbp7在癌症中的确切作用仍有争议。一方面，igfbp7被证明从癌细胞中释放，并作为肿瘤抑制因子触发肿瘤凋亡和抑制血管生成；igf1r被认为是受体，并且igfbp7的结合阻断了igf-1与igf1r之间的相互作用，从而抑制了癌症干细胞样细胞的扩增和侵袭性。施用igfbp7抑制体内肿瘤生长，并且igfbp7-/-小鼠易受二乙基亚硝胺诱导的肝癌形成的影响(55,63)。另一方面，igfbp7经显示在癌组织的血管中被上调，并且能够促进血管生成(48,64)。在血管ec中，igfbp7可以被vegf强烈诱导(48)，并且已经报道了igfbp7与vegf之间在血管生成中的协同作用(50)。出于各种目的，上面列出的每篇参考文献都通过引用以其整体并入。
[0129]
人igfbp7基因位于4q12并编码多肽。所述多肽的一种同种型具有264个氨基酸残基(seq id no:2)，其包括信号肽结构域(seq id no:2的残基1-26)、胰岛素结合结构域(ib结构域，seq id no:2的残基28-106)、kazal样结构域(seq id no:2的残基105-158)和ig样c2型结构域(seq id no:2的残基160-264)。
[0130]
本技术中描述的igfbp7包括任何天然存在的igfbp7或其具有igfbp7功能的变体。还包括在其它物种中，诸如在马、牛、黑猩猩、鸡、斑马鱼、狗、猪、牛、绵羊、大鼠、小鼠、豚鼠或灵长类动物中发现的igfbp7直向同源物。
[0131]
抗cd93抗体或抗igfbp抗体
[0132]
a.抗cd93抗体
[0133]
在一些实施方案中，本文描述的方法涉及使用抗cd93抗体，所述抗cd93抗体特异性识别cd93并特异性阻断cd93与igfbp7之间的相互作用。本技术一方面还提供了本文所述的任何新型抗cd93抗体。
[0134]
在一些实施方案中，被抗cd93抗体识别的cd93是人cd93。在一些实施方案中，人cd93包含或具有seq id no:1或人cd93的天然变体。在一些实施方案中，人cd93的天然变体源自肿瘤组织。
[0135]
在一些实施方案中，抗cd93抗体与cd93上的igfbp7结合位点结合。在一些实施方案中，抗cd93抗体与cd93上igfbp7结合位点之外的区域结合。
[0136]
在一些实施方案中，抗cd93抗体与cd93的细胞外区域结合。在一些实施方案中，抗cd93抗体与人cd93的胞外区(例如根据seq id no:1的残基a24-k580)结合。
[0137]
在一些实施方案中，抗cd93抗体与cd93的c型凝集素结构域结合。在一些实施方案中，抗cd93抗体与人cd93的c型凝集素结构域(诸如根据seq id no:1的残基t22-n174)结合。
[0138]
在一些实施方案中，抗cd93抗体与cd93的c型凝集素结构域中的长环区结合。在一些实施方案中，抗cd93抗体与人cd93的c型凝集素结构域中的长环区(诸如根据seq id no:1的残基g96-c141)结合。在一些实施方案中，抗cd93抗体与cd93的c型凝集素结构域中的保守性较低的残基或c型凝集素结构域中的长环区结合。例如，抗cd93抗体与选自根据seq id no:1的g96、q98、r99、e100、k101、g102、k103、c104、l105、d106、p107、s108、l109、k112、s115、v117、g118、g120、e121、d122、t123、p124、y125、s126、n127、h129、k130、e131、l132、r133、n134、s135、c136、i137、s138、k139和r140的任一个或多个(诸如约2、3、4、5、6、7、8、9或10个)残基结合。在一些实施方案中，抗cd93抗体与人cd93的区域结合，所述区域包含根据seq id no:1的残基f182-y262或由所述残基组成。在一些实施方案中，抗cd93抗体与根据seq id no:1的f238结合。
[0139]
在一些实施方案中，抗cd93抗体与c型凝集素样结构域(d1结构域)与egf样结构域(d2结构域)之间的dx结构域结合。在一些实施方案中，抗cd93抗体与人cd93的dx结构域(诸如根据seq id no:1的残基i175-l256或i175-s259)结合。在一些实施方案中，抗cd93抗体与根据seq id no:1的f238结合。
[0140]
在一些实施方案中，抗cd93抗体与cd93的dx结构域和c型凝集素结构域结合。在一些实施方案中，抗cd93抗体与f238和人cd93的c型凝集素结构域(诸如根据seq id no:1的残基t22-n174)结合。在一些实施方案中，抗cd93抗体与f238和人cd93的c型凝集素结构域中的长环区(诸如根据seq id no:1的残基g96-c141)结合。在一些实施方案中，抗cd93抗体与f238和选自根据seq id no:1的g96、q98、r99、e100、k101、g102、k103、c104、l105、d106、p107、s108、l109、k112、s115、v117、g118、g120、e121、d122、t123、p124、y125、s126、n127、h129、k130、e131、l132、r133、n134、s135、c136、i137、s138、k139和r140的任一个或多个(诸如约2、3、4、5、6、7、8、9或10个)残基结合。
[0141]
在一些实施方案中，抗cd93抗体与cd93的egf样区域结合。在一些实施方案中，抗cd93抗体与人cd93的egf样区域(诸如根据seq id no:1的残基c257-m469或p260-t468)结
合。
[0142]
在一些实施方案中，抗cd93抗体还阻断cd93与mmnr2之间的相互作用。在一些实施方案中，抗cd93抗体与和mmnr2所结合的表位相同的cd93的表位结合。在一些实施方案中，抗cd93抗体与和mmnr2所结合的表位不同的cd93的表位结合。
[0143]
在一些实施方案中，抗cd93抗体不阻断cd93与mmnr2之间的相互作用。
[0144]
在一些实施方案中，抗cd93抗体是多克隆抗体。在一些实施方案中，抗cd93抗体是单克隆抗体。
[0145]
在一些实施方案中，抗cd93抗体是抗人cd93抗体。
[0146]
在一些实施方案中，抗cd93抗体是人源化的或嵌合的。
[0147]
在一些实施方案中，抗cd93抗体与mab mm01(sinobiological)、mab r3(sinobiological)或mab 273107(sinobiological)竞争与cd93的结合。在一些实施方案中，抗cd93抗体与和mab mm01(sinobiological)、mab r3(sinobiological)或mab 273107(sinobiological)的表位重叠或基本重叠的表位结合。在一些实施方案中，抗cd93抗体不与和mab mm01(sinobiological)、mab r3(sinobiological)或mab 273107(sinobiological)的表位基本重叠的表位结合。在一些实施方案中，上述“基本重叠”是指cd93上抗cd93抗体所结合的残基的至少约50％、60％、70％、80％或90％与mm01(sinobiological)、r3(sinobiological)或273107(sinobiological)所结合的残基重叠。在一些实施方案中，抗cd93抗体与cd93上mm01(sinobiological)、r3(sinobiological)或273107(sinobiological)所结合的残基中的至少1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个残基结合。
[0148]
在一些实施方案中，抗cd93抗体不与mab mm02(sinobiological)竞争与cd93的结合。在一些实施方案中，抗cd93抗体不与mab r004(sinobiological)竞争与cd93的结合。
[0149]
在一些实施方案中，抗cd93抗体与抗mab 7c10竞争与cd93的结合。在一些实施方案中，抗cd93抗体与和7c10的表位重叠或基本重叠的表位结合。在一些实施方案中，抗cd93抗体不与和7c10的表位基本重叠的表位结合。在一些实施方案中，抗cd93抗体与cd93上7c10所结合的残基中的至少1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个残基结合。
[0150]
在一些实施方案中，抗cd93抗体是选自epr5386(abcam)、3d12(sigma-aldrich)、1a4(sigma-aldrich)、1a10e10、2f7d11、r139、r3、mni-11、x-2和mm01的抗人cd93单克隆抗体。
[0151]
在一些实施方案中，抗人cd93抗体是mab mm01或其人源化形式。
[0152]
在一些实施方案中，抗cd93抗体是全长抗体或免疫球蛋白衍生物。在一些实施方案中，抗cd93抗体是抗原结合片段，例如选自由以下组成的组的抗原结合片段：单链fv(scfv)、fab、fab’、f(ab’)2、fv片段、二硫键稳定的fv片段(dsfv)、(dsfv)2、vhh、fv-fc融合物、scfv-fc融合物、scfv-fv融合物、双抗体、三抗体和四抗体。在一些实施方案中，抗cd93抗体是scfv。在一些实施方案中，抗cd93抗体是fab或fab’。在一些实施方案中，抗cd93抗体是嵌合的、人的、部分人源化的、完全人源化的或半合成的。抗体和/或抗体片段可源自鼠抗体、兔抗体、人抗体、完全人源化抗体、骆驼科动物抗体可变结构域和人源化形式、鲨鱼抗体可变结构域和人源化形式以及骆驼化抗体可变结构域。
[0153]
在一些实施方案中，所述抗cd93抗体包含fc片段。在一些实施方案中，所述fc片段
选自由来自igg、iga、igd、ige、igm及其组合和杂合体的fc片段组成的组。在一些实施方案中，所述fc片段源自人igg。在一些实施方案中，所述fc片段包含人igg1、igg2、igg3、igg4或组合或杂合igg的fc区。
[0154]
b.抗igfbp7抗体
[0155]
在一些实施方案中，本文描述的方法涉及使用特异性识别igfbp7并特异性阻断cd93与igfbp7之间相互作用的抗igfbp7抗体。本技术一方面还提供了本文所述的任何新型抗igfbp7抗体。
[0156]
在一些实施方案中，由抗igfbp7抗体识别的igfbp7是人igfbp7。在一些实施方案中，igfbp7是小鼠igfbp7。
[0157]
在一些实施方案中，抗igfbp7抗体与igfbp7上的cd93(诸如人cd93)结合位点结合。在一些实施方案中，抗igfbp7抗体与igfbp7上cd93结合位点之外的区域结合。
[0158]
在一些实施方案中，抗igfbp7抗体与igfbp7的胰岛素结合结构域(“ib结构域”)结合。在一些实施方案中，抗igfbp7抗体与人igfbp7的ib结构域(诸如根据seq id no:2的残基s28-g106)结合。
[0159]
在一些实施方案中，抗igfbp7抗体与igfbp7的kazal样结构域结合。在一些实施方案中，抗igfbp7抗体与人igfbp7的kazal样结构域(诸如根据seq id no:2的残基p105-q158)结合。
[0160]
在一些实施方案中，抗igfbp7抗体与igfbp7的ig样c2结构域结合。在一些实施方案中，抗igfbp7抗体与人igfbp7的ig样c2结构域(诸如根据seq id no:2的残基p160-t264)结合。
[0161]
在一些实施方案中，抗igfbp7抗体不与igfbp1、igfbp2、igfbp3、igfbp4、igfbp5、igfbp6、igfbpl1、kazald1、htra1、wisp1、wisp3、nov、cyr61、ctgf和esm1中的任一种或多种特异性结合。在一些实施方案中，抗igfbp7抗体不与选自igfbp1、igfbp2、igfbp3、igfbp4、igfbp5、igfbp6、igfbpl1、kazald1、htra1、wisp1、wisp3、nov、cyr61、ctgf和esm1的任一种分子特异性结合。
[0162]
在一些实施方案中，所述抗igfbp7抗体还阻断igfbp7与igf-1、igf-2和/或igf1r之间的相互作用。
[0163]
在一些实施方案中，所述抗igfbp7抗体不阻断igfbp7与igf-1、igf-2和/或igf1r之间的相互作用。
[0164]
在一些实施方案中，所述抗igfbp7抗体是多克隆抗体。在一些实施方案中，所述抗igfbp7抗体是单克隆抗体。
[0165]
在一些实施方案中，所述抗igfbp7抗体是抗人igfbp7抗体。
[0166]
在一些实施方案中，所述抗igfbp7抗体是人源化的或嵌合的。
[0167]
在一些实施方案中，所述抗igfbp7抗体与mab r003(sinobiological)、mm01(sinobiological)、r065(sinobiological)或r115(sinobiological)竞争与igfbp7的结合。在一些实施方案中，抗igfbp7抗体与和mab r003(sinobiological)、mm01(sinobiological)、r065(sinobiological)或r115(sinobiological)的表位重叠的表位结合。在一些实施方案中，抗igfbp7抗体与igfbp7上r003(sinobiological)、mm01(sinobiological)、r065(sinobiological)或r115(sinobiological)所结合的残基中的至
少1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个残基结合。
[0168]
在一些实施方案中，所述抗igfbp7抗体与mab 2c6竞争与igfbp7的结合。在一些实施方案中，所述抗igfbp7抗体与和mab2c6的表位重叠的表位结合。在一些实施方案中，所述抗igfbp7抗体与igfbp7上2c6所结合的残基中的至少1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个残基结合。
[0169]
在一些实施方案中，所述抗igfbp7抗体是抗人igfbp7单克隆抗体，其选自mab aedo-9(克隆名称，以下抗体相同)(bosterbio)、(lifespan biosciences)、5a4a9(lifespan biosciences)、192520(r&d systems)、h3(santa cruz biotechnology)、40012b(r&d systems)、epr11912(b)(abcam)、mm0346-3n37(abcam)、01(即mm01,sino biological)、003(即r003,sino biological)。在一些实施方案中，所述抗人igfbp7单克隆抗体是mab 003(即r003，sino biological)或其人源化形式。
[0170]
在一些实施方案中，所述抗igfbp抗体是全长抗体或免疫球蛋白衍生物。在一些实施方案中，所述抗igfbp抗体是抗原结合片段，例如选自单链fv(scfv)、fab、fab’、f(ab’)2、fv片段、二硫键稳定化的fv片段(dsfv)、(dsfv)2、vhh、fv-fc融合物、scfv-fc融合物、scfv-fv融合物、双抗体、三抗体和四抗体的抗原结合片段。在一些实施方案中，所述抗igfbp抗体是scfv。在一些实施方案中，所述抗igfbp抗体是fab或fab’。在一些实施方案中，所述抗igfbp抗体是嵌合的、人的、部分人源化的、完全人源化的或半合成的。抗体和/或抗体片段可源自鼠抗体、兔抗体、人抗体、完全人源化抗体、骆驼科动物抗体可变结构域和人源化形式、鲨鱼抗体可变结构域和人源化形式以及骆驼化抗体可变结构域。
[0171]
在一些实施方案中，所述抗igfbp抗体包含fc片段。在一些实施方案中，所述fc片段选自由来自igg、iga、igd、ige、igm及其组合和杂合体的fc片段组成的组。在一些实施方案中，所述fc片段源自人igg。在一些实施方案中，fc片段包含人igg1、igg2、igg3、igg4或组合或杂合igg的fc区。
[0172]
竞争测定和表位作图
[0173]
以下关于竞争测定和表位作图的描述使用抗igfbp7抗体作为示例进行说明。其类似地适用于上述抗cd93抗体。
[0174]
竞争可以通过例如流式细胞术测试来评估。在这样的测试中，可以首先将含有具有igfbp7的给定igfbp7多肽的细胞与抗体(例如，mab 2c6)一起孵育，然后与用荧光染料或生物素标记的测试抗体一起孵育。如果在用饱和量的2c6预孵育后获得的结合是通过未用2c6预孵育的抗体获得的结合(如通过荧光测量的)的约80％，优选约50％，约40％或更少(例如，约30％，20％或10％)，则认为所述抗体与2c6竞争或与2c6竞争与igfbp7的结合。或者，如果在用饱和量的测试抗体预孵育的细胞上用标记的2c6抗体获得的结合(通过荧光染料或生物素)是不用测试抗体预孵育获得的结合的约80％，优选约50％，约40％或更少(例如，约30％，20％或10％)，则抗体被认为与2c6竞争。
[0175]
也可以采用简单的竞争测定，其中测试抗体被预吸附并以饱和浓度应用于其上固定有igfbp7的表面。简单的竞争测定中的表面优选是biacore芯片(或其它适于表面等离子共振分析的介质)。然后将对照抗体(例如，2c6)以igfbp7饱和浓度与表面接触，并测量igfbp7和对照抗体的表面结合。将对照抗体的这种结合与测试抗体不存在时对照抗体与含igfbp7表面的结合进行比较。在测试测定中，在测试抗体存在的情况下，对照抗体与含
igfbp7的表面的结合显著减少，表明测试抗体与对照抗体识别基本相同的表位，使得测试抗体与对照抗体“交叉反应”。使对照(诸如2c6)抗体与igfbp7的结合减少至少约30％或更多，优选约40％的任何测试抗体，可以被认为是与对照(例如，2c6)结合基本相同的表位或决定簇的抗体。优选地，这种测试抗体使对照抗体(例如2c6)与igfbp7的结合减少至少约50％(例如，至少约60％，至少约70％或更多)。应当理解，对照抗体和测试抗体的顺序可以颠倒：也就是说，可以首先将对照抗体结合到表面上，然后在竞争测定中使测试抗体与所述表面接触。优选地，对igfbp7具有较高亲和力的抗体首先与表面结合，因为预计针对第二抗体(假设抗体是交叉反应的)看到的结合降低的幅度将更大。此类测定的其它实例提供于例如saunal(1995)j.immunol.methods 183:33-41(其公开内容通过引用以其整体并入本文)中。
[0176]
优选地，识别igfbp7表位的单克隆抗体将与存在于相当大百分比的或甚至所有相关igfbp7等位基因上的表位反应。
[0177]
在优选实施方案中，抗体将与来自一个或多个患有特征在于igfbp7阳性细胞的表达的疾病的受试者(即为使用本技术的抗igfbp7抗体，利用本文所述方法之一进行治疗的候选受试者的受试者)的igfbp7表达细胞结合。因此，一旦获得特异性识别细胞上的igfbp7的抗体，就可以测试其与igfbp7阳性细胞(例如，癌细胞)结合的能力。特别地，在用本发明的抗体之一治疗患者之前，测试抗体结合取自患者(例如血液样品或肿瘤活检物中)的恶性细胞的能力，以最大化疗法对患者有益的可能性是有益的。在一个实施方案中，本技术的抗体在测试其与igfbp7表达细胞(例如恶性细胞)结合的能力的免疫测定中得到验证。例如，进行肿瘤活检并收集肿瘤细胞。然后使用本领域技术人员熟知的标准方法评估给定抗体与细胞结合的能力。发现与相当大比例(例如，20％、30％、40％、40％、50％、60％、70％、80％或更多)的来自相当大百分比的受试者或患者(例如，5％、10％、20％、30％、40％、50％或更多)的已知表达igfbp7的细胞(例如，肿瘤细胞)结合的抗体适用于本发明，既可用于确定患者体内恶性细胞的存在或水平的诊断目的，也可用于本文所述的治疗方法，例如用于增加或减少恶性细胞数量或活性。为了评估抗体与细胞的结合，可以直接或间接标记抗体。当间接标记时，通常添加第二标记的抗体。
[0178]
可以以本领域技术人员已知的方式确定抗体是否结合在表位区域内。作为此类作图/表征方法的一个实例，抗igfbp7抗体的表位区域可通过表位“足迹”，使用对igfbp7蛋白中暴露的胺/羧基的化学修饰来确定。这种足迹技术的一个具体实例是使用hxms(通过质谱检测的氢-氘交换),其中发生受体与配体蛋白质酰胺质子的氢/氘交换、结合和反向交换，其中参与蛋白质结合的骨架酰胺基团被保护而不发生反向交换，因此将保持氘化。在这一点上，可以通过胃蛋白酶水解、快速微孔高效液相色谱分离(fast microbore high-performance liquid chromatography separation)和/或电喷雾电离质谱法鉴定相关区域。参见例如ehring h,analytical biochemistry，第267卷(2)第252-259页(1999)；engen,j.r.和smith,d.l.(2001)anal.chem.73,256a-265a,所述文献中的每一篇出于所有目的通过引用以其整体并入本文.合适的表位鉴定技术的另一个实例是核磁共振表位作图(nmr)，其中通常比较游离抗原和与抗原结合肽(诸如抗体)复合的抗原的二维nmr谱中的信号位置。抗原通常用15n进行选择性同位素标记，使得在nmr谱中仅看到对应于抗原的信号而无来自抗原结合肽的信号。与游离抗原的谱相比，源自参与和抗原结合肽的相互作用的
氨基酸的抗原信号通常将在复合物的谱中移动位置，并且参与结合的氨基酸可以以该方式鉴定。参见例如ernst schering res found workshop.2004；(44):149-67；huang等人，journal of molecular biology，第281卷(1)第61-67页(1998)；以及saito和patterson,methods.1996jun；9(3):516-24，所述文献中的每一篇都出于所有目的通过引用以其整体并入本文。
[0179]
表位作图/表征也可以使用质谱方法来进行。参见例如downard,j mass spectrom.2000apr；35(4):493-503以及kiselar和downard,anal chem.1999may 1；71(9):1792-1801，所述文献中的每一篇都出于所有目的通过引用以其整体并入本文。蛋白酶消化技术也可用于表位作图和鉴定的情况。抗原决定簇相关区域/序列可通过蛋白酶消化(例如通过使用与igfbp7的比例约为1∶50的胰蛋白酶或在ph 7-8下的o/n消化)，然后进行质谱(ms)分析以进行肽鉴定来确定。随后可以通过比较经受胰蛋白酶消化的样品和与抗体一起孵育然后经受例如胰蛋白酶消化的样品来鉴定被抗-igfbp7结合剂保护免于胰蛋白酶切割的肽(从而揭示结合剂的足迹)。其它酶如胰凝乳蛋白酶、胃蛋白酶等也可或者备选地可用于类似的表位表征方法。此外，酶促消化可以提供快速方法，用于分析潜在的抗原决定簇序列是否在igfbp7多肽的区域内，所述区域不暴露于表面的，因此，最可能在免疫原性/抗原性方面不相关。
[0180]
定点诱变是另一种用于阐明结合表位的技术。例如，在“丙氨酸扫描”中，蛋白质区段内的每个残基被丙氨酸残基取代，并测量结合亲和力的结果。如果突变导致结合亲和力显著降低，则最可能与结合有关。对结构表位特异的单克隆抗体(即不结合未折叠蛋白质的抗体)可用于证实丙氨酸置换不影响蛋白的整体折叠。参见例如clackson和wells,science 1995；267:383-386；以及wells,proc natl acad sci usa 1996；93:1-6。
[0181]
电子显微镜也可用于表位“足迹”。例如，wang等人，nature 1992；355:275-278使用冷冻电子显微术、三维图像重建和x射线晶体学的协同应用来确定天然豇豆花叶病毒衣壳表面上fab片段的物理足迹。
[0182]
用于表位评估的其它形式的“无标记”测定包括表面等离子共振(spr，biacore)和反射干涉光谱学(rifs)。参见例如fagerstam等人，journal of molecular recognition 1990；3:208-14；nice等人，j.chroma-togr.1993；646:159-168；leipert等人，angew.chem.int.ed.1998；37:3308-3311；kroger等人，biosensors and bioelectronics2002；17:937-944。
[0183]
还应该注意的是，可以在本文所述的一种或多种示例性竞争测定中鉴定与本技术的抗体(第二抗体)结合相同或基本相同的表位的抗体(第一抗体)。在一些实施方案中，与第二抗体结合基本相同的表位的第一抗体是指第一抗体所结合的残基与第二抗体所结合的残基具有至少约50％、60％、70％、80％或90％的重叠的情形。
[0184]
包含抗cd93抗体或抗igfbp7抗体的药剂
[0185]
a.抗cd93或抗igfbp7 fc融合蛋白
[0186]
在一些实施方案中，包含如本文所述的抗cd93抗体或抗igfbp7抗体的药剂是融合蛋白。在一些实施方案中，抗cd93抗体和/或抗igfbp7抗体(诸如抗cd93和/或抗igfbp7抗体片段)通过接头(诸例如肽接头)与fc片段融合。在“抗cd93抗体或抗igfbp7抗体”部分中描述的任何抗cd93抗体或抗igfbp7抗体可用于抗cd93 fc融合蛋白或抗igfbp7 fc融合蛋白。
[0187]
1.fc片段
[0188]
术语“fc区”、“fc结构域”或“fc”是指免疫球蛋白重链的c末端非抗原结合区，其包含恒定区的至少一部分。该术语包括天然fc区和变体fc区。在一些实施方案中，人igg重链fc区从cys226延伸至重链的羧基末端。然而，fc区的c-末端赖氨酸(lys447)可以存在或可以不存在，而不影响fc区的结构或稳定性。除非本文另有说明，否则igg或fc区中氨基酸残基的编号是根据抗体的eu编号系统(也称为eu索引)编号的，如kabat等人，sequences of proteins of immunological interest，第5版public health service,national institutes of health,bethesda,md,1991中所描述的。
[0189]
在一些实施方案中，fc片段包含免疫球蛋白重链恒定区，其包含铰链区、ch2结构域和/或ch3结构域。如本文中所用，术语“铰链区”或“铰链序列”是指位于接头与ch2结构域之间的氨基酸序列。在一些实施方案中，融合蛋白包含含有铰链区的fc片段。在一些实施方案中，铰链区包含氨基酸序列cppcp(seq id no:3)(一种在天然igg1铰链区中发现的序列)，以促进二聚化。在一些实施方案中，融合蛋白的fc片段起始于铰链区并延伸至igg重链的c末端。在一些实施方案中，融合蛋白包含不含铰链区的fc片段。在一些实施方案中，fc片段包含人igg重链铰链区(始于cys226)、igg ch2结构域和/或igg ch3结构域。
[0190]
在一些实施方案中，融合蛋白包含选自igg、iga、igd、ige、igm及其组合和杂合体的fc片段。在一些实施方案中，fc片段源自人igg。在一些实施方案中，fc片段包含人igg1、igg2、igg3、igg4或组合或杂合igg的fc区。在一些实施方案中，fc片段是igg1 fc片段。
[0191]
在一些实施方案中，fc片段包含igg1的ch2和ch3结构域。在一些实施方案中，fc片段是igg4 fc片段。在一些实施方案中，fc片段包含igg4的ch2和ch3结构域。已知igg4 fc表现出比igg1 fc更低的效应子活性，因此可能是某些应用所需要的。在一些实施方案中，fc片段源自小鼠免疫球蛋白。
[0192]
在一些实施方案中，igg ch2结构域始于ala231。在一些实施方案中，igg ch3结构域始于gly341。在一些实施方案中，不存在人igg的c-末端lys残基。在一些实施方案中，在fc区进行一个或多个保守氨基酸取代，而不影响fc的所需结构和/或稳定性。
[0193]
此外，设想了包含下述任何fc变体或其组合的抗cd93或抗igfbp7-fc融合蛋白。在一些实施方案中，fc片段包含已经被改变或以其它方式改变的序列，使得其具有增强的抗体依赖性细胞毒性(adcc)或补体依赖性细胞毒性(cdc)效应子功能。
[0194]
抗cd93或抗igfbp7-fc融合蛋白中不相同多肽的异二聚化可通过本领域已知的方法来促进，包括但不限于通过杵臼结构(knob-into-hole)技术的异二聚化。杵臼结构技术的结构和组装方法可见于例如us5,821,333、us7,642,228、us 201 1/0287009和pct/us2012/059810(出于所有目的，据此通过引入以其整体并入本文)中。这项技术是通过在一个fc的ch3结构域中用大的氨基酸残基替换小的氨基酸残基来引入一个“杵(knob)”(或突起)，并通过用较小的氨基酸残基替换一个或多个大的氨基酸残基来在另一个fc的ch3结构域中引入“臼(hole)”(或空腔)而开发的。在一些实施方案中，融合蛋白中fc片段的一条链包含杵，fc片段的第二条链包含臼。
[0195]
形成杵的优选残基通常是天然存在的氨基酸残基，优选选自精氨酸(r)、苯丙氨酸(f)、酪氨酸(y)和色氨酸(w)。最优选的是色氨酸和酪氨酸。在一个实施方案中，用于形成杵的原始残基具有小的侧链体积，诸如丙氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸
或缬氨酸。用于形成杵的igg的ch3结构域中的示例性氨基酸取代包括但不限于t366w、t366y或f405w取代。
[0196]
用于形成孔的优选残基通常是天然存在的氨基酸残基，并且优选选自丙氨酸(a)、丝氨酸(s)、苏氨酸(t)和缬氨酸(v)。在一个实施方案中，用于形成臼的原始残基具有大的侧链体积，诸如酪氨酸、精氨酸、苯丙氨酸或色氨酸。用于产生臼的igg的ch3结构域中的示例性氨基酸取代包括但不限于t366s、l368a、f405a、y407a、y407t和y407v取代。在某些实施方案中，杵包含t366w取代，臼包含t366s/l368a/y407v取代。应当理解，本技术也设想和涵盖了本领域已知的促进异二聚化的fc区的其它修饰。
[0197]
涵盖涉及药剂的方法，所述药剂是诸如分离的抗cd93或抗igfbp7-fc融合蛋白的变体(例如，全长抗cd93或抗igfbp7抗体变体)，其包含本文所述的任何变体(例如，fc变体、效应子功能变体、糖基化变体、半胱氨酸工程化变体)或其组合。
[0198]
2.接头
[0199]
在一些实施方案中，本文所述的抗cd93或抗igfbp7-fc融合蛋白包含通过接头与fc片段融合的本文所述的抗cd93或抗igfbp7抗体。
[0200]
抗cd93或抗igfbp7-fc融合蛋白中使用的接头的长度、柔性程度和/或其它性质可能对性质有一定影响，所述性质包括但不限于抗cd93或抗igfbp7抗体对一种或多种特定抗原或cd93和/或igfbp7上存在的表位的亲和力、特异性或亲合力。例如，可以选择更长的接头以确保两个相邻的抗体部分不会在空间上相互干扰。在一些实施方案中，接头(诸如肽接头)包含柔性残基(诸如甘氨酸和丝氨酸)，使得相邻的抗体部分可以相对于彼此自由移动。例如，甘氨酸-丝氨酸双联体可以是合适的肽接头。在一些实施方案中，接头是非肽接头。在一些实施方案中，接头是肽接头。在一些实施方案中，接头是不可切割的接头。在一些实施方案中，接头是可切割的接头。
[0201]
其它接头考虑因素包括对所得抗cd93或抗igfbp7-fc融合蛋白的物理或药代动力学性质的影响，所述性质是诸如溶解度、亲脂性、亲水性、疏水性、稳定性(或多或少稳定的以及计划降解的)、刚性、柔性、免疫原性、抗体结合的调节、掺入胶束或脂质体的能力等。
[0202]
a.非肽接头
[0203]
本文所述的任一种或所有接头可通过结合两种分子的任何化学反应来实现，只要组分或片段保持其各自的活性(即与靶cd93或igfbp7结合、与fcr和/或adcc/cdc结合)即可。这种键联可以包括许多化学机制，例如共价结合、亲和结合、嵌入、配位结合和络合。在一些实施方案中，结合是共价结合。共价结合可以通过现有侧链的直接缩合或者通过引入外部桥接分子来实现。许多二价或多价连接剂可用于将蛋白质分子(诸如fc片段)与本发明的抗cd93抗体或抗igfbp7抗体偶联。例如，代表性偶联剂可以包括有机化合物，诸如硫酯类、碳二亚胺类、琥珀酰亚胺酯类、二异氰酸酯类、戊二醛、重氮苯类和六亚甲基二胺类。该列表并不旨在穷尽本领域已知的各种偶联剂，而是更常见的偶联剂的示例(参见killen和lindstrom,jour.immun.133:1335-2549(1984)；jansen等人，immunological reviews 62:185-216(1982)；以及vitetta等人，science 238:1098(1987),出于各种目的，每篇文献均通过引用以其整体并入)。
[0204]
可用于本技术的接头描述于文献中(参见例如ramakrishnan,s.等人，cancer res.44:201-208(1984)描述了mbs(间马来酰亚胺苯甲酰基-n-羟基琥珀酰亚胺酯)的用途，
该文献出于所有目的通过引用以其整体并入)。在一些实施方案中，本文使用的非肽接头包括：(i)edc(1-乙基-3-(3-二甲基氨基-丙基)碳化二亚胺盐酸盐；(ii)smpt(4-琥珀酰亚胺基氧羰基-α-甲基-α-(2-吡啶基-二硫代)-甲苯(pierce chem.co.，目录号(21558g)；(iii)spdp(琥珀酰亚胺基-6[3-(2-吡啶基二硫代)丙酰氨基]己酸酯(pierce chem.co.，目录号21651g)；(iv)磺基-lc-spdp(磺基琥珀酰亚胺基6[3-(2-吡啶基二硫代)-丙酰胺]己酸酯(pierce chem.co.目录号2165-g)；和(v)与edc缀合的磺基-nhs(n-羟基磺基-琥珀酰亚胺:pierce chem.co.，目录号24510)。
[0205]
上述接头包含具有不同属性的组分，从而产生具有不同理化性质的抗cd93或抗igfbp7-fc融合蛋白。例如，烷基羧酸的磺基-nhs酯比芳族羧酸的磺基-nhs酯更稳定。含nhs-酯的接头比磺基-nhs酯更难溶解。另外，接头smpt包含空间位阻二硫键，并且可以形成稳定性增加的融合蛋白。二硫键联通常不如其它键联稳定，因为二硫键联在体外被切割，导致可用的融合蛋白更少。磺基-nhs尤其可以增强碳二亚胺偶联的稳定性。碳二亚胺偶联(诸如edc)与磺基-nhs结合使用时，形成比单独的碳化二亚胺偶联反应更抗水解的酯。
[0206]
b.肽接头
[0207]
本文所述的任一种或所有接头都可以是肽接头。肽接头可具有天然存在的序列或非天然存在的序列。例如，源自仅有重链的抗体的铰链区的序列可用作接头。参见例如wo1996/34103，其出于所有目的通过引用以其整体并入。在一些实施方案中，肽接头包含cppcp的氨基酸序列(seq id no:3)(一种在天然igg1铰链区中发现的序列)。
[0208]
肽接头可具有任何合适的长度。在一些实施方案中，肽接头的长度为约1aa至约10aa、约1aa至约20aa、约1aa至约30aa、约5aa至约15aa、约10aa至约25aa、约5aa至约30aa、约10aa至约30aa、约30aa至约50aa、约50aa至约100aa或约1aa至约100aa中的任一者。
[0209]
这种肽接头的基本技术特征是所述肽接头不包含任何聚合活性。肽接头的特征(其包括二级结构的促进的缺失)是本领域已知的，并且描述于例如dall’acqua等人(biochem.(1998)37,9266-9273),cheadle等人(mol immunol(1992)29,21-30)以及raag和whitlow(faseb(1995)9(1),73-80，每一篇都通过引用以其整体并入本文)。“肽接头”的上下文中特别优选的一种氨基酸是gly。此外，也不促进任何二级结构的肽接头是优选的。分子彼此之间的键联可以通过例如基因工程来提供。制备融合的和可操作连接的抗体构建体并在哺乳动物细胞或细菌中表达它们的方法是本领域公知的(例如wo 99/54440，ausubel,current protocols in molecular biology,green publishing associates and wiley interscience,n.y.1989和1994或sambrook等人，molecular cloning:a laboratory manual,cold spring harbor laboratory press,cold spring harbor,n.y.,2001，出于所有目的，每一篇都通过引用以其整体并入)。
[0210]
在一些实施方案中，肽接头是稳定的接头，其不被蛋白酶诸如基质金属蛋白酶(mmp)切割。
[0211]
在一些实施方案中，肽接头倾向于不采用刚性三维结构，而是为多肽(例如，第一和/或第二组分)提供柔性，诸如在抗cd93或抗igfbp7抗体与fc片段之间提供柔性。在一些实施方案中，肽接头是柔性接头。示例性柔性接头包括甘氨酸聚合物(g)n(seq id no:4)、甘氨酸-丝氨酸聚合物(包括例如(gs)n(seq id no:5)、(gsggs)n(seq id no:6),(ggggs)n(seq id no:7)和(gggs)n(seq id no:8)，其中n是至少为1的整数)、甘氨酸-丙氨酸聚合
物、丙氨酸-丝氨酸聚合物和本领域已知的其它柔性接头。甘氨酸和甘氨酸-丝氨酸聚合物相对来说是无结构的，因此可以能够作为组分之间的中性系链。甘氨酸甚至比丙氨酸进入显著更多的phi-psi空间，并且比具有较长侧链的残基限制性小得多(参见scheraga,rev.computational chem.11173-142(1992))。普通技术人员将认识到抗cd93或抗igfbp7-fc融合蛋白的设计可包括全部或部分柔性的接头，使得接头可以包括柔性接头部分以及一个或多个赋予较低柔性结构以提供所需的融合蛋白结构的部分。
[0212]
在一些实施方案中，抗cd93抗体或抗igfbp7抗体(诸如抗cd93抗体片段或抗igfbp7抗体片段)和fc片段通过足够长度的接头连接在一起，使得抗cd93或抗igfbp7-fc融合蛋白能够以允许结合靶cd93或igfbp7以及fcr的方式折叠。在一些实施方案中，接头包含氨基酸序列srggggsggggsggggslema(seq id no:9)。在一些实施方案中，接头是或包含(ggggs)n(seq id no:13)序列，其中n等于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多。在一些实施方案中，接头包含氨基酸序列tsggggs(seq id no:10)。在一些实施方案中，接头包含氨基酸序列gegtstgsggsggsggad(seq id no:11)。
[0213]
天然接头在二级结构中采用各种构象(诸如螺旋、β-链、卷曲/弯曲和转角)来发挥其功能。α-螺旋结构中的接头可能作为刚性间隔子来有效地分隔蛋白质结构域，从而减少它们的不利相互作用。具有pro-rich序列的非螺旋接头可以增加接头的刚性和减少结构域间干扰的功能。在一些实施方案中，抗cd93抗体或抗igfbp7抗体(诸如抗体片段)和fc片段(或包含fc片段的抗体)通过具有氨基酸序列a(eaaak)4a(seq id no:12)的α螺旋接头连接在一起。
[0214]
b.多特异性抗cd93或抗igfbp7分子
[0215]
多特异性分子是对至少两种不同抗原或表位具有结合特异性的分子(例如，双特异性抗体对两种抗原或表位具有结合特异性)。还设想了具有超过两个化合价和/或特异性的多特异性分子。例如，可以制备三特异性抗体(tutt等人j.immunol.147:60(1991))。应当理解，本领域技术人员可以选择本文所述主题多特异性分子的适当特征，以相互组合形成本技术的多特异性抗cd93分子或抗igfbp7分子。
[0216]
在一些实施方案中，阻断cd93与igfbp7之间的相互作用的药剂包含多特异性(例如双特异性)抗cd93分子或抗igfbp7分子，其包含根据本文所述抗cd93抗体或抗igfbp7抗体中的任一种的抗cd93抗体或抗igfbp7抗体，以及特异性识别第二抗原的第二结合部分(诸如第二抗体)。在一些实施方案中，所述多特异性抗cd93或抗igfbp7分子包含抗cd93或抗igfbp7抗体和特异性识别第二抗原的第二抗体。
[0217]
在一些实施方案中，所述多特异性抗cd93或抗igfbp7分子是例如双抗体(db)、单链双抗体(scdb)、串联双抗体(tandab)、线性二聚体scdb(ld-scdb)、环状二聚体scdb(cd-scdb)、二-双抗体、串联scfv、串联二-scfv(例如，双特异性t细胞接合物)、串联三-scfv、三抗体(tri(a)body)、双微型抗体、四抗体、scfv-fc-scfv融合物、双亲和重靶向(dart)抗体、双可变区(dvd)抗体、igg-scfab、scfab-ds-scfv、fv2-fc、igg-scfv融合物、对接锁定(dnl)抗体、杵臼结构(kih)抗体(通过kih技术制备的双特异性igg)、duobody(通过duobody技术制备的双特异性igg)、异多聚体抗体或异结合物抗体。
[0218]
在一些实施方案中，所述药剂包含抗cd93抗体和抗igfbp7抗体。在一些实施方案中，所述药剂是双特异性抗体。
[0219]
在一些实施方案中，阻断cd93与igfbp7之间相互作用的药剂包括多特异性(例如，双特异性)抗cd93分子，该分子包含与cd93的第一表位特异性结合的第一抗cd93抗体和与cd93的第二表位特异性结合的第二抗cd93抗体。在一些实施方案中，第一和第二表位之一或两者与mab mm01或mab 7c10的表位重叠或基本重叠。在一些实施方案中，第一抗体和第二抗体之一或两者与mab mm01或mab 7c1竞争与cd93的结合。在一些实施方案中，第一抗体和第二抗体之一或两者也阻断cd93与mmrn2之间的相互作用。在一些实施方案中，第一抗体和第二抗体之一或两者不阻断cd93与mmrn2之间的相互作用。在一些实施方案中，第一抗体和第二抗体之一或两者与cd93上igfbp7结合位点之外的区域结合。
[0220]
在一些实施方案中，阻断cd93与igfbp7之间相互作用的药剂包括多特异性(例如，双特异性)抗igfbp7分子，该分子包含与igfbp7的第一表位特异性结合的第一抗igfbp7抗体和与igfbp7的第二表位特异性结合的第二抗igfbp7抗体。在一些实施方案中，第一和第二表位之一或两者与mab r003或mab 2c6的表位重叠或基本重叠。在一些实施方案中，第一抗体和第二抗体之一或两者与mab r003或mab 2c6竞争与igfbp7的结合。
[0221]
抑制性cd93或igfbp7多肽
[0222]
a.抑制性cd93多肽
[0223]
本文在一些实施方案中描述的方法涉及使用阻断cd93与igfbp7之间相互作用的多肽，所述多肽包含cd93域或其变体(“抑制性cd93多肽”)的胞外结构。本技术一方面提供了本文所述的新型非天然存在的抑制性cd93多肽。在一些实施方案中，抑制性cd93多肽是可溶性多肽。
[0224]
在一些实施方案中，抑制性cd93多肽是膜结合的。在一些实施方案中，膜结合抑制性cd93多肽与igfbp7结合，但不触发cd93/igfbp7信号传导。在一些实施方案中，膜结合抑制性cd93多肽与igfbp7结合并减弱cd93/igfbp7信号传导。在一些实施方案中，通过基因编辑系统或mrna递送媒介物引入膜结合抑制性cd93多肽。
[0225]
在一些实施方案中，所述抑制性cd93多肽包含cd93(诸如人cd93)或其变体的胞外结构域。在一些实施方案中，所述抑制性cd93多肽包含seq id no:1的残基a24-k580的氨基酸序列或其与seq id no:1的残基a24-k580具有至少约80％(诸如约85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)序列同一性的变体。在一些实施方案中，所述抑制性cd93多肽还包含f238残基，其中氨基酸编号是基于seq id no:1。
[0226]
在一些实施方案中，所述抑制性cd93多肽包含cd93(诸如人cd93)的c型凝集素结构域或其变体。在一些实施方案中，所述抑制性cd93多肽包含seq id no:1的残基t22-n174的氨基酸序列或其与seq id no:1的残基t22-n174具有至少约80％(诸如约85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)序列同一性的变体。在一些实施方案中，所述抑制性cd93多肽还包含f238残基，其中氨基酸编号是基于seq id no:1。
[0227]
在一些实施方案中，所述抑制性cd93多肽包含cd93(诸如人cd93)的c型凝集素结构域中的长环区或其变体域。在一些实施方案中，所述抑制性cd93多肽包含seq id no:1的残基g96-c141的氨基酸序列或其与seq id no:1的残基g96-c141具有至少约80％(诸如约85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)序列同一性的变体。在一些实施方案中，所述抑制性cd93多肽还包含选自g96、q98、r99、e100、k101、g102、k103、c104、l105、d106、p107、s108、l109、k112、s115、v117、g118、g120、e121、d122、t123、p124、
y125、s126、n127、h129、k130、e131、l132、r133、n134、s135、c136、i137、s138、k139和r140的残基中的至少一个或多个(诸如约至少10个、15个、20个、25个、30个、35个或全部)残基，其中氨基酸编号是基于seq id no:1。
[0228]
在一些实施方案中，所述抑制性cd93多肽包含cd93(诸如人cd93)或其变体的c型凝集素样结构域(d1结构域)与egf样结构域(d2结构域)之间的dx结构域。在一些实施方案中，所述抑制性cd93多肽包含seq id no:1的残基i175-l256和i175-l259的氨基酸序列或其与seq id no:1的残基i175-l256和i175-l259具有至少约80％(诸如约85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)序列同一性的变体。
[0229]
在一些实施方案中，所述抑制性cd93多肽包含seq id no:1的残基f182-y262、i175-l256和/或i175-l259中的任一个的氨基酸序列或其与seq id no:1的残基f182-y262、i175-l256和i175-l259中的任一个具有至少约80％(诸如约85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)序列同一性的变体。在一些实施方案中，所述抑制性cd93多肽还包含基于seq id no:1的f238残基。在一些实施方案中，抑制性cd93多肽还包含选自g96、q98、r99、e100、k101、g102、k103、c104、l105、d106、p107、s108、l109、k112、s115、v117、g118、g120、e121、d122、t123、p124、y125、s126、n127、h129、k130、e131、l132、r133、n134、s135、c136、i137、s138、k139和r140的残基中的至少一个或多个(诸如至少约10个、15个、20个、25个、30个、35个或全部)残基，其中氨基酸编号是基于seq id no:1。
[0230]
在一些实施方案中，所述抑制性cd93多肽包含seq id no:1的残基t22-y262的氨基酸序列或其与seq id no:1的残基t22-y262具有至少约80％(诸如约85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)序列同一性的变体。在一些实施方案中，所述抑制性cd93多肽还包含基于seq id no:1的f238残基。在一些实施方案中，所述抑制性cd93多肽还包含选自基于seq id no:1的g96、q98、r99、e100、k101、g102、k103、c104、l105、d106、p107、s108、l109、k112、s115、v117、g118、g120、e121、d122、t123、p124、y125、s126、n127、h129、k130、e131、l132、r133、n134、s135、c136、i137、s138、k139和r140的残基中的至少一个或多个(诸如至少约10个、15个、20个、25个、30个、35个或全部)残基。
[0231]
在一些实施方案中，所述抑制性cd93多肽包含f238残基，其中氨基酸编号是基于seq id no:1。
[0232]
在一些实施方案中，所述抑制性cd93多肽包含cd93(诸如人cd93)或其变体的五个egf样区域中的一个、两个、三个、四个或五个区域。在一些实施方案中，所述抑制性cd93多肽包含seq id no:1的残基c257-m469或p260-t468的氨基酸序列或其与seq id no:1的残基c257-m469或p260-t468具有至少约80％(诸如约85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)序列同一性的变体。
[0233]
在一些实施方案中，本文描述的变体是天然变体。在一些实施方案中，所述变体不包含非保守取代。在一些实施方案中，所述变体仅包含一个或多个保守取代。在一些实施方案中，所述一个或多个保守取代包括下表1中在标题“优选取代”下显示的取代或由所述取代组成。
[0234]
表1.氨基酸取代
[0235][0236][0237]
在一些实施方案中，所述抑制性cd93多肽以比mmnr2更大的亲和力结合igfbp7。在一些实施方案中，所述抑制性cd93多肽与igfbp7结合的kd至多为抑制性cd93多肽与mmnr2结合的kd的一半、五分之一、十分之一、二十分之一、五十分之一、百分之一、千分之一。
[0238]
在一些实施方案中，所述抑制性cd93多肽以比cd93更大的亲和力结合igfbp7。在一些实施方案中，所述抑制性cd93多肽与igfbp7结合的kd至多为野生型cd93(如seq id no:1中所示的多肽)与igfbp7结合的kd的一半、五分之一、十分之一、二十分之一、五十分之一、一百分之一、一千分之一。
[0239]
在一些实施方案中，所述抑制性cd93多肽还包含稳定化结构域。所述稳定化结构域可以是稳定抑制性igfbp7多肽的任何结构域(例如，延长抑制性igfbp7多肽的体内半衰
期)。在一些实施方案中，所述稳定化结构域是fc结构域。示例性的fc结构域包括在“fc片段”部分描述的那些。
[0240]
在一些实施方案中，所述抑制性多肽的长度为约50至约1000个氨基酸，例如长度为约50-800、50-500、50-400、50-300或50-200个氨基酸。在一些实施方案中，所述抑制性多肽的长度为约50至约100个氨基酸、约100至约150个氨基酸或约150个氨基酸至约200个氨基酸。
[0241]
b.抑制性igfbp多肽
[0242]
本文在一些实施方案中描述的方法涉及使用阻断cd93与igfbp7之间相互作用的多肽，所述多肽包含igfbp7的变体(“抑制性igfbp7多肽”)。本技术一方面提供了本文所述的新型非天然存在的抑制性igfbp7多肽。
[0243]
在一些实施方案中，所述抑制性igfbp7多肽与cd93结合，但不激活cd93。
[0244]
在一些实施方案中，所述抑制性igfbp7多肽与cd93的结合亲和力大于与igf-1、igf-2和/或igf1r的结合亲和力。在一些实施方案中，所述抑制性igfbp7多肽以至多为抑制性igfbp多肽与igf-1、igf-2和/或igf1r之间结合的kd的一半、五分之一、十分之一、二十分之一、五十分之一、百分之一、千分之一的kd与igfbp7结合。
[0245]
在一些实施方案中，所述抑制性igfbp7多肽与cd93的结合亲和力大于与igfbp7的结合亲和力。在一些实施方案中，所述抑制性igfbp7多肽以至多为野生型igfbp7(诸如seq id no:2中所示的多肽)与cd93之间结合的kd的一半、五分之一、十分之一、二十分之一、五十分之一、百分之一、千分之一的kd与cd93结合。
[0246]
在一些实施方案中，所述抑制性igfbp7多肽包含igfbp7(诸如人igfbp7)或其变体的ib结构域。在一些实施方案中，所述抑制性igfbp7多肽包含seq id no:2的残基s28-g106的氨基酸序列或其与seq id no:2的残基s28-g106具有至少约80％(诸如约85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)序列同一性的变体。
[0247]
在一些实施方案中，所述抑制性igfbp7多肽包含或进一步包含igfbp7(诸如人igfbp7)或其变体的kazal样结构域。在一些实施方案中，所述抑制性igfbp7多肽包含或进一步包含与seq id no:2的残基p105-q158的氨基酸序列或其与seq id no:2的残基p105-q158具有至少约80％(诸如约85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)序列同一性的变体。
[0248]
在一些实施方案中，所述抑制性igfbp7多肽包含或进一步包含igfbp7(诸如人igfbp7)或其变体的ig样c2结构域。在一些实施方案中，所述抑制性igfbp7多肽包含或进一步包含与seq id no:2的残基p160-t264的氨基酸序列或其与seq id no:2的残基p160-t264具有至少约80％(诸如约85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)序列同一性的变体。
[0249]
在一些实施方案中，本文描述的变体是天然变体。在一些实施方案中，所述变体不包含非保守取代。在一些实施方案中，所述变体仅包含一个或多个保守取代。在一些实施方案中，所述一个或多个保守取代包括表1中标题“优选取代”下所示的取代或由所述取代组成。
[0250]
在一些实施方案中，所述抑制性igfbp7多肽还阻断cd93与mmnr2之间的相互作用。在一些实施方案中，所述抑制性igfbp7多肽与和mmnr2所结合的表位相同的cd93的表位。在
一些实施方案中，所述抑制性igfbp7多肽与和mmnr2所结合的表位不同的cd93的表位结合。
[0251]
在一些实施方案中，所述抑制性igfbp7多肽不阻断cd93与mmnr2之间的相互作用。
[0252]
在一些实施方案中，所述抑制性igfbp7多肽是可溶性多肽。
[0253]
在一些实施方案中，所述抑制性igfbp7多肽是膜结合的。在一些实施方案中，所述膜结合抑制性igfbp7多肽与cd3结合3，但不触发或减弱cd93/igfbp7信号传导。在一些实施方案中，通过基因编辑系统或mrna递送媒介物引入膜结合抑制性igfbp7多肽。
[0254]
在一些实施方案中，所述抑制性igfbp多肽还包含稳定化结构域。所述稳定化结构域可以是稳定抑制性igfbp7多肽(例如，延长抑制性igfbp7多肽的体内半衰期)的任何结构域。在一些实施方案中，所述稳定化结构域是fc结构域。示例性fc结构域包括在“fc片段”部分下描述的那些。
[0255]
在一些实施方案中，所述抑制性多肽的长度为约50至约1000个氨基酸，诸如长度为约50-800个、50-500个、50-400个、50-300个或50-200个氨基酸。在一些实施方案中，所述抑制性多肽的长度为约50至约100个氨基酸、约100至约150个氨基酸或约150个氨基酸至约200个氨基酸。
[0256]
抑制igfbp3/cd93信号传导途径的其它药剂
[0257]
除了上述剂之外，还设想了在本文所述的方法中使用能够抑制igfbp3/cd93的其它剂。在一些实施方案中，所述药剂包括肽、多肽、肽类似物、融合肽、适体、avimer、anticalin、speigelmer或小分子化合物。
[0258]
在一些实施方案中，所述药剂降低cd93(诸如人cd93)的表达。在一些实施方案中，与不使用所述药剂的情况下的cd93水平相比，所述药剂使cd93(诸如人cd93)的表达降低至少5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％。在一些实施方案中，所述药剂使cd93的表达与参照水平相当。在一些实施方案中，参照水平是受试者非肿瘤器官中cd93表达的水平。在一些实施方案中，参照水平是无所述疾病或疾患或异常血管结构的受试者或受试者组中的cd93表达的水平(或平均水平)。
[0259]
在一些实施方案中，所述药剂降低igfbp7(诸如人igfbp7)的表达。在一些实施方案中，与不使用所述药剂的情况下的igfbp7水平相比，所述药剂将igfbp7(诸如人igfbp7)的表达降低至少5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％。在一些实施方案中，所述药剂使igfbp7的表达与参照水平相当。在一些实施方案中，所述参照水平是受试者非肿瘤器官中igfbp7的表达水平。在一些实施方案中，所述参照水平是无所述疾病或疾患或异常血管结构的受试者或受试者组中的igfbp7表达的水平(或平均水平)。
[0260]
在一些实施方案中，所述药剂包括靶向cd93(诸如人cd93)的sirna、shrna、mirna或反义rna。在一些实施方案中，特异性靶向igfbp7(诸如人igfbp7)的sirna、shrna、mirna或反义rna。
[0261]
在一些实施方案中，所述药剂包含靶向cd93或igfbp7的基因组编辑系统。在一些实施方案中，所述基因组编辑系统包含dna核酸酶，诸如工程化(例如，可编程的或可靶向的)dna核酸酶，以诱导cd93或igfbp7的靶dna序列的基因组编辑。可以使用任何合适的dna核酸酶，包括但不限于crispr相关蛋白(cas)核酸酶、锌指核酸酶(zfn)、转录激活因子样效应物核酸酶(talen)、大范围核酸酶、其它内切或外切核酸酶、其变体、其片段及其组合。在一些实施方案中，所述基因组编辑包括修饰cd93，使得经修饰的cd93不再与igfbp7结合或
者与igfbp7的结合程度低于野生型cd93。在一些实施方案中，所述修饰包括插入包含cd93的变体的转基因。在一些实施方案中，所述变体cd93在基于seq id no:1的残基f238处具有突变。在一些实施方案中，所述变体cd93具有基于seq id no:1的f238突变。
[0262]
在一些实施方案中，基因组编辑包括修饰igfbp7，使得经修饰的igfbp7不再与cd93结合，或者与cd93的结合程度低于野生型igfbp7。在一些实施方案中，所述修饰包括插入包含igfbp7的变体的转基因。在一些实施方案中，所述igfbp7的变体具有c型凝集素结构域，并且所述igfbp7的c型凝集素结构域不来源于igfbp7。
[0263]
血管成熟/正常化
[0264]
所有组织的成功发挥作用依赖于分级结构的成熟血管网络的建立。与健康状态相反，许多人疾病表现出新血管形成失调过量。实体瘤是一个典型的实例。实体瘤远不只是大量增殖的癌细胞，而是癌细胞、血管网络、淋巴管和各种其它细胞的集合，所有这些都对局部微环境有贡献。实体瘤内的血管生成主要由缺氧驱动。这种缺氧是肿瘤微环境的标志，通过调节氧传感分子直接导致促血管生成诸如vegf的产生。参见goel等人，cold spring harb perspect med2012；2:a006486.。
[0265]
微环境中丰富的vegf和其它促血管生成因子驱动着持续的血管生成和异常血管网络的产生。在结构上，血管经常扩张，形成曲折的路径，并表现出分布的不均一性，使得肿瘤内的某些区域血管减少，而其它区域血管过多。在细胞水平，促血管生成因子诱导ve-钙粘蛋白介导的内皮细胞(ec)联接和ec迁移的减弱，改变血管壁结构。类似地，血管周细胞(pvc，由周细胞和血管平滑肌细胞(vsmc)组成)通常仅松散地附着于ec，并且数量减少。最后，血管周基底膜(bm)在肿瘤中也是结构异常的—在某些区域过薄或缺失，而在其它区域异常厚。参见goel等人，cold spring harb perspect med2012；2:a006486.。
[0266]
这些结构紊乱的直接后果是肿瘤血管功能的显著异常。血管的无序和奇怪的分布导致不均匀的血流，在一些区域缓慢而在另一些区域过度。另外，pvc覆盖率降低、ec脱离以及囊泡-液泡细胞器(vvo)过量导致显著的肿瘤血管渗透性，流体和蛋白质过量外渗到细胞外区室中。这种渗漏，加上功能性肿瘤内淋巴管的相对缺乏，导致肿瘤间质液压力(ifp)显著升高至与血管内压力平衡的水平，从而导致跨血管流量减少。此外，由癌细胞的增殖块施加的压力会导致血管压迫和塌陷。最终结果是血液供应不均，导致缺氧和酸中毒。所描述的生理变化对实体瘤的行为有直接影响。低氧肿瘤细胞通常表现出更具侵袭性的表型，激活癌基因并经历“上皮细胞向间质细胞的转变”(emt)，这提高了它们的转移潜力。此外，不利的微环境损害了抗肿瘤免疫细胞的功能，其向肿瘤的递送也受到损害。重要的是，肿瘤对治疗的反应也受到影响。已知缺氧会降低肿瘤细胞对放射疗法和化学疗法的敏感性，全身性施用的细胞毒性物质进入肿瘤的递送受到显著阻碍，特别是在低血流和肿瘤ifp升高的区域。参见goel等人，cold spring harb perspect med 2012；2:a006486.。
[0267]
本技术提供了用于使疾病或疾患(诸如癌症，诸如实体瘤)中的血管正常化(即，促进异常血管的成熟)的方法和组合物。在一些实施方案中，所述异常血管与缺氧有关。
[0268]“脉管系统的正常化”、“不成熟和渗漏血管的正常化”、“血管成熟化”或“促进功能性血管网络的形成”和“促进有利的肿瘤微环境”通常是指或包括将渗漏的、曲折的、紊乱的血管(例如，肿瘤血管)的网络转化为更有组织的血管网络，其渗透性更低、扩张性更低和/或曲折性更低。在一些实施方案中，血管正常化的特征在于更成熟的血管(例如，更长的血
管、圆形血管)。在一些实施方案中，血管正常化的特征在于周细胞和/或平滑肌细胞与衬在血管壁上的内皮细胞的结合增加，形成更正常的基底膜(例如，具有更厚的生理厚度)和/或血管与基底膜的更紧密结合。脉管系统的正常化还可以包括修剪未成熟的血管，以及增加剩余脉管系统的完整性和稳定性。在一些实施方案中，本文所述的血管正常化的特征在于血管密度的维持。
[0269]
在一些实施方案中，血管的成熟(或血管正常化)可以通过血管的形态来表征。在一些实施方案中，血管正常化的特征在于组织中血管长度的增加。如实施例中所述(参见例如，图2b)，可以以每视野的总血管长度为单位(例如，μm)来测量血管的长度。在一些实施方案中，在施用igfbp7/cd93阻断剂后，血管的长度(例如，每个视野的总长度)增加了至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。在一些实施方案中，通过cd31表达来鉴定血管。
[0270]
在一些实施方案中，血管正常化的特征在于组织中圆形血管百分比(圆形血管/总血管的百分比)的增加。如实施例中所述(参见例如图2b)，圆形血管百分比可通过将圆形血管数除以总血管数来测量。在一些实施方案中，在施用igfbp7/cd93阻断剂后，圆形血管百分比增加至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。在一些实施方案中，通过cd31表达来鉴定血管。
[0271]
在一些实施方案中，血管正常化的特征在于组织中血管的血管密度的维持。如实施例中所述(参见例如图2b)，可以以每个视野的血管数为单位来测量血管密度。在一些实施方案中，施用igfbp7/cd93阻断剂后，血管密度减小不超过约30％、20％、10％或5％。在一些实施方案中，施用igfbp7/cd93阻断剂后，血管密度增加不超过约30％、20％、10％或5％。在一些实施方案中，施用igfbp7/cd93阻断剂后，血管密度既不增加也不减小超过约30％、20％、10％或5％。在一些实施方案中，通过cd31表达来鉴定血管。
[0272]
在一些实施方案中，血管的成熟(或血管正常化)的特征可在于更密集水平的周细胞(例如，ng2 周细胞)和/或更密集水平的平滑肌细胞(例如，α-sma 平滑肌细胞)。在一些实施方案中，血管正常化的特征在于血管上ng2表达的增加。在一些实施方案中，在施用igfbp7/cd93阻断剂后，血管上的ng2表达增加至少约25％、50％、75％、100％、125％、150％、175％或200％。在一些实施方案中，血管正常化的特征在于血管上α-sma 表达的增加。在一些实施方案中，施用igfbp7/cd93阻断剂后，血管上的α-sma 表达增加至少约25％、50％、75％、100％、125％、150％、175％、200％、225％或250％。在一些实施方案中，血管正常化的特征在于血管上icam表达的增加。在一些实施方案中，施用igfbp7/cd93阻断剂后，血管上icam 表达增加至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％或70％。在一些实施方案中，血管正常化的特征在于血管上活化的整联蛋白β1表达的减少。在一些实施方案中，在用igfbp7/cd93阻断剂后，血管上活化的整联蛋白β1表达减少至少约10％、20％、30％、40％或50％。在一些实施方案中，通过cd31表达来鉴定血管。
[0273]
在一些实施方案中，血管的成熟(或血管正常化)的特征可在于血管灌注和/或渗透性。在一些实施方案中，血管正常化的特征在于血管渗透性或灌注增加。可以例如如实施例所述(例如，图2e)所述，通过评估所施用的药物(诸如凝集素)在血管中的分布来评估渗透性或灌注。在一些实施方案中，施用igfbp7/cd93阻断剂后，血管灌注增加至少约25％、50％、75％、100％、125％、150％、175％、200％、225％、250％、275％或300％。
[0274]
在一些实施方案中，血管正常化的特征在于组织中缺氧减少。可以例如如实施例所述(诸如图6a),评估肿瘤缺氧。在一些实施方案中，通过吡莫硝唑阳性百分比(即，吡莫硝唑阳性面积除以总肿瘤面积)来评估肿瘤缺氧。在一些实施方案中，施用igfbp7/cd93阻断剂后，肿瘤缺氧减少至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％。
[0275]
在一些实施方案中，血管正常化的特征在于更有效的药物递送。例如，可以通过评估药物递送后药物在组织(诸如肿瘤组织)中的分布来测定药物递送的有效性(例如，如实施例中所述(例如，图6a))。在一些实施方案中，施用igfbp7/cd93阻断剂后，递送后药物(诸如化学治疗药物)在组织中的存在/分布增加至少约25％、50％、75％、100％、125％、150％、175％、200％、225％、250％、275％或300％。
[0276]
在一些实施方案中，血管正常化的特征在于组织(例如，肿瘤组织)中免疫细胞的浸润增加。组织中免疫细胞的浸润可通过评估组织(例如，肿瘤组织)中免疫细胞的百分比来测量(例如，通过测量组织中免疫细胞的数量除以肿瘤重量单位(例如，mg)或通过测量组织中免疫细胞的数量除以视野单位，如图3a和图3d中所描述的)。在一些实施方案中，免疫细胞是肿瘤浸润淋巴细胞。在一些实施方案中，免疫细胞包括cd45 白细胞。在一些实施方案中，免疫细胞包括cd3 t细胞。在一些实施方案中，免疫细胞包括cd4 t细胞。在一些实施方案中，免疫细胞包括cd8 t细胞。在一些实施方案中，免疫细胞是内源免疫细胞。在一些实施方案中，免疫细胞是外源免疫细胞。在一些实施方案中，免疫细胞是源自受试者的工程化免疫细胞(例如，car t细胞)。在一些实施方案中，施用igfbp7/cd93阻断剂后，组织(例如，肿瘤组织)中免疫细胞的百分比增加至少约25％、50％、75％、100％、125％、150％、175％、200％、225％、250％、275％或300％。
[0277]
在一些实施方案中，施用igfbp7/cd93阻断剂后，浸润的免疫细胞中抑制性免疫细胞的比例降低。在一些实施方案中，抑制性免疫细胞包括髓源性抑制细胞(mdsc)。在一些实施方案中，mdsc包括粒细胞mdsc(例如，cd3-cd11c-cd11b ly6g ly6c-cd45 白细胞)。在一些实施方案中，mdsc包括单核细胞mdsc(例如，cd3-cd11c-cd11b ly6g-ly6c cd45 白细胞)。在一些实施方案中，mdsc包括粒细胞mdsc和单核细胞mdsc。在一些实施方案中，施用igfbp7/cd93阻断剂后，浸润的免疫细胞中抑制性免疫细胞的比例降低了至少10％、20％、30％、40％或50％。
[0278]
可在一次或多次施用igfbp7/cd93阻断剂后的不同时间点评估上一节中描述的不同参数(诸如血管长度、形态学、缺氧、灌注、免疫细胞浸润、药物递送)。在一些实施方案中，施用igfbp7/cd93阻断剂14天后评估该参数，其中以约每周两次的频率施用该药剂，持续两周。
[0279]
终点
[0280]
在“血管成熟/正常化”部分中描述的任何参数(诸如血管长度、形态学、缺氧、灌注、免疫细胞的浸润、药物递送)可以用作上述方法(诸如治疗癌症的方法)的特征。“血管成熟/正常化”一节以其整体并入本文以用于论述上述方法的各种实施方案的特征。
[0281]
在一些实施方案中，受试者具有降低的肿瘤细胞增殖和/或增加的肿瘤细胞凋亡。肿瘤细胞的增殖和凋亡可以通过增殖标志物或凋亡标志物(诸如实施例中所述的ki-67和切割的胱天蛋白酶3(cc3))来评估。在一些实施方案中，肿瘤细胞增殖的特征在于肿瘤中的ki-67阳性细胞。在一些实施方案中，施用igfbp7/cd93阻断剂后，肿瘤中的ki-67阳性细胞
减少至少约10％、20％、30％、40％、50％或60％。在一些实施方案中，肿瘤细胞的凋亡的特征在于肿瘤组织中的cc3阳性细胞。在一些实施方案中，施用igfbp7/cd93阻断剂后，肿瘤组织中的cd3阳性细胞增加了至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％。
[0282]
在一些实施方案中，与治疗前相同受试者的相应肿瘤大小、癌细胞数量或肿瘤生长速率相比，或与未接受治疗的其他受试者的相应活性相比，受试者的肿瘤大小、癌细胞数量或肿瘤生长速率降低至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或100％中的任一个。可以使用标准方法，诸如使用纯化的酶的体外测定、基于细胞的测定、动物模型或人体测试，来测量这种效应的大小。
[0283]
疾病或疾患
[0284]
本文描述的方法适用于与异常血管结构相关的任何疾病或疾患。在一些实施方案中，所述疾病或疾患是年龄相关性黄斑变性(armd)。在一些实施方案中，所述疾病或疾患是皮肤银屑病。在一些实施方案中，所述疾病或疾患是良性肿瘤。在一些实施方案中，所述疾病或疾患是癌症。
[0285]
癌症
[0286]
在一些实施方案中，本文所述的疾病或疾患是癌症。可以使用本文所述的任何方法治疗的癌症包括任何类型的癌症。用本技术中描述的药剂治疗的癌症类型包括但不限于癌、母细胞瘤、肉瘤、良性和恶性肿瘤以及恶性肿瘤，例如肉瘤、癌和黑色素瘤。成人肿瘤/癌症和儿童肿瘤/癌症也包括在内。
[0287]
在各种实施方案中，所述癌症是早期癌症、非转移性癌症、原发性癌症、晚期癌症、局部晚期癌症、转移性癌症、缓解期癌症、复发性癌症、辅助治疗中的癌症、新辅助治疗中的癌症或对治疗基本上难治的癌症。
[0288]
在一些实施方案中，所述癌症是实体瘤。
[0289]
在一些实施方案中，所述癌症包括cd93 肿瘤内皮细胞。在一些实施方案中，肿瘤中至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％的内皮细胞为cd93阳性。在一些实施方案中，所述癌症包含的cd93 内皮细胞比受试者正常组织的cd93 内皮细胞多至少20％、40％、60％、80％或100％。在一些实施方案中，所述癌症包含的cd93 内皮细胞比未患癌症的受试者或受试者组中相应器官的cd93 内皮细胞多至少20％、40％、60％、80％或100％。
[0290]
在一些实施方案中，所述癌症包含igfbp7 血管。在一些实施方案中，所述癌症包含的igfbp7 血管比受试者正常组织的igfbp7 血管多至少20％、40％、60％、80％或100％。在一些实施方案中，所述癌症包含的igfbp7 血管比未患有癌症的受试者或受试者组的相应器官的igfbp7 血管多至少20％、40％、60％、80％或100％。
[0291]
在一些实施方案中，所述癌症(例如，实体瘤)的特征在于肿瘤缺氧。可以例如如实施例所述(诸如图6a),评估肿瘤缺氧。在一些实施方案中，所述癌症的特征在于至少约1％、2％、3％、4％或5％的吡莫硝唑阳性百分比(即，吡莫硝唑阳性面积除以总肿瘤面积)。
[0292]
可通过本技术的方法治疗的癌症的实例包括但不限于肛门癌、星形细胞瘤(例如，小脑和脑)、基底细胞癌、膀胱癌、骨癌(例如，骨肉瘤和恶性纤维组织细胞瘤)、脑瘤(例如，神经胶质瘤、脑干神经胶质瘤、小脑或大脑星形细胞瘤(例如，星形细胞瘤、恶性神经胶质瘤、髓母细胞瘤和胶质母细胞瘤)、乳腺癌(例如，tnbc)、宫颈癌、结肠癌、结直肠癌、子宫内
膜癌(例如，子宫癌)、食道癌、眼癌(例如，眼内黑素瘤和视网膜母细胞瘤)、胃(胃)癌、胃肠道间质瘤(gist)、头颈癌、肝细胞(肝)癌(例如肝癌和肝细胞瘤(heptoma))、肝癌、肺癌(例如，小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌和肺鳞癌)、髓母细胞瘤、黑色素瘤、间皮瘤、骨髓增生异常综合征、鼻咽癌、神经母细胞瘤、卵巢癌、胰腺癌、甲状旁腺癌、腹膜癌、垂体瘤、直肠癌、肾癌、肾盂和输尿管癌(移行细胞癌)、横纹肌肉瘤、皮肤癌(例如，非黑色素瘤(例如，鳞状细胞癌)、黑色素瘤和默克尔细胞癌)、小肠癌、鳞状细胞癌、睾丸癌、甲状腺癌和结节性硬化症。癌症的其它实例可见于由merck sharp&dohme corp.于2011出版的the merck manual of diagnosis and therapy，第19版，
§
on hematology and oncology(isbn978-0-911910-19-3)；由merck sharp&dohme corp.于2018年出版的the merck manual of diagnosis and therapy，第20版，
§
on hematology and oncology(isbn 978-0-911-91042-1)(在merck manuals的因特网站上的2018年数字在线版本)；和seer program coding and staging manual 2016，所述文献中的每一篇均出于所有目的通过引用以其整体并入。
[0293]
在一些实施方案中，所述癌症是三阴性乳腺癌(tnbc，例如具有高igfbp或cd93表达的tnbc)。在一些实施方案中，所述癌症是黑色素瘤。在一些实施方案中，患者对先前的疗法具有抗性，所述疗法包括施用免疫检查点抑制剂，例如抗pd1抗体、抗pd-l1抗体、抗ctla4抗体或其组合。
[0294]
受试者
[0295]
在一些实施方案中，所述受试者是哺乳动物(诸如人)。
[0296]
在一些实施方案中，所述受试者具有包含异常血管的组织，所述异常血管包含cd93 内皮细胞。在一些实施方案中，具有异常血管的组织中至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％的内皮细胞为cd93阳性。在一些实施方案中，具有异常血管的组织包含的cd93 内皮细胞比受试者中正常组织的cd93 内皮细胞多至少20％、40％、60％、80％或100％。在一些实施方案中，具有异常血管的组织包含的cd93 内皮细胞比无异常血管的受试者或受试者组的相应器官的cd93 内皮细胞多至少20％、40％、60％、80％或100％。
[0297]
在一些实施方案中，所述受试者具有包含异常脉管的组织，所述异常脉管包括igfbp7 血管。在一些实施方案中，所述组织包含的igfbp7 血管比受试者正常组织的igfbp7 血管多至少20％、40％、60％、80％或100％。在一些实施方案中，所述组织包含的igfbp7 血管比无异常血管的受试者或受试者组的相应器官的igfbp7 血管多至少20％、40％、60％、80％或100％。
[0298]
在一些实施方案中，基于异常血管结构选择受试者进行治疗。在一些实施方案中，异常血管结构的特征在于cd93 内皮细胞(例如，通过测量cd93 cd31 细胞)。在一些实施方案中，具有异常血管的组织中至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％的内皮细胞为cd93阳性。在一些实施方案中，具有异常血管的组织包含的cd93 内皮细胞比受试者中正常组织的cd93 内皮细胞多至少20％、40％、60％、80％或100％。在一些实施方案中，具有异常血管的组织包含的cd93 内皮细胞比无异常血管的受试者或受试者组的相应器官的cd93 内皮细胞多至少20％、40％、60％、80％或100％。
[0299]
在一些实施方案中，异常血管结构的特征在于igfbp7 血管的异常水平。在一些实
施方案中，所述组织包含的igfbp7 血管比受试者正常组织的igfbp7 血管多至少20％、40％、60％、80％或100％。
[0300]
在一些实施方案中，所述组织包含的igfbp7 血管比无异常血管的受试者或受试者组的相应器官的igfbp7 血管多至少20％、40％、60％、80％或100％。
[0301]
在一些实施方案中，受试者具有至少一种在先疗法。在一些实施方案中，所述先前的疗法包括放射疗法、化学疗法和/或免疫疗法。在一些实施方案中，受试者对所述在先疗法具有抗性、难治性或复发性。在一些实施方案中，所述先前的治疗包括施用免疫检查点抑制剂，例如，抗pd1抗体、抗pd-l1抗体、抗ctla4抗体或其组合。
[0302]
联合治疗
[0303]
本技术还提供了向受试者施用抑制本文所述igfbp7/cd93信号传导途径的药剂(“igfbp7/cd93阻断剂”)以治疗疾病或疾患(诸如癌症)的方法，其中所述方法还包括施用第二药剂或疗法。在一些实施方案中，第二药剂或疗法是用于治疗疾病或疾患的标准或常用药剂或疗法。在一些实施方案中，第二药剂或疗法包括化学治疗剂。在一些实施方案中，第二药剂或疗法包括手术。在一些实施方案中，第二药剂或疗法包括放射疗法。在一些实施方案中，第二药剂或疗法包括免疫疗法。在一些实施方案中，第二药剂或疗法包括细胞疗法(诸如包括免疫细胞(例如，car t细胞)的细胞疗法)。在一些实施方案中，第二药剂或疗法包括血管生成抑制剂。
[0304]
在一些实施方案中，第二药剂是化学治疗剂。在一些实施方案中，第二药剂是抗代谢剂。在一些实施方案中，抗代谢剂是5-fu。
[0305]
在一些实施方案中，第二药剂是免疫检查点调节剂。在一些实施方案中，免疫检查点调节剂是选自由pd-l1、pd-l2、ctla4、pd-l2、pd-1、cd47、tigit、gitr、tim3、lag3、cd27、4-1bb和b7h4组成的组的免疫检查点蛋白的抑制剂。在一些实施方案中，免疫检查点蛋白是pd-1。在一些实施方案中，第二药剂是抗pd-1抗体或其片段。在一些实施方案中，第二药剂是抗ctla4抗体或其片段。在一些实施方案中，第二药剂是抗pd1抗体或其片段和抗ctla4抗体或其片段的组合。
[0306]
在一些实施方案中，将igfbp7/cd93阻断剂与第二药剂或疗法同时施用。在一些实施方案中，将抑制igfbp7/cd93信号传导途径的igfbp7/cd93阻断剂与第二药剂或疗法同时施用。在一些实施方案中，将igfbp7/cd93阻断剂与第二药剂或疗法依次施用。在一些实施方案中，将igfbp7/cd93阻断剂以与第二药剂或疗法相同的单位剂型施用。在一些实施方案中，将igfbp7/cd93阻断剂以不同于第二药剂或疗法的单位剂型施用。
[0307]
给药方案和施用途径
[0308]
施用给受试者(例如人)的igfbp7/cd93阻断剂的药剂量，以及在一些实施方案中，施用给受试者的本文所述的第二药剂的药剂量，可以随着具体的组合物、施用方法以及所治疗的疾病或疾患(诸如癌症)的具体种类和阶段而变化。所述量应足以产生所需的反应，诸如针对疾病或疾患(诸如癌症)的治疗反应。在一些实施方案中，igfbp7/cd93阻断剂和/或第二药剂的量是治疗有效量。
[0309]
在一些实施方案中，igfbp7/cd93阻断剂的量是足以促进血管正常化(诸如增加血管长度、增加圆形血管数量、维持血管密度并且/或者增加周细胞和/或平滑肌细胞)、组织(诸如肿瘤组织)灌注的增加、缺氧的减少、递送到组织中的药物量的增加、组织中免疫细胞
浸润的增加和/或肿瘤细胞生长的抑制的量。
[0310]
在一些实施方案中，igfbp7/cd93阻断剂的量是足以在施用igfbp7/cd93阻断剂后使组织中血管的长度(例如，每个视野的总长度)增加至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％的量。在一些实施方案中，igfbp7/cd93阻断剂的量是足以在施用igfbp7/cd93阻断剂后使组织中的圆形血管百分比(圆形血管/总血管的百分比)增加至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％的量。在一些实施方案中，igfbp7/cd93阻断剂的量是足以在施用igfbp7/cd93阻断剂后维持组织中的血管密度的量。
[0311]
在一些实施方案中，igfbp7/cd93阻断剂的量是足以在施用igfbp7/cd93阻断剂后使组织中周细胞(例如，血管上的ng2阳性表达)增加至少约25％、50％、75％、100％、125％、150％、175％或200％的量。在一些实施方案中，igfbp7/cd93阻断剂的量是足以在施用igfbp7/cd93阻断剂后使组织中平滑肌细胞(例如，血管上的α-sma 表达)增加至少约25％、50％、75％、100％、125％、150％、175％、200％、225％或250％的量。在一些实施方案中，igfbp7/cd93阻断剂的量是足以在施用igfbp7/cd93阻断剂后使icam 表达增加至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％或70％的量。在一些实施方案中，igfbp7/cd93阻断剂的量是足以在施用igfbp7/cd93阻断剂后使激活的整联蛋白β1表达降低至少约10％、20％、30％、40％或50％的量。
[0312]
在一些实施方案中，igfbp7/cd93阻断剂的量是足以在施用igfbp7/cd93阻断剂后使组织中血管通透性或灌注增加至少约25％、50％、75％、100％、125％、150％、175％、200％、225％、250％、275％或300％的量。
[0313]
在一些实施方案中，igfbp7/cd93阻断剂的量是足以在施用igfbp7/cd93阻断剂后使组织中缺氧减少至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％的量。
[0314]
在一些实施方案中，igfbp7/cd93阻断剂的量是足以在施用igfbp7/cd93阻断剂后，在递送后使药物(诸如化学治疗药物)在组织中的存在/分布增加至少约25％、50％、75％、100％、125％、150％、175％、200％、225％、250％、275％或300％的量。
[0315]
在一些实施方案中，igfbp7/cd93阻断剂的量是足以在施用igfbp7/cd93阻断剂后使组织中免疫细胞浸润(诸如组织中免疫细胞的百分比)增加至少约25％、50％、75％、100％、125％、150％、175％、200％、225％、250％、275％或300％的量。在一些实施方案中，igfbp7/cd93阻断剂的量是足以在施用igfbp7/cd93阻断剂后使抑制性免疫细胞在组织中浸润的免疫细胞中的比例降低至少约10％、20％、30％、40％或50％的量。
[0316]
在一些实施方案中，igfbp7/cd93阻断剂的量是足以在施用igfbp7/cd93阻断剂后使组织中细胞(例如，肿瘤细胞)增殖减少至少约10％、20％、30％、40％、50％或60％的量。在一些实施方案中，igfbp7/cd93阻断剂的量是足以在施用igfbp7/cd93阻断剂后使组织中细胞(例如，肿瘤细胞)凋亡增加至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％的量。
[0317]
在一些实施方案中，igfbp7/cd93阻断剂的量是足以使肿瘤大小减小、癌细胞数量减少或肿瘤生长速率相较于治疗前同一受试者中的相应肿瘤大小、癌细胞数量或肿瘤生长率，或相较于未接受治疗的其它受试者中的相应活性，降低至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或100％中的任一个的量。
[0318]
在一些实施方案中，所述igfbp7/cd93阻断剂包括抗cd93抗体。在一些实施方案中，所述受试者是人，并且每次施用的抗cd93抗体的量相当于用于小鼠的约300μg的药剂量。在一些实施方案中，所述受试者是人，并且每次施用的抗cd93抗体的量不超过约2g(诸如约50-75mg)。在一些实施方案中，所述受试者是人，并且每次施用的抗cd93抗体的量不超过约30mg/kg(诸如约0.8mg/kg至约1.2mg/kg)。在一些实施方案中，所述受试者是人，并且每次施用的抗cd93抗体的量为30-45mg/m2。在一些实施方案中，所述受试者是人，并且每次施用的抗cd93抗体的量不超过约75mg(或约1.25mg/kg，或约45mg/m2)。
[0319]
在一些实施方案中，所述igfbp7/cd93阻断剂包含抗igfbp7抗体。在一些实施方案中，所述受试者是人，并且每次施用的抗igfbp7抗体的量相当于用于小鼠的约300μg的药剂量。在一些实施方案中，所述受试者是人，并且每次施用的抗igfbp7抗体的量不超过约2g(诸如约50-75mg)。在一些实施方案中，所述受试者是人，并且每次施用的抗igfbp7抗体的量不超过约30mg/kg(诸如约0.8mg/kg至约1.2mg/kg)。在一些实施方案中，所述受试者是人，并且每次施用的抗igfbp7抗体的量为30-45mg/m2。在一些实施方案中，所述受试者是人，并且每次施用的抗igfbp7抗体的量不超过约75mg(或约1.25mg/kg，或约45mg/m2)。
[0320]
在一些实施方案中，施用抗igfbp7抗体或抗cd93抗体，持续至少约1、3、7、10、12或14天的一段时间。在一些实施方案中，以至少约每周两次的频率施用所述抗igfbp7抗体或抗cd93抗体。
[0321]
在一些实施方案中，所述方法包括施用第二药剂，其中第二药剂是5-fu。在一些实施方案中，所述受试者是人，并且每次施用的5-fu抗体的量相当于用于小鼠的约3mg至约4mg的药剂量。
[0322]
在根据本文所述任一方法的一些实施方案中，通过静脉内、动脉内、腹膜内、囊内、皮下、鞘内、肺内、肌内、气管内、眼内、经皮、口服或通过吸入施用所述igfbp7/cd93阻断剂和/或第二药剂组合物。在一些实施方案中，静脉内施用所述igfbp7/cd93阻断剂和/或第二药剂。
[0323]
iii诊断和预后的方法
[0324]
本文提供的还包括对受试者进行诊断或预后的方法，其包括确定受试者对于第ii部分所述的治疗或不同疗法的适合性，确定受试者对第ii部分所述的方法或不同疗法的反应性的可能性，以及确定受试者组织中血管的成熟状态。
[0325]
在一些实施方案中，提供了确定受试者对于治疗的适合性的方法，其包括测量受试者组织中cd93表达的水平。在一些实施方案中，提供了确定受试者对于治疗的适合性的方法，其包括测量受试者组织中igfbp7表达的水平。在一些实施方案中，受试者患有癌症，并且所述组织是肿瘤组织。在一些实施方案中，治疗包括cd93/igfbp7阻断剂。在一些实施方案中，治疗包括癌症疗法(诸如细胞疗法，例如化学治疗剂)。在一些实施方案中，与参照水平相比，较高的cd93或igfbp7表达水平指示较低的治疗适合性。
[0326]
在一些实施方案中，提供了对患有癌症(诸如实体瘤)的受试者进行预后的方法，其包括体外或体内测量肿瘤样品中cd93的表达水平，其中与参照水平相比，较高的cd93表达水平表明对疗法无反应或反应差的可能性较高。在一些实施方案中，参照水平是受试者的非肿瘤样品或未患癌症的不同受试者(或受试者组)的相应组织中的cd93表达水平(诸如平均cd93表达)。
[0327]
在一些实施方案中，提供了对患有癌症(例如实体瘤)的受试者进行预后的方法，其包括体外或体内测量肿瘤样品中igfbp7的表达水平，其中与参照水平相比，较高的igfbp7表达水平表明对疗法无反应或反应差的可能性较高。在一些实施方案中，参照水平是受试者的非肿瘤样品或未患癌症的不同受试者(或受试者组)的相应组织中的igfbp7表达水平(诸如平均igfbp7表达)。
[0328]
在一些实施方案中，所述疗法包括细胞疗法。在一些实施方案中，所述疗法包括选自化学治疗剂(诸如抗代谢剂，诸如免疫检查点调节剂)、放射剂或免疫治疗剂的药剂。在一些实施方案中，所述药剂具有不超过1μm、0.5μm、0.2μm或0.1μm的大小。
[0329]
在一些实施方案中，提供了确定受试者组织(诸如癌组织)中血管成熟状态的方法，其包括施用包含用成像分子标记的抗cd93抗体的成像剂。在一些实施方案中，所述成像分子是放射性核素。
[0330]
在一些实施方案中，提供了确定受试者组织(诸如癌组织)中血管成熟状态的方法，其包括施用包含用成像分子标记的抗igfbp7抗体的成像剂。在一些实施方案中，所述成像分子是放射性核素。
[0331]
iv鉴定破坏cd93与igfbp7之间相互作用的药剂的方法
[0332]
本文所述的药剂可以通过评估剂破坏cd93与igfbp7之间相互作用的能力来鉴定。本文提供了鉴定用于治疗癌症或癌症治疗的一个或多个方面的药剂(诸如抗体、肽、多肽、肽类似物、融合肽、适体、avimer、anticalin、speigelmer和小分子化合物)的方法，所述方法包括但不限于：阻断异常肿瘤血管生成、使未成熟和渗漏的肿瘤血管正常化、促进肿瘤中的功能性血管网络、促进血管成熟、促进有利的肿瘤微环境、增加肿瘤中的免疫细胞浸润，增加肿瘤灌注，减少肿瘤中的增生，使肿瘤对第二疗法敏感，以及促进第二药剂的递送。所述方法通常包括确定候选药剂是否特异性破坏cd93/igfbp7相互作用，其中如果候选药剂显示出特异性破坏cd93/igfbp7相互作用，则该候选药剂可用于治疗癌症和癌症治疗的各个方面。
[0333]
所述药剂可以是针对以下物质的抗体、抗体样支架、小分子、融合蛋白、肽、模拟物或抑制性核苷酸(例如r，rnai)：(i)cd93；(ii)igfbp7；(iii)由cd93/igfbp7相互作用产生的新型位点(例如，新产生的表位决定簇),或(iv)包含任何上述物质的蛋白质复合物。
[0334]
因此，例如，在一些实施方案中，提供了确定候选药剂是否可用于治疗癌症的方法，其包括：确定候选药剂是否特异性破坏cd93/igfbp7相互作用，其中如果显示候选药剂特异性破坏cd93/igfbp相互作用，则该候选药剂可用于治疗癌症。在一些实施方案中，该方法还包括确定候选药剂是否特异性破坏cd93/mmrn2相互作用。在一些实施方案中，该方法还包括确定候选药剂是否相对于cd93/mmrn2优先破坏cd93/igfbp7的结合。在一些实施方案中，该方法还包括确定候选药剂是否特异性破坏igfbp7与igf-1、igf-2和/或igf1r之间的相互作用的结合。在一些实施方案中，该方法还包括确定候选药剂是否相对于igfbp7/igf-1、igfbp-7/igf-2和/或igfbp-7/igf1r优先破坏cd93/igfbp7的结合。
[0335]
在一些实施方案中，提供了筛选用于治疗癌症的药剂的方法，其包括：a)提供多种候选药剂；以及b)鉴定特异性破坏cd93/igfbp7相互作用的候选药剂，从而获得用于治疗癌症的药剂。
[0336]
在一些实施方案中，提供了鉴定特异性破坏cd93/igfbp7相互作用的药剂的方法，
其包括：a)将候选药剂与cd93/igfbp7复合物接触，以及b)评估候选药剂对cd93/igfbp7复合物的作用，从而鉴定特异性破坏cd93/igfbp7相互作用的药剂。在一些实施方案中，所述方法还包括提供cd93/igfbp7复合物。在一些实施方案中，所述方法还包括形成cd93/igfbp7复合物。在一些实施方案中，cd93/igfbp7复合物存在于细胞表面。在一些实施方案中，cd93/igfbp7复合物存在于体外系统中。
[0337]
在一些实施方案中，所述cd93/igfbp7复合物是非天然存在的。例如，所述复合物可以包含cd93的变体和/或igfbp7的变体。在一些实施方案中，所述变体cd93与igfbp7的结合亲和力高于野生型cd93与igfbp7的结合亲和力。在一些实施方案中，所述变体igfbp7与cd93的结合亲和力高于野生型igfbp7与cd93的结合亲和力。合适的cd93变体和igfbp7变体包括以上章节中描述的那些。在一些实施方案中，本技术还提供了非天然存在的cd93/igfbp复合物，其包含本文所述的任何cd93变体和/或igfbp7变体。这种复合物可用于鉴定破坏cd93与igfbp7相互作用的候选药剂。
[0338]
在一些实施方案中，提供了鉴定特异性破坏cd93/igfbp7相互作用的药剂的方法，其包括：a)将候选药剂与cd93接触，以及b)评估igfbp7与cd93之间的相互作用，其中与未与候选药剂接触的cd93相比，相互作用减小表明所述药剂特异性破坏cd93/igfbp7相互作用。在一些实施方案中，所述方法还包括提供cd93。在一些实施方案中，所述方法还包括提供igfbp7。合适的cd93包括野生型cd93及其变体。合适的igfbp7包括野生型igfbp93及其变体。本文描述的任何cd93变体和/或igfbp7变体可用于鉴定方法。
[0339]
在一些实施方案中，提供了鉴定特异性破坏cd93/igfbp7相互作用的药剂的方法，其包括：a)将候选药剂与igfbp7接触，以及b)评估igfbp7与cd93之间的相互作用，其中与未与候选药剂接触的igfbp7相比，相互作用减小表明所述药剂特异性破坏cd93/igfbp7相互作用。在一些实施方案中，所述方法还包括提供igfbp7。在一些实施方案中，所述方法还包括提供cd93。在一些实施方案中，所述方法还包括提供igfbp7。合适的cd93包括野生型cd93及其变体。合适的igfbp7包括野生型igfbp93及其变体。本文描述的任何cd93变体和/或igfbp7变体可用于鉴定方法。
[0340]
cd93/igfbp7结合活性和/或cd93/igfbp7途径活性的破坏可以通过pcr、taqman pcr、噬菌体展示系统、凝胶电泳、报告基因测定、酵母双杂交测定、northern或western分析、免疫组织化学、常规闪烁照相机、γ射线照相机、直线扫描仪、pet扫描仪、spect扫描仪、mri扫描仪、nmr扫描仪或x光机来测量。还可以通过使用选自标记置换、表面等离子体共振、荧光共振能量转移(fret)或生物发光共振能量转移(bret)、荧光猝灭和荧光偏振的方法来测量破坏。
[0341]
cd93/igfbp7结合活性和/或cd93/igfbp7途径活性的变化可以通过检测cd93与igfbp7之间相互作用的变化、通过检测cd93和/或igfbp7水平的变化或通过检测cd93/igfbp7途径中一种或多种蛋白质水平的变化来检测。其中可以检测到上述物质的细胞可以是肿瘤来源的，可以是培养的细胞，或者可以从转基因生物中获得或者可以在转基因生物中。此类转基因生物包括但不限于小鼠、大鼠、兔、绵羊、牛或灵长类动物。
[0342]
本技术的筛选测定可以包括适合化学文库高通量筛选的方法，使它们特别适合于鉴定小分子候选药剂。所述测定可以以多种形式进行，包括蛋白-蛋白结合测定、生化筛选测定、免疫测定和基于细胞的测定，所述测定都是本领域熟知的。对于体外筛选，可以通过
例如噬菌体展示、gst下拉、fret(荧光共振能量转移)或biacore(表面等离子共振；biacore ab,uppsala,sweden)分析来鉴定所述药剂。对于体内筛选，可以通过例如酵母双杂交分析、免疫共沉淀、免疫荧光共定位或fret来鉴定剂。
[0343]
对于涉及破坏cd93/igfbp7相互作用的筛选实验，可以在递增浓度的候选药剂存在或不存在的情况下，将表达cd93或igfbp7的细胞在分别具有标记的igfbp7或cd93的结合缓冲液中孵育。为了验证和校准测定，可以分别使用递增浓度的未标记的igfbp7或cd93进行对照竞争反应。孵育后，进行洗涤步骤以去除未结合的igfbp7或cd93。根据给定标记(例如，闪烁计数、荧光、抗体-染料等)的情况测量结合的、标记的cd93或igfbp7。在候选药剂存在的情况下结合的标记的cd93或igfbp7的量减少至少10％(例如，至少20％、30％、40％、50％或60％)表明候选药剂置换了结合。
[0344]
在一些实施方案中，如果候选药剂在1mm或更低的浓度下置换至少10％、20％、30％、40％、50％或优选60％、70％、80％、90％或更多的标记的cd93或igfbp7，则认为候选药剂在本文所述的这种或其它测定中特异性结合。当然，cd93和igfbp7的作用可以互换；本领域技术人员可以修改该方法，从而在各种浓度的候选药剂存在的情况下将cd93施加到igfbp7中，以确定cd93/igfbp7相互作用的破坏。
[0345]
cd93/igfbp7相互作用的破坏可以通过表面等离子共振(spr)来监测。表面等离子体共振测定可用作定量方法，以通过固定传感器附近的质量变化来测量两个分子之间的结合，所述质量变化由来自水相的igfbp7与固定在传感器上的cd93的结合或结合丧失引起(反之亦然)。在注射或去除igfbp7或候选药剂后，质量的这种变化以共振单位对比时间的形式进行测量，并使用biacore生物传感器(biacore ab)进行测量。可以根据salamon等人(salamon等人，1996,biophys j.71:283-294；salamon等人2001,biophys.j.80:1557-1567；salamon等人，1999,trends biochem.sci.24:213-219，其中每一篇都出于所有目的通过引用并入本文)描述的方法，将cd93固定在传感器芯片(例如，研究级cm5芯片；biacore ab)上。sarrio等人证明了spr可用于检测与固定在芯片上脂质层中的gpcr a(1)腺苷受体结合的配体(sarrio等人，2000,mol.cell.biol.20:5164-5174，出于所有目的通过引用并入本文)。spr分析中igfbp7与cd93结合的条件可由本领域技术人员使用sarrio等报道的条件作为起点进行微调。
[0346]
spr可以通过至少两种方式测定结合的抑制剂。首先，可以将igfbp7预先结合到固定的cd93上，然后注射浓度范围为0.1nm至1pm的候选药剂。可以定量结合的igfbp7的置换，从而允许检测抑制剂结合。或者，芯片结合的cd93可以用候选药剂预孵育并用igfbp7攻击。与未预先暴露于抑制剂的芯片相比，暴露于抑制剂的igfbp7与cd93结合的差异将证明在cd93存在的情况下igfbp7的结合或置换。在任一测定中，相对于在候选药剂不存在的情况下的结合的igfbp7的量，在候选药剂存在的情况下的结合的igfbp7的量减少10％(例如，20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％)或更多，表明候选药剂抑制cd93与igfbp7的相互作用。虽然cd93在上面是被固定的，但是技术人员可以容易地修改该方法，使得igfbp7为被固定的组分。
[0347]
检测抑制cd93/igfbp7相互作用的结合的药剂的另一种方法使用荧光共振能量转移(fret)。fret是量子力学现象，如果荧光供体(d)的发射光谱与荧光受体(a)的激发光谱重叠，所述量子力学现象会发生在相互靠近的荧光供体(d)与荧光受体(a)之间(通常间隔《
100埃)。待测分子，例如cd93和igfbp7，用互补的供体和受体荧光团对进行标记。虽然通过cd93/igfbp7相互作用紧密结合在一起，但是当cd93和igfbp7未结合时，供体荧光团激发时发射的荧光将具有与响应该激发波长而发射的荧光不同的波长，从而通过测量每个波长的发射强度来提供结合分子对比未结合分子的定量。用于标记cd93或igfbp7的供体荧光团是本领域公知的。实例包括称为青色fp(cfp，供体(d))和黄色fp(yfp，受体(a))的维多利亚曲霉(a.victoria)gfp的变体。
[0348]
在一些实施方案中，向标记的igfbp7和yfp-cd93的混合物中加入候选药剂将导致能量转移的抑制，这由例如相对于不含候选药剂的样品，yfp荧光减弱来证明。在使用fret检测cd93/igfbp7相互作用的测定中，相对于不含候选药剂的样品，含有候选药剂的样品中在受体波长处的荧光发射强度降低10％或更多(例如等于或大于20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％)，表明候选药剂抑制cd93/igfbp7相互作用。相反，相对于不含候选药剂的样品，含有候选药剂的样品中在受体波长处的荧光发射强度增加10％或更多(例如，等于或大于20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％)，表明候选药剂诱导构象变化并增强cd93/igfbp7相互作用。
[0349]
fret的变型使用荧光猝灭来监测分子相互作用。相互作用对中的一个分子可以用荧光团标记，另一个分子可以用当与所述荧光团紧密并置时猝灭所述荧光团荧光的分子标记。激发时荧光的变化表明用荧光团:猝灭剂对标记的分子的缔合的变化。通常，标记的cd93的荧光增加表明带有淬灭剂的igfbp7分子已被置换。当然，当igfbp7被荧光标记并且cd93带有猝灭剂时，也会出现类似的效果。对于淬灭测定，相对于不含候选药剂的样品，含有候选药剂的样品中荧光发的射强度增加10％或更多(例如，等于或大于20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％)，表明候选药剂抑制cd93/igfbp7相互作用。相反，相对于不含候选药剂的样品，含有候选药剂的样品中荧光发射的强度降低10％或更多(例如，等于或大于20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％)，表明候选药剂诱导构象变化并增强cd93/igfbp7相互作用。
[0350]
除了表面等离子共振和fret方法之外，荧光偏振测量对于定量结合也是有用的。荧光标记分子的荧光偏振值取决于旋转相关时间或翻转速率。复合物，诸如由cd93或igfbp7分别与荧光标记的igfbp7或cd93缔合形成的复合物，分别比未复合的、标记的igfbp7或cd93具有更高的偏振值。如果候选药剂破坏或抑制cd93/igfbp7的相互作用，则相对于不含候选药剂的混合物，包含cd93/igfbp7相互作用的候选药剂导致荧光偏振的降低。荧光偏振非常适合于鉴定破坏复合物形成的小分子。相对于缺乏候选药剂的样品中的荧光偏振，含有候选药剂的样品中的荧光偏振降低10％或更多(例如，等于或大于20％、30％、40％、50％、60％)，表明候选药剂抑制cd93/igfbp7相互作用。
[0351]
另一种检测系统是生物发光共振能量转移(bret),其使用包含生物发光萤光素酶的融合蛋白与荧光受体之间的光转移。一般来说，cd93/igfbp7相互作用对的一个分子与萤光素酶(例如海肾萤光素酶(rluc))融合，所述萤光素酶是在荧光素酶底物(例如deepbluec)存在的情况下发射波长为-395nm的光的供体。该对中的另一个分子与受体荧光蛋白融合，所述受体荧光蛋白可以吸收来自供体的光，并发射不同波长的光。荧光蛋白的实例是gfp(绿色荧光蛋白),其发射约5-10nm的光。向供体融合的igfbp7和受体融合的cd93的混合物中加入候选药剂(反之亦然)将导致能量转移的抑制，这通过例如相对于不含候选药
剂的样品，受体荧光的减少来证明。在使用bret检测cd93/igfbp7相互作用的测定中，相对于不含候选药剂的样品，含有候选药剂的样品中在受体波长下的荧光发射强度降低10％或更多(例如等于或大于20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％)，表明候选药剂抑制cd93/igfbp7相互作用。相反，相对于不含候选药剂的样品，在含有候选药剂的样品中，在受体波长下荧光发射强度增加10％或更多(例如等于或大于20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％)，表明候选药剂诱导构象变化并增强cd93/igfbp7相互作用。
[0352]
应当理解，本文所述的任何结合测定可以用除cd93和igfbp7之外的结合cd93或igfbp7的任何配体(例如激动剂、拮抗剂等)(例如，本文所述鉴定的小分子或cd93或igfbp7模拟物，包括但不限于天然或合成肽、多肽、抗体或其抗原结合片段、脂质、碳水化合物和小有机分子中的任一种)进行。
[0353]
所述的任何结合测定可用于确定样品(例如组织样品)中与cd93或igfbp7结合或者影响cd93和igfbp7的结合的抑制剂的存在。为此，在样品存在或不存在的情况下，使cd93与igfbp7反应，并根据所用的结合测定适当地测量结合。cd93/igfbp7结合减少10％或更多(例如，等于或大于20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％)表明样品含有阻断cd93/igfbp7相互作用的抑制剂。
[0354]
所述的任何结合测定也可用于确定化合物文库中抑制剂的存在。此类使用例如高通量筛选的筛选技术在本领域是公知的。
[0355]
本技术还提供了用于鉴定能够抑制cd93/igfbp7信号传导途径的药剂的方法，其中所述方法包括在所述药剂存在的情况下测量由cd93/igfbp7相互作用诱导的信号传导反应，并将其与在所述药剂不存在的情况下由cd93/igfbp7相互作用诱导的信号传导反应进行比较。在一些实施方案中，所述方法包括以下步骤：a)在允许cd93与igfbp7相互作用的条件下，在测试剂存在和不存在的情况下，使cd93与igfbp7接触；以及b)测量由cd93/igfbp7相互作用诱导的信号传导反应，其中与测试剂不存在的情况下的反应相比，在测试剂存在的情况下的反应变化至少约10％(诸如至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％)，表明测试剂被鉴定为能够抑制cd93/igfbp7相互作用。
[0356]
本技术提供了用于鉴定cd93或igfbp7模拟物的方法，所述模拟物在与igfbp7或cd93的相互作用中具有与cd93或igfbp7相同、相似或改善的功能效果，其中所述方法包括通过候选模拟物测量与igfbp7或cd93的相互作用。在一些实施方案中，所述方法包括：a)在允许模拟物与cd93或igfbp7相互作用的条件下，使cd93或igfbp7与候选模拟物接触；以及b)测量模拟物与cd93或igfbp7的相互作用，其中所述相互作用为对于cd93/igfbp7相互作用观察到的相互作用的至少约10％(诸如约20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％)将候选模拟物区分为本技术的cd93或igfbp7模拟物。
[0357]
此外，本技术还提供了用于鉴定cd93或igfbp7模拟物的方法，所述模拟物在分别与igfbp7或cd93相互作用中具有与cd93或igfbp7相同、相似或改善的功能效应，其中所述方法包括测量由cd93或igfbp7模拟物相互作用诱导的信号传导反应，并将其与由cd93/igfbp7相互作用诱导的信号传导反应进行比较。在一些实施方案中，所述方法包括：a)在允许模拟物与cd93或igfbp7相互作用的条件下，将cd93或igfbp7与候选模拟物接触；以及b)测量由cd93或igfbp7-模拟物相互作用诱导的信号传导反应，其中为对于cd93/igfbp7相互作用观察到的信号传导反应的至少约10％(诸如约20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％
或90％)的信号传导反应将候选模拟物区分为本技术的cd93或igfbp7模拟物。
[0358]
与cd93或igfbp7相互作用的模拟信号传导活性的测量可以通过本文所述的用于其它测定的方法(诸如spr和fret)进行。所述的任何结合测定可用于确定样品(例如，组织样品)中与cd93或igfbp7结合的模拟物的存在。为此，cd93或igfbp7在样品存在或不存在的情况下发生反应，并根据所用的测定测量信号传导。cd93或igfbp7的信号传导增加约10％或更多(例如，等于或大于约20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％)表明样品含有与cd93或igfbp7结合的模拟物。
[0359]
所述的任何信号传导测定也可用于确定化合物文库中模拟物的存在。此类使用例如高通量筛选的筛选技术在本领域是公知的。
[0360]
本技术的候选或测试化合物或药剂或被本技术采用的候选或测试化合物或药剂可以使用本领域已知的组合文库方法中的许多方法中的任一种获得，所述方法包括：生物文库；空间可寻址的平行固相或溶液相库；需要去卷积的合成库方法；“一珠一化合物”文库法；和使用亲和色谱选择的合成文库方法。生物文库方法限于肽文库，而其它四种方法适用于肽、非肽寡聚体或化合物的小分子文库(lam等人(1997)anticancer drug des.12:145，出于所有目的通过引以其整体并入)。
[0361]
分子文库的合成方法的实例可见于本领域中，例如见于dewitt等人(1993)proc.natl.acad.sci.u.s.a.90:6909；erb等人(1994)proc.natl.acad.sci.usa 91:11422；zuckermann等人(1994).j.med.chem.37:2678；cho等人(1993)science 261:1303；carrell等人(1994)angew.chem.int.ed.engl.33:2059；carell等人(1994)angew.chem.int.ed.engl.33:2061和gallop等人(1994)j.med.chem.37:1233(其每一篇均出于所有目的通过引用以其整体并入)中。化合物的文库可以存在于溶液中(例如，houghten(1992)biotechniques 13:412)，或存在于珠粒(lam(1991)nature 354:82)、芯片(fodor(1993)nature 364:555)、细菌(ladner,美国专利第5,223,409号)、孢子(ladner'409)、质粒(cull等人(1992)proc natl acad sci usa 89:1865)或噬菌体(scott和smith(1990)science 249:386)；(devlin(1990)science 249:404)；(cwirla等人(1990)proc.natl.acad.sci.87:6378)；(felici(1991)j.mol.biol.222:301)；(ladner，同上)上，所述文献中的每一篇均出于所有目的通过引用以其整体并入。
[0362]
在一些实施方案中，提供了基于细胞的测定法，其包括将表达cd93或igfbp7的细胞与候选或测试化合物或药剂接触，以及测定所述测试化合物抑制所述cd93或igfbp7活性的能力。确定测试化合物抑制cd93/igfbp7相互作用的能力可以例如通过确定候选或测试化合物或药剂抑制cd93/igfbp7相互作用的能力来实现。
[0363]
确定候选或测试化合物或药剂抑制cd93/igfbp7信号传导途径的能力可以通过确定直接结合来实现。这些测定可以例如通过将cd93或igfbp7与放射性同位素或酶标记耦接(使得可以通过检测复合物中的标记的蛋白质来确定蛋白质与候选或测试化合物或药剂)的结合来实现。例如，分子，例如蛋白质，可以用
125
i、
35
s、
14
c或3h直接或间接标记，并且通过直接计数放射性发射或通过闪烁计数来检测放射性同位素。或者，可以用例如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶或萤光素酶对分子进行酶促标记，并通过测定合适底物向产物的转化来检测酶促标记。
[0364]
确定候选或测试化合物或药剂抑制cd93/igfbp7相互作用而无需标记任何相互作
用物的能力也在本技术的范围内。例如，微生理计可用于检测测试化合物与cd93或igfbp7的相互作用，而无需标记任何相互作用物(mcconnell等人(1992)science 257:1906，出于所有目的通过引用以其整体并入)。如本文中所用，“微生理计”(例如，细胞传感器)是一种分析仪器，其使用光寻址电位传感器(laps)测量细胞酸化其环境的速率。这种酸化速率的变化可以用作化合物与受体之间相互作用的指标。
[0365]
在一些实施方案中，提供了无细胞测定法，其中将蛋白质或其生物活性部分与候选或测试化合物或药剂(例如，或测试其抑制cd93/igfbp7相互作用的能力的化合物)接触，并测定测试化合物与cd93或igfbp7或其生物活性部分结合的能力。测试化合物与cd93或igfbp7的结合可以如上所述直接或间接测定。
[0366]
这种确定可以使用诸如实时生物分子相互作用分析(bia)的技术来完成。sjolander等人，1991anal.chem.63:2338-2345和szabo等人，1995curr.opin.struct.biol.5:699-705，所述文献中的每一篇出于所有目的通过引用以其整体并入。如本文中所用，“bia”是用于实时研究生物特异性相互作用而无需标记任何相互作用物的技术(例如，blacore)。表面等离子体共振(spr)的光学现象的变化可以用作生物分子之间实时反应的指示。
[0367]
在本技术的上述测定方法的一些实施方案中，可能需要固定cd93或igfbp7，以促进蛋白质的复合形式与未复合形式的分离，以及适应测定的自动化。测试化合物与cd93或igfbp7的结合可以在任何适于容纳反应物的容器中实现。此类容器的实例包括微量滴定板、试管和微量离心管。在一些实施方案中，可以提供融合蛋白，其添加了允许该蛋白与基质结合的结构域。例如，可将谷胱甘肽-s-转移酶/激酶融合蛋白或谷胱甘肽-s-转移酶/靶融合蛋白吸附至谷胱甘肽琼脂糖珠(sigma chemical,st.louis,mo.)或谷胱甘肽衍生的微量滴定板，然后将它们与测试化合物或者测试化合物和未吸附的cd93或igfbp7结合，并将混合物在有助于复合物形成的条件下(例如，在盐和ph的生理条件下)进行孵育。孵育后，洗涤珠粒或微量滴定板孔以除去任何未结合的组分，在珠子的情况下固定的基质，直接或间接测定的复合物，例如，如上所述的。或者，可以将复合物从基质中分离出来，并用标准技术测定结合水平。
[0368]
用于将蛋白质固定在基质上的其它技术也可以用于本技术的筛选测定。例如，cd93或igfbp7可以利用生物素和链霉抗生物素蛋白的缀合来固定。可以使用本领域熟知的技术(例如，生物素化试剂盒，pierce chemicals,rockford,ill.)从生物素-nhs(n羟基琥珀酰亚胺)制备生物素化的cd93或igfbp7或靶分子，并将其固定在链霉抗生物素蛋白包被的96孔板(pierce chemical)的孔中。或者，可将与cd93或igfbp7或靶分子反应的抗体衍生到板的孔中，通过抗体缀合将未结合的cd93或igfbp7捕获在孔中。除了上述用于gst固定化复合物的检测方法外，检测此类复合物的方法还包括使用与cd93或igfbp7或靶分子反应的抗体免疫检测复合物。
[0369]
在一些实施方案中，cd93或igfbp7可在双杂交测定或三杂交测定中用作“诱饵蛋白”(参见例如美国专利第5,283,317号；zervos等人，1993cell 72:223-232；madura等人，1993j.biol.chem.268:12046-12054；bartel等人，1993biotechniques14:920-924；iwabuchi等人，1993oncogene 8:1693-1696和brent w094/10300)(所述文献中的每一篇出于所有目的通过通过引用以其整体并入)以鉴定与cd93或igfbp7结合的其它蛋白质。
[0370]
双杂交系统基于大多数转录因子的模块性质，其由可分离的dna结合和激活结构域组成。简言之，该测定利用了两种不同的dna构建体。在一个构建体中，编码cd93或igfbp7的基因与编码已知转录因子(例如gal-4)的dna结合结构域的基因融合。在另一种构建体中，来自dna序列文库的编码未鉴定蛋白质(“猎物”或“样品”)的dna序列与编码已知转录因子的激活结构域的基因融合。如果“诱饵”和“猎物”蛋白质能够在体内相互作用，形成激酶依赖性复合物，则转录因子的dna结合和活化域被带到紧密接近的位置。这种接近允许报道基因(例如lacz)的转录，所述报道基因与对转录因子起反应的转录调节位点可操作地连接。可以检测报道基因的表达，可以分离含有功能性转录因子的细胞集落，并用于获得编码与cd93或igfbp7相互作用的蛋白质的克隆基因。
[0371]
应当理解，本文所述的蛋白质-蛋白质相互作用测定也可用于确定剂是否阻断cd93或igfbp7与其它结合配偶体之间的相互作用，例如cd93与mmnr2之间的相互作用以及igfbp7与igf-1、igf-2或igf1r之间的相互作用。
[0372]
还提供了通过本文描述的任何方法鉴定的药剂。因此，在合适的动物模型中进一步使用如本文所述鉴定的药剂也在本技术的范围内。例如，如本文所述鉴定的药剂(例如，能够阻断cd93/igfbp7相互作用的药剂)可用于动物模型中，以确定利用这种剂的治疗的功效、毒性或副作用。或者，如本文所述鉴定的药剂可用于动物模型中，以确定这种剂的作用机制。此外，本技术涉及通过上述筛选测定鉴定的新型药剂用于本文所述治疗的用途。
[0373]
v.制备方法、核酸、载体、宿主细胞和培养基
[0374]
在一些实施方案中，提供了制备cd93/igfbp7阻断剂(诸如本文所述的抗cd93抗体、抗igfbp7抗体、抑制性cd93多肽、抑制性igfbp7多肽)和组合物的方法，所述组合物包含所述药剂、核酸构建体、载体、宿主细胞或在制备所述药剂期间产生的培养基。
[0375]
多肽的表达和生产
[0376]
本文所述的多肽(例如，抗cd93或抗igfbp7抗体，例如，抑制性cd93或igfbp7多肽)可使用本领域任何已知方法(包括下文和实施例中所述的方法)制备。
[0377]
单克隆抗体
[0378]
除了可能以微量存在的可能的天然存在的突变和/或翻译后修饰(例如，异构化、酰胺化)之外，包含群体的主题抗体是相同的。因此，修饰词“单克隆”表示抗体的特征不是离散抗体的混合物。例如，单克隆抗体可以使用由kohler等人，nature,256:495(1975)首次描述的杂交瘤方法制备，或者可以通过重组dna方法(美国专利第4,816,567号)制备。在杂交瘤方法中，如上所述免疫小鼠或其它合适的宿主动物，诸如仓鼠或美洲驼，以诱导产生或能够产生特异性结合用于免疫的蛋白质的抗体的淋巴细胞。或者，可以在体外免疫淋巴细胞。然后使用合适的融合剂诸如聚乙二醇将淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合，形成杂交瘤细胞(goding，monoclonal antibodies:principles and practice，第59-103页(academic press,1986)。
[0379]
免疫剂通常包括抗原性蛋白质或其融合变体。通常，如果需要人来源的细胞，可以使用外周血淋巴细胞(“pbl”)，如果需要非人哺乳动物来源的细胞，可以使用脾细胞或淋巴结细胞。然后用合适的融合剂诸如聚乙二醇将淋巴细胞与永生化细胞系融合，形成杂交瘤细胞。goding,monoclonal antibodies:principles and practice,academic press(1986)，第59-103页，出于所有目的通过引用以其整体并入。
[0380]
永生化细胞系通常是转化的哺乳动物细胞，特别是啮齿动物、牛和人来源的骨髓瘤细胞。通常，使用大鼠或小鼠骨髓瘤细胞系。在合适的培养基中接种并生长如此制备的杂交瘤细胞，所述培养基优选含有一种或多种抑制未融合的亲代骨髓瘤细胞生长或存活的物质。例如，如果亲代骨髓瘤细胞缺乏次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(hgprt或hprt)，则杂交瘤的培养基通常包含次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸苷(hat培养基)，它们是阻止hgprt缺陷型细胞生长的物质。
[0381]
优选的永生化骨髓瘤细胞是那些高效融合、支持所选抗体产生细胞稳定高水平产生抗体、并且对诸如hat培养基等培养基敏感的细胞。其中，优选的是鼠骨髓瘤细胞系，诸如可从san diego,calif.usa的索尔克研究所细胞分配中心获得的源自mopc-21和mpc-11小鼠肿瘤的细胞系，以及可从manassas,va.usa的美国典型培养物保藏中心获得的sp-2细胞(及其衍生物，例如x63-ag8-653)。人骨髓瘤和小鼠-人异源骨髓瘤细胞系也被描述用于产生人单克隆抗体(kozbor,j.immunol.,133:3001(1984)；brodeur等人，monoclonal antibody production techniques and applications，第51-63页(marcel dekker,inc.,new york,1987，所述文献中的每一篇出于所有目通过引用以其整体并入)。
[0382]
测定杂交瘤细胞生长的培养基中针对抗原的单克隆抗体的产生。优选地，由杂交瘤细胞产生的单克隆抗体的结合特异性通过免疫沉淀或通过体外结合测定诸如放射免疫测定(ria)或酶联免疫吸附测定(elisa)来确定。
[0383]
可以测定培养杂交瘤细胞的培养基中针对所需抗原的单克隆抗体的存在。优选地，单克隆抗体的结合亲和力和特异性可以通过免疫沉淀或通过体外结合测定诸如放射免疫测定(ria)或酶联测定(elisa)来确定。此类技术和测定是本领域已知的。例如，结合亲和力可以通过munson等人，anal.biochem.,107:220(1980)的的scatchard分析来测定。
[0384]
在鉴定出产生具有所需特异性、亲和力和/或活性的抗体的杂交瘤细胞后，可以通过有限稀释方法亚克所述隆克隆，并通过标准方法(goding，同上)培养所述克隆。用于此目的合适的培养基包括，例如，d-mem或rpmi-1640培养基。此外，杂交瘤细胞可以在哺乳动物体内生长为肿瘤。
[0385]
通过常规的免疫球蛋白纯化方法，例如蛋白a-sepharose、羟磷灰石色谱、凝胶电泳、透析或亲和色谱，将亚克隆分泌的单克隆抗体从培养基、腹水或血清中适当地分离出来。
[0386]
还可以通过重组dna方法，诸如美国专利第4,816,567号中所述的那些方法以及如上所述制备单克隆抗体。编码单克隆抗体的dna可使用常规方法(例如，通过使用能与编码鼠抗体重链和轻链的基因够特异性结合的寡核苷酸探针)容易地分离并进行测序。杂交瘤细胞用作这种dna的优选来源。一旦分离，可将dna置于表达载体中，然后将其转染入原本不产生免疫球蛋白的宿主细胞，如大肠杆菌(e.coli)细胞、猿猴cos细胞、中国仓鼠卵巢(cho)细胞或骨髓瘤细胞，以便在此类重组宿主细胞中合成单克隆抗体。关于编码抗体的dna在细菌中重组表达的综述论文包括skerra等，curr.opinion in immunol.,5:256-262(1993)和pl
ü
ckthun,immunol.revs.130:151-188(1992)。
[0387]
在又一实施方案中，可以从使用mccafferty等人，nature,348:552-554(1990)中描述的技术产生的抗体噬菌体文库中分离抗体。clackson等人，nature,352:624-628(1991)和marks等人，j.mol.biol.,222:581-597(1991)(所述文献的每一篇出于所有目的
通过引用以其整体并入)分别描述了使用噬菌体文库分离鼠抗体和人抗体。随后的出版物描述了通过链改组(marks等人，bio/technology,10:779-783(1992))以及组合感染和体内重组作为构建非常大的噬菌体文库的策略(waterhouse等，nucl.acids res.,21:2265-2266(1993))进行的高亲和力(nm范围)的人抗体的产生。因此，这些技术是分离单克隆抗体的常规单克隆抗体杂交瘤技术的可行替代方法。
[0388]
还可例如通过用人重链和轻链恒定结构域的编码序列取代同源鼠序列(美国专利第4816567号；morrison等人，proc.natl acad.sci.usa，81:6851(1984))，或者通过将非免疫球蛋白多肽的全部或部分编码序列共价连接至免疫球蛋白编码序列对dna进行修饰。通常，用此类非免疫球蛋白多肽替代抗体的恒定结构域，或者用它们替代抗体的一个抗原组合位点的可变结构域，以产生嵌合的二价抗体，所述二价抗体包含一种对抗原具有特异性的抗原组合位点和另一个对不同抗原具有特异性的抗原组合位点。
[0389]
本文所述的单克隆抗体可以是单价的，其制备是本领域公知的。例如，一种方法涉及免疫球蛋白轻链和经修饰的重链的重组表达。重链通常在fc区的任何点被截短，以防止重链交联。或者，相关的半胱氨酸残基可以被另一种氨基酸残基取代或者被删除，以防止交联。体外方法也适用于制备单价抗体。消化抗体以产生其片段，特别是fab片段，可以使用本领域已知的常规技术来完成。
[0390]
嵌合或杂合抗体也可以使用合成蛋白质化学中的已知方法(包括那些涉及交联剂的方法)在体外制备。例如，可以使用二硫键交换反应或通过形成硫醚键来构建免疫毒素。用于此目的的合适试剂的实例包括亚氨基硫醇盐和4-巯基丁酰亚胺酸甲酯。
[0391]
编码多肽的核酸分子
[0392]
在一些实施方案中，提供了编码本文所述的任一种抗体(诸如抗cd93抗体或抗igfbp7抗体)或多肽(诸如抑制性cd93或igfbp7多肽)的多核苷酸。在一些实施方案中，提供了使用本文所述的任一种方法制备的多核苷酸。在一些实施方案中，核酸分子包含编码抗体(例如，抗cd93抗体或抗igfbp7抗体)的重链或轻链的多核苷酸。在一些实施方案中，核酸分子包含编码抑制性cd93多肽或抑制性igfbp7多肽的多核苷酸。在一些实施方案中，核酸分子包含编码抗体(例如，抗cd93抗体或抗igfbp7抗体)的重链的多核苷酸和编码抗体的轻链的多核苷酸。在一些实施方案中，第一核酸分子包含编码重链的第一多核苷酸，第二核酸分子包含编码轻链的第二多核苷酸。在一些实施方案中，提供了编码scfv(例如，抗cd93抗体或抗igfbp7 scfv)的核酸分子。在一些实施方案中，核酸分子包含编码抑制性cd93多肽或抑制性igfbp7多肽的多核苷酸。
[0393]
在一些此类实施方案中，抗体(例如，抗cd93抗体或抗igfbp7抗体)的重链和轻链由一个核酸分子表达，或由两个独立的核酸分子表达，表达为两个独立的多肽。在一些实施方案中，诸如当抗体是scfv时，单个多核苷酸编码包含连接在一起的重链和轻链的单个多肽。
[0394]
在一些实施方案中，编码抗体(例如，抗cd93抗体或抗igfbp7抗体)的重链或轻链的多核苷酸包含编码前导序列的核苷酸序列，所述前导序列在翻译时位于重链或轻链的n末端。如上所述，前导序列可以是天然重链或轻链前导序列，或者可以是另一种异源前导序列。
[0395]
在一些实施方案中，多核苷酸是dna。在一些实施方案中，多核苷酸是rna。在一些
实施方案中，rna是mrna。
[0396]
可以使用本领域常规的重组dna技术构建核酸分子。在一些实施方案中，核酸分子是适合在选定的宿主细胞中表达的表达载体。
[0397]
核酸构建体
[0398]
在一些实施方案中，提供了包含本文所述的任一种多核苷酸的核酸构建体。在一些实施方案中，提供了使用本文描述的任何方法制备的核酸构建体。
[0399]
在一些实施方案中，核酸构建体还包含与多核苷酸可操作连接的启动子。在一些实施方案中，多核苷酸对应于基因，其中启动子是该基因的野生型启动子。
[0400]
载体
[0401]
术语“载体”、“克隆载体”和“表达载体”意指可籍以将dna或rna序列(例如，外源基因)引入宿主细胞，从而对宿主进行遗传修饰并促进引入序列的表达(例如，转录和翻译)的媒介物。载体包括质粒、合成的rna和dna分子、噬菌体、病毒等。在某些实施方案中，载体是病毒载体，诸如但不限于，病毒载体是腺病毒、腺相关病毒、甲病毒、疱疹病毒、慢病毒、逆转录病毒或痘苗病毒载体。
[0402]
在一些实施方案中，提供了包含编码本文所述任一种抗体(例如，抗cd93或抗igfbp7抗体)的重链和/或轻链的任何多核苷酸的载体。在一些实施方案中，提供了包含编码本文所述的多肽(例如，抑制性cd93或igfbp7多肽)的任何多核苷酸的载体。在一些实施方案中，提供了包含本文描述的任何核酸构建体的载体。在一些实施方案中，提供了使用本文描述的任何方法制备的载体。还提供了包含编码任何多肽(诸如抗cd93或抗igfbp7抗体或抑制性cd93或igfbp7多肽)的多核苷酸的载体。此类载体包括但不限于dna载体、噬菌体载体、病毒载体、逆转录病毒载体等。在一些实施方案中，载体包含编码重链的第一多核苷酸序列和编码轻链的第二多核苷酸序列。在一些实施方案中，所述重链和轻链由载体表达为两种独立的多肽。
[0403]
在一些实施方案中，第一载体包含编码抗体(例如，抗cd93抗体或抗igfbp7抗体)的重链的多核苷酸，第二载体包含编码抗体(例如，抗cd93抗体或抗igfbp7抗体)的轻链的多核苷酸。在一些实施方案中，将第一载体和第二载体以相似的量(诸如相似的摩尔量或相似的质量量)转染到宿主细胞中。在一些实施方案中，将摩尔比或质量比在5∶1与1∶5之间的第一载体和第二载体转染到宿主细胞中。在一些实施方案中，以1∶1与1∶5之间的质量比使用编码重链的载体和编码轻链的载体。在一些实施方案中，以1∶2的质量比使用编码重链的载体和编码轻链的载体。
[0404]
在一些实施方案中，选择被优化用于在cho或cho衍生细胞或nso细胞中表达多肽的载体。示例性的此类载体描述于例如running deer等人，biotechnol.prog.20:880-889(2004)。
[0405]
在某些实施方案中，所述载体是病毒载体。在某些实施方案中，所述病毒载体可以是但不限于逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体、甲病毒载体、疱疹病毒载体和痘苗病毒载体。在一些实施方案中，所述病毒载体是慢病毒载体。
[0406]
在一些实施方案中，所述载体是非病毒载体。所述病毒载体可以是质粒或转座子(诸如piggybac-转座子或sleeping beauty转座子)。
[0407]
宿主细胞
[0408]
在一些实施方案中，提供了包含本文所述的任何多肽、核酸构建体和/或载体的宿主细胞。在一些实施方案中，提供了使用本文描述的任何方法制备的宿主细胞。在一些实施方案中，所述宿主细胞能够在发酵条件下产生本文所述的任何多肽(诸如抗体或抑制性多肽)。
[0409]
在一些实施方案中，本文描述的多肽(例如，抗cd93抗体或抗igfbp7抗体或抑制性cd93或igfbp7多肽)可在原核细胞(诸如细菌细胞)、或真核细胞(诸如真菌细胞(诸如酵母))、植物细胞、昆虫细胞和哺乳动物细胞中表达。这种表达可以例如根据本领域已知的方法进行。可用于表达多肽的示例性真核细胞包括但不限于cos细胞，包括cos 7细胞；293细胞，包括293-6e细胞；cho细胞，包括cho-s、dg44。lec13 cho细胞和fut8 cho细胞；per.细胞(crucell)和nso细胞。在一些实施方案中，本文描述的多肽(例如，抗cd93抗体或抗igfbp7抗体或抑制性cd93或igfbp7多肽)可在酵母中表达。参见例如美国公布第us 2006/0270045 a1号。在一些实施方案中，基于其对所需抗体的重链和/或轻链进行所需翻译后修饰的能力来选择特定的真核宿主细胞。例如，在一些实施方案中，cho细胞产生的多肽比293细胞中产生的相同多肽具有更高的唾液酸化水平。
[0410]
可通过任何方法将一种或多种核酸引入所需的宿主细胞，所述方法包括但不限于磷酸钙转染、deae-葡聚糖介导的转染、阳离子脂质介导的转染、电穿孔、转导、感染等。非限制性示例性方法描述于例如sambrook等人，molecular cloning,a laboratory manual，第3版cold spring harbor laboratory press(2001)(出于所有目的通过引用将以其整体并入)中。根据任何合适的方法，可将核酸瞬时或稳定地转染到所需的宿主细胞中。
[0411]
本发明还提供了包含本文描述的任何多核苷酸或载体的宿主细胞。在一些实施方案中，本发明提供了包含抗cd93抗体或抗igfbp7抗体的宿主细胞。任何能够过表达异源dna的宿主细胞都可以用于分离编码目标抗体、多肽或蛋白质的基因。哺乳动物宿主细胞的非限制性实例包括但不限于cos、hela和cho细胞。也参见pct公布第wo 87/04462号。合适的非哺乳动物宿主细胞包括原核生物(诸如大肠杆菌或枯草芽孢杆菌(b.subtillis))和酵母(诸如酿酒酵母、粟酒裂殖酵母；或乳酸克雷伯氏菌)。
[0412]
在一些实施方案中，在无细胞系统中产生多肽。非限制性示例性无细胞系统描述于例如sitaraman等人，methods mol.biol.498:229-44(2009)；spirin,trends biotechnol.22:538-45(2004)；endo等人，biotechnol.adv.21:695-713(2003)中。
[0413]
培养基
[0414]
在一些实施方案中，提供了包含本文所述的任何多肽、多核苷酸、核酸构建体、载体和/或宿主细胞的培养基。在一些实施方案中，提供了使用本文描述的任何方法制备的培养基。
[0415]
在一些实施方案中，培养基包含次黄嘌呤、氨基蝶呤和/或胸苷(例如，hat培养基)。在一些实施方案中，培养基不包含血清。在一些实施方案中，培养基包含血清。在一些实施方案中，培养基是d-mem或rpmi-1640培养基。
[0416]
多肽的纯化
[0417]
多肽(例如，抗cd93抗体或抗igfbp7抗体，例如，抑制性cd93或igfbp7多肽)可通过任何合适的方法纯化。此类方法包括但不限于使用亲和基质或疏水相互作用色谱。合适的亲和配体包括ror1 ecd和结合抗体恒定区的配体。在一些实施方案中，蛋白a、蛋白g、蛋白
a/g或抗体亲和柱可用于结合恒定区并纯化包含fc片段的抗体。疏水相互作用层析，例如丁基或苯基柱，也适用于纯化某些多肽，诸如抗体。离子交换色谱(例如阴离子交换色谱和/或阳离子交换色谱)也适用于纯化某些多肽，诸如抗体。混合模式色谱(例如反相/阴离子交换、反相/阳离子交换、亲水相互作用/阴离子交换、亲水相互作用/阳离子交换等)也可适用于纯化某些多肽，诸如抗体。本领域已知许多纯化多肽的方法
[0418]
vi.组合物、试剂盒和制品
[0419]
本技术还提供了用于本文所述任何方法的组合物、试剂盒、药物和单位剂型。
[0420]
组合物
[0421]
本文所述的任何cd93/igfbp7阻断剂可以存在于包含其它剂、赋形剂或稳定剂的组合物(诸如制剂)中。
[0422]
在一些实施方案中，组合物还包含促进cd93/igfbp7阻断剂递送至肿瘤组织或与异常血管或缺氧相关的组织的靶向剂或运载体。示例性运载体包括脂质体、胶束、纳米分散白蛋白及其修饰物、聚合物纳米颗粒、树枝状聚合物、不同组成的无机纳米颗粒。
[0423]
在一些实施方案中，所述组合物适于向人施用。在一些实施方案中，所述组合物适于向哺乳动物施用，诸如在兽医方面，向家养宠物和农业动物施用。包含cd93/igfbp7阻断剂的组合物有多种合适的制剂。下面的制剂和方法仅仅是示例性的，决不是限制性的。适于口服施用的制剂可以由以下组成：(a)液体溶液，诸如有效量的溶解在稀释剂诸如水、盐水或橙汁中的化合物，(b)胶囊、囊剂或片剂，各自含有预定量的固体或颗粒形式的活性成分，(c)在合适液体中的混悬液，和(d)合适的乳剂。片剂形式可以包括乳糖、甘露醇、玉米淀粉、马铃薯淀粉、微晶纤维素、阿拉伯胶、明胶、胶体二氧化硅、交联羧甲基纤维素钠、滑石、硬脂酸镁、硬脂酸和其它赋形剂、着色剂、稀释剂、缓冲剂、润湿剂、防腐剂、调味剂和药理学上相容的赋形剂中的一种或多种。锭剂形式可在调味剂(通常为蔗糖和阿拉伯胶或黄蓍胶)中包含活性成分，而糖果锭剂在惰性基质(例如明胶和甘油，或蔗糖和阿拉伯胶、乳剂、凝胶等)中包含活性成分，除了活性成分以外，还包含诸如本领域已知的赋形剂。
[0424]
合适的载体、赋形剂和稀释剂的实例包括但不限于乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、淀粉、阿拉伯树胶、磷酸钙、藻酸盐、黄蓍胶、明胶、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水、盐溶液、糖浆、甲基纤维素、羟基苯甲酸甲酯和羟基苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸镁和矿物油。在一些实施方案中，本文所述的包含cd93/igfbp7阻断剂和运载体的组合物以无水制剂(诸如冻干组合物)的形式存在。所述制剂还可以包含润滑剂、湿润剂、乳化剂和助悬剂、防腐剂、甜味剂或调味剂。
[0425]
适于肠胃外施用的制剂包括含水和非含水等渗无菌注射溶液，其可包含抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂和使制剂与预期受者的血液相容的溶质，以及含水和非水无菌混悬液，其可包含助悬剂、增溶剂、增稠剂、稳定剂和防腐剂。所述制剂可以存在于单位剂量或多剂量密封容器(诸如安瓿和小瓶)中，并且可以在冷冻干燥(冻干)条件下储存，仅需要在即将使用时加入无菌液体赋形剂，例如注射用水。临时注射液和混悬液可以由上述种类的无菌粉末、颗粒和片剂制备。注射制剂是优选的。
[0426]
在一些实施方案中，组合物被配制成具有约4.5至约9.0的ph范围，包括例如约5.0至约8.0、约6.5至约7.5以及约6.5至约7.0中的任一种的ph范围。在一些实施方案中，组合物的ph被配制成不小于约6，包括例如不小于约6.5、7或8中的任一个(诸如约8)。通过加入
合适的张力调节剂，诸如甘油，也可以使组合物与血液等渗。
[0427]
试剂盒
[0428]
本文提供的试剂盒包括一个或多个包含cd93/igfbp7阻断剂或药物组合物的容器，并且在一些实施方案中，还包括根据本文所述的任何方法使用的说明书，所述药物组合物包含本文所述的cd93/igbp7阻断剂和/或一种或多种其它剂。所述试剂盒还可包括选择适合治疗的受试者的说明。本发明试剂盒中提供的说明书通常是标签或包装插页(例如，试剂盒中包含的纸片)上的书面说明书，但机器可读说明书(例如，磁或光存储盘上携带的说明书)也是可接受的。
[0429]
在一些实施方案中，所述试剂盒包括a)包含含有抗cd93抗体的cd93/igfbp7阻断剂或其药学上可接受的盐和药学上可接受的运载体的组合物；和任选的b)用于施用cd93/igfbp7阻断剂以治疗疾病或疾患的说明书。在一些实施方案中，所述试剂盒包括a)包含含有抗igfbp7抗体的cd93/igfbp7阻断剂或其药学上可接受的盐和药学上可接受的运载体的组合物；和任选的b)用于施用cd93/igfbp7阻断剂以治疗疾病或疾患的说明书。在一些实施方案中，所述试剂盒包括a)包含含有抑制性cd93多肽的cd93/igfbp7阻断剂或其药学上可接受的盐和药学上可接受的运载体的组合物；和任选的b)用于施用cd93/igfbp7阻断剂以治疗疾病或疾患的说明书。在一些实施方案中，所述试剂盒包括a)包含含有抑制性igfbp7多肽的cd93/igfbp7阻断剂或其药学上可接受的盐和药学上可接受的运载体的组合物；和任选的b)用于施用cd93/igfbp7阻断剂以治疗疾病或疾患的说明书。
[0430]
本发明的试剂盒在合适的包装中。合适的包装包括但不限于小瓶、瓶子、广口瓶、软包装(例如，密封的聚酯薄膜或塑料袋)等。试剂盒可以任选地提供附加的组分，诸如缓冲液和解释信息。因此，本技术还提供了制品，其包括小瓶(诸如密封小瓶)、瓶子、广口瓶、软包装等。
[0431]
在一些实施方案中，所述试剂盒包括一种或多种有助于向受试者递送cd93/igfbp7阻断剂、或包含该药剂的组合物、和/或附加的治疗剂的组分。在一些实施方案中，所述试剂盒包括例如适于向受试者递送细胞的注射器和针头等。在此类实施方案中，cd93/igfbp7阻断剂或包含该药剂的组合物可在试剂盒中包含在袋中或一个或多个小瓶中。在一些实施方案中，所述试剂盒包含促进向受试者静脉内或动脉内递送cd93/igfbp7阻断剂或包含该药剂的组合物的组分。在一些实施方案中，cd93/igfbp7阻断剂或包含该药剂的组合物可以包含在例如瓶子或袋(例如，能够包含高达约1.5l含有细胞的溶液的血袋或类似袋)中，并且所述试剂盒还包括适于将cd93/igfbp7封闭剂或含有该药剂的组合物递送至受试者的管和针。
[0432]
关于组合物使用的说明书通常包括关于剂量、给药方案和用于预期治疗的施用途径的信息。容器可以是单位剂量、散装包装(例如多剂量包装)或亚单位剂量。例如，可以提供试剂盒，其包含足够剂量的本文公开的锌，以在延长的时期(诸如1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、2周、3周、4周、6周、8周、3个月、4个月、5个月、7个月、8个月、9个月或更长时间)内为受试者提供有效治疗。试剂盒还可包括多个单位剂量的药物组合物和使用说明，并以足以在药房例如医院药房和配制药房中储存和使用的量包装。
[0433]
实施例
[0434]
以下实施例旨在纯粹作为应用的示例，因此不应被认为以任何方式限制本发明。以下实施例和详细描述是以举例说明的方式而非限制的方式提供的。
[0435]
实施例1
[0436]
为了鉴定可能负责vegf抑制剂诱导的血管正常化的新靶点，从四份最近发表的rna-seq数据集研究了在体内vegf抑制剂处理下肿瘤ec中的基因表达谱(28-31)。三个数据库来自用vegf抑制剂处理的异种移植肿瘤模型，一个来自人神经内分泌肿瘤。分选出在多个数据集之间一致地减少的具有＜-0.5的截断log2倍数变化的基因。鉴定了在至少三个数据集中其表达被vegf抑制剂显著降低了11个基因(图1a)。其中大部分是跨膜蛋白或细胞外基质蛋白(见表2)。选择在肿瘤ec中被上调的五个候选基因，使用新鲜分离的来自血管的人内皮细胞(huvec)在成管测定中测试它们的功能。其中，cd93基因的敲除导致huvec细胞中小管形成的显著减少(图1b)。
[0437]
表2.
[0438]
[0439][0440]
对胰腺癌的癌症基因组图谱(“tcga”)数据库的分析显示，胰腺导管腺癌(pda)中的cd93转录显著高于正常胰腺中的cd93转录(图1c)。此外，cd93蛋白在pda和胰腺神经内分泌肿瘤(pnet)(胰腺中的两种主要肿瘤类型)内的血管上被明显上调(图1d)。
[0441]
还评估了小鼠正常组织和肿瘤中的cd93表达。新鲜分离的主动脉内皮细胞(maec)表达可忽略不计的cd93，但通过与vegf一起孵育可以上调cd93，证实vegf信号传导直接调节cd93表达(图1e)。在小鼠正常胰腺和皮肤中，血管表达非常低水平的cd93，如通过cd93和cd31的共免疫荧光染色所揭示的。有趣的是，cd93在肿瘤血管中的表达在原位kpc模型和b16黑色素瘤模型中显著增加(图1f和图1g)。这些结果表明，cd93在肿瘤脉管系统中被选择性上调，这可能是由于暴露于肿瘤微环境(“tme”)中的vegf。
[0442]
实施例2
[0443]
为了评估cd93在体内的可能作用，通过用小鼠cd93融合蛋白免疫大鼠产生了对小鼠cd93特异的mab(克隆7c10，大鼠igg)。用源自kpc转基因小鼠的kpc肿瘤细胞系植入c57bl/6小鼠(36)。当肿瘤变得可触知时，用7c10处理小鼠，每周两次，持续两周。单独的7c10能够使kpc肿瘤生长减缓约60％(图2a)。肿瘤组织的if染色在7c10处理后没有显示cd31 微血管密度的明显变化。然而，血管长度显著增加超过1.8倍，并且在用7c10治疗的肿瘤中，圆形血管的百分比增加了3倍(图2b)。此外，治疗后，基于ng2和cd31的共染色，周细胞覆盖的血管比对照组增加了约3.5倍(图2c)。与这一观察结果一致，在7c10处理的肿瘤中，与血管相关的α平滑肌肌动蛋白(α-sma)阳性细胞的数量超过两倍(图2d)。
[0444]
为了确定肿瘤脉管系统的结构变化是否可以转化为功能改善，检查了响应cd93阻断的肿瘤血管灌注。正在接受一周抗体治疗的上述荷瘤小鼠在处死前静脉内(i.v.)注射凝
集素-fitc。发现在对照肿瘤中，位于肿瘤边缘的少数血管是fitc阳性的，而在用7c10处理的肿瘤中，肿瘤中心和边缘的大多数血管都被fitc-凝集素染色(图2e)。经7c10处理的肿瘤中fitc阳性微血管明显多于对照(75％对比20％)。总之，所述结果支持靶向cd93可以使肿瘤脉管系统正常化，并促进肿瘤中的血管成熟和灌注。
[0445]
实施例3
[0446]
使用人基因组规模受体阵列(human genome-scale receptor array)(gsra)来寻找cd93的反受体(counter-receptor)。igfbp7(一种胰岛素生长因子结合蛋白(igfbp)家族的分泌蛋白)是文库中约6,600人跨膜和分泌蛋白中唯一的阳性命中(图4a)。加入人cd93 mab(克隆mm01)或igfbp7 mab(克隆r003)显著降低了igfbp7蛋白与cd93转染的293细胞的结合(图4b)。重组igfbp7蛋白阳性地结合huvec细胞系，cd93 mab mm01完全消除了这种结合活性(图4c)，证明cd93介导igfbp7蛋白与huvec系的结合。此外，igfbp7可以用cd93 mab从huvec细胞裂解物中免疫沉淀出来，表明cd93-igfbp7相互作用天然存在于内皮细胞(ec)中(图4d)。通过微尺度热泳(mst)对igfbp7/cd93相互作用的亲和力测量显示kd值为53.13
±
20.19nm(图4e)。cd93与igfbp7之间的相互作用在小鼠中也是保守的，这可以被抗小鼠igfbp7 mab(克隆2c6)(图4f)或抗小鼠cd93 mab(克隆7c10)(图4f)阻断,所述mab用于上述体内功能研究。结果表明cd93 mab 7c10通过阻断igfbp7/cd93相互作用介导其在肿瘤血管正常化中的功能。
[0447]
通过用其家族成员之一替换其c-凝集素结构域(～1-190aa)产生了cd93的嵌合蛋白。两种嵌合蛋白都不能结合igfbp7(数据未显示)。这表明在cd93上的igfbp7的结合位点是c-凝集素与egf样结构域之间的未表征序列(例如，seq id no:1的f182-y262)。
[0448]
测试了各种商业抗人cd93单克隆抗体和抗人igfbp7单克隆抗体阻断cd93/igfbp7相互作用的能力。结果如图16所示。
[0449]
实施例4
[0450]
igfbp7包含位于其n末端的igf结合(ib)结构域，位于中心区域的kazal型丝氨酸蛋白酶抑制剂结构域(kazal)，以及位于c末端的免疫球蛋白样c2型(igc2)结构域(43)。为了进一步研究igfbp7与cd93之间的结合相互作用，通过用来自igfbpl1的相应部分替代igfbp7(一种不结合cd93的igfbp相关蛋白)的每个结构域(44)，产生一系列嵌合蛋白用于分析(图4g)。正如所预期的，igfbp7，而不是igfbpl1，与cd93 293细胞强烈结合。替换了ib结构域的嵌合蛋白失去了结合cd93 293细胞的能力，而替换了kazal或igc2结构域的嵌合蛋白则没有作用或作用极小(图4g和图10a)。为了排除其它含ib结构域的人蛋白也能与cd93相互作用的可能性，从大多数含ib结构域的人基因构建并产生小鼠fc-标记的融合蛋白(n＝15)。除igfbp7外，未检测到这些重组蛋白与cd93的显著结合(图10b)。因此，igfbp7上的ib结构域对与cd93的相互作用具有高度特异性。
[0451]
实施例5
[0452]
通过if分析pdac患者的组织样品中的igfbp7表达。在邻近的正常胰腺组织中，igfbp7蛋白主要存在于胰岛细胞中，少数血管具有可检测的igfbp7蛋白。cd31染色在人pdac组织中也很少见。然而，与邻近的正常胰腺相比，igfbp7阳性血管的数量是正常胰腺的两倍多(图5a)。与此一致，对tcga胰腺癌数据集的分析显示，与正常胰腺相比，igfbp7在人pdac中被显著上调(图11a)；igfbp7基因的表达与ec标志基因，诸如pda的pecam1(cd31)、
cd34和von willebrand因子(vwf)密切相关，进一步支持igfbp7是肿瘤ec中富集的基因(图11b)。在小鼠癌症组织中，观察到类似的igfbp7表达模式。在肿瘤血管中，与正常胰腺相比，原位植入的kpc(胰腺腺癌)肿瘤中igfbp7的表达被显著上调(图12a)。在正常小鼠皮肤组织的血管中几乎检测不到igfbp7的表达，而在皮下植入的小鼠kpc和b16肿瘤中，igfbp7在cd31 ec中高度表达(图12b)。
[0453]
注意到与肿瘤边缘周围的微血管相比，植入的小鼠肿瘤中心内的微血管表达显著更高水平的igfbp7(图5b)，表明igfbp7上调可由肿瘤内的缺氧诱导。为了验证这一点，将ec在二甲基草酰甘氨酸(dmog)中培养以模拟缺氧条件，并通过蛋白质印迹检查其igfbp7表达。事实上，发现在dmog中培养的huvec细胞具有升高的hif-1α水平，伴随着igfbp7的更高表达(图5c)。
[0454]
因为igfbp7基因在启动子区不具有共有低氧反应元件(hre，5
’‑
rcgtg-3’基序)(47)，其在ec中的上调可能不是由低氧直接触发的。假设缺氧诱导的vegf(一种ec中igfbp7的强诱导剂(48))可能是igfbp7上调的原因。这一假设在小鼠内皮细胞中得到了验证。与huvec细胞相似，在dmog存在的情况下，小鼠ec中igfbp7的表达可被上调以模拟缺氧条件。向培养物中加入vegfr阻断性mab完全阻止了小鼠ec中缺氧诱导的igfbp7表达(图5d)，表明缺氧诱导的igfbp7完全依赖于该系统中的vegf信号传导。有趣的是，对异种移植结肠癌小鼠模型(49)的rna-seq数据(gse110501)的分析表明，igfbp7在肿瘤ec中也被vegf抑制剂阿柏西普显著抑制(图5e)。综上所述，这些结果支持igfbp7是通过vegf信号传导在肿瘤相关脉管系统中低氧诱导的ecm蛋白。
[0455]
实施例6
[0456]
igfbp7蛋白在huvec细胞中组成型表达，并通过dmog进一步上调，伴随着hif-1α的诱导(图5c)。igfbp7基因表达的敲低显著抑制huvec细胞中的管形成(图13a)。为了确定igfbp7是否通过cd93介导血管生成，用cd93 sirna转染huvec细胞以敲低cd93表达，作为测试igfbp7蛋白的作用的体外模型。外源性igfbp7蛋白的加入增加了野生型huvec细胞管的形成和增殖。然而，在敲低cd93的huvec细胞中，igfbp7蛋白在跨孔迁移测定中失去了其对小管形成或ec迁移的作用(图13b和图13c)。这些研究表明cd93介导igfbp7蛋白对ec的促血管生成作用。
[0457]
igfbp7 mab(克隆2c6，图14a)，其阻断igfbp7与cd93的结合，用于测试其对体内肿瘤生长和肿瘤血管成熟的作用。如上所述，相对于对照，2c6的施用显著抑制了kpc肿瘤生长超过40％(图14b)。肿瘤组织的if染色显示，2c6阻断igfbp7/cd93相互作用大大增加了循环血管和肿瘤微血管的长度，但不影响cd31 肿瘤血管的密度(图14c)。与cd93 mab对血管成熟的作用相似，igfbp7 mab提高了肿瘤血管旁ng2 周细胞的覆盖率(图14d)，并增加肿瘤血管上的α-sma覆盖率(图14e)。来自用2c6 mab处理的小鼠的肿瘤组织显示β1整联蛋白激活明显减少超过50％(图14f)，进一步支持抗igfbp7影响整联蛋白以使肿瘤血管正常化(51)。这些结果支持igfbp7/cd93相互作用的阻断促进血管正常化并减弱肿瘤生长。
[0458]
另外，高剂量的igfbp7和cd93 mab(15mg/kg，或300μg)未降低体内肿瘤血管密度。结果表明，tme中改变的cd93/igfbp7的主要作用是对血管异常，而不是增加血管生成。这表明igfbp7/cd93轴可能是血管正常化的更好治疗靶标。igfbp7和cd93在小鼠和人肿瘤的肿瘤血管上被选择性上调。这些有限的表达模式与正常组织微血管中vegfr-1、-2和-3的广泛
显示相反。
[0459]
实施例7
[0460]
随着cd93/igfbp7相互作用在肿瘤血管生成异常中的深远影响，进一步测试了通过mab阻断这种相互作用是否可以改善肿瘤灌注，从而作为血管正常化的结果促进药物递送。在kpc模型中，测试了多柔比星(一种具有固有自体荧光的蒽环类化学治疗剂)的递送功效。处死前20分钟对小鼠静脉注射多柔比星。同时，用吡莫硝唑作为低氧探针处理小鼠，以评估肿瘤低氧的可能变化。在经cd93 mab处理的小鼠中观察到多柔比星更强地渗透到肿瘤中；同时，肿瘤中的缺氧也显著减少(图6a)。还评估了抗cd93在利用5-氟尿嘧啶(5-fu)治疗的b16肿瘤模型中的抗肿瘤作用。小鼠皮下植入b16黑色素瘤，并开始用cd93 mab进行处理，每周两次，然后一旦肿瘤变得可触知，就利用两剂5-fu。正如所预期的，cd93 mab或5-fu单独治疗仅适度抑制肿瘤生长，最终两组中的肿瘤都生长过度。5-fu和cd93 mab的联合治疗能够显著抑制肿瘤生长(图6b)以及使相当大部分(约40％)小鼠的生存期延长超过20天(图6c)。组织染色显示，基于植入的b16黑色素瘤的ki-67染色，cd93阻断增强了5-fu诱导的肿瘤增殖抑制(图6d)。综上所述，这些实验证明cd93/igfbp7相互作用的阻断减少了缺氧，促进了药物递送，因此有利于癌症的化学疗法。
[0461]
实施例8
[0462]
肿瘤脉管系统的正常化可以增强免疫细胞运输到肿瘤中，这可能归因于被上调的粘附分子(16,40,41)。发现抗cd93处理在s.c.kpc和b16肿瘤模型中都增加了肿瘤血管上的icam1表达(图9a和图9b)。与此一致，与第8天和第15天的对照组比，cd3的if染色显示抗cd93处理的小鼠的kpc肿瘤组织中的til增加了约3倍(图3a和图3b)。通过流式细胞术对til组合物的进一步分析揭示，抗cd93大大增加了肿瘤中cd45 白细胞的百分比和绝对数量：在cd93 mab处理的肿瘤中，cd4 和cd8 t细胞比对照多3倍(图3c和图3d)。抗cd93未改变cd45 造血细胞区室中的cd8 或cd4 til亚群的比例(图8a)，以及由til的ifn-γ和tnf-α的相似水平显示的功能(图8b)。然而，抗cd93显著降低了肿瘤内髓源性抑制细胞(mdsc)的百分比(图3e)，进一步支持有利的炎症tme。在b16黑色素瘤中观察到抗cd93对促进til的类似作用，尽管在该模型中肿瘤内通常存在较少的til(图3f)。综上所述，这些结果支持cd93/igfbp7相互作用的阻断通过改善t细胞浸润来调节炎症性tme。
[0463]
实施例9
[0464]
测试了阻cd93/igfbp7的断是否可以促进基于肿瘤微环境免疫正常化的癌症免疫疗法。首先确定了抗cd93对抑制肿瘤生长的作用是否依赖于t细胞介导的免疫反应。在抗cd3处理开始时通过mab去除cd8 t细胞完全减弱了抗肿瘤作用，而去除cd4 t细胞仅具有很小的作用(图7a)，支持cd8 t细胞在该模型中在抗cd93介导的肿瘤抑制中的主要作用。
[0465]
假设b7-h1诱导可能是抗cd93的有限抗肿瘤作用的原因。事实上，在抗cd93处理后观察到肿瘤组织上b7-h1表达上调(图7b)。除了cd31 肿瘤ec中b7-h1表达增加外，在抗cd93治疗的肿瘤中的肿瘤细胞和cd45 白细胞中也观察到与对照相比b7-h1表达显著增加(图7c)。因此，抗cd93上调tme中的b7-h1可能会限制抗肿瘤免疫，这些发现证明了抗cd93疗法与抗pd-1/pd-l1疗法的联合治疗的合理性，这种可能性随后在kpc模型中得到验证。虽然单用抗cd93或抗pd-1mab治疗可部分抑制肿瘤生长，但在该模型中，抗cd93/pd-1mab的组合可以极大地抑制肿瘤生长(图7d)。结果，组合组中的肿瘤重量减少至仅为对照组的约20％(图
7e)。与更好的抗肿瘤作用相一致，对联合治疗的肿瘤内免疫细胞的分析表明cd8 和cd4 t细胞的绝对数量都大大增加(图7f)。与此同时，cd8 t细胞的比例显著增加，而肿瘤相关巨噬细胞(tam)在联合治疗组中显著减少(图7g)。这些结果表明，cd93/igfbp7的阻断可以使肿瘤脉管系统正常化，这可以增强抗pd-1/pd-l1癌症免疫疗法的效果。
[0466]
实施例10
[0467]
该实施例证明了非造血细胞上的cd93介导由抗cd93显示的抗肿瘤免疫。发现注射后抗cd93 mab在b16肿瘤的肿瘤脉管系统上积累(图17a)。除了ec以外，还已知cd93在几种造血细胞类型上表达，包括单核细胞、巨噬细胞和未成熟b细胞(71)。为了充分揭示cd93的细胞来源是抗cd93治疗的抗肿瘤作用的原因，通过用来自wt或cd93ko小鼠的骨髓(bm)重建经致死辐照的wt b6小鼠来制备cd93嵌合小鼠。如所预期的，不管bm的来源如何，抗cd93的治疗抑制了嵌合小鼠中的肿瘤生长(图17b)。由于ec是非造血细胞中cd93的唯一细胞来源，所以结果证实抗cd93是靶向肿瘤脉管系统的阻断性mab。
[0468]
实施例11
[0469]
本实施例证明了cd93阻断抑制了b16黑色素瘤的生长。在许多实体瘤中观察到肿瘤血管中的cd93过表达(32-34)。类似地，cd93(图18a)和igfbp7(图18b)在皮下b16黑色素瘤中均被显著上调。当用阻断性mcd93 mab(克隆7c10)治疗荷瘤小鼠时，cd93阻断显著抑制了b16肿瘤中的肿瘤生长并减轻了肿瘤重量(图18c)。利用抗cd93的fab进行的治疗在抑制b16肿瘤生长方面仍然有效，排除了fc介导的耗竭的可能性(数据未显示)。这些数据与在cd93-/-小鼠中观察到的延缓的肿瘤生长一致。
[0470]
实施例12
[0471]
本实施例证明了cd93阻断大大增加了小鼠黑色素瘤中t细胞的浸润和功能。肿瘤脉管系统的正常化增强了免疫细胞至肿瘤中的运输(16，74)。发现抗cd93治疗导致b16肿瘤中cd3 til增加约三倍(图19a)。流式细胞术分析显示，抗cd93大大增加了肿瘤中cd45 免疫细胞的百分比和密度(图19b)。免疫细胞组成的详细分析表明，nk细胞和t细胞，特别是cd8 t细胞，是抗cd93治疗的b16肿瘤中增加的主要细胞类型(图19c)。抗cd93显著增加了cd8 t细胞亚群中效应记忆t细胞(tem)的百分比，这通过增加的pd1和粒酶b表达得到了进一步证实(图19d)；一致地，cd93治疗的肿瘤中的cd8 til产生显著更多的包括ifn-γ和tnf在内的效应细胞因子(图19e)。虽然cd93阻断不影响cd4 til的密度，但在抗cd93治疗的肿瘤中，效应t细胞(tem和pd1阳性)成比例增加，并且treg细胞减少(图19f)。分析还显示，许多免疫抑制细胞，包括treg、粒细胞髓样衍生抑制细胞(gmdsc)和肿瘤相关巨噬细胞(mac)，在用抗cd93治疗的肿瘤中显著减少(图19c)。mdsc和巨噬细胞(cd11b )优先定位于缺氧区域；由于mdsc和巨噬细胞本身不表达cd93，所以它们在抗cd93治疗的肿瘤中的减少可能是由缺氧减少引起的(图19g)。综上所述，所述结果支持cd93途径的阻断可以在b16黑色素瘤中调节免疫有利的tme。
[0472]
实施例13
[0473]
本实施例证明了cd93阻断使b16黑色素瘤对免疫疗法敏感。由于til增加，pd-l1经常在肿瘤组织中响应于ifn-γ而被上调(52)。事实上，在抗cd93治疗时在肿瘤组织上观察到pd-l1表达的上调(图20a)。除了cd31 ec以外，通过抗cd93在肿瘤细胞和cd45 白细胞中都观察到pd-l1表达的显著增加(图20b)。此外，在抗cd93治疗下，pd1阳性til在b16肿瘤中
更丰富(图19e和图19g)。这种观察到的tme中pd1/pd-l1途径的上调可能会限制抗cd93的抗肿瘤免疫。在b16黑色素瘤模型中，单独的抗cd93或icb(pd1加ctla4阻断性mab)的治疗适度延缓了肿瘤生长。然而，在该模型中，抗cd93/icb的组合极大地抑制了肿瘤生长；组合组中超过80％的小鼠存活超过20天，而对照组的所有小鼠在15天之前死亡(图20c)。与更好的抗肿瘤作用一致，对联合治疗的肿瘤内免疫细胞的分析表明cd45 免疫细胞(包括cd4 和cd8 t细胞)的数量大大增加(图20d)。同时，在联合组的cd4 和cd8 t细胞中，具有效应记忆表型(t
em
，cd44
hi
cd62l-)的t细胞的数量均显著增加(图20e)。综上所述，所述结果支持cd93信号传导的阻断使肿瘤对icb疗法敏感。
[0474]
实施例14
[0475]
本实施例证明了在tnbc脉管系统中igfbp7/cd93途径的表达被上调。cd93是先前报道的人原发性肿瘤血管生成基因标志中的顶级基因之一(45)，并且已经在许多实体肿瘤中观察到肿瘤脉管系统中的cd93过表达(30，74-76)。发现与邻近正常乳腺组织相比，cd93在人tnbc的血管中被明显上调(n＝5)(图21a)。在邻近正常乳腺组织的血管中几乎检测不到igfbp7蛋白，然而，其在人tnbc血管中的表达显著增加(图21b)。类似地，在原位4t1小鼠乳腺肿瘤模型中，cd93(图21c)和igfbp7(图21d)的表达都被显著上调。为了评估igfbp7在bc中的临床相关性，分析了tcga乳腺癌数据集。有趣的是，高igfbp7与tnbc中的不良预后相关，但并不与er阳性乳腺癌中的不良预后相关(图22)。
[0476]
实施例15
[0477]
本实施例证明了igfbp7/cd93相互作用的阻断抑制了体内tnbc肿瘤的生长。当4t1肿瘤变得可触知时，用阻断性mcd93mab(克隆7c10)治疗4t1荷瘤小鼠。肿瘤生长曲线表明，施用抗cd93阻断性mab显著抑制了肿瘤生长，从而降低了肿瘤重量(图23a)。类似地，相同的cd93封闭性mab对原位植入的py8119(另一种小鼠tnbc模型)具有相当的抗肿瘤作用(图23b)。
[0478]
实施例16
[0479]
本实施例表明，在tnbc，cd93阻断可以促进血管成熟，从而改善灌注。cd93 mab阻断igfbp7/cd93相互作用不影响血管密度(图24a)。cd93 mab对肿瘤血管正常化的作用通过肿瘤血管上增加的α-sma染色(图24a)和周细胞覆盖率(ng2 血管，图24b)得到证实。在py8119肿瘤模型中发现抗cd93对血管成熟的类似结果(数据未显示)。cd93阻断增加了肿瘤灌注，因为在用cd93 mab治疗的肿瘤中，fitc凝集素阳性血管增加超过两倍；与此同时，在抗cd93治疗的4t1肿瘤中，缺氧区域(吡莫硝唑 )显著减少(图24c)。
[0480]
实施例17
[0481]
本实施例证明了在cd93阻断后在4t1中til增加并且mdsc减少。在两周的抗体治疗后，通过if染色检查4t1肿瘤中的浸润免疫细胞。发现用cd93 mab治疗的肿瘤中cd3 t细胞明显更多(图25a)。4t1肿瘤中的cd11b ly6g mdsc丰富。有趣的是，抗cd93的治疗大大减少了其在肿瘤中的数量(图25b)。通过facs分析进一步证实了肿瘤细胞混悬液的if结果(图25c)。因此，cd93阻断可以为tnbc的免疫治疗产生有利的tme。
[0482]
实施例18
[0483]
本实施例证明了igfbp7和cd93在人癌症内的血管中被上调。与邻近正常组织相比，在人癌症中igfbp7的表达被上调(图26a)。基于免疫荧光染色，人癌症中的cd93表达主
要存在于肿瘤脉管系统中(图26b)。cd93和igfbp7在人黑色素瘤的血管中均被上调(图26c)。
[0484]
实施例19
[0485]
本实施例证明了igfbp7/cd93途径在对抗pd疗法具有抗性的人癌症中的富集。肿瘤血管功能障碍限制了抗肿瘤免疫，对免疫疗法构成巨大威胁(19)。在接受抗pd疗法的癌症患者中检测了igfbp7和cd93的基因表达。在接受阿特珠单抗(抗pd-l1 mab)治疗的转移性尿路上皮癌患者的ii期试验中(77)，无应答者的肿瘤组织中igfbp7和cd93表达的基线水平均显著高于应答者(图27a)。一致地，在抗pd1治疗(78)下的转移性黑色素瘤患者的小队列中，与未受益的患者相比，在对抗pd1疗法起反应的患者中基线igfbp7水平倾向于更低(图27b)。观察到无应答者中朝向平均cd93表达增加的趋势，尽管这种相关性未达到统计学显著性(图27b)。总之，tme中的igfbp7/cd93途径可能有助于临床上对抗pd疗法的癌症抗性。
[0486]
实施例20
[0487]
本实施例证明了igfbp7和mmrn2与cd93的不同基序结合。mmrn2(一种不存在于gsra文库中的ecm蛋白(42))是另一种已知的cd93的配体。除了cd93以外，mmrn2还与clec14a和cd248(两种另外的第14组c型凝集素成员)相互作用；与mmrn2相反，igfbp7仅与cd93结合，而不与任何其它c型凝集素分子结合(图28a)。mmrn2和igfbp7不相互竞争与cd93的结合，因为igfbp7的加入不干扰mmrn2与cd93的结合，反之亦然(图28b)。支持在elisa测定中，用cd93蛋白预孵育igfbp7包被的孔导致mmrn2结合(图28c)；这表明cd93可以同时与其两种配体结合，一起形成蛋白复合物。还发现用于体内研究的抗小鼠cd93(克隆7c10)也阻断了cd93与mmrn2之间的相互作用(图28d)。当检查这两种配体与几种具有点突变的小鼠cd93的结合时，发现失去与mmrn2的结合的cd93突变体中的两种(c103s和c135s)与igfbp7的结合很强(图28e)。所有这些都支持igfbp7和mmrn2与cd93上的不同位置结合。
[0488]
以下是实施例中使用的方法和材料。
[0489]
细胞系、融合蛋白和抗体
[0490]
kpc细胞源自kraslslg12d/ ；trp53r172h；pdx1-cre(kpc)转基因小鼠。人igf bp 7(fc-标签)和小鼠igfbp7(fc-标签)购自sino biological。大鼠抗小鼠cd93 mab(克隆7c10)由杂交瘤产生，所述杂交瘤源自sp2骨髓瘤与来自用小鼠cd93-ig免疫的大鼠的b细胞的融合。仓鼠抗小鼠igfbp7 mab(克隆2c6，6f1)由杂交瘤产生，所述杂交瘤源自sp2骨髓瘤与来自用小鼠igfbp7-ig免疫的亚美尼亚仓鼠的b细胞的融合。使杂交瘤适应于不含杂交瘤血清的培养基(life technologies)并在其中培养。上清液中的抗体通过hitrap蛋白g亲和柱(ge healthcare)纯化。抗小鼠vegfr-2(克隆dc101)购自bioxcell。抗人igfbp7 mab(r003，sinobiological)和抗人cd93(mm01，sinobiological)用于阻断人igfbp7-cd93相互作用。商业抗体，如果没有列出，购自biolegend。
[0491]
igfbp7嵌合体和cd93-f238l突变体
[0492]
通过两步pcr产生igfbp7-igfbpl1嵌合体。嵌合蛋白共享相似的结构，并含有来自在不同切割位点互换的igfbp7和igfbpl1的结构域。从受试者转染的hek293t细胞收集上清液用于下游结合分析。使用全长cd93作为模板，将密码子序列从ttc(苯丙氨酸)改变为acc(亮氨酸)，通过pcr产生含有苯丙氨酸至苏氨酸的取代的cd93-f238l突变体(46)。所有的构
建体都通过测序得到证实。
[0493]
流式细胞术
[0494]
细胞表面和细胞间染色以及流式细胞仪分析遵循前面描述的方案(71)。用blue dead cell stain试剂盒(thermo fisher scientific)排除死细胞。用bd facs calibur或bd lsrfortessatm细胞分析仪(bd bioscience，franklin lakes，nj，usa)进行流式细胞分析，然后用flowjo软件(tree star inc.)分析数据。
[0495]
微型热泳(mst)实验
[0496]
使用monolith his-tag labeling试剂盒，red-tris-nta第二代(nanotemper gmbh,munchen,germany)用荧光染料标记igfbp7蛋白(r&d系统公司，minneapolis mn)。将样品从100nm原液稀释到pbs 0.05％p20中至20nm的浓度，装载到premium mst毛细管中，并在monolith nt.115pico仪(nanotemper gmbh,munchen,germany)上对成功标记和蛋白质稳定性进行预测试。在pbs 0.05％p20中将5.9μm重组人cd93蛋白(r&d系统，minneapolis mn)的原液进行2倍稀释16次，以产生跨越5.9μm至180pm的稀释系列。将20nm igfbp7以1∶1的比例加入到每个浓度中，使得每个样品含有10nm igfbp7的最终浓度。将样品装入mst premium毛细管，并在上述仪器上测量其微量热泳。用pico red检测器进行实验，所述检测器具有20％的激光功率和中等mst功率。将该实验以一式两份以相同的程序重复一次。使用mo亲和力分析软件(nanotemper gmbh,munchen,germany)分析数据。
[0497]
ec培养
[0498]
将购自thermo fisher的合并的人脐静脉ec(huvec)在含有lves(life technologies)的培养基200中进行培养。c57bl/6小鼠原代主动脉ec和含补充物的内皮细胞培养基购自cell biologics。为了形成管，将2x105个细胞/ml的huvec铺在24孔板的基质胶上。孵育后每4-6小时记录一次图像。在细胞迁移模型中使用预先装载在24孔培养板(corning 3422,8um)中的transwell 6.5mm聚碳酸酯膜插入物。将200μl中1x105/ml的huvec细胞加载到每个24孔插入物中，在下室中含有500μl含fbs的培养基和不同的试剂。大约20小时后，用甲醇固定迁移的细胞，用吉姆萨溶液染色，并在光学显微镜下计数。
[0499]
小鼠肿瘤模型
[0500]
所有的动物护理、实验和安乐死都是按照university of colorado anschutz medical campus的动物护理和使用委员会批准的方案进行的。c57bl/6小鼠购自jackson实验室(bar harbor,me)。6至8周龄的小鼠用于这些实验。将kpc(4x105)细胞皮下注射到c57bl/6小鼠的右肋腹。在肿瘤变得可触知后，根据肿瘤体积将小鼠随机分成不同的处理组，所述肿瘤体积计算为1/2x(长x宽2)。每周两次腹膜内注射300μg/小鼠的治疗性抗体，共进行四次。每2或3天用卡尺测量肿瘤直径(长度和宽度)。在第一次治疗后14天，对小鼠实施安乐死并处死，切取肿瘤组织用于详细分析。在第一次治疗后第8天获得用于fitc-凝集素、多柔比星递送和低氧探针测定的肿瘤组织。对于pd-1(克隆rmp1-14，bioxcell)和cd93抗体的联合治疗，开始用抗体治疗kpc荷瘤小鼠，每周两次，持续两周。在第一次cd93 mab处理以耗竭cd4/cd8 t细胞前一天，腹膜内施用抗小鼠cd4(克隆gk1.5，bioxcell)或抗小鼠cd8β(克隆53-5.8，bioxcell)300μg/小鼠，并在第7天以200μg剂量进行重复。每周两次施用300μg抗小鼠cd93mab治疗。
[0501]
对于b16肿瘤模型，以2x105/小鼠给c57bl/6小鼠皮下接种b16黑色素瘤。在可检测
到肿瘤后，将小鼠随机分成4个不同的组：对照组、单独的cd93 mab、单独的5-fu以及cd93 mab 5-fu(组合)。在随机化当天(第0天)、第4天和第9天施用cd93 mab(300μg，腹膜内)治疗。在第2天和第7天施用5-fu(3.5mg i.p.)。每2或3天测量一次肿瘤大小。当肿瘤体积超过2000mm3并且/或者形成溃疡时，荷瘤小鼠被视为死亡，用于计算存活曲线。
[0502]
免疫组织化学和免疫荧光染色
[0503]
免疫组织化学染色方案已在前面描述过(72)。对于免疫荧光染色，收集小鼠组织样品，并使用最佳切割温度(otc)固定液在干冰上冷冻。然后将冷冻块切成7μm切片，并封固在载玻片上。将载玻片固定在丙酮中，用2.5％山羊血清进行封闭，与一抗在4℃下孵育过夜，与二抗孵育1小时，用dapi复染10分钟。然后清洁并封回载玻片。用nikon eclipse te2000-e立式显微镜拍摄图像，并使用slidebook软件(版本6，intelligent imaging inc.)和image j(版本1.52k，nih)进行分析。用于if染色的一抗包括抗人igfbp7(r115,sino biological)、抗人cd31(jc/70a，thermofisher)、抗人cd93(mm01,sino biological)、抗小鼠cd3ε(145-2c11)、抗小鼠b7-h1(10f.9g2)、抗小鼠igfbp7(6f1)和、抗小鼠cd93(7c10)。将ng2(缀合有cy3的pab，ab5320c3，millipore)和αsma(1a4，缀合有efluor 660，invitrogen)染色用于评价血管周围的周细胞。用来自bd pharmingen的cd29mab(克隆9eg7)对激活的整联蛋白β1进行染色。进行ki-67(16a8,biolegend)和裂解的胱天蛋白酶3(#9661,cell signaling)染色以分别评估肿瘤细胞的增殖和凋亡。
[0504]
缺氧和灌注测量
[0505]
在将30mg/kg盐酸吡莫硝唑(hypoxyprobe试剂盒)注射到荷瘤小鼠(注射后1小时收获肿瘤)中后，检测肿瘤缺氧。为了检测吡莫硝唑加合物的形成，按照制造商的说明用apc-低氧探针mab对肿瘤冷冻切片进行了染色。低氧肿瘤面积表示为总肿瘤面积的百分比。在将30mg/kg多柔比星尾静脉注射到荷瘤小鼠中后，评估肿瘤中的药物递送。注射后1小时收获肿瘤。通过荧光显微镜检测冷冻组织切片上的多柔比星，其中将激发和发射波长设置为488nm和570nm。在荷瘤小鼠中静脉注射50μg fitc-标记的栽培番茄(lycopersicon esculentum)(番茄)凝集素(fl-1171,vector实验室,brussels,belgium)后，在肿瘤冷冻切片上定量肿瘤血管灌注(注射后10分钟收获肿瘤)。灌注面积定义为凝集素 cd31 面积，以cd31 面积的百分比表示。
[0506]
统计
[0507]
prism软件(graphpad)用于分析数据，并通过应用双尾未配对学生t检验来确定组间差异的统计学显著性(包括平均值
±
sem)。所有小于0.05的p值被认为具有统计学意义。
[0508]
参考资料:
[0509]
1.hillen f,and griffioen aw.tumour vascularization:sprouting angiogenesis and beyond.cancer metastasis rev.2007；26(3-4):489-502.
[0510]
2.de palma m,biziato d,and petrova tv.microenvironmental regulation of tumour angiogenesis.nat rev cancer.2017；17(8):457-74.
[0511]
3.carmeliet p,and jain rk.angiogenesis in cancer and other diseases.nature.2000；407(6801):249-57.
[0512]
4.mcdonald dm,and baluk p.significance of blood vessel leakiness in cancer.cancer res.2002；62(18):5381-5.
acad sci usa.2012；109(43):17561-6.
[0564]
55.akiel m,guo c,li x,rajasekaran d,mendoza rg,robertson cl,et al.igfbp7 deletion promotes hepatocellular carcinoma.cancer res.2017；77(15):4014-25.
[0565]
56.norsworthy pj,fossati-jimack l,cortes-hernandez j,taylor pr,bygrave ae,thompson rd,et al.murine cd93(c1qrp)contributes to the removal of apoptotic cells in vivo but is not required for c1q-mediated enhancement of phagocytosis.journal of immunology.2004；172(6):3406-14.
[0566]
57.hwa v,oh y,and rosenfeld rg.the insulin-like growth factor-binding protein(igfbp)superfamily.endocr rev.1999；20(6):761-87.
[0567]
58.bach la.what happened to the igf binding proteins？endocrinology.2018；159(2):570-8.
[0568]
59.oh y,nagalla sr,yamanaka y,kim hs,wilson e,and rosenfeld rg.synthesis and characterization of insulin-like growth factor-binding protein(igfbp)-7.recombinant human mac25protein specifically binds igf-i and-ii.j biol chem.1996；271(48):30322-5.
[0569]
60.wajapeyee n,serra rw,zhu x,mahalingam m,and green mr.oncogenic braf induces senescence and apoptosis through pathways mediated by the secreted protein igfbp7.cell.2008；132(3):363-74.
[0570]
61.cao z,scandura jm,inghirami gg,shido k,ding bs,and rafii s.molecular checkpoint decisions made by subverted vascular niche transform indolent tumor cells into chemoresistant cancer stem cells.cancer cell.2017；31(1):110-26.
[0571]
62.evdokimova v,tognon ce,benatar t,yang w,krutikov k,pollak m,et al.igfbp7 binds to the igf-1 receptor and blocks its activation by insulin-like growth factors.sci signal.2012；5(255):ra92.
[0572]
63.darr j,klochendler a,isaac s,and eden a.loss of igfbp7expression and persistent akt activation contribute to smarcb1/snf5-mediated tumorigenesis.oncogene.2014；33(23):3024-32.
[0573]
64.pen a,moreno mj,durocher y,deb-rinker p,and stanimirovic db.glioblastoma-secreted factors induce igfbp7 and angiogenesis by modulating smad-2-dependent tgf-beta signaling.oncogene.2008；27(54):6834-44.
[0574]
65.akaogi k,okabe y,sato j,nagashima y,yasumitsu h,sugahara k,et al.specific accumulation of tumor-derived adhesion factor in tumor blood vessels and in capillary tube-like structures of cultured vascular ecs.proc natl acad sci u s a.1996；93(16):8384-9.
[0575]
66.sato j,hasegawa s,akaogi k,yasumitsu h,yamada s,sugahara k,et al.identification of cell-binding site of angiomodulin(agm/taf/mac25)that interacts with heparan sulfates on cell surface.j cell biochem.1999；75(2):
187-95.
[0576]
67.mura m,swain rk,zhuang x,vorschmitt h,reynolds g,durant s,et al.identification and angiogenic role of the novel tumor endothelial marker clec14a.oncogene.2012；31(3):293-305.
[0577]
68.noy pj,lodhia p,khan k,zhuang x,ward dg,verissimo ar,et al.blocking clec14a-mmrn2 binding inhibits sprouting angiogenesis and tumour growth.oncogene.2015；34(47):5821-31.
[0578]
69.lugano r,vemuri k,yu d,bergqvist m,smits a,essand m,et al.cd93 promotes beta1 integrin activation and fibronectin fibrillogenesis during tumor angiogenesis.j clin invest.2018；128(8):3280-97.
[0579]
70.langenkamp e,zhang l,lugano r,huang h,elhassan te,georganaki m,et al.elevated expression of the c-type lectin cd93 in the glioblastoma vasculature regulates cytoskeletal rearrangements that enhance vessel function and reduce host survival.cancer res.2015；75(21):4504-16.
[0580]
71.tian y,sun y,gao f,koenig mr,sunderland a,fujiwara y,et al.cd28h expression identifies resident memory cd8 t cells with less cytotoxicity in human peripheral tissues and cancers.oncoimmunology.2019；8(2).
[0581]
72.zhu yw,yao s,iliopoulou bp,han x,augustine mm,xu hy,et al.b7-h5 costimulates human t cells via cd28h.nature communications.2013；4.
[0582]
73.greenlee mc,sullivan sa,bohlson ss.cd93 and related family members:their role in innate immunity.curr drug targets.2008；9(2):130-8.pubmed pmid:wos:000253937200005.
[0583]
74.shrimali rk,yu zy,theoret mr,chinnasamy d,restifo np,rosenberg sa.antiangiogenic agents can increase lymphocyte infiltration into tumor and enhance the effectiveness of adoptive immunotherapy of cancer.cancer research.2010；70(15):6171-80.doi:10.1158/0008-5472.can-10-0153.pubmed pmid:wos:000280557500007.
[0584]
75.zhu yw,yao s,augustine mm,xu hy,wang j,sun jw,broadwater m,ruff w,luo lq,zhu gf,tamada k,chen lp.neuron-specific salm5 limits inflammation in the cns via its interaction with hvem.sci adv.2016；2(4).doi:unsp e150063710.1126/sciadv.1500637.pubmed pmid:wos:000380072100002.
[0585]
76.fujiwara y,sun y,torphy rj,he jd,yanaga k,edil bh,schulick rd,zhu yw.pomalidomide inhibits pd-l1 induction to promote antitumor immunity.cancer research.2018；78(23):6655-65.doi:10.1158/0008-5472.can-18-1781.pubmed pmid:wos:000452369300013.
[0586]
77.mariathasan,s.,turley,s.j.,nickles,d.,castiglioni,a.,yuen,k.,wang,y.l.,kadel,e.e.,koeppen,h.,astarita,j.l.,cubas,r.,et al.(2018).tgf beta attenuates tumour response to pd-l1 blockade by contributing to exclusion of t cells.nature 554,544-548.
[0587]
78.hugo,w.,zaretsky,j.m.,sun,l.,song,c.y.,moreno,b.h.,hu-lieskovan,s.,berent-maoz,b.,pang,j.,chmielowski,b.,cherry,g.,et al.(2017).genomic and transcriptomic features of response to anti-pd-1therapy in metastatic melanoma(vol 165,pg35,2016).cell 168,542-542.
[0588]
79.yao s,zhu y,zhu g,augustine m,zheng l,goode dj,b7-h2 is a costimulatory ligand for cd28 in human.immunity.2011may 27；34(5):729
–
740.
[0589]
序列表
[0590][0591][0592]
＊＊＊
[0593]
要求保护的主题在范围上不受本文所述的具体实施方案的限制。实际上，根据前面的描述，除了本文所述的那些之外，对所要求保护的主题的各种修改对于本领域技术人员来说将变得显而易见。此类修改旨在落入所附权利要求的范围内。
[0594]
本文引用的所有专利、申请、出版物、测试方法、文献和其它材料都据此通过引用以其整体并入，就如同物理上存在于本说明书中一样。