CAR-T细胞组合物及其使用方法

car-t细胞组合物及其使用方法
1.相关申请的交叉引用
2.本技术要求2019年9月21日提交的美国临时专利申请62/903,776的优先权和权益，该临时专利申请全文以引用方式并入本文。
3.关于美国联邦政府资助的研究的声明
4.本发明是在美国国立卫生研究院授予的ca168912的政府资助下进行的。美国政府拥有本发明的某些权利。
技术领域
5.本发明的方面一般涉及免疫疗法，特别是涉及抗体和嵌合抗原受体t细胞以及它们的使用方法。


背景技术：

6.每年有850,000例新发肝癌病例，使其成为全球第六大最常见的癌症(1)。大多数(80％-90％)肝癌是肝细胞癌(hcc)。虽然由于乙型肝炎病毒(hbv)疫苗接种，hcc发病率在亚洲已经趋于平稳(2)，但由于肥胖症/糖尿病，发达国家hcc发病率显著增加(3,4)。根据美国疾病控制中心的数据，肝癌的发病率在过去的20年中增加了一倍，成为了增长最快的癌症。肝癌的治疗选择是有限的。虽然肝切除术是治愈性的，但大多数hcc在晚期才被诊断出来，已经无法进行手术。此外，缺乏辅助治疗导致约70％的5年复发率(5)，这使肝癌成为成年男性癌症死亡的第二大原因(1)。因此，迫切需要新的疗法。
7.免疫疗法在治疗恶性肿瘤方面具有很大的潜力(6-10)。检查点阻断已显示出对hcc的治疗效果(9,11)，但它需要肿瘤浸润t细胞的存在，而肿瘤浸润t细胞并不总是存在(12)。产生肿瘤特异性t细胞的一种方法是用特异性t细胞受体(tcr)重定向患者的自体t细胞(13,14)。然而，tcr的主要组织相容性复合体(mhc)限制性限制了其应用。一种独立于mhc的方法是利用嵌合抗原受体(car)基因来改造t细胞以靶向肿瘤表面抗原。car将单克隆抗体(mab)的高亲和力和特异性与tcr信号传导结合，可激活t细胞并介导独立于mhc的对肿瘤细胞的强而特异性的杀伤(15,16)。用car基因改造的t细胞(cart)已被证明在治疗血液学癌症中具有强大的抗肿瘤作用(16-18)。
8.cart也被深入研究用于治疗包括hcc在内的实体瘤(19)。磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(gpc3)是硫酸肝素(hs)蛋白聚糖家族的成员，通过糖基磷脂酰肌醇(gpi)锚附着在细胞膜上(20,21)，并参与wnt/β-连环蛋白信号传导(22,23)。大约70％-80％的hcc肿瘤细胞(但不是正常的肝细胞)表达gpc3。其水平与患者生存率低有关(24)。因此，gpc3可能是hcc免疫疗法的重要靶标(25)。已测试了几种hgpc3-特异性mab(gc33、yp7、hn3和mdx-1414)的抗肿瘤作用(26-28)。但是只有gc33已经进入临床试验(29)，没有显著的抗肿瘤益处(30)。目前，有几个小组正在研究gc33衍生的cart的抗肿瘤作用(31-33)，它们的抗肿瘤益处仍有待评估。同时，从不同的mab(尤其是靶向hgpc3的不同区域的那些mab)开发的cart是否会产生不同的抗肿瘤作用尚不清楚。此外，尽管gc33 mab已在临床试验中被证明是安全的，但最近的一
项研究表明，在34个非hcc肿瘤组织中，有7个组织经gc33染色呈阳性(34)。因此，需要针对hcc免疫疗法产生更多具有高特异性和高有效性的cart。
9.本发明的一个目的是提供抗体组合物及其使用方法。
10.本发明的另一个目的是提供嵌合抗原受体t细胞组合物及其使用方法。
11.本发明的又一个目的是提供用于治疗癌症的方法和组合物。


技术实现要素：

12.本发明提供了嵌合抗原受体t细胞(cart)组合物及其使用方法。一个实施方案提供了一种包含8f8嵌合抗原受体t细胞的嵌合抗原受体t细胞组合物。另一个实施方案提供了一种包含6g11嵌合抗原受体t细胞的嵌合抗原受体t细胞组合物。又一个实施方案提供了一种包含12d7嵌合抗原受体t细胞的嵌合抗原受体t细胞组合物。本发明所公开的cart可用于治疗癌症，例如肝细胞癌。
13.其他实施方案涉及用于产生cart的抗体。一个实施方案提供了一种具有mab 6g11可变轻链和mab 6g11可变重链的重组单克隆抗体。另一个实施方案提供了一种具有mab 8f8可变轻链和mab 8f8可变重链的重组单克隆抗体。又一个实施方案提供了一种包含mab 12d7可变轻链和mab 12d7可变重链的重组单克隆抗体。
14.一个实施方案提供了一种包含本发明所公开的抗体和/或cart的药物组合物。
15.另一个实施方案提供了一种治疗肝癌的方法，该方法通过向对其有需要的受试者施用有效量的6g11、8f8或12d7嵌合抗原受体t细胞来治疗癌症，例如肝细胞癌。
16.一个实施方案提供了一种治疗对其有需要的受试者的肝细胞癌的方法，该方法包括以下步骤：从该受试者中分离t细胞；用包含6g11-car核酸序列的载体转染这些分离的t细胞；任选地在细胞培养物中扩增这些转染的细胞；以及向该受试者施用有效量的这些转染的细胞以治疗肝细胞癌。
17.一个实施方案提供了一种治疗对其有需要的受试者的肝细胞癌的方法，该方法包括以下步骤：从该受试者中分离t细胞；用包含8f8-car核酸序列的载体转染这些分离的t细胞；任选地在细胞培养物中扩增这些转染的细胞；以及向该受试者施用有效量的这些转染的细胞以治疗肝细胞癌。
18.一个实施方案提供了一种治疗对其有需要的受试者的肝细胞癌的方法，该方法包括以下步骤：从该受试者中分离t细胞；用包含12d7-car核酸序列的载体转染这些分离的t细胞；任选地在细胞培养物中扩增这些转染的细胞；以及向该受试者施用有效量的这些转染的细胞以治疗肝细胞癌。
19.一个实施方案提供了一种嵌合抗原受体免疫细胞，该嵌合抗原受体免疫细胞包含与seq id no:1、2或3具有85％、90％、95％、99％或100％序列同一性的核酸。
附图说明
20.图1a是通过酶联免疫吸附(elisa)测定鉴定的22种hgpc3-特异性mab的表。提供了它们的ig类别、对hepg2细胞的染色以及与hgpc3的n片段或c片段的结合。灰色阴影的mab没有对hepg2细胞染色。图1b是示出5种mab对hepg2肿瘤细胞的代表性免疫荧光染色的一组显微照片。图1c是表达hgpc3的n片段和c片段的质粒图。图1d是示出用hgpc3-n或hgpc3-c质粒
转染并用指示的mab进行细胞内染色的293细胞的一组图。门由未转染的亲本293t细胞设置。图1e是示出用指示的hgpc3-特异性mab对hepg2肿瘤细胞进行的免疫荧光染色的一组图。图1f是示出通过指示的hgpc3-特异性mab对huh7细胞进行的免疫荧光染色的一组图。图1g是示出对hgpc3-n或hgpc3-c片段基因转染的293t细胞用不同的hgpc3-特异性mab进行的细胞内染色的一组图。门由未转染的亲本293细胞设置。
21.图2a是示出肝组织的免疫组织化学(ihc)染色的一组显微照片。健康肝脏以及相同肝脏的配对的hcc和邻近正常组织的代表性ihc染色。给出了低放大倍数和高放大倍数。黑斑指示阳性染色。图2b是示出通过5种mab对多个组织样品进行ihc染色的总结的表。anl：邻近正常肝组织。免疫评分最高为8分，最低分为0。图2c是示出通过5种mab对hcc肿瘤组织以及它们配对的邻近正常肝组织进行的ihc染色的一组显微照片。mab的一些阴性染色未示出。
22.图3a是示出重组mab的示意性结构的图示。sp：人igg信号肽；vl：轻链可变区；vh：重链可变区；cl：人igg轻链恒定区；ch：人igg重链恒定区。图3b是示出在还原和非还原条件下纯化的重组mab的聚丙烯酰胺凝胶电泳(page)分析的凝胶。在共转染l链表达质粒和h链表达质粒后，从293细胞中纯化mab。用simplyblue safestain对凝胶染色。图3c是示出通过elisa的重组mab的ec50的图。图3d是示出通过生物膜层干涉测量法(bli)测量的每个mab的kd值的一组图。每个实验重复了至少3次，并获得了相似的数据。图3e是示出用于对hepg2肿瘤细胞进行染色的mab 6g11、8f8和12d7的kd值的图。使用不同浓度的mab对hepg2肿瘤细胞进行免疫荧光染色。基于阳性细胞百分比和mab浓度，通过prism软件计算kd值。
23.图4a示出了用hgpc3的n片段或hgpc3的c片段转染的293细胞的蛋白质印迹分析。图4b和图4c示出了具有证实6g11和12d7结合到hgpc3的n片段并且8f8结合到hgpc3的c片段的数据的图。将hepg2细胞裂解液用作阳性对照。通过重叠肽绘制6g11和8f8结合表位。数据显示，6g11 mab结合到n1肽(aa25-39)(b)并且8f8结合到c5肽(aa463-496)。图4d是示出来自haruyama和kataoka(参考文献25)的hgpc3的示意性结构上的mab结合位点的图示。作为参考，已指示出gc33 mab的表位。还示出了hgpc3的n片段和c片段之间的潜在二硫键。
24.图5a示出了从6g11、8f8和12d7构建的第二代car-t的示意性结构。gs接头：甘氨酸-丝氨酸接头；tm：cd28的跨膜结构域。图5b是实验程序的图示。从外周血单核细胞(pbmc)中分离人t细胞，并通过cd3/cd28珠激活24小时。在第0天，用慢病毒载体(lv)转导t细胞，并在第3天至第13天监测car的表达。图5c是呈现在不同时间点car基因转导后的一组点图。在指定的时间点通过抗小鼠fab抗体检测car的表达。此实验重复了至少5次，观察结果相似。图5d和图5e是示出用抗小鼠fab抗体(a)或fitc标记的hgpc3对转导t细胞上的car分子进行染色的点图。将模拟转导t细胞用作对照。图5f是示出可结合hgpc3蛋白的car t细胞的百分比的图。
25.图6a至图6d示出了car-t对hcc肿瘤细胞刺激的反应性。如图5所述产生cart。在转导后第14天，将cart与或不与hepg2肿瘤细胞共培养。6天后检查car t细胞的百分比及其效应子功能。图6a示出了hepg2刺激后的cart的代表性点图。图6b是示出在hepg2刺激之前和之后的car t细胞的倍数变化的总结的图。统计是通过学生t检验完成的。图6c和图6d是示出cart的细胞毒性和细胞因子产量的折线图。在转导后第20天(hepg2刺激后6天)，将未刺激的cart(图6c)和hepg2刺激的cart(图6d)与hepg2细胞共培养20小时。通过乳酸脱氢酶
(ldh)和elisa测量细胞毒性以及ifng和il-2。数据显示平均值 /-sd，用双因素方差分析(anova)进行统计。实验重复了三次，观察结果相似。图6e至图6g示出了cart对huh7肿瘤细胞的细胞毒性。图6e是示出6g11 cart杀伤hgpc3
low huh7肿瘤细胞但不杀伤hgpc3-293t细胞的图。图6f示出了8f8 cart可以杀伤huh7肿瘤细胞，但12d7 cart不能(图6g)。
26.图7a至图7c示出了可溶性hgpc3既不激活cart，也不抑制hepg2激活cart。图7a是示出cart与hepg2或与不同浓度的可溶性hgpc3共培养20小时并进行elisa以测定ifng的图。图7b和图7v是示出在存在不同浓度的hgpc3蛋白的情况下将cart与hepg2(2:1比例)共培养20小时的图。通过ldh测定测量细胞毒性，并通过elisa评估细胞因子。采用学生t检验进行统计分析。ns：不显著。实验重复了两次，观察结果相似。
27.图8a至图8f示出了cart的过继转移产生了与体内car扩增相关的强效抗肿瘤作用。图8a是实验方案的图示。图8b是不同治疗组中肿瘤生长曲线的折线图。每条折线代表一个肿瘤。图8c至图8e示出了转移的cart的分析。设门策略如图8c所示。将小鼠cd45 细胞用作内部参考。总结了nsg小鼠中人cd45 的动力学(图8d)和car t细胞的百分比(图8e)。每条折线代表一只小鼠。颜色与b中的肿瘤大小曲线匹配。图8f是在肿瘤接种后40天(治疗后33天)携带肿瘤的小鼠的图片。该实验重复了5次，观察结果相似。图8g是示出当使用较低的效应子/肿瘤负荷(0.6cart比1hepg2肿瘤细胞)时cart的抗肿瘤作用的图。用500万个hepg2肿瘤细胞接种建立了hcc异种移植物。七天后，将300万个cart过继转移到携带肿瘤的小鼠中。即使在0.6的较低e/t比下，所有cart都对肿瘤生长产生了显著抑制。然而，只有8f8 car-t能够完全根除hcc肿瘤异种移植物。相反，用6g11 cart处理的小鼠中只有20％没有肿瘤。
28.图9是示出cart的开发和给药的图示。
29.图10是示出指示的cart的抗肿瘤作用的总结的图。
具体实施方式
30.i.定义
31.如本文所用，如果一种分子与第二分子的结合表现出抗体对其同源抗原的特异性和亲和力，则认为这种分子能够“免疫特异性结合”第二分子。如果此类结合涉及免疫球蛋白分子的抗原识别位点，则认为抗体能够免疫特异性地结合抗原的靶区或构象(“表位”)。如果其他抗原具有由抗原识别位点识别的某些序列或构象相似性，如通过例如免疫测定、测定或本领域已知的其他测定所确定的，则免疫特异性结合特定抗原的抗体可以较低亲和力结合该其他抗原，但不结合完全无关的抗原。然而，优选地，抗体(及其抗原结合片段)不会与其他抗原交叉反应。抗体也可通过非免疫特异性的方式结合其他分子，诸如通过结合其他区的结构域/不涉及抗原识别位点的分子的结构域(诸如fc区)与fcr受体结合。
32.如本文所用，如果此类结合表现出受体对其同源结合配体的特异性和亲和力，则认为这种分子能够“生理特异性结合”第二分子。一种分子能够生理特异性地结合一种以上其他分子。
33.如本文所用，术语“抗体”旨在表示具有“可变区”抗原识别位点的免疫球蛋白分子。术语“可变区”旨在将免疫球蛋白的此类结构域与抗体广泛共有的结构域(诸如抗体fc结构域)区分开。可变区包括由其残基负责抗原结合的“高变区”。高变区包括来自“互补决
定区”或“cdr”的氨基酸残基(即，通常在轻链可变结构域中约24-34(l1)、50-56(l2)和89-97(l3)处的残基以及重链可变结构域中约27-35(h1)、50-65(h2)和95-102(h3)处的残基；kabat等人，“sequences of proteins of immunological interest”，第5版，public health service,national institutes of health,bethesda,md.，1991年)和/或来自“高变环”的那些残基(即，轻链可变结构域中的26-32(l1)、50-52(l2)和91-96(l3)残基以及重链可变结构域中的26-32(h1)、53-55(h2)和96-101(h3)残基；chothia等人，j mol biol，第196卷：第901-917页，1987年)。“骨架区”(“fr”)残基是指那些可变结构域残基，而非本文所定义的高变区残基。术语抗体包括单克隆抗体、多特异性抗体、人抗体、人源化抗体、合成抗体、嵌合抗体、骆驼化抗体(参见例如，muyldermans等人，trends biochem sci，第26卷：第230页，2001年；nuttall等人，cur pharm biotech，第1卷：第253页，2000年；reichmann等人，j immunol meth，第231卷：第25页，1999年；国际公布wo94/04678和wo 94/25591；美国专利6,005,079)、单链fv(scfv)(参见例如，“pluckthun in the pharmacology of monoclonal antibodies”，第113卷，rosenburg和moore编辑，springer-verlag，new york，第269-315页，1994年)、单链抗体、二硫键连接的fv(sdfv)、细胞内抗体和抗独特型(抗id)抗体(包括例如，抗id抗体和抗抗id抗体的抗体)。特别地，此类抗体包括任何类型(例如，igg、ige、igm、igd、iga和igy)、类别(例如，igg1、igg2、igg3、igg4、iga1和iga2)或亚类的免疫球蛋白分子。
34.如本文所用，术语抗体的“抗原结合片段”是指抗体的一个或多个部分，该一个或多个部分包含抗体的互补决定区(“cdr”)以及可选地包括抗体的“可变区”抗原识别位点的骨架残基，而且表现出免疫特异性地结合抗原的能力。此类片段包括fab'、f(ab')2、fv、单链(scfv)及其突变体、天然存在的变体和包括抗体的“可变区”抗原识别位点和异源蛋白(例如毒素、不同抗原的抗原识别位点、酶、受体或受体配体等)的融合蛋白。
35.如本文所用，术语“片段”是指包含以下氨基酸序列的肽或多肽：至少5个连续氨基酸残基、至少10个连续氨基酸残基、至少15个连续氨基酸残基、至少20个连续氨基酸残基、至少25个连续氨基酸残基、至少40个连续氨基酸残基、至少50个连续氨基酸残基、至少60个连续氨基酸残基、至少70个连续氨基酸残基、至少80个连续氨基酸残基、至少90个连续氨基酸残基、至少100个连续氨基酸残基、至少125个连续氨基酸残基、至少150个连续氨基酸残基、至少175个连续氨基酸残基、至少200个连续氨基酸残基或至少250个连续氨基酸残基。
36.如本文所用，术语“治疗”和“治疗用途”是指消除、减轻或改善疾病或病症的一种或多种症状。
37.如本文所用，“治疗有效量”是指足以介导此类症状的临床相关消除、减轻或改善的治疗剂的量。如果作用大小足以影响受体受试者的健康或预后，则作用具有临床相关性。治疗有效量可指足以使疾病发作延迟或减至最低程度(例如，延迟癌症扩散或将其减至最低程度)的治疗剂的量。治疗有效量也可指在疾病治疗或管控中提供治疗益处的治疗剂的量。
38.如本文所用，“免疫细胞”是指来自造血起源的任何细胞，包括但不限于t细胞、b细胞、自然杀伤(nk)细胞、nkt细胞、单核细胞、树突状细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、肥大细胞、先天淋巴样细胞(ilc)和髓源性抑制细胞(mdsc)。
39.如本文所用，术语“个体”、“宿主”、“受试者”和“患者”在本文中可互换使用，并且
指哺乳动物，包括但不限于人、啮齿类动物(诸如小鼠和大鼠)和其他实验动物。
40.ii.嵌合抗原受体t细胞
41.本发明提供了嵌合抗原受体t细胞(cart)组合物及其使用方法。cart是合成的构建体，被设计成在宿主t细胞或nk细胞中表达以及诱导针对特定靶抗原和表达该抗原的细胞的免疫应答。car通常包含掺入融合蛋白中的抗体片段，诸如scfv或fab片段，该融合蛋白还包括另外的组成部分，诸如cd3-或cd28跨膜结构域和选择性t细胞激活部分，包括cd3-、cd28、ox40、4-1bb、lck和/或icos的内结构域。一般来讲，构建体可包含连接到scfv、fab或其他抗体部分的前导序列，该序列通常在scfv和跨膜结构域之间具有铰链或其他接头。跨膜结构域将连接到细胞内信号传导结构域，诸如cd28或cd3-，并且通常将包括如下所述的一个或多个共刺激结构域。car被设计成具有激活结构域、共刺激结构域、跨膜结构域和抗原结合结构域。激活结构域是细胞内结构域，诸如cd3。共刺激结构域可增加car t细胞的活性，比如增殖和持久性。跨膜结构域起到结构锚的作用。可与靶抗原结合的抗原结合结构域是car的重要组成部分，并且通常包含单链可变片段(scfv)。
42.如美国专利5,359,046、5,686,281和6,103,521中所述，细胞外结构域可从各种与配体结合和/或信号转导相关的细胞外结构域或分泌蛋白中的任一者获得。细胞外结构域可以是蛋白质的一部分，该蛋白质是单体、同源二聚体、异二聚体或与非共价复合物中大量蛋白质相关。特别地，细胞外结构域可由ig重链组成，该重链可由于ch1和铰链区的存在而与ig轻链共价相关，或者可由于铰链、ch2和ch3结构域的存在而与其他ig重链/轻链复合物共价相关。在后一种情况下，与嵌合构建体连接的重链/轻链复合物可构成具有与嵌合构建体的抗体特异性不同的特异性的抗体。根据抗体的功能、所需结构和信号转导，可使用整个链或可使用截短的链，其中ch1、ch2或ch3结构域的全部或部分可被去除，或者铰链区的全部或部分可被去除。
43.嵌合抗原受体t细胞(car-t细胞)是经过基因改造以表达和产生嵌合t细胞受体的t细胞。这使改造的t细胞具有靶向特定蛋白质的能力。car-t免疫疗法的基础是修饰t细胞以识别癌细胞，以便更有效地靶向和破坏癌细胞。通过白细胞分离术从受试者中获得t细胞，然后进行淘洗以去除髓样细胞，对t淋巴细胞进行富集，进行转基因递送以及体外扩增。将所得的car-t细胞注入受试者以攻击他们的肿瘤。car-t细胞可来源于受试者自身血液中的t细胞(自体)，也可来源于另一个健康供体的t细胞(同种异体)。这些t细胞一旦从受试者中分离出来，就会被基因改造以表达特定car，这将它们进行编程以靶向存在于肿瘤表面的抗原。为了安全起见，car-t细胞被改造为对在肿瘤上表达而在健康细胞上不表达的抗原具有特异性。
44.产生cart细胞的方法在本领域中是已知的，并且在美国专利7,446,190、7,741,465、9,181,527和9,629,877中有所描述。
45.用于将car构建体引入t细胞的基因修饰可通过用重组dna或rna构建体(例如载体)转导(或以其他方式递送)t细胞组合物来完成。载体可以是能够在宿主细胞中递送或维持核酸的任何试剂，并且载体包括病毒载体(例如逆转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体或腺相关病毒载体)、质粒、裸核酸、与多肽或其他分子复合的核酸和固定在固相颗粒上的核酸。可通过多种程序将适当的dna序列插入载体中。一般来讲，通过本领域已知的程序将dna序列插入适当的限制性内切酶位点中。此类程序和其他程序均被认为在本领域技术
人员的范围内。为了实现对基于细胞的基因治疗的持久临床应答，通常需要进行永久性转基因表达。小鼠γ逆转录病毒和慢病毒是两种可提供长期car转基因表达的可用的临床基因治疗载体系统。大量临床证据表明，逆转录病毒载体在人t细胞中表达时是安全的。
46.用于蛋白质表达的启动子和其他调控序列的选择是本领域技术人员所熟知的。用于在t细胞中表达的细胞特异性启动子包括但不限于人cd2、远端lck和近端lck。在其他实施方案中，可使用非组织特异性启动子诸如包括病毒启动子(诸如巨细胞病毒(cmv)启动子)的非组织特异性启动子、β-肌动蛋白启动子、磷酸甘油酸激酶(pgk)启动子、泛素启动子和ef-1a启动子。此列举并不意味着限制。表达构建优选地还包括序列，以允许表达构建体的复制。通过将增强子序列插入载体中，可增加通过高等真核生物编码本发明多肽的dna的转录。增强子是dna的顺式作用元件，通常在作用于启动子的约10至300位置以增加其转录。示例包括在复制起点后期100至270位置的sv40增强子、巨细胞病毒早期的启动子增强子、复制起点后期的多瘤增强子和腺病毒增强子。优选地，采用逆转录病毒载体(γ-逆转录病毒或慢病毒)将car核酸构建体引入细胞中。例如，可将编码共刺激配体蛋白(例如，肿瘤坏死因子(tnf)配体诸如4-1bbl、ox40l、cd70、light和cd30l，或ig超家族配体诸如cd80和cd86)的多核苷酸、或结合抗原的受体、或变体、或其片段克隆到逆转录病毒载体中，并且表达可从其内源性启动子、从逆转录病毒长末端重复序列或从对感兴趣的靶细胞类型具有特异性的启动子驱动。也可使用非病毒载体。
47.一个实施方案提供了一种包含8f8嵌合抗原受体t细胞的嵌合抗原受体t细胞组合物。另一个实施方案提供了一种包含6g11嵌合抗原受体t细胞的嵌合抗原受体t细胞组合物。又一个实施方案提供了一种包含12d7嵌合抗原受体t细胞的嵌合抗原受体t细胞组合物。本发明所公开的cart可用于治疗癌症，例如肝细胞癌。
48.其他实施方案涉及用于产生cart的抗体。一个实施方案提供了一种具有mab 6g11可变轻链和mab 6g11可变重链的重组单克隆抗体。另一个实施方案提供了一种具有mab 8f8可变轻链和mab 8f8可变重链的重组单克隆抗体。又一个实施方案提供了一种包含mab 12d7可变轻链和mab 12d7可变重链的重组单克隆抗体。
49.一个实施方案提供了一种包含本发明所公开的抗体和/或cart的药物组合物。
50.另一个实施方案提供了一种治疗肝癌的方法，该方法通过向对其有需要的受试者施用有效量的6g11、8f8或12d7嵌合抗原受体t细胞来治疗癌症，例如肝细胞癌。
51.一个实施方案提供了一种治疗对其有需要的受试者的肝细胞癌的方法，该方法包括以下步骤：从该受试者中分离t细胞；用包含6g11-car核酸序列的载体转染这些分离的t细胞；任选地在细胞培养物中扩增这些转染的细胞；以及向该受试者施用有效量的这些转染的细胞以治疗肝细胞癌。
52.一个实施方案提供了一种治疗对其有需要的受试者的肝细胞癌的方法，该方法包括以下步骤：从该受试者中分离t细胞；用包含8f8-car核酸序列的载体转染这些分离的t细胞；任选地在细胞培养物中扩增这些转染的细胞；以及向该受试者施用有效量的这些转染的细胞以治疗肝细胞癌。
53.一个实施方案提供了一种治疗对其有需要的受试者的肝细胞癌的方法，该方法包括以下步骤：从该受试者中分离t细胞；用包含12d7-car核酸序列的载体转染这些分离的t细胞；任选地在细胞培养物中扩增这些转染的细胞；以及向该受试者施用有效量的这些转
染的细胞以治疗肝细胞癌。
54.iii.药物组合物
55.本文所述的抗体和cart可被配制成药物组合物。包含抗体和/或cart的药物组合物可被配制成用于肠胃外给药，包括但不限于肌内、腹膜内、静脉内(iv)或皮下注射。
56.在一些体内方法中，本文所公开的组合物以治疗有效量施用于受试者。如本文所用，术语“有效量”或“治疗有效量”是指足以治疗、抑制或缓解所治疗疾病的一种或多种症状或以其他方式提供所需的药理和/或生理作用的剂量。精确剂量将根据多种因素而变化，诸如受试者因变量(例如，年龄、免疫系统健康等)、疾病和正在进行的治疗。
57.对于所公开的抗体，随着进一步研究的进行，将出现关于用于治疗各种患者的各种病症的适当剂量水平的信息，并且考虑到接受者的治疗背景、年龄和总体健康状况，普通技术人员将能够确定合适的剂量。选择的剂量取决于所需的治疗效果、给药途径和所需的治疗持续时间。一般来讲，对于静脉内注射或输注，剂量可能更低。
58.向患者施用的剂量通常为0.01mg/kg至100mg/kg患者体重。向患者施用的剂量可以是例如，0.01mg/kg至20mg/kg、0.01mg/kg至10mg/kg、0.01mg/kg至5mg/kg、0.01mg/kg至2mg/kg、0.01mg/kg至1mg/kg、0.01mg/kg至0.75mg/kg、0.01mg/kg至0.5mg/kg、0.01mg/kg至0.25mg/kg、0.01mg/kg至0.15mg/kg、0.01mg/kg至0.10mg/kg、0.01mg/kg至0.05mg/kg或0.01mg/kg至0.025mg/kg患者体重。示例性的具体剂量包括但不限于0.2mg/kg、0.3mg/kg、1mg/kg、3mg/kg、6mg/kg或10mg/kg。低至0.01mg/kg的剂量被认为适合具有明显的药效学作用。预计0.10mg/kg-1mg/kg的剂量水平是最合适的。预计更高的剂量(例如，1mg/kg-30mg/kg)也将是有效的。
59.一般来讲，由于对外来多肽的免疫应答，人抗体在人体内的半衰期比来自其他物种的抗体的半衰期更长。因此，较低的人抗体剂量和较少频率的给药通常是可行的。此外，可通过修饰(例如脂化)来增强抗体的摄取和组织渗透，从而降低本发明抗体或其片段的给药剂量和频率。
60.在某些实施方案中，抗体和/或cart在局部施用，例如通过直接注射到待治疗的部位中。
61.在一些实施方案中，本文所公开的组合物在水溶液中通过肠胃外注射或输注施用。制剂也可以是混悬剂或乳剂形式。一般来讲，提供了包含有效量的抗体和/或cart的药物组合物，并且该药物组合物任选地包含药学上可接受的稀释剂、防腐剂、增溶剂、乳化剂、佐剂和/或载体。此类组合物任选地包含以下的一者或多者：稀释剂、无菌水、具有各种缓冲内容物(例如，tris-hcl、乙酸盐、磷酸盐)、ph和离子强度的缓冲盐水，以及添加剂，诸如洗涤剂和增溶剂(例如，20(聚山梨醇酯-20)、80(聚山梨醇酯-80))、抗氧化剂(例如，抗坏血酸、焦亚硫酸钠)、防腐剂(例如，硫柳汞、苯甲醇)和填充物质(例如，乳糖、甘露醇)。非水溶剂或溶媒的示例是丙二醇、聚乙二醇、植物油(诸如橄榄油和玉米油)、明胶和可注射的有机酯(诸如油酸乙酯)。制剂可以是冻干的，并且可在使用前立即重新溶解/重悬。制剂可通过以下方式灭菌，例如通过细菌保留过滤器过滤、通过将灭菌剂掺入组合物中、通过辐照组合物或通过加热组合物。
62.iv.联合疗法
63.本发明所公开的抗体和/或cart可单独或与一种或多种附加治疗剂联合施用于对
其有需要的受试者。在一些实施方案中，附加治疗剂单独但同时施用。附加治疗剂也可作为相同组合物的一部分施用。在其他实施方案中，抗体和/或cart与第二治疗剂分开且在不同时间施用，但作为相同治疗方案的一部分施用。
64.可在施用第二治疗剂之前1、2、3、4、5、6或更多小时、或1、2、3、4、5、6、7或更多天向受试者施用第一治疗剂。在一些实施方案中，可在第一次施用第二治疗剂之前每1、2、3、4、5、6、7、14、21、28、35或48天向受试者施用一剂或多剂第一治疗剂。抗体和/或cart可以是第一或第二治疗剂。在一些实施方案中，抗体和/或cart与第二治疗剂联合施用。抗体和/或cart与附加治疗剂可作为治疗方案的一部分施用。例如，如果可每四天向受试者施用第一治疗剂，则可在第一天、第二天、第三天或第四天、或其组合施用第二治疗剂。第一治疗剂或第二治疗剂可在整个治疗方案中重复施用。
65.示例性附加治疗剂包括但不限于细胞因子、化学治疗剂、放射性核素、其他免疫治疗剂、酶、抗生素、抗病毒药(尤其是单独或与核苷联合使用的用于治疗hiv或乙型或丙型肝炎的蛋白酶抑制剂)、抗寄生虫剂(蠕虫、原生动物)、生长因子、生长抑制剂、激素、激素拮抗剂、抗体及其生物活性片段(包括人源化抗体、单链抗体和嵌合抗体)、抗原和疫苗制剂(包括佐剂)、肽类药物、抗炎药、与toll样受体结合以激活先天免疫系统的配体(包括但不限于聚肌苷:聚胞苷酸(polyi:c)和cpg寡核苷酸)、动员和优化适应性免疫系统的分子、激活或上调细胞毒性t淋巴细胞、自然杀伤细胞和辅助t细胞作用的其他分子，以及其他使抑制因子或调节t细胞失活或下调的分子。
66.基于待治疗的病征、紊乱或疾病选择附加治疗剂。例如，抗体和/或cart可与一种或多种具有增强或促进免疫应答、或降低或抑制免疫应答的功能的附加药剂共同施用。
67.a.化学治疗剂
68.抗体和/或cart可与一种或多种化学治疗剂和促凋亡剂组合。代表性化学治疗剂包括但不限于安吖啶、博来霉素、白消安、卡培他滨、卡铂、卡莫司汀、苯丁酸氮芥、顺铂、克拉屈滨、氯法拉滨、克立他酶、环磷酰胺、阿糖胞苷、达卡巴嗪、放线菌素、柔红霉素、多西他赛、阿霉素、表柔比星、依托泊苷、氟达拉滨、氟尿嘧啶、吉西他滨、羟基脲、伊达比星、异环磷酰胺、伊立替康、亚叶酸、阿霉素脂质体、柔红霉素脂质体、洛莫司汀、美法仑、巯嘌呤、美司钠、甲氨蝶呤、丝裂霉素、米托蒽醌、奥沙利铂、紫杉醇、培美曲塞、喷司他丁、甲基苄肼、雷替曲塞、沙铂、链脲菌素、优福定、替莫唑胺、替尼泊苷、噻替派、硫鸟嘌呤、托泊替康、苏消安、长春碱、长春新碱、长春地辛、长春瑞滨或它们的组合。代表性促凋亡剂包括但不限于氟达拉滨星形孢菌素、环己酰亚胺、放线菌素d、乳糖基神经酰胺、15d-pgj(2)以及它们的组合。
69.b.其他免疫调节剂
70.1.pd-1拮抗剂
71.在一些实施方案中，抗体和/或cart与pd-1拮抗剂共同施用。程序性死亡因子-1(pd-1)是cd28受体家族的成员，当在t细胞上被诱导时产生负免疫应答。pd-1与其配体中的一个配体(b7-h1或b7-dc)之间的接触会诱导抑制应答，减少t细胞增殖和/或t细胞应答的强度和/或持续时间。合适的pd-1拮抗剂在美国专利8,114,845、8,609,089和8,709,416中有所描述(这些专利全文以引用方式明确并入本文)，并且包括化合物或试剂，这些化合物或试剂结合并阻断pd-1的配体以干扰或抑制配体与pd-1受体的结合，或者在不诱导通过pd-1受体的抑制信号转导的情况下直接结合并阻断pd-1受体。
72.在一些实施方案中，pd-1受体拮抗剂可在不触发抑制信号转导的情况下直接与pd-1受体结合，并且还可与pd-1受体的配体结合以减少或抑制配体通过pd-1受体触发信号转导。通过减少与pd-1受体结合并触发抑制信号转导的配体的数量和/或量，更少的细胞被pd-1信号转导传递的负信号减弱，并且可实现更强的免疫应答。
73.据信，pd-1信号传导是通过与pd-1配体(诸如b7-h1或b7-dc)结合而驱动的，该配体与主要组织相容性复合体(mhc)呈递的肽抗原非常靠近(参见例如，freeman，proc natl acad sci u.s.a.，第105卷：第10275-10276页，2008年)。因此，阻止pd-1和tcr在t细胞膜上共连接的蛋白质、抗体或小分子也是有用的pd-1拮抗剂。
74.在一些实施方案中，pd-1受体拮抗剂是小分子拮抗剂或抗体，可通过与pd-1的配体或与pd-1本身结合而减少或干扰pd-1受体信号转导，特别是在pd-1与tcr的共连接不遵循此类结合方式的情况下，因此不会通过pd-1受体触发抑制性信号转导。
75.本发明的方法设想的其他pd-1拮抗剂包括与pd-1或pd-1的配体结合的抗体和其他抗体。
76.合适的抗pd-1抗体包括但不限于以下美国专利中所述的抗体：7332582、7488802、7521051、7524498、7563869、7981416、8088905、8287856、8580247、8728474、8779105、9067999、9073994、9084776、9205148、9358289、9387247、9492539、9492540，所有这些专利全文以引用方式并入本文。
77.另参见berger等人，clin cancer res，第14卷：第3044-3051页，2008年。
78.示例性抗b7-h1(也称为抗pd-l1)抗体包括但不限于以下美国专利中所述的抗体：8383796、9102725、9273135、9393301和9580507，所有这些专利全文以引用方式明确并入本文。
79.对于抗b7-dc(也称为抗pd-l2)抗体，参见美国专利7,411,051、7,052,694、7,390,888、8,188,238和9,255,147，所有这些专利全文以引用方式明确并入本文。
80.其他示例性pd-1受体拮抗剂包括但不限于b7-dc多肽，包括这些多肽的同系物和变体，以及前述任何一者的活性片段，以及包含这些任何一者的融合蛋白。在一些实施方案中，融合蛋白包括与抗体(诸如人igg)的fc部分偶联的b7-dc的可溶部分，并且不包含人b7-dc的全部或部分跨膜部分。
81.pd-1拮抗剂也可以是哺乳动物b7-h1的片段，例如来自小鼠或灵长类动物(诸如人)，其中该片段结合并阻断pd-1，但不会通过pd-1导致抑制性信号转导。片段也可以是融合蛋白的一部分，例如ig融合蛋白。
82.其他有用的多肽pd-1拮抗剂包括与pd-1受体的配体结合的多肽。这些多肽包括可与pd-1配体(诸如b7-h1或b7-dc)结合并防止与内源pd-1受体结合从而防止抑制性信号转导的pd-1受体蛋白或其可溶性片段。b7-h1还被证明可结合蛋白b7.1(butte等人，immunity，第27卷，第111-122页，2007年)。此类片段还包括pd-1蛋白的可溶性ecd部分，该部分包括增加与天然配体的结合的突变，诸如a99l突变(molnar等人，pnas，第105卷：第10483-10488页，2008年)。可与b7-h1配体结合并防止与内源pd-1受体结合从而防止抑制性信号转导的b7-1或其可溶性片段也是有用的。
83.pd-1和b7-h1反义核酸(包括dna和rna)以及sirna分子也可以作为pd-1拮抗剂。此类反义分子阻止pd-1在t细胞上的表达以及t细胞配体(诸如b7-h1、pd-l1和/或pd-l2)的产
useful as anti-tumor agents”的美国专利5,190,929中有所描述，该专利全文以引用方式并入本文。
92.虽然ctx本身无毒，但它的一些代谢产物是细胞毒性烷基化剂，这些烷基化剂诱导dna交联并在较高剂量时引起链断裂。许多细胞对ctx具有抗性，因为它们表达高水平的解毒酶醛脱氢酶(aldh)。ctx靶向增殖的淋巴细胞，因为淋巴细胞(而非造血干细胞)仅表达低水平的aldh，而循环细胞对dna烷基化剂最敏感。
93.低剂量的ctx(＜200mg/kg)可具有免疫刺激作用，包括刺激人和小鼠癌症模型中的抗肿瘤免疫应答(brode和cooke，crit rev,immunol，第28卷：第109-126页，2008年)。这些低剂量是亚治疗性的，不具有直接的抗肿瘤活性。相反，高剂量的ctx抑制抗肿瘤应答。几种机制可解释ctx在增强抗肿瘤免疫应答中的作用：(a)耗竭cd4 cd25 foxp3 调节性t细胞(treg)(特别是增殖的treg，可能特别具有抑制性)；(b)耗竭b淋巴细胞；(c)一氧化氮(no)的诱导，导致抑制肿瘤细胞生长；(d)动员和扩增cd11b gr-1 mdsc。这些初始效应具有许多次级效应，例如，在treg耗竭后，巨噬细胞产生更多的ifn-γ和更少的il-10。ctx也被证明诱导i型ifn的表达并促进淋巴细胞的稳态增殖。
94.treg的耗竭最常被引用为ctx增强抗肿瘤免疫应答的机制。该结论部分基于过继转移实验的结果。在ab1-ha肿瘤模型中，在第9天的ctx治疗达到75％的治愈率。在第12天，纯化的treg的转移几乎完全抑制了ctx应答(van der most等人，cancer immunol.immunother，第58卷：第1219-1228页，2009年)。在hhd2肿瘤模型中观察到相似的结果：ctx预处理后cd4 cd25 treg的过继转移消除了对疫苗的治疗应答(taieb，j.，j immunol，第176卷：第2722-2729页，2006年)。
95.大量人体临床试验已证明，低剂量ctx是一种安全、耐受性良好且有效的促进抗肿瘤免疫应答的药剂(bas和mastrangelo，cancer immunol,immunother，第47卷：第1-12页，1998年)。
96.增强抗肿瘤免疫应答的ctx的最佳剂量是通过将treg水平降低到正常范围以下来降低总t细胞计数的剂量，但是为亚治疗性的(参见machiels等人，cancer res，第61卷：第3689-3697页，2001年)。
97.在ctx已被用作免疫增强剂的人体临床试验中，通常使用300mg/m2的剂量。对于平均男性(6英尺，170磅(78千克)，体表面积为1.98m2)，300mg/m2为8mg/kg，或624mg总蛋白。在小鼠癌症模型中，在15mg/kg-150mg/kg的剂量范围内观察到效力，这与30g小鼠中0.45mg-4.5mg的总蛋白有关(machiels等人，cancer res，第61卷：第3689-3697页，2001年；hengst等人，cancer res，第41卷：第2163-2167页，1981年；hengst，cancer res，第40卷：第2135-2141页，1980年)。
98.对于大型哺乳动物，诸如灵长类动物(诸如人类患者)，可使用这种mg/m2剂量，但也可使用在有限时间间隔内施用的单位剂量。此类单位剂量可在有限时间段内每日施用，诸如最多3天、或最多5天、或最多7天、或最多10天、或最多15天、或最多20天或最多25天，这些都是本发明特别考虑的。相同方案可应用于本文所述的其他增强剂。
99.在其他实施方案中，增强剂是降低调节性t淋巴细胞(t-reg)的活性和/或数量的药剂，诸如舒尼替尼抗tgfβ或伊马替尼所述治疗方案还可包括施用佐剂。
100.有用的增强剂还包括有丝分裂抑制剂、蒽环类、奥沙利铂、阿霉素、tlr4拮抗剂和il-18拮抗剂，其中有丝分裂抑制剂诸如紫杉醇、芳香化酶抑制剂(例如来曲唑)和血管生成抑制剂(vegf抑制剂，例如avastin、vegf-trap)(参见例如，li等人，clin cancer res，11月15日，第12卷第22期：第6808-6816页，2006年)。
101.实施例
102.实施例i：1.结合hcc肿瘤细胞的hgpc3-特异性mab的产生。
103.材料和方法
104.细胞
105.从当地血库中获得外周血单核细胞(pbmc)血沉棕黄层，并且将pbmc用ficoll-hypaque柱分离，并在液氮中以等分试样冷冻。jurkat细胞、hek293t细胞和hepg2细胞来自美国典型培养物保藏中心，huh7细胞来自奥古斯塔大学佐治亚癌症中心的satyanayana ande博士。将细胞通过pcr检测(赛默飞世尔科技公司(fisher scientific))检查支原体，并在使用前培养不超过八次传代，以确保其真实性。
106.小鼠
107.balb/c小鼠购自查尔斯河实验室公司(charles river)。从杰克逊实验室(jackson laboratory)获得免疫受损的nod-scid il2rgammanull(nsg)小鼠繁殖对，并在室内繁殖。动物方案已由奥古斯塔大学机构动物护理和使用委员会批准。
108.mab的产生
109.mab如前所述(xiao h等人，blood cells mol dis，第44卷：第127-132页，2010年)产生。用100μg重组hgpc3蛋白(aa25-560)和完全弗氏佐剂(西格玛奥德里奇公司(sigma-aldrich))通过足垫注射对6-10周龄的雌性balb/c小鼠进行免疫。三周后，每隔2周用70μg重组hgpc3蛋白和不完全弗氏佐剂(西格玛奥德里奇公司)通过足垫注射对小鼠进行两次或三次增强免疫。用elisa测量小鼠血清中的抗hgpc3抗体滴度。通过尾静脉注射50μg/小鼠重组hgpc3的100μl pbs进行最后一次增强免疫。最后一次增强免疫后三天，处死小鼠，并在存在50％peg1500的情况下，产生脾细胞以与融合伴侣ns-1骨髓瘤细胞融合。通过hat培养基选择杂交瘤，并通过elisa筛选阳性杂交瘤。使用有限稀释法进行三次亚克隆。
110.统计分析
111.在prism软件(graphpad公司)中使用学生t检验或双因素anova进行统计分析。
112.结果
113.在第一组实验中，产生了结合hcc肿瘤细胞的hgpc3-特异性mab。我们使用可溶性hgpc3蛋白通过elisa鉴定出了22种mab(图1a)。基于重链，有8种igm、7种igg1、3种igg2a、3种igg2b和1种iga。所有mab都有κ链。其中，11种mab对hepg2细胞的染色强，3种mab对hepg2细胞的染色弱(图1b)。其他8种mab无法对hepg2细胞染色(图1e)。此外，其中对hepg2细胞染色呈阳性的7种(2d7、3h4、5d5、6g11、8f8、10c6和12d7)也对hgpc3
low huh7细胞染色，尽管染色强度较低(图1f)。由于细胞表面的hgpc3分子可以裂解为40kd的n片段和30kd的c片段，因此我们研究了mab是否与hgpc3的n片段或c片段结合。为此，我们构建了两个分别表达氨基酸(aa)1-358(hgpc3-n片段)和aa359-580(hgpc3-c片段)的重组质粒(图1c)。用质粒dna转染293t细胞，并用mab染色。我们发现，在对hepg2肿瘤细胞染色的14种mab中，有11种与hgpc3-n片段结合，而只有3种与hgpc3-c片段结合(图1d和图1g)。此数据表明，n末端表位可
能更容易获得。不能对hepg2细胞染色的其他8种mab不与hgpc3-n片段或hgpc3-c片段结合(图1g)。图1a总结了22种mab的特征。
114.实施例ii：仅对hcc肿瘤染色而不对邻近正常肝组织染色的mab的鉴定。
115.材料和方法
116.免疫组织化学染色(ihc)
117.hcc和肝组织从乔治敦癌症中心的癌症诊所获得。在乔治敦癌症中心的临床病理实验室对组织进行切片和染色。健康肝脏、邻近正常肝脏和hcc组织的多聚甲醛固定、石蜡包埋的切块来自乔治城大学伦巴第癌症中心手术的病例。所有患者给予知情同意，并且该研究由各自的医院伦理委员会授权。用以下纯化的mab之一(6g11、12d7、12e6、8c8和8f8)对病理切片进行染色。二级抗体是羊抗小鼠igm或羊抗小鼠igg(vector labs)。通过增加染色强度和染色区域来计算免疫评分：0、1、2、3对应于无染色、弱、中、高强度染色；0、1、2、3对应于无染色、小于10％的细胞局灶性染色、10％-50％的细胞区域性染色、＞50％的细胞弥漫性染色。
118.结果
119.对5种mab(其中3种(6g11、12d7和12e6)用于n片段，2种(8c8和8f8)用于c片段)进行了纯化，并测定了hcc肿瘤组织以及它们的配对的邻近正常组织的ihc染色情况，以进一步研究它们的特异性。健康肝脏组织也作为对照包括在内。我们的数据显示，其中3种mab(6g11、8f8和12d7)能够特异性地对hcc肿瘤组织染色，不染色邻近正常肝组织(图2a-图2c)。然而，其他两种mab(8c8和12e6)对正常的邻近肝组织甚至健康肝组织的染色显示出较高的非特异性。因此，仅将mab 6g11、8f8和12d7用于进一步研究。
120.实施例iii：mab cdna序列的鉴定。
121.材料和方法
122.mab cdna序列的鉴定
123.为了获得mab的cdna序列，我们使用了互补dna末端的5'快速扩增技术(5'race)(walchli,s.等人，plos one 6:e27930，2011年；zhu,w.等人，hepatology，第68卷：第574-589页，2018年)。简而言之，从杂交瘤中分离出总rna，并用oligo dt引物产生互补dna。通过末端转移酶将polyc添加到互补dna的5'末端。然后，进行pcr以扩增cdna，使用5'pgi引物：caccgggiigggiigggiigg，以及对应于小鼠igm重链或κ链的恒定(c)区的以下3'引物中的一个引物：
124.1.对于6g11和12d7，igm重链引物(migm-op)和κ链引物(migκ-op)被设计为3'引物。
125.a.小鼠igm重链引物(migm-op)：
126.cctggatgacttcagtgttgttctg；
127.b.小鼠κ链引物(migκ-op)：cactgccatcaatcttccacttg。
128.2.对pcr产物进行纯化和测序。基于初步序列，设计了内部3'引物。与5'pgi引物一起，进行了第二次更具特异性的pcr。
129.a.小鼠igm重链内部3'引物(migm-ip)：
130.gggggaagacatttgggaagg；
131.b.小鼠κ链内部3'引物(migκ-ip)：
132.cactggatggtgggaagatgg。
133.3.由于8f8的免疫球蛋白类别是igg2a，所以使用了不同的重链3'引物：
134.a.小鼠igg2a重链引物(migg2ah-op)：
135.ggttacagtcactgagctgctg；
136.b.小鼠igg2a重链内部引物(migg2ah-ip)：
137.ggagccagttgtatctccacac。
138.结果
139.鉴定了来自对应杂交瘤克隆的mab 6g11，8f8和12d7的重链可变区(vh)和轻链可变区(vl)的cdna序列。将推导的vl和vh的aa序列与国际免疫遗传学信息系统(imgt)数据库中编译的ig序列进行了比对(37)。aa序列显示，6g11 vl与igkv15-103*01具有99.64％同源性(1aa差异)，并且其j区与igkj1*01相同。相反，6g11 vh与ighv1s5*01具有94.44％同源性，并且其j区与ighj4*01具有96.3％同源性。8f8 vl与igk15-135*01具有99％同源性，并且其j区与igkj5*01相同，而8f8 vh与ighv5-9-2*01具有94.9％同源性，并且其j区与ighj2*01具有85.5％同源性。12d7 vl与igkv6-15*01和igkj5*01相同，而12d7 vh与ighv1s5*01具有89.8％同源性，并且其j区与ighj3*01具有85.7％同源性。结果总结在表1中。
[0140][0141]
实施例iv：mab 6g11、8f8和12d7的亲和力。
[0142]
材料和方法
[0143]
生物膜层干涉测量法
[0144]
使用fortebio octet red96平台进行动力学实验。在25℃下，在96孔黑色平底板(greiner bio-one)中，以1,000rpm的速度在200μl中进行轨道振荡来收集所有数据。在加载5μg/ml的mab持续2分钟之前，在1
×
动力学缓冲液中平衡抗higg fc捕获传感器(fortebio)10分钟。加载步骤之后，在用一系列浓度的gpc3结合2分钟之前，在1
×
动力学缓冲液中建立30s基线。在mab与gp结合后，在动力学缓冲液中有一个10分钟的解离步骤。对于所有实验，使用两个与mab无关的参考传感器来解释分析物与传感器的非特异性结合以及系统漂移。使用数据分析软件9.0(fortebio)将所有数据全局拟合到1:1的langmuir结合模型。
[0145]
结果
[0146]
3种mab属于不同的ig类别，即，6g11和12d7是igm，而8f8是igg2a。为了公平地比较它们的亲和力，使用它们的vl和vh以及相同的人igg恒定区重组产生了mab。图3a示出了重组mab的结构。从293细胞中表达和纯化mab(图3b)。首先通过elisa研究了mab的亲和力，数据显示，所有3种mab对hgpc3具有高亲和力(图3c)(ec50值在亚纳摩尔至低纳摩尔水平范围内)。还通过生物膜层干涉测量法(bli)研究了mab的亲和力。通过这种生物物理方法，这些
与hgpc3结合的mab的kd值处于纳摩尔水平，6g11为7.4nm，12d7为9.8nm，8f8为23nm(图3d)。通过elisa测定和bli获得的亲和力数据顺序相同，即，6g11＞12d7＞8f8。由于开发mab的目的是结合肿瘤细胞表面的hgpc3分子，因此我们确定了mab对hepg2细胞上的hgpc3的亲和力。与elisa和bli数据一致，6g11和12d7对hepg2肿瘤细胞上的hgpc3亲和力高(ec50：分别为0.095nm和0.1nm)，而8f8 mab对hepg2肿瘤细胞上的hgpc3亲和力低(ec50：12nm)(图3e)。
[0147]
实施例v：mab识别的表位。
[0148]
材料和方法
[0149]
使用合成肽进行elisa测定
[0150]
将96孔平底免疫板(来自赛默飞世尔科技公司)用4μg的pbs稀释的肽在4℃下包被过夜。将1μg的rhgpc3(来自creative biomart)用作阳性对照。第二天，丢弃肽，用100μl 5％脱脂牛奶的pbs封闭板。然后，用300μl/孔的pbst(0.1％吐温20)洗涤板。接下来，用100μl/孔不同抗体稀释液孵育。随后用pbst洗涤四次。然后，用100μl/孔的抗人igg-hrp(来自kpl)(1:2000稀释)孵育。随后用pbst洗涤四次。接下来，用100μl/孔的tmb(来自biolengend)孵育30分钟。然后，用100μl/孔的2n h2so4孵育。最后，在xmark
tm
微孔板分光光度计(来自bio-rad)中检测450nm处的od。如果没有其他说明，则将抗体在室温下孵育1小时，并用2％脱脂牛奶的pbs稀释抗体。
[0151]
结果
[0152]
图1c显示，mab 6g11和12d7结合hgpc3的n片段(aa1-358)，而8f8结合hgpc3的c片段(aa359-580)。为了进一步绘制mab的表位，构建了蛋白质印迹分析，并确认了6g11和12d7 mab结合hgpc3的n片段并且8f8结合hgpc3的c片段(图4a)。接下来，我们使用重叠的合成肽和elisa测定，确定了6g11的表位是hgpc3的aa25-39(图4b)。通过类似的策略确定，8f8的表位位于hgpc3的aa463-496(图4c)。然而，没有发现12d7的特定表位。12d7很可能识别hgpc3的n片段中的构象表位。由mab识别的表位总结并示出在图4d中。
[0153]
实施例vi：cart的产生。
[0154]
材料和方法
[0155]
第二代car构建如下。car包括人cd8分子的前导序列、vl和vh、vl和vh之间的甘氨酸和丝氨酸(gs)接头、cd8铰链的片段、人cd28的跨膜结构域，以及4-1bb和cd3ζ链信号传导结构域。将整个表达盒插入慢病毒载体(lv)中的ef1α启动子后面。如前所述(4)，通过用293t细胞与4个质粒dna(包括穿梭car表达穿梭质粒、plp1、plp2和pvsvg(invitrogen))共转染产生慢病毒载体。如前所述(4,5)，通过高速离心和蔗糖梯度浓缩培养基中的病毒颗粒。通过用系列稀释的病毒原液转导jurkat细胞并用抗小鼠fab抗体染色来确定病毒滴度(jackson immunoreseach lab)。
[0156]
人t细胞的转导
[0157]
原代人t细胞的激活和转导如所述进行(zhu,w.等人，hepatology，第68卷：第574-589页，2018年)。简而言之，将人t细胞通过阴性选择(stemcell technologies,inc)从健康供体的血沉棕黄层中分离，并通过dynabeads(赛默飞世尔科技公司)激活24小时。用20moi-40moi的lv转导激活的t细胞。再激活24小时后移除磁珠24小时。在整个过程中，每3天将40个单位的白介素-2(il-2)添加到rpmi培养基中。
[0158]
结果
[0159]
使用6g11、8f8和12d7 mab的cdna序列构建第二代cart。car包含mab衍生的单链可变片段，该片段前面是cd8a前导肽，后面是cd28跨膜结构域，与41-bb和cd3ζ的细胞内信号传导结构域连接(图5a)。表达car基因的慢病毒载体用于转导人原代t细胞(图5b)。所有三种表达car的慢病毒载体都可以有效地转导原代人t细胞(图5c)。转导后三天，6g11、8f8和12d7 car t细胞分别约占总t细胞的75％、40％和40％。然而，car在t细胞上的表达不稳定。当在转导后第13天达到10％-15％的表达时，car t细胞的百分比逐渐降低并变得稳定(图5c)。还发现t细胞上的car能够结合可溶性hgpc3蛋白(补充图s5)。数据表明，可溶性hgpc3可对约90％的6g11 cart染色，但仅对约40％的8f8和12d7 cart染色。这些数据表明，6g11的表位和6g11 car更容易相互接触。
[0160]
实施例vii：cart对hepg2肿瘤细胞刺激做出反应而扩增，但具有显著不同的效应子功能。
[0161]
材料和方法
[0162]
流式细胞术分析
[0163]
使用了以下抗体进行染色：抗人cd45、抗小鼠cd45、抗小鼠fab、hgpc3蛋白。用指示的抗体对细胞染色，并在lsr流式细胞仪上分析。羊抗小鼠fab抗体(jackson immunoreseach lab)和fitc标记的hgpc3用于确定car转导以及car与同源抗原的结合。
[0164]
结果
[0165]
研究了cart对hcc肿瘤细胞的反应性。数据显示，所有3种cart都可对hepg2细胞刺激做出反应并进行扩增(图6a至图6b)。hepg2刺激后6天，car t细胞从约10％增加到高达70％。事实上，6g11 car t的百分比增加为6倍，并且8f8和12d7 car t的百分比增加为约4倍。然而，它们的效应子功能显著不同。8f8 cart对hepg2产生最强的细胞毒性，并产生最高量的infγ和il-2(图6c)。尽管6g11 cart比8f8 cart稍弱，但它也具有强效的细胞毒性，但其细胞因子(尤其是infγ)的产量明显低于8f8 cart的细胞因子产量。另一方面，12d7 cart具有最弱的效应子功能，无法检测到细胞毒性和细胞因子产量(图6c)。重要的是，经过6天的抗原(hepg2细胞)刺激后，8f8 cart和6g11 cart维持了其强大的细胞毒性和细胞因子产量(图6d)。hepg2刺激后，6g11 cart和8f8 cart的il-2产量增加。相反，即使12d7 cart可通过hepg2细胞刺激而扩增(图6a至图6b)，它们的细胞因子产量仍然无法检测到。然而，在hepg2刺激6天后，12d7 cart确实产生了低水平的细胞毒性(图6d)。此外，8f8 cart和6g11 cart显示出对gpc3
low huh7细胞的显著杀伤作用(图6e至图6g)。同样，12d7 cart不能杀伤huh7肿瘤细胞。
[0166]
实施例viii：可溶性hgpc3不会激活cart，也不会阻止hcc肿瘤细胞激活cart。
[0167]
材料和方法
[0168]
ldh测定和细胞因子elisa测定
[0169]
将hepg2细胞(5
×
103/孔)在平底96孔板上生长过夜。在不添加外源性细胞因子的情况下，以指示的效应子与靶细胞比添加cart。过夜共培养后，如供应商(promega)和elisa(biolegend)所指示，通过乳酸脱氢酶(ldh)活性测量cart的细胞毒性和效应子细胞因子。
[0170]
结果
[0171]
hcc患者的血清中可溶性gpc3的水平通常升高。在这里，我们研究了可溶性gpc3是否会激活cart，以及可溶性hgpc3的存在是否会阻止hcc肿瘤细胞的识别和杀伤。为此，我们
在平底96孔板上接种了5
×
103个hepg2细胞。第二天，加入具有不同浓度hgpc3的cart。使用不含hepg2细胞的cart加可溶性hgpc3，仅通过可溶性蛋白检测cart的激活。我们的数据表明，可溶性hgpc3不会激活cart(图7a)，并且不会影响cart对hepg2肿瘤细胞的杀伤(图7b)。低浓度的hgpc3(0.01μg/ml-0.1μg/ml)不会抑制与hepg2细胞共培养的cart的细胞因子产量。然而，高浓度的可溶性hgpc3(1μg/ml)适度地提高了hepg2诱导的cart的ifnγ产量(图7c)。实施例ix：cart的过继转移消除了nsg小鼠的hepg2肿瘤异种移植物。
[0172]
材料和方法
[0173]
肿瘤与过继细胞转移
[0174]
根据最近的报道(zhu,w.等人)建立hepg2肿瘤异种移植物。将250万(或500万)个hepg2肿瘤细胞接种到nsg小鼠的剃光的侧腹。七天后，将带有指示数字的cart转移到携带肿瘤的nsg小鼠中。通过测量肿瘤的长度、宽度和高度来监测肿瘤的生长。肿瘤体积按1/2(长
×
宽
×
高)计算。通过收集尾静脉血并用抗人cd45和抗小鼠fab抗体进行免疫染色来监测小鼠血液中的cart。将小鼠cd45细胞的共染色用作内部参考，以估计人cd45 细胞的变化。
[0175]
结果
[0176]
为了研究cart的体内抗肿瘤作用，将携带hepg2异种移植物的nsg小鼠用cart过继转移。监测nsg小鼠血液中肿瘤的生长以及cart的扩增和持久性(图8a)。在第一个体内实验中，通过皮下接种250万个hepg2细胞来建立hcc肿瘤。7天后，用300万个cart处理小鼠。我们的数据显示，与未转导的模拟t细胞(mock-t)相比，所有cart都产生了显著的抗肿瘤作用(图8b)。即便某些肿瘤可能会经历短暂生长(图8b和图8f)，6g11cart和8f8 cart最终都可以根除肿瘤。12d7 cart延迟并抑制肿瘤生长，但没有根除肿瘤(图8b和图8f)。在第二个实验中，我们将hepg2细胞的数量增加一倍至500万，用于肿瘤接种。7天后，用相同剂量的300万个cart处理携带肿瘤的小鼠。我们发现，虽然8f8 cart仍然能够根除大于90％的肿瘤，但6g11 cart仅在20％的小鼠中实现了完全根除(图8g)。将6g11cart剂量增加至1000万导致完全根除约90％处理的小鼠中的肿瘤(表2)。因此，1.2倍至2倍的6g11 cart的过继转移(与接种的hepg2细胞的数量相比)可导致完全根除75％-90％处理的小鼠中的hcc肿瘤。8f8 cart显著更有效，即使只转移了0.6倍的8f8 cart，也在大于90％的小鼠中导致完全根除。表2总结了5个体内实验的抗肿瘤作用。这些体内抗肿瘤作用数据与体外数据一致(图6)，显示8f8 cart产生最强的细胞毒性和最高的细胞因子产量，而12d7 cart具有最弱的效应子功能。
[0177]
表2
[0178][0179]
监测cart在携带肿瘤的nsg小鼠中的扩增和持久性(图8c至图8e)。数据显示，在转移后的第11天至第25天之间，在用6g11 cart和8f8 cart处理的组中，人t细胞的百分比(图8d)和car t细胞的百分比(图8e)显著增加。过继转移后2周，用6g11 cart细胞和8f8 cart细胞处理的组中的car t细胞从接种前的10％-15％增加到30％-60％(图8e)。相反，用12d7cart处理的组显示采用的人t细胞和car t细胞的百分比没有增加。数据表明，6g11 cart和8f8 cart在体内遇到hcc肿瘤细胞时被激活并扩增，这与它们的有效抗肿瘤作用和肿瘤的消退有关。
[0180]
实施例x：cart的产生概述
[0181]
1.从单克隆杂交瘤细胞中分离出总rna。使用5'race技术通过pcr合成并扩增cdna。对pcr产物进行测序。单克隆抗体(mab)6g11、8f8和12d7的轻链(vl)和重链(vh)的可变区的核苷酸序列如下所示。将根据cdna推导的氨基酸序列与imgt数据库进行比对。并给出了每个mab的指定的骨架区(fr)和互补决定区(cdr)。
[0182]
a.mab 6g11-vl：
[0183]
6g11_vl的原始序列 c区的部分(465bp)
[0184][0185]
b.mab 6g11-vh
[0186]
6g11_vh的原始序列 c区的部分(507bp)
[0187][0188]
c.mab 8f8-vl
[0189]
8f8_vl的原始序列 c区的部分(450bp)
[0190][0191]
d.mab 8f8-vh
[0192]
8f8_vh的原始序列 c区的部分(420bp)
[0193]
[0194]
e.mab 12d7-vl
[0195]
12d7-vl的原始序列 c区的部分(671bp)
[0196][0197]
f.mab 12d7-vh
[0198]
12d7-vh的原始序列 c区的部分(510bp)
[0199][0200]
2.接下来，我们通过融合人igg前导序列，每个mab(6g11、8f8和12d7)的vl或vh序列以及人igg的恒定(c)区来产生重组mab。每个重组h链和l链的氨基酸序列如下所示。
[0201]
a.重组mab 6g11氨基酸序列
[0202]
重组mab 6g11-h链
[0203][0204]
重组mab 6g11-l链
[0205][0206]
b.重组mab 8f8氨基酸序列
[0207]
8f8-h链
[0208][0209]
8f8-l链
[0210][0211]
c.重组mab 12d7氨基酸序列
[0212]
12d-h链
[0213][0214]
12d7-l链
[0215][0216]
3.接下来，我们根据mab 6g11、8f8和12d7的vl序列和vh序列构建了第二代car。3种car的dna和蛋白质的序列如下所示。
[0217]
a.6g11-car(seq id no:1)
[0218]
[0219][0220][0221]
b.8f8-car(seq id no:2)
[0222]
[0223][0224][0225]
c.12d7-car序列(seq id no:3)
[0226]
[0227][0228][0229]
讨论
[0230]
本研究的目的是通过靶向不同的hgpc3表位来开发用于hcc免疫疗法的新型有效
的cart。为此，产生了3种分别识别hgpc3的n-、c-和构象表位的mab(6g11、8f8和12d7)。这些mab具有高特异性，能够将hcc肿瘤与邻近正常肝组织区分开。然后，用mab构建cart，发现所有3种cart都可对hcc肿瘤细胞刺激做出反应而进行扩增。但是，它们的效应子功能明显不同。在hcc肿瘤细胞刺激后，8f8 cart产生了最强的细胞毒性和最高的ifnγ产量。与8f8 cart相比，6g11 cart经历了甚至更大的体外扩增，但细胞毒性稍弱，并且ifnγ和il-2的产量明显降低。相反，12d7 cart显示出最弱的细胞毒性，并且产生了最少量的ifnγ并且未产生il-2。6g11 cart和8f8 cart而非12d7 cart的过继转移，产生了强效的抗肿瘤作用，并导致了nsg小鼠中hcc肿瘤异种移植物的完全根除，这与它们的体内扩增有关。
[0231]
几个因素可能有助于cart的不同效应子功能。第一个原因可能是靶抗原中的表位位置。先前的报道表明，靶分子内表位的位置决定了cart激活的效率(38,39)。膜近端表位可能有助于靶标和cart之间形成有效的免疫突触(40)。该解释与8f8 cart非常符合，其结合hgpc3的膜近端c-表位(aa463-496)并具有最强的细胞毒性并产生最高量的细胞因子。然而，6g11 cart识别在n末端起始处的表位(aa25-39)，当然n末端在膜远端。然而，它在hcc肿瘤刺激后经历了更强的扩增，并具有强大的效应子功能，尽管它比8f8 cart稍弱。这些数据表明，cart与hgpc3的n末端表位的接合也足以启动cart激活和效应子功能。可以解释靶向膜远端表位的6g11 cart也产生强效的效应子功能和抗肿瘤作用的一个原因是其对靶抗原的可及性。事实上，我们的数据显示，90％的6g11 car t细胞可结合hgpc3，而只有约40％的8f8 car t细胞和12d7 car t细胞能够结合hgpc3，这表明t细胞上的6g11 car和hgpc3上的6g11'表位更容易相互接触(图5d至图5f)。因此，即使靶表位可能不在膜附近，更多的car和hgpc3接合也可能产生更强的信号传导来激活cart。另一个可能影响cart功能的因素是mab的亲和力(41)。根据两次测量(bli和elisa)的数据，3种mab的亲和力顺序为6g11＞12d7＞8f8。即使表位是膜远端的，6g11对hgpc3的高亲和力也可能有助于产生cart和肿瘤细胞的更强的相互作用。第三，hgpc3的n片段通过二硫键与c片段连接(25,42,43)，这可能使n末端表位比预期的更接近细胞膜，从而在cart和肿瘤细胞之间产生更强的相互作用。然而，由于最近的研究(44,45)表明，强大的t细胞信号传导可能导致过早衰竭，因此确定这些cart的信号传导强度及其与表位位置和效应子功能的相关性将是有趣的。
[0232]
与识别hgpc3特定区域的6g11和8f8不同，12d7 cart识别hgpc3的n片段上的构象表位，并具有最低的效应子功能。这些数据与最近的一份报告一致，该报告显示，即使会议摘要(46)中没有提供详细的分析，靶向gpc3构象表位的hn3 cart也没有产生抗肿瘤效力。在研究中，对hepg2细胞刺激做出反应的12d7 cart的扩增与8f8 cart的扩增一样好(图6a至图6b)，但它们不产生效应子细胞因子，并且具有较弱的细胞毒性(图6c至图6d)。12d7 cart与hgpc3构象表位的接合可能会产生足够的信号传导来驱动cart的增殖，但不足以完全激活cart以具有效应子功能。缺乏细胞因子尤其是il-2的产生可解释12d7 cart无法在体内扩增(图8e和图8f)，这与它们较弱的体内抗肿瘤作用有关。
[0233]
即使8f8 mab对hgpc3的亲和力最低，但在hepg2肿瘤细胞刺激后，8f8 cart产生最强的细胞毒性并产生最高量的细胞因子。另一方面，6g11 mab和12d7 mab具有相似的亲和力，但它们的效应子功能却截然不同(图6)。此外，可溶性hgpc3不会激活cart，也不会阻止肿瘤细胞激活cart(图7)。总之，这些数据表明，几个参数可能会影响cart的激活，并且免疫突触可能在cart的效应子功能中起主导作用(40,47)。
[0234]
当前和以前的大多数研究主要集中在信号转导领域，包括第1代到第3代car，以提高car-t的效力(48)。抗体结构域在产生强效cart中的作用研究较少。靶向hgpc3不同区域并具有不同亲和力的3种新型cart不仅为hcc免疫疗法提供了更多的宝库，而且为我们扩展cart和靶肿瘤细胞的相互作用机制的研究提供了材料和机会。需要进一步的研究来分析每个cart的亚群，并研究免疫突触和它们产生的信号传导强度。这些不同的cart特性可能有助于我们揭示cart扩增、激活和效应子功能之间的关系背后的机制，并使我们能够进一步提高它们的抗肿瘤效力。
[0235]
尽管在前面的说明书中已关于本发明的某些实施方案描述了本发明，并且出于说明的目的已经提出了许多细节，但是对于本领域技术人员来说显而易见的是，本发明可容许有其他实施方案，并且在不脱离本发明的基本原理的情况下，本文所述的某些细节可以进行相当大的改变。
[0236]
本文所引用的所有参考文献全文均以引用方式并入本文。在不脱离本发明的精神或本质属性的情况下，本发明可以其他特定形式来体现，并且因此，应参考所附权利要求，而不是前述说明书，来指示本发明的范围。