包含乳杆菌菌株组合的用于消化道健康的组合物的制作方法

包含乳杆菌菌株组合的用于消化道健康的组合物
1.相关申请的交叉引用
2.本技术要求2019年8月16日提交的美国临时专利申请号62/887,847的优先权，该临时专利申请的公开通过援引以其全文并入本文。
技术领域
3.本文尤其提供了可用于改善动物消化道健康和/或性能的多菌株直接饲喂微生物细菌聚生体以及制备和使用该多菌株直接饲喂微生物细菌聚生体的方法。


背景技术：

4.在禽类等单胃动物物种中，胃肠道和肠相关的微生物区系不仅参与消化和吸收，而且还与免疫和中枢神经系统相互作用以调节健康。肠道的内部涂覆有粘稠的薄层粘液，并且数百万的细菌和其他微生物包埋在该粘液层中。当肠细菌处于平衡(即，有益细菌的数量超过有害细菌)时，可以说消化道处于健康状态。健康的微生物群为宿主提供多种益处，包括对广谱病原体的定殖抗力、必需营养素的生物合成和吸收以及维持健康的消化道上皮和适当控制的全身免疫的免疫刺激。在“微生态失衡”或共生遭破坏的情况下，微生物群功能可能会丧失或紊乱，导致对病原体的易感性增加、代谢特征改变或促炎信号的诱导，其可能会导致局部或全身炎症或自身免疫。因此，家禽的肠微生物群在许多疾病和障碍的发病机理中起到重要作用，这些疾病和障碍包括诸如球虫病或坏死性肠炎等消化道的多种病原性感染。
5.在过去的几年中，政府和消费者对动物饲料行业施加的压力越来越大，要求减少或缩减抗生素作为动物营养饲喂方案的组成部分的使用。这种压力在很大程度上是由于认识到使用此类抗生素会导致耐抗生素病原性微生物的增加。然而，这种“永不使用抗生素”的消费趋势，尤其是在家禽行业，导致了细菌性疾病(特别是坏死性肠炎)的再度出现(poultry science[家禽科学],第97卷,第6期,2018年6月1日,1929-1933)。坏死性肠炎是由某些产毒素的产气荚膜梭菌(clostridium perfringens)菌株引起的。在某些条件下，产气荚膜梭菌产生的毒素会在小肠中引起病变，并最终导致受感染的禽类的生长减缓或死亡。因此，目前公认需要能够在不使用传统上使用的抗生素的情况下减少家养动物如禽类消化道中的病原性细菌群体的产品和方法。
[0006]
本文所公开的主题解决了这些需求且还提供了额外的益处。


技术实现要素：

[0007]
本文尤其提供了产有机酸微生物的多菌株直接饲喂微生物细菌聚生体，以及制备所述聚生体并使用所述聚生体来抑制动物(如禽类，例如，鸡)胃肠道中病原性细菌群体并另外促进动物的一项或多项指标改善的方法，所述一项或多项指标是例如增加的体重增重、降低的饲料转化率(fcr)、改善的消化道屏障完整性、降低的死亡率、减少的病原体感染和粪便中减少的病原体脱落。
[0008]
因此，在一些方面，本文提供了一种饲料添加剂组合物，其包含直接饲喂微生物(dfm)，所述组合物包含(a)至少一种生物学纯的(i)罗伊氏乳杆菌(lactobacillus reuteri)菌株；和/或(ii)唾液乳杆菌(l.salivarius)菌株；以及(b)一种或多种额外的生物学纯的(i)罗伊氏乳杆菌菌株；(ii)敏捷乳杆菌(l.agilis)菌株；(iii)卷曲乳杆菌(l.crispatus)菌株；和/或(iv)母鸡乳杆菌(l.gallinarum)菌株。在一些实施例中，所述饲料添加剂组合物包含三种生物学纯的罗伊氏乳杆菌菌株。在本文提供的任何实施例中的一些实施例中，所述饲料添加剂组合物包含(a)细菌菌株，其具有与罗伊氏乳杆菌菌株s1的16s核糖体rna序列呈现出至少97.0％序列相似性的16s核糖体rna序列，所述罗伊氏乳杆菌菌株s1保藏于韦斯特迪克真菌生物多样性研究所(wfdb)，保藏号为cbs 145921；和(b)(i)细菌菌株，其具有与罗伊氏乳杆菌菌株s2的16s核糖体rna序列呈现出至少97.0％序列相似性的16s核糖体rna序列，所述罗伊氏乳杆菌菌株s2保藏于wfdb，保藏号为cbs 145922；以及(ii)细菌菌株，其具有与罗伊氏乳杆菌菌株s3的16s核糖体rna序列呈现出至少97.0％序列相似性的16s核糖体rna序列，所述罗伊氏乳杆菌菌株s3保藏于wfdb，保藏号为cbs 145923。在本文提供的任何实施例中的一些实施例中，所述组合物包含(a)罗伊氏乳杆菌菌株s1(cbs 145921)或具有罗伊氏乳杆菌菌株s1(cbs 145921)的所有鉴别特征的活菌株；和(b)(i)罗伊氏乳杆菌菌株s2(cbs 145922)或具有罗伊氏乳杆菌菌株s2(cbs 145922)的所有鉴别特征的活菌株；以及(ii)罗伊氏乳杆菌菌株s3(cbs 145923)或具有罗伊氏乳杆菌菌株s3(cbs 145923)的所有鉴别特征的活菌株，这些菌株(a)是单独的；或(b)与衍生自这些菌株中的每一种的培养上清液组合。在一些实施例中，所述饲料添加剂组合物包含(a)生物学纯的唾液乳杆菌菌株；和(b)(i)生物学纯的母鸡乳杆菌菌株；以及(ii)(a)生物学纯的敏捷乳杆菌菌株；或(b)生物学纯的罗伊氏乳杆菌菌株。在本文提供的任何实施例中的一些实施例中，所述饲料添加剂组合物包含(a)细菌菌株，其具有与唾液乳杆菌菌株h2的16s核糖体rna序列呈现出至少97.0％序列相似性的16s核糖体rna序列，所述唾液乳杆菌菌株h2保藏于wfdb，保藏号为cbs 145919；和(b)(i)细菌菌株，其具有与母鸡乳杆菌菌株h1的16s核糖体rna序列呈现出至少97.0％序列相似性的16s核糖体rna序列，所述母鸡乳杆菌菌株h1保藏于wfdb，保藏号为cbs 145918；以及(ii)(a)细菌菌株，其具有与包含seq id no:1的敏捷乳杆菌菌株h3的16s核糖体rna序列呈现出至少97.0％序列相似性的16s核糖体rna序列；或(b)细菌菌株，其具有与罗伊氏乳杆菌菌株a2的16s核糖体rna序列呈现出至少97.0％序列相似性的16s核糖体rna序列，所述罗伊氏乳杆菌菌株a2保藏于wfdb，保藏号为cbs 145924。在一些实施例中，所述组合物包含(a)唾液乳杆菌菌株h2(cbs 145919)或具有唾液乳杆菌菌株h2(cbs 145919)的所有鉴别特征的活菌株；和(b)(i)母鸡乳杆菌菌株h1(cbs 145918)或具有母鸡乳杆菌菌株h1(cbs 145918)的所有鉴别特征的活菌株；以及(ii)罗伊氏乳杆菌菌株a2(cbs 145924)或具有罗伊氏乳杆菌菌株a2(cbs 145924)的所有鉴别特征的活菌株，这些菌株(a)是单独的；或(b)与衍生自这些菌株中的每一种的培养上清液组合。在一些实施例中，所述饲料添加剂组合物包含(a)生物学纯的唾液乳杆菌菌株；和(b)(i)生物学纯的敏捷乳杆菌菌株；以及生物学纯的罗伊氏乳杆菌菌株。在本文提供的任何实施例中的一些实施例中，所述饲料添加剂组合物包含(a)细菌菌株，其具有与包含seq id no:2的唾液乳杆菌菌株a1的16s核糖体rna序列呈现出至少97.0％序列相似性的16s核糖体rna序列；和(b)(i)细菌菌株，其具有与包含seq id no:3的敏捷乳杆菌菌株a3的16s核糖体rna序列呈
现出至少97.0％序列相似性的16s核糖体rna序列；以及(ii)细菌菌株，其具有与罗伊氏乳杆菌菌株a2的16s核糖体rna序列呈现出至少97.0％序列相似性的16s核糖体rna序列，所述罗伊氏乳杆菌菌株a2保藏于wfdb，保藏号为cbs 145924，这些菌株(a)是单独的；或(b)与衍生自这些菌株中的每一种的培养上清液组合。如权利要求9所述的饲料添加剂组合物，其包含罗伊氏乳杆菌菌株a2(cbs 145924)或具有罗伊氏乳杆菌菌株a2(cbs 145924)的所有鉴别特征的活菌株。如权利要求1所述的饲料添加剂组合物，其包含(a)生物学纯的唾液乳杆菌菌株；和(b)(i)生物学纯的敏捷乳杆菌菌株；以及(ii)生物学纯的卷曲乳杆菌菌株。在本文提供的任何实施例中的一些实施例中，所述饲料添加剂组合物包含(a)细菌菌株，其具有与包含seq id no:4的唾液乳杆菌菌株d2的16s核糖体rna序列呈现出至少97.0％序列相似性的16s核糖体rna序列；(b)(i)细菌菌株，其具有与包含seq id no:5的敏捷乳杆菌菌株d1的16s核糖体rna序列呈现出至少97.0％序列相似性的16s核糖体rna序列；以及(ii)细菌菌株，其具有与包含seq id no:6的卷曲乳杆菌菌株d3的16s核糖体rna序列呈现出至少97.0％序列相似性的16s核糖体rna序列，这些菌株(a)是单独的；或(b)与衍生自这些菌株中的每一种的培养上清液组合。在本文提供的任何实施例中的一些实施例中，a)罗伊氏乳杆菌菌株s1的所述16s核糖体rna序列包含seq id no:7的核苷酸序列；并且(b)(i)罗伊氏乳杆菌菌株s2的所述16s核糖体rna序列包含seq id no:8的核苷酸序列；并且(ii)罗伊氏乳杆菌菌株s3的所述16s核糖体rna序列包含seq id no:9的核苷酸序列。在本文提供的任何实施例中的一些实施例中，a)唾液乳杆菌菌株h2的所述16s核糖体rna序列包含seq id no:10的核苷酸序列；并且(b)(i)母鸡乳杆菌菌株h1的所述16s核糖体rna序列包含seq id no:11的核苷酸序列；并且(ii)罗伊氏乳杆菌菌株a2的所述16s核糖体rna序列包含seq id no:12的核苷酸序列。在一些实施例中，(b)(ii)罗伊氏乳杆菌菌株a2的所述16s核糖体rna序列包含seq id no:12的核苷酸序列。在本文提供的任何实施例中的一些实施例中，所述一种或多种菌株进一步包含一种或多种抗微生物药物抗性(amr)基因被灭活或缺失。在本文提供的任何实施例中的一些实施例中，所述组合物产生选自由以下组成的组的一种或多种有机酸：乳酸、丁酸、异丁酸、丙酸、乙酸、异戊酸和戊酸。在本文提供的任何实施例中的一些实施例中，所述组合物进一步包含一种或多种酶。在一些实施例中，所述一种或多种酶选自由以下组成的组：植酸酶、蛋白酶、淀粉酶、木聚糖酶和β-葡聚糖酶。在本文提供的任何实施例中的一些实施例中，所述组合物进一步包含一种或多种精油。在本文提供的任何实施例中的一些实施例中，每种菌株以至少约1x103cfu/g饲料添加剂组合物到至少约1x109cfu/g(如至少约1x10
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cfu/g)饲料添加剂组合物的浓度存在。在本文提供的任何实施例中的一些实施例中，所述组合物在已摄取有效量的所述直接饲喂微生物组合物的禽类的胃肠道中抑制选自禽病原性沙门菌属物种(salmonella sp.)、大肠杆菌(escherichia coli)、产气荚膜梭菌和肠杆菌科(enterobacteriaceae)的至少一种病原体。在本文提供的任何实施例中的一些实施例中，将该组合物配制用于经由水管(waterline)递送给动物。
[0009]
在其他方面，本文提供了一种细菌聚生体，其包含(a)细菌菌株，其具有与罗伊氏乳杆菌菌株s1的16s核糖体rna序列呈现出至少97.0％序列相似性的16s核糖体rna序列，所述罗伊氏乳杆菌菌株s1保藏于韦斯特迪克真菌生物多样性研究所(wfdb)，保藏号为cbs 145921；和(b)细菌菌株，其具有与罗伊氏乳杆菌菌株s2的16s核糖体rna序列呈现出至少97.0％序列相似性的16s核糖体rna序列，所述罗伊氏乳杆菌菌株s2保藏于wfdb，保藏号为
cbs 145922；以及(c)细菌菌株，其具有与罗伊氏乳杆菌菌株s3的16s核糖体rna序列呈现出至少97.0％序列相似性的16s核糖体rna序列，所述罗伊氏乳杆菌菌株s3保藏于wfdb，保藏号为cbs 145923。在一些实施例中，所述聚生体包含(a)罗伊氏乳杆菌菌株s1(cbs 145921)或具有罗伊氏乳杆菌菌株s1(cbs 145921)的所有鉴别特征的活菌株；和(b)罗伊氏乳杆菌菌株s2(cbs 145922)或具有罗伊氏乳杆菌菌株s2(cbs 145922)的所有鉴别特征的活菌株；以及(c)罗伊氏乳杆菌菌株s3(cbs 145923)或具有罗伊氏乳杆菌菌株s3(cbs 145923)的所有鉴别特征的活菌株，这些菌株(a)是单独的；或(b)与衍生自这些菌株中的每一种的培养上清液组合。在一些实施例中，所述聚生体包含a)罗伊氏乳杆菌菌株s1的所述16s核糖体rna序列包含seq id no:7的核苷酸序列；并且(b)罗伊氏乳杆菌菌株s2的所述16s核糖体rna序列包含seq id no:8的核苷酸序列；并且(c)罗伊氏乳杆菌菌株s3的所述16s核糖体rna序列包含seq id no:9的核苷酸序列。在本文公开的任何实施例中的一些实施例中，一种或多种细菌菌株进一步包含一种或多种抗微生物药物抗性(amr)基因被灭活或缺失。在本文公开的任何实施例中的一些实施例中，所述聚生体产生选自由以下组成的组的一种或多种有机酸：乳酸、丁酸、异丁酸、丙酸、乙酸、异戊酸和戊酸。在本文公开的任何实施例中的一些实施例中，每种菌株在所述聚生体中以至少约1x103cfu/动物/天到至少约1x10
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cfu/动物/天的浓度存在。在本文公开的任何实施例中的一些实施例中，所述聚生体在已摄取有效量的所述直接饲喂微生物组合物的禽类的胃肠道中抑制选自禽病原性沙门菌属物种、大肠杆菌、产气荚膜梭菌和肠杆菌科的至少一种病原体。
[0010]
在另外的方面，本文提供了一种细菌聚生体，其包含(a)细菌菌株，其具有与唾液乳杆菌菌株h2的16s核糖体rna序列呈现出至少97.0％序列相似性的16s核糖体rna序列，所述唾液乳杆菌菌株h2保藏于wfdb，保藏号为cbs 145919；和(b)细菌菌株，其具有与母鸡乳杆菌菌株h1的16s核糖体rna序列呈现出至少97.0％序列相似性的16s核糖体rna序列，所述母鸡乳杆菌菌株h1保藏于wfdb，保藏号为cbs 145918；以及(c)(i)细菌菌株，其具有与包含seq id no:1的敏捷乳杆菌菌株h3的16s核糖体rna序列呈现出至少97.0％序列相似性的16s核糖体rna序列；或(ii)细菌菌株，其具有与罗伊氏乳杆菌菌株a2的16s核糖体rna序列呈现出至少97.0％序列相似性的16s核糖体rna序列，所述罗伊氏乳杆菌菌株a2保藏于wfdb，保藏号为cbs 145924。在一些实施例中，所述聚生体包含(a)唾液乳杆菌菌株h2(cbs 145919)或具有唾液乳杆菌菌株h2(cbs 145919)的所有鉴别特征的活菌株；和(b)母鸡乳杆菌菌株h1(cbs 145918)或具有母鸡乳杆菌菌株h1(cbs 145918)的所有鉴别特征的活菌株；以及(c)罗伊氏乳杆菌菌株a2(cbs 145924)或具有罗伊氏乳杆菌菌株a2(cbs 145924)的所有鉴别特征的活菌株，这些菌株(a)是单独的；或(b)与衍生自这些菌株中的每一种的培养上清液组合。在本文公开的任何实施例中的一些实施例中，一种或多种细菌菌株进一步包含一种或多种抗微生物药物抗性(amr)基因被灭活或缺失。在本文公开的任何实施例中的一些实施例中，所述聚生体产生选自由以下组成的组的一种或多种有机酸：乳酸、丁酸、异丁酸、丙酸、乙酸、异戊酸和戊酸。在本文公开的任何实施例中的一些实施例中，每种菌株在所述聚生体中以至少约1x103cfu/动物/天到至少约1x10
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cfu/动物/天的浓度存在。在本文公开的任何实施例中的一些实施例中，所述聚生体在已摄取有效量的所述直接饲喂微生物组合物的禽类的胃肠道中抑制选自禽病原性沙门菌属物种、大肠杆菌、产气荚膜梭菌和肠杆菌科的至少一种病原体。
[0011]
在仍另外的方面，本文提供了一种细菌聚生体，其包含(a)细菌菌株，其具有与包含seq id no:2的唾液乳杆菌菌株a1的16s核糖体rna序列呈现出至少97.0％序列相似性的16s核糖体rna序列；和(b)细菌菌株，其具有与包含seq id no:3的敏捷乳杆菌菌株a3的16s核糖体rna序列呈现出至少97.0％序列相似性的16s核糖体rna序列；以及(c)细菌菌株，其具有与罗伊氏乳杆菌菌株a2的16s核糖体rna序列呈现出至少97.0％序列相似性的16s核糖体rna序列，所述罗伊氏乳杆菌菌株a2保藏于wfdb，保藏号为cbs 145924，这些菌株(a)是单独的；或(b)与衍生自这些菌株中的每一种的培养上清液组合。在一些实施例中，所述聚生体包含罗伊氏乳杆菌菌株a2(cbs 145924)或具有罗伊氏乳杆菌菌株a2(cbs 145924)的所有鉴别特征的活菌株。在本文公开的任何实施例中的一些实施例中，一种或多种细菌菌株进一步包含一种或多种抗微生物药物抗性(amr)基因被灭活或缺失。在本文公开的任何实施例中的一些实施例中，所述聚生体产生选自由以下组成的组的一种或多种有机酸：乳酸、丁酸、异丁酸、丙酸、乙酸、异戊酸和戊酸。在本文公开的任何实施例中的一些实施例中，每种菌株在所述聚生体中以至少约1x103cfu/动物/天到至少约1x10
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cfu/动物/天的浓度存在。在本文公开的任何实施例中的一些实施例中，所述聚生体在已摄取有效量的所述直接饲喂微生物组合物的禽类的胃肠道中抑制选自禽病原性沙门菌属物种、大肠杆菌、产气荚膜梭菌和肠杆菌科的至少一种病原体。
[0012]
在另一个方面，本文提供了一种细菌聚生体，其包含(a)细菌菌株，其具有与包含seq id no:4的唾液乳杆菌菌株d2的16s核糖体rna序列呈现出至少97.0％序列相似性的16s核糖体rna序列；(b)细菌菌株，其具有与包含seq id no:5的敏捷乳杆菌菌株d1的16s核糖体rna序列呈现出至少97.0％序列相似性的16s核糖体rna序列；以及(c)细菌菌株，其具有与包含seq id no:6的卷曲乳杆菌菌株d3的16s核糖体rna序列呈现出至少97.0％序列相似性的16s核糖体rna序列，这些菌株(a)是单独的；或(b)与衍生自这些菌株中的每一种的培养上清液组合。在本文公开的任何实施例中的一些实施例中，一种或多种细菌菌株进一步包含一种或多种抗微生物药物抗性(amr)基因被灭活或缺失。在本文公开的任何实施例中的一些实施例中，所述聚生体产生选自由以下组成的组的一种或多种有机酸：乳酸、丁酸、异丁酸、丙酸、乙酸、异戊酸和戊酸。在本文公开的任何实施例中的一些实施例中，每种菌株在所述聚生体中以至少约1x103cfu/动物/天到至少约1x10
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cfu/动物/天的浓度存在。在本文公开的任何实施例中的一些实施例中，所述聚生体在已摄取有效量的所述直接饲喂微生物组合物的禽类的胃肠道中抑制选自禽病原性沙门菌属物种、大肠杆菌、产气荚膜梭菌和肠杆菌科的至少一种病原体。
[0013]
在其他方面，本文提供了一种预混物，其包含本文公开的饲料添加剂组合物中的任一种或本文公开的细菌聚生体中的任一种，以及至少一种矿物质和/或至少一种维生素。
[0014]
在另外的方面，本文提供了一种饲料，其包含本文公开的饲料添加剂组合物中的任一种或本文公开的预混物中的任一种或本文公开的细菌聚生体中的任一种。
[0015]
在又其他方面，本文提供了一种试剂盒，其包含a)本文公开的饲料添加剂组合物中的任一种或本文公开的细菌聚生体中的任一种；以及b)针对向动物施用的书面说明。在一些实施例中，所述试剂盒进一步包含一种或多种酶。在一些实施例中，所述一种或多种酶选自由以下组成的组：植酸酶、蛋白酶、淀粉酶、木聚糖酶和β-葡聚糖酶。
[0016]
在另一个方面，本文提供了一种用于改善动物的一项或多项指标的方法，所述一
项或多项指标选自由以下组成的组：增加的体重增重、肠健康状态、降低的饲料转化率(fcr)、改善的消化道屏障完整性、降低的死亡率、减少的病原体感染和粪便中减少的病原体脱落，所述方法包括施用有效量的本文公开的细菌聚生体中的任一种、或本文公开的饲料添加剂组合物中的任一种、本文公开的预混物中的任一种、或本文公开的饲料中的任一种，从而改善所述动物的所述一项或多项指标。在一些实施例中，所述饲料添加剂组合物使所述动物的胃肠道的乳酸、乙酸、异丁酸、丁酸、异戊酸和/或戊酸中的一种或多种的含量增加。在本文提供的任何实施例中的一些实施例中，所述病原体是产气荚膜梭菌、空肠弯曲杆菌(campylobacter jejuni)、肠杆菌科、沙门菌属物种和/或大肠杆菌中的一种或多种。在本文提供的任何实施例中的一些实施例中，所述方法进一步治疗、预防坏死性肠炎或降低坏死性肠炎的发生率。在本文提供的任何实施例中的一些实施例中，所述动物是家养禽类。在一些实施例中，所述家养禽类选自由鸡、火鸡、鸭、鹅、鹌鹑、鸸鹋、鸵鸟和雉鸡组成的组。在一些实施例中，所述鸡是肉鸡或蛋鸡。
[0017]
在仍另外的方面，本文提供了一种用于制备饲料添加剂组合物或细菌聚生体的方法，所述方法包括将以下组合：(a)细菌菌株，其具有与罗伊氏乳杆菌菌株s1的16s核糖体rna序列呈现出至少97.0％序列相似性的16s核糖体rna序列，所述罗伊氏乳杆菌菌株s1保藏于韦斯特迪克真菌生物多样性研究所(wfdb)，保藏号为cbs 145921；和(b)(i)细菌菌株，其具有与罗伊氏乳杆菌菌株s2的16s核糖体rna序列呈现出至少97.0％序列相似性的16s核糖体rna序列，所述罗伊氏乳杆菌菌株s2保藏于wfdb，保藏号为cbs 145922；以及(ii)细菌菌株，其具有与罗伊氏乳杆菌菌株s3的16s核糖体rna序列呈现出至少97.0％序列相似性的16s核糖体rna序列，所述罗伊氏乳杆菌菌株s3保藏于wfdb，保藏号为cbs 145923。在一些实施例中，(a)所述罗伊氏乳杆菌菌株s1是罗伊氏乳杆菌菌株s1(cbs 145921)或具有罗伊氏乳杆菌菌株s1(cbs 145921)的所有鉴别特征的活菌株；并且(b)(i)所述罗伊氏乳杆菌菌株s2是罗伊氏乳杆菌菌株s2(cbs 145922)或具有罗伊氏乳杆菌菌株s2(cbs 145922)的所有鉴别特征的活菌株；并且(ii)所述罗伊氏乳杆菌菌株s3是罗伊氏乳杆菌菌株s3(cbs 145923)或具有罗伊氏乳杆菌菌株s3(cbs 145923)的所有鉴别特征的活菌株，这些菌株(a)是单独的；或(b)与衍生自这些菌株中的每一种的培养上清液组合。在本文公开的任何实施例中的一些实施例中，所述方法进一步包括将一种或多种酶与所述饲料添加剂组合物组合。在一些实施例中，所述一种或多种酶选自由以下组成的组：植酸酶、蛋白酶、淀粉酶、木聚糖酶和β-葡聚糖酶。在本文公开的任何实施例中的一些实施例中，将至少约1x103cfu/g饲料添加剂组合物到至少约1x109cfu/g饲料添加剂组合物组合以形成所述饲料添加剂组合物。在本文公开的任何实施例中的一些实施例中，所述方法进一步包括将所述饲料添加剂组合物包装。
[0018]
在另一个方面，本文提供了一种用于制备饲料添加剂组合物或细菌聚生体的方法，所述方法包括将以下组合：(a)细菌菌株，其具有与唾液乳杆菌菌株h2的16s核糖体rna序列呈现出至少97.0％序列相似性的16s核糖体rna序列，所述唾液乳杆菌菌株h2保藏于wfdb，保藏号为cbs 145919；和(b)(i)细菌菌株，其具有与母鸡乳杆菌菌株h1的16s核糖体rna序列呈现出至少97.0％序列相似性的16s核糖体rna序列，所述母鸡乳杆菌菌株h1保藏于wfdb，保藏号为cbs 145918；以及(ii)(a)细菌菌株，其具有与包含seq id no:1的敏捷乳杆菌菌株h3的16s核糖体rna序列呈现出至少97.0％序列相似性的16s核糖体rna序列；或
(b)细菌菌株，其具有与罗伊氏乳杆菌菌株a2的16s核糖体rna序列呈现出至少97.0％序列相似性的16s核糖体rna序列，所述罗伊氏乳杆菌菌株a2保藏于wfdb，保藏号为cbs 145924。在一些实施例中，(a)所述唾液乳杆菌菌株h2是唾液乳杆菌菌株h2(cbs 145919)或具有唾液乳杆菌菌株h2(cbs 145919)的所有鉴别特征的活菌株；并且(b)(i)所述母鸡乳杆菌菌株h1是母鸡乳杆菌菌株h1(cbs 145918)或具有母鸡乳杆菌菌株h1(cbs 145918)的所有鉴别特征的活菌株；并且(ii)所述罗伊氏乳杆菌菌株a2是罗伊氏乳杆菌菌株a2(cbs 145924)或具有罗伊氏乳杆菌菌株a2(cbs 145924)的所有鉴别特征的活菌株，这些菌株(a)是单独的；或(b)与衍生自这些菌株中的每一种的培养上清液组合。在本文公开的任何实施例中的一些实施例中，所述方法进一步包括将一种或多种酶与所述饲料添加剂组合物组合。在一些实施例中，所述一种或多种酶选自由以下组成的组：植酸酶、蛋白酶、淀粉酶、木聚糖酶和β-葡聚糖酶。在本文公开的任何实施例中的一些实施例中，将至少约1x103cfu/g饲料添加剂组合物到至少约1x109cfu/g饲料添加剂组合物组合以形成所述饲料添加剂组合物。在本文公开的任何实施例中的一些实施例中，所述方法进一步包括将所述饲料添加剂组合物包装。
[0019]
在其他方面，本文提供了一种用于制备饲料添加剂组合物或细菌聚生体的方法，所述方法包括将以下组合：(a)细菌菌株，其具有与包含seq id no:2的唾液乳杆菌菌株a1的16s核糖体rna序列呈现出至少97.0％序列相似性的16s核糖体rna序列；和(b)(i)细菌菌株，其具有与包含seq id no:3的敏捷乳杆菌菌株a3的16s核糖体rna序列呈现出至少97.0％序列相似性的16s核糖体rna序列；以及(ii)细菌菌株，其具有与罗伊氏乳杆菌菌株a2的16s核糖体rna序列呈现出至少97.0％序列相似性的16s核糖体rna序列，所述罗伊氏乳杆菌菌株a2保藏于wfdb，保藏号为cbs 145924，这些菌株(a)是单独的；或(b)与衍生自这些菌株中的每一种的培养上清液组合。在一些实施例中，所述罗伊氏乳杆菌菌株a2是罗伊氏乳杆菌菌株a2(cbs 145924)或具有罗伊氏乳杆菌菌株a2(cbs 145924)的所有鉴别特征的活菌株。在本文公开的任何实施例中的一些实施例中，所述方法进一步包括将一种或多种酶与所述饲料添加剂组合物组合。在一些实施例中，所述一种或多种酶选自由以下组成的组：植酸酶、蛋白酶、淀粉酶、木聚糖酶和β-葡聚糖酶。在本文公开的任何实施例中的一些实施例中，将至少约1x103cfu/g饲料添加剂组合物到至少约1x109cfu/g饲料添加剂组合物组合以形成所述饲料添加剂组合物。在本文公开的任何实施例中的一些实施例中，所述方法进一步包括将所述饲料添加剂组合物包装。
[0020]
在另外的方面，本文提供了一种用于制备饲料添加剂组合物或细菌聚生体的方法，所述方法包括将以下组合：(a)细菌菌株，其具有与包含seq id no:4的唾液乳杆菌菌株d2的16s核糖体rna序列呈现出至少97.0％序列相似性的16s核糖体rna序列；(b)(i)细菌菌株，其具有与包含seq id no:5的敏捷乳杆菌菌株d1的16s核糖体rna序列呈现出至少97.0％序列相似性的16s核糖体rna序列；以及(ii)细菌菌株，其具有与包含seq id no:6的卷曲乳杆菌菌株d3的16s核糖体rna序列呈现出至少97.0％序列相似性的16s核糖体rna序列，这些菌株(a)是单独的；或(b)与衍生自这些菌株中的每一种的培养上清液组合。在本文公开的任何实施例中的一些实施例中，所述方法进一步包括将一种或多种酶与所述饲料添加剂组合物组合。在一些实施例中，所述一种或多种酶选自由以下组成的组：植酸酶、蛋白酶、淀粉酶、木聚糖酶和β-葡聚糖酶。在本文公开的任何实施例中的一些实施例中，将至少
约1x103cfu/g饲料添加剂组合物到至少约1x109cfu/g饲料添加剂组合物组合以形成所述饲料添加剂组合物。在本文公开的任何实施例中的一些实施例中，所述方法进一步包括将所述饲料添加剂组合物包装。
[0021]
在其他方面，本文提供了一种用于制备预混物的方法，所述方法包括将本文公开的饲料添加剂组合物中的任一种与至少一种矿物质和/或至少一种维生素组合。在一些实施例中，所述方法进一步包括将所述预混物包装。
[0022]
本文所描述的方面和实施例中的每个能够一起使用，除非明确地或清楚地从实施例或方面的上下文中排除。
[0023]
在整个说明书中，援引了各种专利、专利申请和其他类型的出版物(例如，期刊文章、电子数据库条目等)。出于所有目的，本文所引用的所有专利、专利申请和其他出版物的公开通过援引以其全文特此并入。
附图说明
[0024]
图1描绘了表示大型动物研究中所有鸡舍随时间的累积死亡率数据的图。
具体实施方式
[0025]
已表明多种微生物物种在体外或体内对消化道病原体具有一定程度的功效。如本文更详细地描述的，发明人惊奇地发现，将特定种类的产有机酸(如乳酸)的微生物施用于动物(如家养禽类，例如，鸡)可以改善一项或多项指标的表现，该一项或多项指标包括增加的体重增重、肠健康状态、降低的饲料转化率(fcr)、改善的消化道屏障完整性、降低的死亡率、减少的病原体感染(如但不限于产气荚膜梭菌感染)和粪便中减少的病原体脱落。不受理论束缚，据信产有机酸的细菌的代谢物在预防肠炎症和维持肠稳态方面起重要作用。虽然许多细菌物种具有产生有机酸的能力，但并非所有物种在作为饲料添加剂或作为饲料的一部分施用时都能为动物提供益处。然而，如将在实例部分中描述的，发现施用微生物的特定组合在预防和/或治疗动物消化道发病机理以及维持整体健康方面出人意料地有效。
[0026]
i.定义
[0027]
如本文所用，“有机酸”是指具有酸性特性的有机化合物。在一些非限制性实施例中，有机酸化合物选自由以下组成的组：乳酸(2-羟基丙酸)、琥珀酸、呋喃二甲酸、富马酸、马来酸、柠檬酸、谷氨酸、天冬氨酸、丙烯酸、草酸和葡聚糖酸。其他非限制性有机酸包括甲酸(formic acid)(甲酸(methanoic acid))、乙酸(acetic acid)(乙酸(ethanoic acid))、丙酸(propionic acid)(丙酸(propanoic acid))、丁酸(butanoic acid)(丁酸(butyric acid))、异丁酸(2-甲基丙酸)、戊酸(valeric acid)(戊酸(pentanoic acid))和异戊酸(3-甲基丁酸)。在有机酸的该定义中还包括有机酸的共轭碱，包括例如乳酸根、谷氨酸根、富马酸根、苹果酸根、甲酸根、乙酸根、丙酸根、丁酸根、异丁酸根、戊酸根、异戊酸根等。
[0028]
如本文所用，“微生物(microorganism或microbe)”是指细菌、真菌、病毒、原生动物、和其他微生物或微观生物体。
[0029]
如本文所用，术语“直接饲喂微生物”是指供动物食用的组合物(即，作为动物饲料或作为动物饲料的组分)，该组合物包含有活力的微生物，即能够生存和繁殖的微生物。参见例如美国专利号8,420,074。直接饲喂微生物可包含本文所述的任何微生物菌株中的一
种或多种(如任何1、2、3、4、5或6种或更多种)。
[0030]
如本文所用，细菌“菌株”是指在生长或繁殖时遗传上保持不变的细菌。包括许多相同的细菌。
[0031]“至少一种菌株”意指单一菌株，但也指包含至少两种微生物菌株的菌株混合物。“至少两种菌株的混合物”意指两种、三种、四种、五种、六种或甚至更多种菌株的混合物。在菌株混合物的一些实施例中，比例可以在1％至99％之间变化。当混合物包含多于两种菌株时，菌株能以基本上相等的比例或以不同的比例存在于混合物中。
[0032]
出于本公开的目的，“生物学纯的菌株”意指不包含足以干扰菌株的复制或可通过正常的细菌学技术检测到的量的其他细菌菌株的菌株。当与本文所述的生物体和培养物结合使用时，“分离”不仅包括生物学纯的菌株，而且还包括除自然界中发现的那些之外生长或维持的生物体的任何培养物。在一些实施例中，菌株是菌株a1、a2、a3、d1、d2、d3、h1、h2、h3、s1、s2、和s3的突变体、变体或衍生物，这些突变体、变体或衍生物也提供了与由a1、a2、a3、d1、d2、d3、h1、h2、h3、s1、s2、和s3所提供的益处相当的益处。在一些实施例中，菌株是具有菌株a1、a2、a3、d1、d2、d3、h1、h2、h3、s1、s2、和s3的所有鉴别特征的菌株。此外，每个单独的菌株(a1、a2、a3、d1、d2、d3、h1、h2、h3、s1、s2、和s3)或这些菌株的任何组合也可以提供本文所述的一种或多种益处。还将清楚的是，添加其他微生物菌株、载剂、添加剂、酶、酵母等也将在动物中提供一种或多种益处或改善一项或多项指标，并且不会构成实质上不同的dfm。
[0033]
术语“16s rrna”或“16s核糖体rna”意指构成原核生物核糖体小亚基的rrna。在细菌中，该序列可用于鉴定和表征运算分类单元。
[0034]
如本文所用，术语“序列同一性”或“序列相似性”意指两个多核苷酸序列(候选序列和参考序列)在候选序列的长度上是相同的(即100％序列同一性)或相似的(即在逐个核苷酸的基础上)。在将候选序列与参考序列进行比较时，如与用于两个序列的最佳比对的参考序列(其不包含添加或缺失)相比，候选序列可包含添加或缺失(即，空位)。用于确定序列同一性的最佳序列比对可以使用本领域已知的任何数量的公开可用的局部比对算法(如align或megalign(dnastar公司))、或通过检查来进行。
[0035]
如本文关于参考序列所用的术语“百分比(％)序列同一性”或“百分比(％)序列相似性”定义为在对序列进行最佳比对并在必要时引入空位以实现最大百分比序列同一性之后，候选序列中与参考多核苷酸序列中的残基相同的核苷酸残基的百分比。
[0036]
如本文所用，“预防(prevent、preventing、prevention)”及其语法变体是指部分或完全延迟或阻碍障碍或病症(如坏死性肠炎)和/或其伴随症状中的一种或多种的发生或复发，或阻止动物获得或重新获得障碍或病症或降低动物获得或重新获得障碍或病症或其伴随症状中的一种或多种的风险的方法。
[0037]
如本文所用，关于特定性状、特征、特性、生物过程、或现象的术语“减少”是指特定性状、特征、特性、生物过程、或现象的减少。性状、特征、特性、生物过程、或现象可以降低5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％或大于100％。
[0038]
如本文所用的术语“家禽”意指为了它们的蛋、它们的肉或它们的羽毛而由人类饲养的家养禽类。这些禽最典型地是鸡雁总目(galloanserae)的成员，特别是包括但不限于
鸡、鹌鹑、鸭、鹅、鸸鹋、鸵鸟、雉鸡和火鸡的鸡形目(galliformes)。
[0039]
如本文所用，“施用(administer或administering)”意指如通过饲喂或通过灌胃将一种或多种微生物菌株、外源性饲料酶和/或菌株以及外源性饲料酶引入动物的行为。
[0040]
如本文所用，“有效量”意指改善动物的一项或多项指标的dfm和/或外源性酶的数量。对动物的一项或多项指标(如但不限于增加的体重增重、肠健康状态、降低的饲料转化率(fcr)、改善的消化道屏障完整性、降低的死亡率、减少的病原体感染和粪便中减少的病原体脱落中的任何一项)的改善可以如本文所述的或通过本领域已知的其他方法测量。可以通过提供自由采食的含有dfm和外源性酶的饲料向动物施用有效量。dfm和外源性酶也能以一剂或多剂施用。
[0041]
术语“肠健康状态”是指可能会受到例如传染原或非传染性原因(如次优配制的饮食)的影响的消化道壁结构和形态的状态。“消化道壁结构和形态”或“消化道屏障完整性”可以指但不限于其特征为绒毛缩短、隐窝延长和炎性细胞(如但不限于cd3 细胞)的浸润的上皮损伤和上皮渗透率。当使用评分系统(如由teirlynck等人所描述的评分系统(2011))评价时，与“正常”外观相比，后一损伤和炎症标志物也可以与消化道的“严重”肉眼可见的外观相关。
[0042]
如本文所用，术语“饲料”在本文中与“喂养料”同义使用。饲料广义上是指用于滋养动物并用于维持动物(包括新生或年幼和发育中的动物)的正常或加速生长的液体或固体材料。该术语包括适合于动物(如例如家禽如鹌鹑、鸭、火鸡、和鸡)摄入的化合物、制剂、混合物、或组合物。在一些实施例中，饲料或饲料组合物包含基础食物组合物和一种或多种饲料添加剂或饲料添加剂组合物。如本文所用，术语“饲料添加剂”是指出于用另外的组分强化基础饲料以促进饲料摄入、治疗或预防疾病、或改变代谢的目的而包括的组分。饲料添加剂包括预混物。在其他实施例中，饲料添加剂是指对饲料加以补充但不一定是饲料或食物的组分的组合物。例如，在一个实施例中，饲料添加剂组合物通过流体(例如水)的递送来对饲料加以补充，该流体与饲料或食物分开施用给动物(例如，经由水管或水分配系统)。
[0043]
如本文所提及的，“预混物”可以是由微量成分组成的组合物，这些微量成分如但不限于维生素、矿物质、化学防腐剂、抗生素、发酵产物、和其他必需成分中的一种或多种。预混物通常是适合于共混进商业口粮内的组合物。
[0044]
如本文所用，“改善动物的一项或多项指标”是指对与动物(如家养禽类，例如，鸡)的生长和/或健康相关的测量值的改善，通过以下参数中的一项或多项来衡量：平均日增重(adg)、总重、死亡率、饲料转化率(其包括饲料:增重和增重:饲料两者)、饲料摄入、肠健康状态、降低的饲料转化率(fcr)、改善的消化道屏障完整性、降低的死亡率、减少的病原体感染、和粪便中减少的病原体脱落。如本文所用的“指标的改善”或“改善的指标”是指在动物定义中指标下列出的至少一个参数的改善。
[0045]
如本文所用，术语“饲料转化率(fcr)”是指饲喂给动物以使动物增重指定量的饲料量。改善的饲料转化率意指较低的饲料转化率。“较低的饲料转化率”或“改善的饲料转化率”意指在饲料中使用饲料添加剂组合物使动物的增重指定量而所需饲喂给动物的饲料量低于该饲料不包含所述饲料添加剂组合物的情况下使动物的增重相同量时所需的饲料量。
[0046]
如本文可互换使用的短语“抗生素抗性基因”或“抗微生物药物抗性(amr)基因”是指例如通过如下方式赋予对抗生素抗性的基因：通过编码破坏抗生素的酶，通过编码阻止
抗生素进入微生物、主动将其输出的表面蛋白，或通过成为抗生素靶标的突变形式以便使抗生素能够忽略它。amr基因的示例可在ardb-抗生素抗性基因数据库(antibiotic resistance genes database)(生物信息学和计算生物学中心(center for bioinformatics and computational biology)，马里兰大学帕克分校(university of maryland,college park)，md 20742；gene.https://ardb.cbcb.umd.edu/)中找到。amr基因的非限制性示例包括但不限于超广谱β内酰胺酶(esbl)基因、甲氧西林抗性基因、ctx-m-15；万古霉素抗性基因ndm-1、2、5、6、vana、vanb、vanc和vand，核苷酸转移酶lnuc、乙酰转移酶vate和/或四环素抗性核糖体保护基因tetm和tetw。在一些实施例中，一种或多种amr基因可以与基因附近的可移动遗传元件(如转座子)相关(如在该基因的约10kb、9kb、8kb、7kb、6kb、5kb、4kb、3kb、2kb、1kb、0.5kb中的任一个距离内或更靠近该基因，包括落入任何这些值之间的距离)。在其他实施例中，一种或多种amr基因不与可移动遗传元件(如转座子)相关。
[0047]
如本文所用，“可移动遗传元件”意在包括能够在基因组内移动或从一个基因组移动到另一个基因组的任何类型的核酸分子。例如，这些可以包括但不限于转座子或转座元件(包括反转录转座子、dna转座子和插入序列)；质粒；噬菌体元件(包括mu；和ii组内含子)。
[0048]
某些范围在本文以前面有术语“约”的数值呈现。术语“约”在本文用于为其后面的准确数字以及接近或近似于该术语后面的数字的数字提供字面支持。在判定数字是否接近或近似于特定叙述的数字时，接近或近似的未叙述的数字可以是在呈现其的上下文中提供特定叙述的数字的实质性等效物的数字。例如，关于数值，术语“约”是指数值的-10％至 10％的范围，除非术语在上下文中另有具体定义。
[0049]
除非上下文另有明确指示，否则如本文所用，单数术语“一个/一种(a/an)”和“该/所述(the)”包括复数引用。
[0050]
还需注意的是，权利要求书可以经撰写而排除任何任选的要素。因此，该陈述旨在作为使用与权利要求要素的叙述有关的排他性术语如“单独”、“仅”等或使用“否定型”限定的前提基础。
[0051]
仍需注意的是，如本文所用的术语“基本上由
……
组成(consisting essentially of)”是指组合物，其中该术语之后的一种或多种组分在存在其他已知的一种或多种组分的情况下为总组合物的小于30％重量的总量，并且不会影响或干扰一种或多种组分的作用或活性。
[0052]
进一步注意到，如本文所用的术语“包含(comprising)”意指包括但不限于在术语“包含”之后的一种或多种组分。在术语“包含”之后的一种或多种组分是必需的或强制性的，但是包含该一种或多种组分的组合物可以进一步包括其他非强制性或任选的一种或多种组分。
[0053]
还要注意的是，如本文所用的术语“由
……
组成(consisting of)”意指包括且限于术语“由
……
组成”之后的一种或多种组分。因此，术语“由
……
组成”之后的一种或多种组分是必需的或强制性的，且组合物中不存在一种或多种其他组分。
[0054]
在本说明书通篇中给出的每一最大数值限度旨在包括每一较低数值限度，如同此类较低数值限度在本文中明确写出一样。在本说明书通篇中给出的每一最小数值限度将包
括每一较高数值限度，如同此类较高数值限度在本文中明确写出一样。在本说明书通篇中给出的每一数值范围将包括落入此类较宽数值范围内的每一较窄数值范围，如同此类较窄数值范围在本文中全部明确写出一样。
[0055]
除非本文另外定义，否则本文所用的所有技术与科学术语均具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
[0056]
术语的其他定义可在整个本说明书中出现。
[0057]
ii.组合物
[0058]
a.菌株
[0059]
直接饲喂微生物(dfm)是指在动物(例如家禽)处于应激时期(疾病、日粮变化、环境或生产挑战)时或作为日常营养方案的一部分以预防疾病和促进消化过程中的营养素利用而向动物饲喂的有益微生物。益生菌是这类饲料添加剂的另一种说法。在对照研究中已证明益生菌或dfm可以改善动物的表现。在一些实施例中，dfm包括直接饲喂的细菌和/或基于酵母的产品两者，并且在特定实施例中，包括有活力的微生物。术语“有活力的微生物”意指具有代谢活性或能够分化的微生物。
[0060]
在一个实施例中，dfm可以是形成孢子的细菌并且因此术语dfm可以指由孢子组成或包含孢子(例如细菌孢子)的组合物。因此，在一个实施例中，如本文所用的术语“有活力的微生物”可以包括微生物孢子，如内生孢子或分生孢子。在另一个实施例中，根据本发明的饲料添加剂组合物中的dfm不由微生物孢子组成或不包含微生物孢子，例如内生孢子或分生孢子(即，dfm不形成孢子)。
[0061]
本文提供的菌株包括罗伊氏乳杆菌菌株s1、罗伊氏乳杆菌菌株s2、罗伊氏乳杆菌菌株s3、母鸡乳杆菌菌株h1、唾液乳杆菌菌株h2、敏捷乳杆菌菌株h3、唾液乳杆菌菌株a1、罗伊氏乳杆菌菌株a2、罗伊氏乳杆菌菌株a3、敏捷乳杆菌菌株d1、唾液乳杆菌菌株d2、和卷曲乳杆菌菌株d3，这些菌株在本文中也分别称为s1、s2、s3、h1、h2、h3、a1、a2、a3、d1、d2、和d3。
[0062]
罗伊氏乳杆菌菌株s1、罗伊氏乳杆菌菌株s2、罗伊氏乳杆菌菌株s3、罗伊氏乳杆菌菌株a2、母鸡乳杆菌菌株h1、唾液乳杆菌菌株h2和敏捷乳杆菌菌株h3于2019年7月24日保藏于韦斯特迪克真菌生物多样性研究所(wfdb)，uppsalalaan 8,3584ct，荷兰乌特勒支(utrecht,the netherlands)，并分别给出保藏号cbs 145921、cbs 145922、cbs 145923、cbs 145924、cbs145918、cbs145919、和cbs 145920。保藏是根据国际承认用于专利程序目的的微生物保藏的布达佩斯条约(budapest treaty on the international recognition of the deposit of microorganisms for the purposes of patent procedure)的规定进行的。本文提供的一种或多种菌株可以用作直接饲喂微生物(dfm)。
[0063]
本文公开的dfm菌株主要发现于乳杆菌属中。截至2020年3月，乳杆菌属包括261个物种，这些物种在表型、生态学和基因型方面极为多样化。鉴于全基因组测序和比较基因组学的最新进展，乳杆菌属最新被分为25个独立的属，属于先前指定的乳杆菌属物种的菌株被转移到新的物种和/或属中(参见zheng等人,2020,int.j.syst.evol.microbiol.[国际系统与进化微生物学杂志],70:2782-2858；pot等人,trends in food science&technology[食品科学与技术趋势]94(2019)105-113；和koutsoumanis等人,2020,efsa journal[efsa杂志],18(7):6174，其中每个的公开通过援引并入本文)。出于本公开的目的，将继续采用先前的乳杆菌属物种分类。然而，在一些实施例中，敏捷乳杆菌
(lactobacillus agilis)也被分类为敏捷乳酸杆菌(ligilactobacillus agilis)。在其他实施例中，唾液乳杆菌(lactobacillus salivarius)也被分类为唾液乳酸杆菌(ligilactobacillus salivarius)。在另外的实施例中，罗伊氏乳杆菌(lactobacillus reuteri)也被分类为罗伊氏粘液乳杆菌(limosilactobacillus reuteri)。
[0064]
dfm组合物可包括含有罗伊氏乳杆菌和/或唾液乳杆菌的一种或多种菌株(如约1、2、3、4、5、6、7或8种或更多种菌株中的任一种)的那些。罗伊氏乳杆菌是革兰氏阳性细菌，其天然栖息在哺乳动物和禽类的消化道中。罗伊氏乳杆菌的一些菌株于二十世纪八十年代初首次描述，它们被用作益生菌。一些罗伊氏乳杆菌可以产生新的广谱抗生素物质，称为罗伊氏菌素。唾液乳杆菌是益生菌物种，已发现其生活在胃肠道中并发挥一系列治疗特性，包括抑制病原性细菌。dfm组合物可以进一步包括含有敏捷乳杆菌、卷曲乳杆菌和/或母鸡乳杆菌的一种或多种菌株(如约1、2、3、4、5、6、7或8种或更多种菌株中的任一种)的那些。
[0065]
dfm组合物还可以仅包括罗伊氏乳杆菌菌株(如1、2、3、4、5、6、7或8种罗伊氏乳杆菌菌株，不存在任何其他微生物)。例如，dfm组合物可以包括罗伊氏乳杆菌菌株s1、s2和/或s3中的一种或多种，或一种或多种微生物，该一种或多种微生物具有与罗伊氏乳杆菌菌株s1(seq id no:7)、s2(seq id no:8)和/或s3(seq id no:9)中的一种或多种的16s核糖体rna序列呈现出至少约97.0％序列相似性(如约97％、97.5％、98％、98.5％、99％、99.5％、或100％序列相似性中的任一者)的16s核糖体rna序列。在一些实施例中，dfm组合物仅包括罗伊氏乳杆菌菌株s1、s2或s3。在另一个实施例中，dfm组合物包括罗伊氏乳杆菌菌株s1和s2；罗伊氏乳杆菌菌株s1和s3；罗伊氏乳杆菌菌株s2和s3；或罗伊氏乳杆菌菌株s1、s2和s3。另外，当一起培养时，一种或多种罗伊氏乳杆菌菌株s1、s2和/或s3具有单独培养的罗伊氏乳杆菌菌株所缺乏的一种或多种生理或代谢特性。这些特性可以包括但不限于所产生的有机酸的量和/或类型的变化、代谢特征的变化和/或细菌一起培养的培养基(如乳酸)的组成的变化。
[0066]
本文提供的dfm组合物可以包括罗伊氏乳杆菌菌株s1、s2和/或s3中的一种或多种(即，组合物包括来自这些菌株的真正细菌)和/或衍生自这些菌株的培养(单独或共培养)的一种或多种培养上清液。
[0067]
dfm组合物可以另外包括含有唾液乳杆菌微生物、母鸡乳杆菌微生物、敏捷乳杆菌微生物和/或罗伊氏乳杆菌微生物中的一种或多种的那些。
[0068]
dfm组合物可以包括唾液乳杆菌菌株h2、母鸡乳杆菌菌株h1、罗伊氏乳杆菌菌株a2和/或敏捷乳杆菌菌株h3中的一种或多种，或一种或多种微生物，该一种或多种微生物具有与唾液乳杆菌菌株h2(seq id no:10)、母鸡乳杆菌菌株h1(seq id no:11)、罗伊氏乳杆菌菌株a2(seq id no:12)和/或敏捷乳杆菌菌株h3(seq id no:1)中的一种或多种的16s核糖体rna序列呈现出至少约97.0％序列相似性(如约97％、97.5％、98％、98.5％、99％、99.5％、或100％序列相似性中的任一者)的16s核糖体rna序列。在一些实施例中，dfm组合物仅包括唾液乳杆菌菌株h2、母鸡乳杆菌菌株h1、罗伊氏乳杆菌菌株a2或敏捷乳杆菌菌株h3。在另一个实施例中，dfm组合物包括唾液乳杆菌菌株h2和母鸡乳杆菌菌株h1；唾液乳杆菌菌株h2和罗伊氏乳杆菌菌株a2；唾液乳杆菌菌株h2和敏捷乳杆菌菌株h3；母鸡乳杆菌菌株h1和罗伊氏乳杆菌菌株a2；母鸡乳杆菌菌株h1和敏捷乳杆菌菌株h3；罗伊氏乳杆菌菌株a2和敏捷乳杆菌菌株h3；唾液乳杆菌菌株h2、母鸡乳杆菌菌株h1和罗伊氏乳杆菌菌株a2；唾
液乳杆菌菌株h2、罗伊氏乳杆菌菌株a2和敏捷乳杆菌菌株h3；母鸡乳杆菌菌株h1、罗伊氏乳杆菌菌株a2和敏捷乳杆菌菌株h3；唾液乳杆菌菌株h2、母鸡乳杆菌菌株h1、罗伊氏乳杆菌菌株a2和敏捷乳杆菌菌株h3；唾液乳杆菌菌株h2、母鸡乳杆菌菌株h1和罗伊氏乳杆菌菌株a2；或唾液乳杆菌菌株h2、母鸡乳杆菌菌株h1和敏捷乳杆菌菌株h3。另外，当一起培养时，一种或多种唾液乳杆菌菌株h2、母鸡乳杆菌菌株h1、罗伊氏乳杆菌菌株a2和/或敏捷乳杆菌菌株h3(如唾液乳杆菌菌株h2、母鸡乳杆菌菌株h1、和罗伊氏乳杆菌菌株a2；或唾液乳杆菌菌株h2、母鸡乳杆菌菌株h1和敏捷乳杆菌菌株h3)具有单独培养的菌株所缺乏的一种或多种生理或代谢特性。这些特性可以包括但不限于有机酸产生(如乳酸的产生)的量和/或类型的变化。
[0069]
本文提供的dfm组合物可以包括一种或多种唾液乳杆菌菌株h2、母鸡乳杆菌菌株h1、罗伊氏乳杆菌菌株a2和/或敏捷乳杆菌菌株h3(如唾液乳杆菌菌株h2、母鸡乳杆菌菌株h1、和罗伊氏乳杆菌菌株a2；或唾液乳杆菌菌株h2、母鸡乳杆菌菌株h1、和敏捷乳杆菌菌株h3)(即组合物包括来自这些菌株的真正细菌)和/或衍生自这些菌株的培养(单独或共培养)的一种或多种培养上清液。
[0070]
dfm组合物可以另外包括含有唾液乳杆菌微生物、敏捷乳杆菌微生物和/或罗伊氏乳杆菌微生物中的一种或多种的那些。
[0071]
dfm组合物可以包括唾液乳杆菌菌株a1、罗伊氏乳杆菌菌株a2和/或敏捷乳杆菌菌株a3中的一种或多种，或一种或多种微生物，该一种或多种微生物具有与唾液乳杆菌菌株a1(seq id no:9)、罗伊氏乳杆菌菌株a2(seq id no:10)和/或敏捷乳杆菌菌株a3(seq id no:11)中的一种或多种的16s核糖体rna序列呈现出至少约97.0％序列相似性(如约97％、97.5％、98％、98.5％、99％、99.5％、或100％序列相似性中的任一者)的16s核糖体rna序列。在一些实施例中，dfm组合物仅包括唾液乳杆菌菌株a1、罗伊氏乳杆菌菌株a2、或敏捷乳杆菌菌株a3。在另一个实施例中，dfm组合物包括唾液乳杆菌菌株a1和罗伊氏乳杆菌菌株a2；唾液乳杆菌菌株a1和敏捷乳杆菌菌株a3；罗伊氏乳杆菌菌株a2和敏捷乳杆菌菌株a3；唾液乳杆菌菌株a1、罗伊氏乳杆菌菌株a2和敏捷乳杆菌菌株a3。另外，当一起培养时，一种或多种唾液乳杆菌菌株a1、罗伊氏乳杆菌菌株a2和/或敏捷乳杆菌菌株a3具有单独培养的菌株所缺乏的一种或多种生理或代谢特性。这些特性可以包括但不限于所产生的有机酸(如乳酸的产生)的量和/或类型的变化、代谢特征的变化和/或细菌一起培养的培养基的组成的变化。
[0072]
本文提供的dfm组合物可以包括唾液乳杆菌菌株a1、罗伊氏乳杆菌菌株a2和/或敏捷乳杆菌菌株a3中的一种或多种(即，组合物包括来自这些菌株的真正细菌)和/或衍生自这些菌株的培养(单独或共培养)的一种或多种培养上清液。
[0073]
dfm组合物可以另外包括含有唾液乳杆菌微生物、敏捷乳杆菌微生物和/或卷曲乳杆菌微生物中的一种或多种的那些。
[0074]
dfm组合物可以包括敏捷乳杆菌菌株d1、唾液乳杆菌菌株d2和/或卷曲乳杆菌菌株d3中的一种或多种，或一种或多种微生物，该一种或多种微生物具有与敏捷乳杆菌菌株d1(seq id no:5)、唾液乳杆菌菌株d2(seq id no:4)和/或卷曲乳杆菌菌株d3(seq id no:6)中的一种或多种的16s核糖体rna序列呈现出至少约97.0％序列相似性(如约97％、97.5％、98％、98.5％、99％、99.5％、或100％序列相似性中的任一者)的16s核糖体rna序列。在一些
实施例中，dfm组合物仅包括敏捷乳杆菌菌株d1、唾液乳杆菌菌株d2、或卷曲乳杆菌菌株d3。在另一个实施例中，dfm组合物包括敏捷乳杆菌菌株d1和唾液乳杆菌菌株d2；敏捷乳杆菌菌株d1和卷曲乳杆菌菌株d3；唾液乳杆菌菌株d2和卷曲乳杆菌菌株d3；敏捷乳杆菌菌株d1、唾液乳杆菌菌株d2和卷曲乳杆菌菌株d3。另外，当一起培养时，一种或多种敏捷乳杆菌菌株d1、唾液乳杆菌菌株d2和/或卷曲乳杆菌菌株d3具有单独培养的菌株所缺乏的一种或多种生理或代谢特性。这些特性可以包括但不限于所产生的有机酸(如乳酸的产生)的量和/或类型的变化、代谢特征的变化和/或细菌一起培养的培养基的组成的变化。
[0075]
本文提供的dfm组合物可以包括一种或多种敏捷乳杆菌菌株d1、唾液乳杆菌菌株d2和/或卷曲乳杆菌菌株d3(即，组合物包括来自这些菌株的真正细菌)和/或衍生自这些菌株的培养(单独或共培养)的一种或多种培养上清液。
[0076]
在一些实施例中，本文提供的菌株(这些菌株包括罗伊氏乳杆菌菌株s1(cbs 145921)、罗伊氏乳杆菌菌株s2(cbs 145922)、罗伊氏乳杆菌菌株s3(cbs 145923)、母鸡乳杆菌菌株h1(cbs145918)、唾液乳杆菌菌株h2(cbs 145919)、罗伊氏乳杆菌菌株a2(cbs 145924)、敏捷乳杆菌菌株h3、唾液乳杆菌菌株a1、敏捷乳杆菌菌株a3、敏捷乳杆菌菌株d1、唾液乳杆菌菌株d2、和卷曲乳杆菌菌株d3)中的一种或多种(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、或11种中的任一者)进一步包含一种或多种(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、或更多种中的任一者)amr基因被灭活或缺失。
[0077]
b.外源性酶
[0078]
补充性酶可用作动物饲料特别是家禽和猪饲料的添加剂，作为提高营养素利用率和改善性能特征的手段。
[0079]
在一个实施例中，本公开涉及一种组合物，其包含一种或多种dfm(如含有本文公开的任何微生物菌株的dfm)和一种或多种外源性饲料酶。在另一个实施例中，本公开涉及一种组合物，其包含多菌株dfm(如本文公开的任何多菌株dfm组合物)和一种或多种外源性饲料酶、由该多菌株dfm和一种或多种外源性饲料酶组成或基本上由其组成。在一个实施例中，外源性饲料酶包括但不限于木聚糖酶、淀粉酶、植酸酶、β-葡聚糖酶和蛋白酶。在仍另一个实施例中，组合物包含饲料添加剂。
[0080]
1.木聚糖酶
[0081]
木聚糖酶是向将线性多糖β-1,4-木聚糖降解为木糖从而分解半纤维素(植物细胞壁的主要组分之一)的一类酶给出的名称。木聚糖酶，例如内切-β-木聚糖酶(ec 3.2.1.8)可将木聚糖主链水解。在一个实施例中，本文提供了组合物，其包含多菌株dfm(如本文公开的任何多菌株dfm组合物)和一种或多种木聚糖酶。
[0082]
在一个实施例中，木聚糖酶可以是任何可商购的木聚糖酶。合适地，木聚糖酶可以是内切-1,4-p-d-木聚糖酶(分类为e.g.3.2.1.8)或1,4β-木糖苷酶(分类为e.g.3.2.1.37)。在一个实施例中，本公开涉及与内切木聚糖酶(例如，内切-1,4-p-d-木聚糖酶)和另一种酶组合的dfm。本文提到的所有e.c.酶分类涉及在国际生物化学与分子生物学联合会(international union of biochemistry and molecular biology)命名委员会的enzyme nomenclature-recommendations[酶命名法-推荐](1992)-isbn 0-12-226164-3中提供的分类，将其并入本文
[0083]
在另一个实施例中，木聚糖酶可以是来自芽孢杆菌属、木霉属(trichodermna)、嗜
热真菌属(therinomyces)、曲霉属(aspergillus)和青霉属(penicillium)的木聚糖酶。在仍另一个实施例中，该木聚糖酶可以是axtra或avizyme中的木聚糖酶，两者都是来自丹尼斯科公司(danisco a/s)的可商购的产品。在一个实施例中，木聚糖酶可以是两种或更多种木聚糖酶的混合物。在仍另一个实施例中，木聚糖酶是内切-1,4-β-木聚糖酶或1,4-β-木糖苷酶。在又另一个实施例中，木聚糖酶来自选自由以下组成的组的生物体：芽孢杆菌属、木霉属、嗜热真菌属、曲霉属、青霉属、和腐质霉属(humicola)。在又另一个实施例中，木聚糖酶可以是表1中引用的一种或多种木聚糖酶或一种或多种商业产品。
[0084]
表1：代表性的商业木聚糖酶
[0085][0086]
在一个实施例中，本公开涉及一种组合物，其包含多菌株dfm(如本文公开的任何
多菌株dfm组合物)和木聚糖酶。在一个实施例中，组合物包含10-50、50-100、100-150、150-200、200-250、250-300、300-350、350-400、400-450、450-500、500-550、550-600、600-650、650-700、700-750和大于750的木聚糖酶单位/g组合物。
[0087]
在一个实施例中，该组合物包含500-1000、1000-1500、1500-2000、2000-2500、2500-3000、3000-3500、3500-4000、4000-4500、4500-5000、5000-5500、5500-6000、6000-6500、6500-7000、7000-7500、7500-8000和大于8000的木聚糖酶单位/g组合物。
[0088]
应当理解，一个木聚糖酶单位(xu)是在ph 5.3和50℃，每分钟从燕麦木聚糖(oat-spelt-xylan)底物释放0.5μmol的还原糖等价物(为木糖，通过二硝基水杨酸(dns)测定-还原糖方法)的酶量。(bailey等人，journal of biotechnology[生物技术杂志]，第23卷(3)，1992年5月，257-270)。
[0089]
2.淀粉酶
[0090]
淀粉酶是向能够将淀粉水解为较短链的寡糖(例如麦芽糖)的一类酶。那么，与从原始的淀粉分子转移相比，葡萄糖部分可以更容易地从麦芽糖转移到单甘油酯或糖基单甘油酯。术语淀粉酶包括α-淀粉酶(e.g.3.2.1.1)、形成g4的淀粉酶(e.g.3.2.1.60)、β-淀粉酶(e.g.3.2.1.2)和γ-淀粉酶(e.c.3.2.1.3)。淀粉酶可以是细菌或真菌来源的，或是化学修饰的或蛋白质工程化的突变体。在一个实施例中，本文提供了组合物，其包含多菌株dfm(如本文公开的任何多菌株dfm组合物)和一种或多种淀粉酶。
[0091]
在一个实施例中，该淀粉酶可以是两种或更多种淀粉酶的混合物。在另一个实施例中，该淀粉酶可以是例如来自地衣芽孢杆菌(bacillus licheniformis)的α-淀粉酶的淀粉酶和例如来自解淀粉芽孢杆菌(bacillus amyloliquefaciens)的α-淀粉酶的淀粉酶。在一个实施例中，该α-淀粉酶可以是axtra或avizyme中的α-淀粉酶，两者都是来自丹尼斯科公司的可商购的产品。在又另一个实施例中，该淀粉酶可以是抗胃蛋白酶的α-淀粉酶，例如抗胃蛋白酶的木霉属(例如里氏木霉(trichoderma reesei))α淀粉酶。在英国申请号101 1513.7(其通过援引并入本文)和pct/ib 2011/053018(其通过援引并入本文)教导了合适的抗胃蛋白酶的α-淀粉酶。
[0092]
在一个实施例中，用于本发明的淀粉酶可以是表2引用的一种或多种商业产品中的一种或多种淀粉酶。
[0093]
表2：代表性的商业淀粉酶
[0094][0095]
应当理解，一个淀粉酶单位(au)是在ph 6.5和37℃，每分钟从非水溶性交联淀粉聚合物底物释放1mmol的糖苷键的酶量。(这在本文中可被称为用于确定1au的测定法)。
[0096]
在一个实施例中，本公开涉及一种组合物，其包含多菌株dfm(如本文公开的任何多菌株dfm组合物)和淀粉酶。在一个实施例中，本公开涉及一种组合物，其包含多菌株dfm、木聚糖酶和淀粉酶。在一个实施例中，该组合物包含10-50、50-100、100-150、150-200、200-250、250-300、300-350、350-400、400-450、450-500、500-550、550-600、600-650、650-700、700-750和大于750的淀粉酶单位/g组合物。
[0097]
在一个实施例中，该组合物包含500-1000、1000-1500、1500-2000、2000-2500、2500-3000、3000-3500、3500-4000、4000-4500、4500-5000、5000-5500、5500-6000、6000-6500、6500-7000、7000-7500、7500-8000、8000-8500、8500-9000、9000-9500、9500-10000、10000-11000、11000-12000、12000-13000、13000-14000、14000-15000和大于15000的淀粉酶单位/g组合物。
[0098]
3.蛋白酶
[0099]
如本文所用的术语蛋白酶(protease)与肽酶或蛋白酶(proteinase)同义。该蛋白酶可以是枯草杆菌蛋白酶(e.g.3.4.21.62)或芽孢杆菌溶素(e.g.3.4.24.28)或碱性丝氨酸蛋白酶(e.g.3.4.21.x)或角蛋白酶(e.g.3.4.x.x)。在一个实施例中，该蛋白酶是枯草杆菌蛋白酶。适合的蛋白酶包括动物、植物或微生物来源的那些蛋白酶。化学修饰的或蛋白质工程化的突变体也是合适的。蛋白酶可以是丝氨酸蛋白酶或金属蛋白酶。例如，碱性微生物蛋白酶或胰蛋白酶样蛋白酶。在一个实施例中，本文提供了组合物，其包含多菌株dfm(如本文公开的任何多菌株dfm组合物)和一种或多种蛋白酶。
[0100]
碱性蛋白酶的示例是枯草杆菌蛋白酶，尤其是衍生自芽孢杆菌属物种的那些，例如枯草杆菌蛋白酶novo、枯草杆菌蛋白酶carlsberg、枯草杆菌蛋白酶309(参见例如，美国
专利号6,287,841)、枯草杆菌蛋白酶147和枯草杆菌蛋白酶168(参见例如，wo 89/06279)。胰蛋白酶样蛋白酶的示例是胰蛋白酶(例如猪或牛来源的)和镰孢菌属(fusarium)蛋白酶(参见例如，wo 89/06270和wo 94/25583)。有用的蛋白酶的示例还包括但不限于wo 92/19729和wo 98/20115中描述的变体。
[0101]
在另一个实施例中，蛋白酶可以是表3中引用的一种或多种商业产品中的一种或多种蛋白酶。
[0102]
表3：代表性的商业蛋白酶
[0103]
商业蛋白酶的代表性示例
[0104][0105]
在一个实施例中，蛋白酶选自由以下组成的组：枯草杆菌蛋白酶、芽孢杆菌溶素、碱性丝氨酸蛋白酶、角蛋白酶和拟诺卡氏菌属(nocardiopsis)蛋白酶。
[0106]
应当理解，一个蛋白酶单位(pu)是在ph 7.5(40mm na2po4/乳酸缓冲液)和40℃，一分钟内从底物(0.6％酪蛋白溶液)释放一微克酚类化合物(表示为酪氨酸等价物)的酶量。这可被称为用于确定1pu的测定法。
[0107]
在一个实施例中，本公开涉及一种组合物，其包含多菌株dfm(如本文公开的任何多菌株dfm组合物)和蛋白酶。在另一个实施例中，本公开涉及一种组合物，其包含多菌株dfm(如本文公开的任何多菌株dfm组合物)和木聚糖酶以及蛋白酶。在仍另一个实施例中，本公开涉及一种组合物，其包含多菌株dfm(如本文公开的任何多菌株dfm组合物)和淀粉酶以及蛋白酶。在又另一个实施例中，本公开涉及一种组合物，其包含多菌株dfm(如本文公开的任何多菌株dfm组合物)和木聚糖酶、淀粉酶以及蛋白酶。
[0108]
在一个实施例中，该组合物包含10-50、50-100、100-150、150-200、200-250、250-300、300-350、350-400、400-450、450-500、500-550、550-600、600-650、650-700、700-750和大于750的蛋白酶单位/g组合物。
[0109]
在一个实施例中，该组合物包含500-1000、1000-1500、1500-2000、2000-2500、2500-3000、3000-3500、3500-4000、4000-4500、4500-5000、5000-5500、5500-6000、6000-6500、6500-7000、7000-7500、7500-8000、8000-8500、8500-9000、9000-9500、9500-10000、10000-11000、11000-12000、12000-13000、13000-14000、14000-15000和大于15000的蛋白酶单位/g组合物。
[0110]
4.植酸酶
[0111]
在一个实施例中，本文提供了组合物，其包含多菌株dfm(如本文公开的任何多菌株dfm组合物)和一种或多种植酸酶。用于本发明的植酸酶可以分类为6-植酸酶(分类为e.c.3.1.3.26)或3-植酸酶(分类为e.c.3.1.3.8)。在一个实施例中，用于本发明的植酸酶可以是下表4中的一种或多种商业产品中的一种或多种植酸酶：
[0112]
表4：代表性的商业植酸酶
[0113][0114]
在一个实施例中，植酸酶是柠檬酸杆菌属(citrobacter)植酸酶，该柠檬酸杆菌属植酸酶衍生自例如弗氏柠檬酸杆菌(citrobacter freundii)，优选地，例如如在wo 2006/038062(通过援引并入本文)和wo 2006/038128(通过援引并入本文)中公开的弗氏柠檬酸杆菌ncimb 41247及其变体，如在wo 2004/085638中公开的布氏柠檬酸杆菌(citrobacter braakii)yh-15，如在wo 2006/037328(通过援引并入本文)公开的布氏柠檬酸杆菌atcc 51113，以及例如如在wo 2007/112739(通过援引并入本文)和wo 2011/117396(通过援引并入本文)中公开的其变体；无丙二酸柠檬酸杆菌(citrobacter amalonaticus)，优选地，如在wo 2006037327(通过援引并入本文)中公开的无丙二酸柠檬酸杆菌atcc 25405或丙二酸盐阴性柠檬酸杆菌atcc 25407；吉伦氏柠檬酸杆菌(citrobacter gillenii)，优选地，如在wo 2006037327(通过援引并入本文)中公开的吉伦氏柠檬酸杆菌dsm 13694；或中间柠檬酸杆菌(citrobacter intermedius)、柯氏柠檬酸杆菌(citrobacter koseri)、啮齿类柠檬酸杆菌(citrobacter murliniae)、鼠类柠檬酸杆菌(citrobacter rodentium)、塞氏柠檬酸杆菌(citrobacter sedlakii)、沃克曼氏柠檬酸杆菌(citrobacter werkmanii)、杨氏柠檬酸杆菌(citrobacter youngae)；柠檬酸杆菌物种多肽或其变体。
[0115]
在一些实施例中，该植酸酶是以丹尼斯科公司phyzyme xp
tm
的名称销售的大肠杆菌植酸酶。替代性地，植酸酶可以是布丘氏菌属(buttiauxella)植酸酶，例如乡间布丘氏菌
(buttiauxella agrestis)植酸酶，例如，在wo 2006/043178、wo 2008/097619、wo 2009/129489、wo 2008/092901、pct/us 2009/41011或pct/ib 2010/051804中教导的植酸酶，所有这些文献通过援引并入本文。
[0116]
在一个实施例中，植酸酶可以是来自哈夫尼亚菌属(hafnia)(例如来自蜂房哈夫尼亚菌(hafnia alvei))的植酸酶，如us 2008263688中教导的一种或多种植酸酶，将该文献通过援引并入本文。在一个实施例中，植酸酶可以是来自曲霉属(例如来自米曲霉(apergillus orzyae))的植酸酶。在一个实施例中，植酸酶可以是来自青霉属(例如来自绳状青霉(penicillium funiculosum))的植酸酶。
[0117]
优选地，植酸酶按以下范围存在于喂养料中：约200ftu/kg至约1000ftu/kg饲料、更优选地约300ftu/kg饲料至约750ftu/kg饲料、更优选地约400ftu/kg饲料至约500ftu/kg饲料。在一个实施例中，植酸酶按以下量存在于喂养料中：多于约200ftu/kg饲料、合适地多于约300ftu/kg饲料、合适地多于约400ftu/kg饲料。在一个实施例中，植酸酶按以下量存在于喂养料中：少于约1000ftu/kg饲料、合适地少于约750ftu/kg饲料。优选地，植酸酶按以下范围的量存在于饲料添加剂组合物中：约40ftu/g至约40,000ftu/g组合物、更优选地约80ftu/g组合物至约20,000ftu/g组合物、以及甚至更优选地约100ftu/g组合物至约10,000ftu/g组合物、以及甚至更优选地约200ftu/g组合物至约10,000ftu/g组合物。在一个实施例中，植酸酶按以下量存在于饲料添加剂组合物中：多于约40ftu/g组合物、合适地多于约60ftu/g组合物、合适地多于约100ftu/g组合物、合适地多于约150ftu/g组合物、合适地多于约200ftu/g组合物。在一个实施例中，植酸酶按以下量存在于饲料添加剂组合物中：少于约40,000ftu/g组合物、合适地少于约20,000ftu/g组合物、合适地少于约15,000ftu/g组合物、合适地少于约10,000ftu/g组合物。
[0118]
应当理解，如本文所用，1ftu(植酸酶单位)定义为在iso 2009植酸酶测定法(用于确定植酸酶活性的标准测定法)中定义的反应条件下，在一分钟内从底物释放1μmol无机正磷酸盐所需的酶量，并且1ftu可在国际标准iso/dis 30024:1-17,2009中找到。在一个实施例中，使用上述e.c.分类法将酶分类，并且当以本文教导的用于确定1ftu的测定法测试时，e.c.分类法对具有该活性的酶进行命名。
[0119]
c.dfm配制品
[0120]
在一个实施例中，可以将dfm(如本文公开的任何多菌株dfm组合物)以及任选地外源性酶配制为液体、干粉或颗粒。在一个实施例中，可以将这些dfm和外源性酶配制为单一混合物。在另一个实施例中，可以将这些dfm和外源性酶配制为单独的混合物。在仍另一个实施例中，dfm和外源性酶的单独的混合物可以同时或不同时施用。在仍另一个实施例中，dfm和外源性酶的单独的混合物可以同时或依序施用。在又另一个实施例中，可以施用包含dfm的第一混合物，随后施用包含外源性酶的第二混合物。在仍另一个实施例中，可以施用包含外源性酶的第一混合物，随后施用包含dfm的第二混合物。
[0121]
干粉或颗粒可通过本领域的技术人员已知的方式，例如在顶喷式流化床包覆器中、在wurster型底喷式流化床中或者通过转鼓制粒(例如高剪切制粒)、挤出、锅式涂层或在微成分混合器中进行制备。
[0122]
在另一个实施例中，可以对dfm和/或一种或多种酶进行涂覆，例如封装。合适地，可以将dfm和酶配制在相同的涂层内或封装在相同的胶囊内。替代性地，可将一种或多种酶
配制在相同的涂层内或封装在相同的胶囊内，同时可将dfm配制在与这些酶分离的涂层中。
[0123]
在一些实施例中，如在dfm能够产生内生孢子的情况下，可以提供没有任何涂层的dfm。在此类情况下，可以将dfm内生孢子简单地与一种或多种酶混合。在后一种情况下，可以对酶进行涂覆，例如封装，例如可以对所有酶中的一种或多种进行涂覆，例如封装。可以将这些酶封装为(即包含一种或多种、两种或多种、三种或更多种或全部)酶的混合物，或者可以将它们单独封装(例如作为单一的酶)。在一个优选的实施例中，可以将所有酶涂覆(例如封装)在一起。在一个实施例中，涂层保护酶免受热影响并且可视为防热剂。
[0124]
在另一个实施例中，可以将这些dfm和外源性饲料酶与饲料混合或在饮用水中施用，如经由水管。在一个实施例中，用于包含进水中的剂量范围是约1
×
103cfu/动物/天至约1
×
10
15
cfu/动物/天，例如，约1
×
103cfu/动物/天、1
×
104cfu/动物/天、1
×
105cfu/动物/天、1
×
106cfu/动物/天、1
×
107cfu/动物/天、1
×
108cfu/动物/天、1
×
109cfu/动物/天、1
×
10
10
cfu/动物/天、1
×
10
11
cfu/动物/天、1
×
10
12
cfu/动物/天、1
×
10
13
cfu/动物/天、1
×
10
14
cfu/动物/天、或1
×
10
15
cfu/动物/天，包括落入这些值之间的所有剂量。
[0125]
d.饲料添加剂组合物
[0126]
在一个实施例中，本文提供了饲料添加剂组合物，其包含一种或多种dfm(如本文公开的任何多菌株dfm)和任选地一种或多种外源性饲料酶。在一个实施例中，能以任何合适的方式配制饲料添加剂组合物，以确保配制品包含有活力的dfm和任选地活性酶。
[0127]
在一个实施例中，饲料添加剂组合物能以固体或液体制剂或其可替代物的形式使用。固体制剂的示例包括粉剂、糊剂、大丸粒、胶囊剂、胚珠剂、药丸、丸粒、片剂、尘剂和颗粒，其可以是可润湿的、喷雾干燥的或冷冻干燥的。液体制剂的示例包括但不限于水性、有机或水性-有机溶液、悬浮液和乳液。
[0128]
在另一个实施例中，该饲料添加剂组合物能以固体形式使用。在一个实施例中，该固体形式是丸粒形式。固体形式的饲料添加剂组合物还可以含有以下中的一种或多种：赋形剂，例如微晶纤维素、乳糖、柠檬酸钠、碳酸钙、磷酸氢钙、和甘氨酸；崩解剂，例如淀粉(优选玉米、马铃薯或木薯淀粉)、淀粉乙醇酸钠、交联羧甲基纤维素钠和某些复合硅酸盐；制粒粘合剂，例如聚乙烯吡咯烷酮、羟丙基甲基纤维素(hpmc)、羟丙基纤维素(hpc)、蔗糖、明胶和阿拉伯树胶；可以包括润滑剂，例如硬脂酸镁、硬脂酸、山嵛酸甘油酯和滑石。
[0129]
用于制备这些形式的营养上可接受的载剂的示例包括例如水、盐溶液、醇、硅酮、蜡类、凡士林、植物油、聚乙二醇、丙二醇、脂质体、糖类、明胶、乳糖、直链淀粉、硬脂酸镁、滑石粉、表面活性剂、硅酸、粘性石蜡、芳香油、脂肪酸甘油单酯和脂肪酸甘油二酯、石油醚(petroethral)脂肪酸酯、羟甲基-纤维素、聚乙烯吡咯烷酮等等。
[0130]
在一个实施例中，将饲料添加剂组合物配制成干粉或颗粒，如wo 2007/044968(称为tpt颗粒)或wo 1997/016076或wo 1992/012645中所述(所述文献各自通过援引并入本文)。
[0131]
在一个实施例中，可以将饲料添加剂组合物配制成包含以下的颗粒饲料组合物：包含一种或多种dfm(如本文公开的任何多菌株dfm组合物)以及任选地一种或多种外源性饲料酶和至少一个涂层的活性剂。在一个实施例中，颗粒的活性剂在加工后保留活性。在一个实施例中，颗粒的活性剂在加工后保留选自由以下组成的组的活性水平：50％-60％活性、60％-70％活性、70％-80％活性、80％-85％活性、85％-90％活性、和90％-95％活性。
[0132]
在另一个实施例中，颗粒可以含有一个涂层。涂层可包含构成颗粒的至少55％w/w的水分水合材料。在另一个实施例中，颗粒可以含有两个涂层。这两个涂层可为水分水合涂层和防潮层涂层。在一些实施例中，该水分水合涂层可为颗粒的25％w/w至60％w/w并且该防潮涂层可为颗粒的2％w/w至15％w/w。该水分水合涂层可选自无机盐、蔗糖、淀粉和麦芽糖糊精，并且该防潮涂层可选自聚合物、树胶、乳清和淀粉。
[0133]
在又另一个实施例中，颗粒可使用饲料制丸方法产生并且所述饲料预处理方法可在70℃与95℃之间(如在85℃与95℃之间)进行长达若干分钟。在另一个实施例中，所述颗粒可使用蒸汽加热制丸方法产生，所述方法可在85℃与95℃之间进行长达若干分钟。
[0134]
在一个实施例中，所述颗粒可具有选自聚合物和树胶的防潮涂层并且水分水合材料可为无机盐。所述水分水合涂层可在所述颗粒的25％与45％w/w之间并且所述防潮涂层可在所述颗粒的2％至20％w/w之间。
[0135]
在一个实施例中，所述活性剂在选自以下中的一种或多种条件后保留活性：(a)饲料制丸方法；(b)蒸汽加热饲料预处理方法；(c)储存；(d)作为未制丸混合物中的成分储存；和(e)作为包含至少一种选自以下的化合物的饲料基础混合物或饲料预混物中的成分储存：微量矿物质、有机酸、还原糖、维生素、氯化胆碱、和导致酸性或碱性饲料基础混合物或饲料预混物的化合物。
[0136]
在一些实施例中，可以使用稀释剂(如淀粉粉末、石灰石等)对dfm(例如dfm内生孢子)进行稀释。在一个实施例中，dfm和酶可以处于适合食用的液体配制品中，优选地，此类液体食用品包含以下中的一种或多种：缓冲液、盐、山梨醇和/或甘油。在另一个实施例中，可以通过将一种或多种酶施加(例如喷涂)于载体基材(例如碾碎的小麦)上来配制饲料添加剂组合物。
[0137]
在一个实施例中，饲料添加剂组合物可以被配制成预混物。仅举个示例，该预混物可包含一种或多种饲料组分，如一种或多种矿物质和/或一种或多种维生素。
[0138]
在一个实施例中，dfm和外源性饲料酶可用至少一种生理上可接受的载剂配制，该载剂选自以下中的至少一种：麦芽糖糊精、石灰岩(碳酸钙)、环糊精、小麦或小麦组分、蔗糖、淀粉、na2so4、滑石、pva、山梨醇、苯甲酸盐、山梨酸盐、甘油、蔗糖、丙二醇、1,3-丙二醇、葡萄糖、对羟基苯甲酸酯、氯化钠、柠檬酸盐、乙酸盐、磷酸盐、钙、偏亚硫酸氢盐、甲酸盐及其混合物。
[0139]
在另一个实施例中，该饲料添加剂组合物可以作为水性悬浮液和/或酏剂递送。可将该饲料添加剂组合物与不同的甜味剂或调味剂、调色物质或染料进行组合，与乳剂和/或悬浮剂进行组合，以及与稀释剂(如水、丙二醇和甘油)进行组合，以及它们的组合。该饲料添加剂组合物还可以作为水性悬浮液通过水管递送。
[0140]
e.喂养料
[0141]
在另一个实施例中，本文提供了含有本文公开的任何多菌株dfm组合物的饲料添加剂组合物，其可用作饲料或用于制备饲料。饲料可以是溶液的形式或作为固体，这取决于用途和/或应用模式和/或施用模式。当用作饲料或用于制备饲料(如功能性饲料)时，该饲料添加剂组合物可以与以下中的一种或多种结合使用：营养上可接受的载剂、营养上可接受的稀释剂、营养上可接受的赋形剂、营养上可接受的辅剂、营养活性成分。
[0142]
在一个实施例中，将本文公开的饲料添加剂组合物与饲料组分混合以形成喂养
料。在一个实施例中，该饲料可以是秣料或其预混物、复合饲料或其预混物。在一个实施例中，可以将本文公开的饲料添加剂组合物与复合饲料、复合饲料组分、或复合饲料的预混物混合，或将其混合至秣料、秣料组分或秣料的预混物中。
[0143]
在一个实施例中，秣料可以获得自选自以下的植物中的一种或多种：苜蓿(紫苜蓿)、大麦、百脉根、芸苔属(brassicas)、chau moellier、羽衣甘蓝、油菜籽(低芥酸菜籽)、芜菁甘蓝(瑞典甘蓝)、萝卜、三叶草、杂种三叶草、红三叶草、地下三叶草、白三叶草、草、燕麦草、羊茅草、绊根草、雀麦草、石南荒原草、草地早熟禾(来自天然混合的草原草地)、野茅、黑麦草、猫尾草、玉米(玉蜀黍)、粟、燕麦、高粱、大豆、树(用作树-干草的修剪下的树嫩枝)、小麦、和豆科植物。
[0144]
复合饲料可以是提供所有每日所需营养素的完全饲料、提供口粮(蛋白质、能量)的一部分的浓缩物或仅提供另外的微量营养素(如矿物质和维生素)的补充剂。用于复合饲料的主要成分是饲料谷物，这些饲料谷物包括玉米、大豆、高粱、燕麦、和大麦。
[0145]
如本文所提及的预混物可以是由微量成分构成的组合物，这些微量成分为如维生素、矿物质、化学防腐剂、抗生素、发酵产物和其他必需成分。预混物通常是适合于共混进商业口粮内的组合物。
[0146]
在一个实施例中，如本文公开的喂养料可包含一种或多种选自包含以下的组的饲料材料：谷类，如小粒谷物(例如小麦、大麦、黑麦、燕麦以及它们的组合)和/或大粒谷物如玉蜀黍或高粱；来自谷类的副产品，如玉米蛋白粉、干酒糟及可溶物(distillers dried grain soluble)(ddgs)、小麦麸、粗小麦粉、次麦粉、米糠、稻壳、燕麦壳、棕榈仁和柑橘渣；获得自以下来源的蛋白：如大豆、向日葵、花生、羽扇豆、豌豆、蚕豆、棉花、低芥酸菜籽、鱼粉、干血浆蛋白、肉和骨粉、马铃薯蛋白、乳清、干椰肉、芝麻；获得自植物和动物来源的油和脂肪；以及矿物质和维生素。
[0147]
在又另一个实施例中，喂养料可包含至少一种高纤维饲料材料和/或至少一种高纤维饲料材料的至少一种副产品以提供高纤维喂养料。高纤维饲料材料的示例包括：小麦，大麦，黑麦，燕麦，来自谷类的副产品，如玉米蛋白粉、干酒糟及可溶物(ddgs)、小麦麸、粗小麦粉、次麦粉、米糠、稻壳、燕麦壳、棕榈仁和柑橘渣。一些蛋白来源也可视为高纤维：获得自来源如向日葵、羽扇豆、蚕豆和棉花的蛋白。
[0148]
在仍另一个实施例中，该饲料可以是以下中的一种或多种：复合饲料和预混物，包括丸粒、球丸(nut)或(牲畜用)饼状物；作物或作物残余物：玉米、大豆、高粱、燕麦、大麦、玉米秸秆、干椰肉、稻草、谷壳、甜菜残渣；鱼粉；新割的草和其他饲用植物；肉粉和骨粉；糖蜜；油饼和滤饼；寡糖；糖渍饲用植物：干草和青贮饲料；海草；种子和谷物，完整的或通过压碎、研磨等制备；发芽谷物及豆类；酵母提取物。
[0149]
在一个实施例中，将本文公开的饲料添加剂组合物与产品(例如喂养料)混合。替代性地，喂养料的乳液或原始成分中可包括饲料添加剂组合物。在另一个实施例中，使饲料添加剂组合物在待影响/处理的产品表面上可用或可用于待影响/处理的产品表面。在仍另一个实施例中，本文公开的饲料添加剂组合物可以与受控量的dfm和任选地酶一起应用、散布、涂覆和/或浸渍于产品(例如喂养料或喂养料的原始成分)。
[0150]
在又另一个实施例中，dfm和任选的酶可同时使用(例如当它们混合在一起时或者甚至当它们通过不同的途径递送时)或者依序使用(例如它们可通过不同的途径递送)。
[0151]
在一个实施例中，将dfm和任选的酶同时应用于喂养料。在又另一个实施例中，将dfm和任选的酶在被递送至喂养料或喂养料的原始成分之前混合。
[0152]
在一个实施例中，本文公开的饲料添加剂组合物中的dfm能以合适的浓度添加，包括但不限于在最终饲料产品中提供约2
×
103cfu至约2
×
10
11
cfu、约2
×
106至约1
×
10
10
、和约3.75
×
107cfu至约1
×
10
10
cfu的日剂量的浓度。
[0153]
iii.方法
[0154]
a.用于改善动物的性能指标的方法
[0155]
本文进一步提供了用于提高动物的性能指标的方法。在另一个实施例中，本公开涉及提高禽类的性能指标的方法。在仍另一个实施例中，本公开涉及提高家禽(其包括但不限于肉鸡、鸡和火鸡)的性能指标的方法。
[0156]
在又另一个实施例中，本公开涉及一种方法，该方法包括向动物施用包含dfm(如本文公开的任何多菌株dfm)和任选地外源性饲料酶的组合物。在仍另一个实施例中，本公开涉及一种方法，该方法包括向动物施用有效量的包含dfm和任选的外源性饲料酶的组合物以提高该动物的性能。该有效量能以一剂或多剂向动物施用。在一个实施例中，该动物是家禽。在仍另一个实施例中，该动物是肉鸡。
[0157]
在另一个实施例中，本公开涉及一种方法，该方法包括向动物(如家养禽类，例如，鸡)施用有效量的包含dfm(如本文公开的任何多菌株dfm)和任选地外源性饲料酶的组合物以增加平均日饲料摄入量。在一些实施例中，相对于未施用本文公开的一种或多种多菌株dfm组合物的动物，该平均日饲料摄入量增加约10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％、105％、或110％中的任一者，包括落入这些百分比之间的所有值。在一些实施例中，该组合物是饲料添加剂组合物。在其他实施例中，该组合物是饲料或喂养料。
[0158]
在另一个实施例中，本公开涉及一种方法，该方法包括向动物(如家养禽类，例如，鸡)施用有效量的包含dfm(如本文公开的任何多菌株dfm)和任选的外源性饲料酶的组合物以增加平均日增重。在一些实施例中，相对于未施用本文公开的一种或多种多菌株dfm组合物的动物，该平均日增重增加了约10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％、105％、或110％中的任一者，包括落入这些百分比之间的所有值。在一些实施例中，该组合物是饲料添加剂组合物。在其他实施例中，该组合物是饲料或喂养料。
[0159]
在另一个实施例中，本公开涉及一种方法，该方法包括向动物(如家养禽类，例如，鸡)施用有效量的包含dfm(如本文公开的任何多菌株dfm)和任选的外源性饲料酶的组合物以提高总增重。在一些实施例中，相对于未施用本文公开的一种或多种多菌株dfm组合物的动物，总增重增加了约10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％、105％、或110％中的任一者，包括落入这些百分比之间的所有值。在一些实施例中，该组合物是饲料添加剂组合物。在其他实施例中，该组合物是饲料或喂养料。
[0160]
在另一个实施例中，本公开涉及一种方法，该方法包括向动物(如家养禽类，例如，鸡)施用有效量的包含dfm(如本文公开的任何多菌株dfm)和任选的外源性饲料酶的组合物以增加饲料转化率，该饲料转化率可以通过饲料:增重或增重:饲料来衡量。在一些实施例
中，相对于未施用本文公开的一种或多种多菌株dfm组合物的动物，饲料转化率增加了约10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％、105％、或110％中的任一者，包括落入这些百分比之间的所有值。在一些实施例中，该组合物是饲料添加剂组合物。在其他实施例中，该组合物是饲料或喂养料。
[0161]
在另一个实施例中，本公开涉及一种方法，该方法包括向动物(如家养禽类，例如，鸡)施用有效量的包含dfm(如本文公开的任何多菌株dfm)和任选的外源性饲料酶的组合物以增加饲料效率。在一些实施例中，相对于未施用本文公开的一种或多种多菌株dfm组合物的动物，饲料效率增加了约10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％、105％、或110％中的任一者，包括落入这些百分比之间的所有值。在一些实施例中，该组合物是饲料添加剂组合物。在其他实施例中，该组合物是饲料或喂养料。
[0162]
在另一个实施例中，本公开涉及一种方法，该方法包括向动物(如家养禽类，例如，鸡)施用有效量的包含dfm(如本文公开的任何多菌株dfm)和任选的外源性饲料酶的组合物以降低死亡率。在一些实施例中，相对于未施用本文公开的一种或多种多菌株dfm组合物的动物，死亡率降低了约10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、或100％中的任一者，包括落入这些百分比之间的所有值。在一些实施例中，该组合物是饲料添加剂组合物。在其他实施例中，该组合物是饲料或喂养料。
[0163]
在另一个实施例中，本公开涉及一种方法，该方法包括向动物(如家养禽类，例如，鸡)施用有效量的包含dfm(如本文公开的任何多菌株dfm)和任选的外源性饲料酶的组合物以降低饲料转化率(fcr)。在一些实施例中，相对于未施用本文公开的一种或多种多菌株dfm组合物的动物，fcr降低了约10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、或100％中的任一者，包括落入这些百分比之间的所有值。在一些实施例中，该组合物是饲料添加剂组合物。在其他实施例中，该组合物是饲料或喂养料。
[0164]
在另一个实施例中，本公开涉及一种方法，该方法包括向动物(如家养禽类，例如，鸡)施用有效量的包含dfm(如本文公开的任何多菌株dfm)和任选的外源性饲料酶的组合物以增加消化道屏障完整性。在一些实施例中，相对于未施用本文公开的一种或多种多菌株dfm组合物的动物，消化道屏障完整性增加了约10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％、105％、或110％中的任一者，包括落入这些百分比之间的所有值。“消化道屏障完整性”可以指但不限于其特征为绒毛缩短、隐窝延长和炎性细胞(如但不限于cd3 细胞)的浸润的上皮损伤和上皮渗透率。当使用评分系统(如由teirlynck等人所描述的评分系统(2011))评价时，与“正常”外观相比，后一损伤和炎症标志物也可以与消化道的“严重”肉眼可见的外观相关。在一些实施例中，该组合物是饲料添加剂组合物。在其他实施例中，该组合物是饲料或喂养料。
[0165]
在另一个实施例中，本公开涉及一种方法，该方法包括向动物(如家养禽类，例如，鸡)施用有效量的包含dfm(如本文公开的任何多菌株dfm)和任选的外源性饲料酶的组合物以减少或防止病原体感染(如但不限于产气荚膜梭菌、空肠弯曲杆菌、沙门菌属物种、和/或
大肠杆菌的感染)。在一些实施例中，相对于未施用本文公开的一种或多种多菌株dfm组合物的动物，病原体感染减少了约10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、或100％中的任一者，包括落入这些百分比之间的所有值。在一些实施例中，该组合物是饲料添加剂组合物。在其他实施例中，该组合物是饲料或喂养料。在一些实施例中，该组合物是饲料添加剂组合物。在其他实施例中，该组合物是饲料或喂养料。
[0166]
在另一个实施例中，本公开涉及一种方法，该方法包括向动物(如家养禽类，例如，鸡)施用有效量的包含dfm(如本文公开的任何多菌株dfm)和任选的外源性饲料酶的组合物以减少或防止粪便中的病原体脱落(如但不限于产气荚膜梭菌、空肠弯曲杆菌、沙门菌属物种、和/或大肠杆菌的脱落)。在一些实施例中，相对于未施用本文公开的一种或多种多菌株dfm组合物的动物，粪便中的病原体脱落减少了约10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、或100％中的任一者，包括落入这些百分比之间的所有值。在一些实施例中，该组合物是饲料添加剂组合物。在其他实施例中，该组合物是饲料或喂养料。
[0167]
在仍另一个实施例中，施用给动物(如家养禽类，例如，鸡)的dfm组合物(如饲料或饲料添加剂组合物)是包含以下中的一种或多种的多菌株dfm：罗伊氏乳杆菌菌株s1(cbs 145921)，或具有罗伊氏乳杆菌菌株s1的所有鉴别特征的菌株，或具有与罗伊氏乳杆菌菌株s1(seq id no:7)的16s核糖体rna序列呈现出至少约97.0％序列相似性(如约97％、97.5％、98％、98.5％、99％、99.5％、或100％序列相似性中的任一者)的16s核糖体rna序列的微生物；罗伊氏乳杆菌菌株s2(cbs145922)，或具有罗伊氏乳杆菌菌株s2的所有鉴别特征的菌株，或具有与罗伊氏乳杆菌菌株s2(seq id no:8)的16s核糖体rna序列呈现出至少约97.0％序列相似性(如约97％、97.5％、98％、98.5％、99％、99.5％、或100％序列相似性中的任一者)的16s核糖体rna序列的微生物；和/或罗伊氏乳杆菌菌株s3(cbs 145923)，或具有罗伊氏乳杆菌菌株s3的所有鉴别特征的菌株，或具有与罗伊氏乳杆菌菌株s3(seq id no:9)的16s核糖体rna序列呈现出至少约97.0％序列相似性(如约97％、97.5％、98％、98.5％、99％、99.5％、或100％序列相似性中的任一者)的16s核糖体rna序列的微生物。在另一个实施例中，dfm组合物包括罗伊氏乳杆菌菌株s1和s2；罗伊氏乳杆菌菌株s1和s3；罗伊氏乳杆菌菌株s2和s3；或罗伊氏乳杆菌菌株s1、s2和s3。在一些实施例中，将该一种或多种(如1、2、或3种)罗伊氏乳杆菌菌株以至少1
×
104cfu/动物/天的速率施用于动物。对于家禽，根据一个非限制性实施例，可以将该一种或多种罗伊氏乳杆菌菌株以约1
×
105cfu/g饲料至约1
×
10
10
cfu/g饲料来饲喂。在至少一些实施例中，将该一种或多种罗伊氏乳杆菌菌株以约1
×
105cfu/禽类/天或约1
×
108cfu/禽类/天来饲喂。
[0168]
在仍另一个实施例中，施用给动物(如家养禽类，例如，鸡)的dfm组合物(如饲料或饲料添加剂组合物)是包含以下中的一种或多种的多菌株dfm：母鸡乳杆菌菌株h1(cbs 145918)，或具有母鸡乳杆菌菌菌株h1的所有鉴别特征的菌株，或具有与母鸡乳杆菌菌株h1(seq id no:11)的16s核糖体rna序列呈现出至少约97.0％序列相似性(如约97％、97.5％、98％、98.5％、99％、99.5％、或100％序列相似性中的任一者)的16s核糖体rna序列的微生物；唾液乳杆菌菌株h2(cbs 145919)，或具有唾液乳杆菌菌株h2的所有鉴别特征的菌株，或具有与唾液乳杆菌菌株h2(seq id no:10)的16s核糖体rna序列呈现出至少约97.0％序列
相似性(如约97％、97.5％、98％、98.5％、99％、99.5％、或100％序列相似性中的任一者)的16s核糖体rna序列的微生物；敏捷乳杆菌菌株h3，或具有敏捷乳杆菌菌株h3的所有鉴别特征的菌株，或具有与敏捷乳杆菌菌株h3(seq id no；1)的16s核糖体rna序列呈现出至少约97.0％序列相似性(如约97％、97.5％、98％、98.5％、99％、99.5％、或100％序列相似性中的任一者)的16s核糖体rna序列的微生物；和/或罗伊氏乳杆菌菌株a2(cbs 145924)，或具有罗伊氏乳杆菌菌株a2的所有鉴别特征的菌株，或具有与罗伊氏乳杆菌菌株a2(seq id no:12)的16s核糖体rna序列呈现出至少约97.0％序列相似性(如约97％、97.5％、98％、98.5％、99％、99.5％、或100％序列相似性中的任一者)的16s核糖体rna序列的微生物。在一些实施例中，dfm组合物仅包括母鸡乳杆菌菌株h1、唾液乳杆菌菌株h2、敏捷乳杆菌菌株h3、或罗伊氏乳杆菌菌株a2。在另一个实施例中，dfm组合物包括母鸡乳杆菌菌株h1和唾液乳杆菌菌株h2；罗伊氏乳杆菌菌株a2和敏捷乳杆菌菌株h3；母鸡乳杆菌菌株h1和罗伊氏乳杆菌菌株a2；唾液乳杆菌菌株h2和敏捷乳杆菌菌株h3；唾液乳杆菌菌株h2和罗伊氏乳杆菌菌株a2；敏捷乳杆菌菌株h3和罗伊氏乳杆菌菌株a2；母鸡乳杆菌菌株h1、唾液乳杆菌菌株h2和敏捷乳杆菌菌株h3；母鸡乳杆菌菌株h1、敏捷乳杆菌菌株h3和罗伊氏乳杆菌菌株a2；唾液乳杆菌菌株h2、敏捷乳杆菌菌株h3和罗伊氏乳杆菌菌株a2；母鸡乳杆菌菌株h1、唾液乳杆菌菌株h2、敏捷乳杆菌菌株h3和罗伊氏乳杆菌菌株a2；母鸡乳杆菌菌株h1、唾液乳杆菌菌株h2和敏捷乳杆菌菌株h3；或母鸡乳杆菌菌株h1、唾液乳杆菌菌株h2和罗伊氏乳杆菌菌株a2。在一些实施例中，罗伊氏乳杆菌菌株a2产生罗伊氏菌素(3-羟基丙醛)。在其他实施例中，罗伊氏乳杆菌菌株a2不产生罗伊氏菌素(3-羟基丙醛)。在一些实施例中，将该一种或多种h1、h2、h3、和/或a2菌株(如h1、h2、和h3；或h1、h2、和a2)以至少1
×
104cfu/动物/天的速率施用于动物。对于家禽，根据一个非限制性实施例，可以将该一种或多种h1、h2、h3、和/或a2菌株(如h1、h2、和h3；或h1、h2、和a2)以约1
×
105cfu/g饲料至约1
×
10
10
cfu/g饲料来饲喂。在至少一些实施例中，将该一种或多种h1、h2、h3、和/或a2菌株(如h1、h2、和h3；或h1、h2、和a2)以约1
×
105cfu/禽类/天或约1
×
108cfu/禽类/天来饲喂。
[0169]
在仍另一个实施例中，施用给动物(如家养禽类，例如，鸡)的dfm组合物(如饲料或饲料添加剂组合物)是包含以下中的一种或多种的多菌株dfm：唾液乳杆菌菌株a1，或具有唾液乳杆菌菌株a1的所有鉴别特征的菌株，或具有与唾液乳杆菌菌株a1(seq id no:2)的16s核糖体rna序列呈现出至少约97.0％序列相似性(如约97％、97.5％、98％、98.5％、99％、99.5％、或100％序列相似性中的任一者)的16s核糖体rna序列的微生物；罗伊氏乳杆菌菌株a2(cbs 145924)，或具有罗伊氏乳杆菌菌株a2的所有鉴别特征的菌株，或具有与罗伊氏乳杆菌菌株a2(seq id no:12)的16s核糖体rna序列呈现出至少约97.0％序列相似性(如约97％、97.5％、98％、98.5％、99％、99.5％、或100％序列相似性中的任一者)的16s核糖体rna序列的微生物；和/或敏捷乳杆菌菌株a3，或具有敏捷乳杆菌菌株a3的所有鉴别特征的菌株，或具有与敏捷乳杆菌菌株a3(seq id no:3)的16s核糖体rna序列呈现出至少约97.0％序列相似性(如约97％、97.5％、98％、98.5％、99％、99.5％、或100％序列相似性中的任一者)的16s核糖体rna序列的微生物。在一些实施例中，罗伊氏乳杆菌菌株a2产生罗伊氏菌素(3-羟基丙醛)。在其他实施例中，罗伊氏乳杆菌菌株a2不产生罗伊氏菌素(3-羟基丙醛)。在一些实施例中，dfm组合物仅包括唾液乳杆菌菌株a1、罗伊氏乳杆菌菌株a2、或敏捷乳杆菌菌株a3。在另一个实施例中，dfm组合物包括唾液乳杆菌菌株a1和罗伊氏乳杆菌菌株
a2；唾液乳杆菌菌株a1和敏捷乳杆菌菌株a3；罗伊氏乳杆菌菌株a2和敏捷乳杆菌菌株a3；或唾液乳杆菌菌株a1、罗伊氏乳杆菌菌株a2和敏捷乳杆菌菌株a3。在一些实施例中，将该一种或多种a1、a2和/或a3菌株以至少1
×
104cfu/动物/天的速率施用于动物。对于家禽，根据一个非限制性实施例，可以将该一种或多种a1、a2和/或a3菌株以约1
×
105cfu/g饲料至约1
×
10
10
cfu/g饲料来饲喂。在至少一些实施例中，将该一种或多种a1、a2和/或a3菌株以约1
×
105cfu/禽类/天或约1
×
108cfu/禽类/天来饲喂。
[0170]
在仍另一个实施例中，施用给动物(如家养禽类，例如，鸡)的dfm组合物(如饲料或饲料添加剂组合物)是包含以下中的一种或多种的多菌株dfm：敏捷乳杆菌菌株d1，或具有敏捷乳杆菌菌株d1的所有鉴别特征的菌株，或具有与敏捷乳杆菌菌株d1(seq id no:5)的16s核糖体rna序列呈现出至少约97.0％序列相似性(如约97％、97.5％、98％、98.5％、99％、99.5％、或100％序列相似性中的任一者)的16s核糖体rna序列的微生物；唾液乳杆菌菌株d2，或具有唾液乳杆菌菌株d2的所有鉴别特征的菌株，或具有与唾液乳杆菌菌株d2(seq id no:4)的16s核糖体rna序列呈现出至少约97.0％序列相似性(如约97％、97.5％、98％、98.5％、99％、99.5％、或100％序列相似性中的任一者)的16s核糖体rna序列的微生物；和/或卷曲乳杆菌菌株d3，或具有卷曲乳杆菌菌株d3的所有鉴别特征的菌株，或具有与卷曲乳杆菌菌株d3(seq id no:6)的16s核糖体rna序列呈现出至少约97.0％序列相似性(如约97％、97.5％、98％、98.5％、99％、99.5％、或100％序列相似性中的任一者)的16s核糖体rna序列的微生物。在一些实施例中，dfm组合物仅包括敏捷乳杆菌菌株d1、唾液乳杆菌菌株d2、或卷曲乳杆菌菌株d3。在另一个实施例中，dfm组合物包括敏捷乳杆菌菌株d1和唾液乳杆菌菌株d2；敏捷乳杆菌菌株d1和卷曲乳杆菌菌株d3；唾液乳杆菌菌株d2和卷曲乳杆菌菌株d3；或敏捷乳杆菌菌株d1、唾液乳杆菌菌株d2和敏捷乳杆菌菌株a3。在一些实施例中，将该一种或多种d1、d2和/或d3菌株以至少1
×
104cfu/动物/天的速率施用于动物。对于家禽，根据一个非限制性实施例，可以将该一种或多种d1、d2和/或d3菌株以约1
×
105cfu/g饲料至约1
×
10
10
cfu/g饲料来饲喂。在至少一些实施例中，将该一种或多种d1、d2和/或d3菌株以约1
×
105cfu/禽类/天或约1
×
108cfu/禽类/天来饲喂。
[0171]
本文提供的dfm组合物可以例如作为含有菌株的培养液、含有菌株的上清液或培养液的细菌产物来施用。将包含本文提供的dfm和任选的外源性饲料酶的组合物施用于动物可以提高动物的性能。在一个实施例中，将本文提供的dfm施用于动物可以增加平均日饲料摄入量(adfi)、平均日增重(adg)或饲料效率(增重:饲料；g:f)(统称为“性能指标”)。可以改善这些性能指标中的一项或多于一项。
[0172]
能以多种方式中的一种向动物施用包含dfm和外源性饲料酶的组合物。例如，该组合物可以作为兽药以固体形式施用，可以分布在赋形剂中，优选地水(如通过水管)，并直接饲喂给动物，能以干燥的形式与饲料材料物理上混合，也可以将该组合物形成溶液，然后喷洒到饲料材料上。向动物施用本文公开的组合物的方法被认为在技术人员的技能范围内。
[0173]
当与饲料材料组合使用时，该饲料材料可以包括玉米、大豆粉、副产品像干酒糟及可溶物(ddgs)、以及维生素/矿物质补充剂。也可以使用其他饲料材料。
[0174]
因此，在至少一些实施例中，通过补充旨在用于动物的饲料，向动物施用有效量的包含dfm和任选的外源性饲料酶的组合物。如本文所用，“补充”是指将有效量的本文提供的细菌直接掺入旨在用于动物的饲料中的行为。因此，动物在饲喂时摄取本文提供的细菌。
[0175]
b.用于制备饲料添加剂组合物的方法
[0176]
本文还提供了用于制备饲料添加剂组合物的方法，这些方法包括将本文公开的两种或更多种dfm组合。在一些实施例中，该方法包括将以下中的两种或更多种(如2种或3种中的任一者)组合：罗伊氏乳杆菌菌株s1(cbs 145921)，或具有罗伊氏乳杆菌菌株s1的所有鉴别特征的菌株，或具有与罗伊氏乳杆菌菌株s1(seq id no:7)的16s核糖体rna序列呈现出至少约97.0％序列相似性(如约97％、97.5％、98％、98.5％、99％、99.5％、或100％序列相似性中的任一者)的16s核糖体rna序列的微生物；罗伊氏乳杆菌菌株s2(cbs 145922)，或具有罗伊氏乳杆菌菌株s2的所有鉴别特征的菌株，或具有与罗伊氏乳杆菌菌株s2(seq id no:8)的16s核糖体rna序列呈现出至少约97.0％序列相似性(如约97％、97.5％、98％、98.5％、99％、99.5％、或100％序列相似性中的任一者)的16s核糖体rna序列的微生物；罗伊氏乳杆菌菌株s3(cbs 145923)，或具有罗伊氏乳杆菌菌株s3的所有鉴别特征的菌株，或具有与罗伊氏乳杆菌菌株s3(seq id no:9)的16s核糖体rna序列呈现出至少约97.0％序列相似性(如约97％、97.5％、98％、98.5％、99％、99.5％、或100％序列相似性中的任一者)的16s核糖体rna序列的微生物。在另一个实施例中，将罗伊氏乳杆菌菌株s1和s2组合；将罗伊氏乳杆菌菌株s1和s3组合；将罗伊氏乳杆菌菌株s2和s3组合；或将a.colihominis菌株s1、s2和s3组合。
[0177]
在又另外的实施例中，该方法包括将以下中的两种或更多种(如2种、3种或4种中的任一者)组合：母鸡乳杆菌菌株h1(cbs 145918)，或具有母鸡乳杆菌菌株h1的所有鉴别特征的菌株，或具有与母鸡乳杆菌菌株h1(seq id no:11)的16s核糖体rna序列呈现出至少约97.0％序列相似性(如约97％、97.5％、98％、98.5％、99％、99.5％、或100％序列相似性中的任一者)的16s核糖体rna序列的微生物；唾液乳杆菌菌株h2(cbs 145919)，或具有唾液乳杆菌菌株h2的所有鉴别特征的菌株，或具有与唾液乳杆菌菌株h2(seq id no:10)的16s核糖体rna序列呈现出至少约97.0％序列相似性(如约97％、97.5％、98％、98.5％、99％、99.5％、或100％序列相似性中的任一者)的16s核糖体rna序列的微生物；敏捷乳杆菌菌株h3，或具有敏捷乳杆菌菌株h3的所有鉴别特征的菌株，或具有与敏捷乳杆菌菌株h3(seq id no:1)的16s核糖体rna序列呈现出至少约97.0％序列相似性(如约97％、97.5％、98％、98.5％、99％、99.5％、或100％序列相似性中的任一者)的16s核糖体rna序列的微生物；和/或罗伊氏乳杆菌菌株a2(cbs 145924)，或具有罗伊氏乳杆菌菌株a2的所有鉴别特征的菌株，或具有与罗伊氏乳杆菌菌株a2(seq id no:12)的16s核糖体rna序列呈现出至少约97.0％序列相似性(如约97％、97.5％、98％、98.5％、99％、99.5％、或100％序列相似性中的任一者)的16s核糖体rna序列的微生物。在另一个实施例中，将母鸡乳杆菌菌株h1和唾液乳杆菌菌株h2组合；将母鸡乳杆菌菌株h1和敏捷乳杆菌菌株h3组合；将母鸡乳杆菌菌株h1和罗伊氏乳杆菌菌株a2组合；将唾液乳杆菌菌株h2和敏捷乳杆菌菌株h3组合；将唾液乳杆菌菌株h2和罗伊氏乳杆菌菌株a2组合；将敏捷乳杆菌菌株h3和罗伊氏乳杆菌菌株a2组合；将母鸡乳杆菌菌株h1、唾液乳杆菌菌株h2和敏捷乳杆菌菌株h3组合；将母鸡乳杆菌菌株h1、敏捷乳杆菌菌株h3和罗伊氏乳杆菌菌株a2组合；将唾液乳杆菌菌株h2、敏捷乳杆菌菌株h3和罗伊氏乳杆菌菌株a2组合；将母鸡乳杆菌菌株h1、唾液乳杆菌菌株h2、敏捷乳杆菌菌株h3和罗伊氏乳杆菌菌株a2组合；将母鸡乳杆菌菌株h1、唾液乳杆菌菌株h2和敏捷乳杆菌菌株h3组合；或将母鸡乳杆菌菌株h1、唾液乳杆菌菌株h2和罗伊氏乳杆菌菌株a2组合。
[0178]
在另外的实施例中，该方法包括将以下中的两种或更多种(如2种或3种中的任一者)组合：唾液乳杆菌菌株a1，或具有唾液乳杆菌菌株a1的所有鉴别特征的菌株，或具有与唾液乳杆菌菌株a1(seq id no:2)的16s核糖体rna序列呈现出至少约97.0％序列相似性(如约97％、97.5％、98％、98.5％、99％、99.5％、或100％序列相似性中的任一者)的16s核糖体rna序列的微生物；罗伊氏乳杆菌菌株a2(cbs 145924)，或具有罗伊氏乳杆菌菌株a2的所有鉴别特征的菌株，或具有与罗伊氏乳杆菌菌株a2(seq id no:12)的16s核糖体rna序列呈现出至少约97.0％序列相似性(如约97％、97.5％、98％、98.5％、99％、99.5％、或100％序列相似性中的任一者)的16s核糖体rna序列的微生物；和/或敏捷乳杆菌菌株a3，或具有敏捷乳杆菌菌株a3的所有鉴别特征的菌株，或具有与敏捷乳杆菌菌株a3(seq id no:3)的16s核糖体rna序列呈现出至少约97.0％序列相似性(如约97％、97.5％、98％、98.5％、99％、99.5％、或100％序列相似性中的任一者)的16s核糖体rna序列的微生物。在另一个实施例中，将唾液乳杆菌菌株a1和罗伊氏乳杆菌菌株a2组合；将唾液乳杆菌菌株a1和敏捷乳杆菌菌株a3组合；将罗伊氏乳杆菌菌株a2和敏捷乳杆菌菌株a3组合；或将唾液乳杆菌菌株a1、罗伊氏乳杆菌菌株a2和敏捷乳杆菌菌株a3组合。
[0179]
在另外的实施例中，该方法包括将以下中的两种或更多种(如2种或3种中的任一者)组合：敏捷乳杆菌菌株d1，或具有敏捷乳杆菌菌株d1的所有鉴别特征的菌株，或具有与敏捷乳杆菌菌株d1(seq id no:5)的16s核糖体rna序列呈现出至少约97.0％序列相似性(如约97％、97.5％、98％、98.5％、99％、99.5％、或100％序列相似性中的任一者)的16s核糖体rna序列的微生物；唾液乳杆菌菌株d2，或具有唾液乳杆菌菌株d2的所有鉴别特征的菌株，或具有与唾液乳杆菌菌株d2(seq id no:4)的16s核糖体rna序列呈现出至少约97.0％序列相似性(如约97％、97.5％、98％、98.5％、99％、99.5％、或100％序列相似性中的任一者)的16s核糖体rna序列的微生物；和/或卷曲乳杆菌菌株d3，或具有卷曲乳杆菌菌株d3的所有鉴别特征的菌株，或具有与卷曲乳杆菌菌株d3(seq id no:6)的16s核糖体rna序列呈现出至少约97.0％序列相似性(如约97％、97.5％、98％、98.5％、99％、99.5％、或100％序列相似性中的任一者)的16s核糖体rna序列的微生物。在另一个实施例中，将敏捷乳杆菌菌株d1和唾液乳杆菌菌株d2组合；将敏捷乳杆菌菌株d1和卷曲乳杆菌菌株d3组合；将唾液乳杆菌菌株d2和卷曲乳杆菌菌株d3组合；或将敏捷乳杆菌菌株d1、唾液乳杆菌菌株d2和卷曲乳杆菌菌株d3组合。
[0180]
另外，用于制备饲料添加剂组合物的方法可以进一步包括将饲料添加剂组合物与本文公开的外源性酶中的一种或多种(例如，植酸酶、蛋白酶、淀粉酶、木聚糖酶或β-葡聚糖酶中的一种或多种)组合。该方法可以另外包括包装所述饲料添加剂组合物用于储存或运输的另外的步骤。
[0181]
c.用于去除抗微生物药物抗性(amr)基因的方法
[0182]
细菌已经进化以克服广泛的抗生素，并且已经在一些细菌中发现了针对大多数常规抗生素的抗性机制。新抗生素的加速开发正被细菌抗性的速度所超越。例如，在美国，超过70％的医院获得性感染涉及对至少一种抗生素具有抗性的细菌，且在日本，超过50％的金黄色葡萄球菌(staphylococcus aureus)的临床分离株具有多药抗性。因此，在一些情况下，从用于预防肠炎症和维持肠稳态的益生菌/dfm中去除抗微生物药物抗性(amr)基因可能是期望的。
[0183]
由多种细菌携带的amr基因在本领域中是已知的，并且如果需要，可以对任何特定细菌中抗生素抗性基因的序列进行确定。在某些非限制性实施例中，本公开包括crispr系统，该系统可用于去除抗生素抗性基因。在一些实施例中，抗性基因赋予对青霉素类抗生素的窄谱β-内酰胺抗生素的抗性。在其他实施例中，抗性基因赋予对甲氧西林(例如，甲氧西林或苯唑西林)、或氟氯西林(flucloxacillin)、或双氯西林(dicloxacillin)、或这些抗生素中的一些或全部的抗性。
[0184]
amr基因的示例包括但不限于磷霉素抗性基因fosb，四环素抗性基因tetm或tetw，卡那霉素核苷酸基转移酶aadd，双功能氨基糖苷修饰酶基因aaca-aphd，氯霉素乙酰转移酶cat，莫匹罗星抗性基因iles2，万古霉素抗性基因vanx、vanr、vanh、vrae、vrad，甲氧西林抗性因子fema、fmta、mecl，链霉素腺苷转移酶spc1、spc2、antl、ant2，壮观霉素腺苷转移酶spd、ant(9)、氨基糖苷类核苷酸转移酶spd、aada2、核苷酸转移酶lnua、lnub、lnuc、乙酰转移酶vate和任何其他抗性基因。在一些实施例中，amr与一个或多个可移动遗传元件(如转座子)相关联，而不是可位于amr基因附近(如在amr基因的约10kb、9kb、8kb、7kb、6kb、5kb、4kb、3kb、2kb、1kb、0.5kb中的任一个距离内或更靠近该基因，包括落入任何这些值之间的距离)。
[0185]
可以通过本领域已知的任何数量的方法定性和/或定量地鉴定或测定amr。例如，可以从微生物样品中提取dna，并使用例如定量pcr(qpcr)，包括多重定量pcr(qpcr)来评估抗生素抗性基因的存在。微生物dna阵列测定可以测试多种抗生素抗性基因，并有助于在单一反应中测试高度普遍的细菌抗生素抗性基因，同时具有抗性基因鉴定(存在与不存在)和定量分析(相对于内标的表达)两者。用于鉴定amr的其他方法包括但不限于通过使用短读段测序技术(illumina)和/或长读段测序技术平台(如oxford nanopore技术或pacbio)或通过实例5中使用和讨论的技术进行全基因组测序。一旦鉴定，可以使用本领域中可用的任何数量的标准分子工具(如重组工程)(zhang等人,2018,j bacteriol[细菌学杂志]200；ozcam等人,2019,appl environ microbiol[应用与环境微生物学]85，其公开通过援引并入本文)，或通过携带amr基因的质粒的丢失(rosander等人,2008,appl environ microbio[应用与环境微生物学]l 74:6032-6040，其公开通过援引并入本文)去除或灭活amr基因。
[0186]
在一些实施例中，本文提供的菌株(这些菌株包括罗伊氏乳杆菌菌株s1(cbs 145921)、罗伊氏乳杆菌菌株s2(cbs 145922)、罗伊氏乳杆菌菌株s3(cbs 145923)、母鸡乳杆菌菌株h1(cbs145918)、唾液乳杆菌菌株h2(cbs 145919)、罗伊氏乳杆菌菌株a2(cbs 145924)、敏捷乳杆菌菌株h3、唾液乳杆菌菌株a1、敏捷乳杆菌菌株a3、敏捷乳杆菌菌株d1、唾液乳杆菌菌株d2、和卷曲乳杆菌菌株d3)中的一种或多种(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、或11种中的任一者)进一步包含一种或多种(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、或更多种中的任一者)amr基因被灭活或缺失。
[0187]
iv.试剂盒
[0188]
本文进一步提供了试剂盒，其含有本文公开的一种或多种dfm(如一种或多种多菌株dfm)。这些试剂盒可以包括本文提供的菌株(这些菌株包括罗伊氏乳杆菌菌株s1(cbs 145921)、罗伊氏乳杆菌菌株s2(cbs 145922)、罗伊氏乳杆菌菌株s3(cbs 145923)、母鸡乳杆菌菌株h1(cbs145918)、唾液乳杆菌菌株h2(cbs 145919)、罗伊氏乳杆菌菌株a2(cbs 145924)、敏捷乳杆菌菌株h3、唾液乳杆菌菌株a1、敏捷乳杆菌菌株a3、敏捷乳杆菌菌株d1、
唾液乳杆菌菌株d2、和卷曲乳杆菌菌株d3)中的一种或多种(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、或11种中的任一者)连同用于正确储存、维护以及用于向动物施用以改善一项或多项性能指标的使用说明。在一个实施例中，该试剂盒可以包括菌株s1、s2、和/或s3。在另一个实施例中，该试剂盒可以包括菌株h1、h2、h3、和/或a2(如h1、h2、和h3；或h1、h2、和a2)。在另外的实施例中，该试剂盒可以包括菌株a1、a2、和/或a3。在又另外的实施例中，该试剂盒可以包括菌株d1、d2、和/或d3。这些试剂盒可以另外包括本文公开的外源性酶中的一种或多种(例如，植酸酶、蛋白酶、淀粉酶、木聚糖酶或β-葡聚糖酶中的一种或多种)。
[0189]
通过参照以下实例可以进一步理解本发明，这些实例是为了说明而提供的，而不是为了限制。
[0190]
实例
[0191]
实例1：材料和方法
[0192]
在以下实例中，为了易于阅读，使用如下所阐述的各种方法和测定法。与下面提供的方案的任何偏差均在相关部分中指出。
[0193]
从鸡肠道中分离乳杆菌菌株：将现场解剖的git样品尽快转移到厌氧运输介质中。一旦肠样品抵达实验室，就开始菌株分离。在厌氧室内使用无菌技术对盲肠、回肠、空肠或十二指肠样品进行解剖。弃去消化物并使用环将粘膜结合的材料刮除。然后将该材料转移到无菌培养基或缓冲液中并进行连续稀释。使用铺板珠将范围从10-1
至10-6
的连续稀释液铺板到各种培养基类型的皮氏培养皿或全能板(omni plate)上。然后将这些板在厌氧条件下孵育直到菌落变得可见。使用mrs琼脂培养基(de man、rogosa和sharpe)或脑心浸液培养基(bhi)进行分离。
[0194]
一旦在琼脂板上可见菌落，就在厌氧室中将菌落挑取到96深孔板中的液体培养基中。一些板最初被挑取到少量液体培养基(即200μl)中，然后在1-4天后添加培养基至800ul以促进生长。对于同一个板，可以在多个时间点进行菌落挑取。例如，在第2天挑取大菌落，然后在第5天挑取非常小的菌落或新菌落。
[0195]
通过16s测序和netb qpcr分析小肠粘膜区域的微生物组成：为了对小肠的微生物组成进行评估，通过16s测序对小肠粘膜区域的鸡拭子进行了分析。将鸡的胃肠道(git)去除并分成四个部分：十二指肠、空肠、回肠和盲肠。对每个部分进行挤压以去除消化物内容物，然后纵向切割以暴露内表面。使用floqswab(加利福尼亚州穆列塔市copan mfgr公司(copan mfgr，murrieta，ca))对每个部分的内表面进行擦拭。将拭子直接添加到96孔凯杰公司(qiagen)magattract powersoil试剂盒(德国希尔登凯杰公司(qiagen，hilden，germany))的孔中。根据制造商的说明，使用kingfisher flex自动化平台对拭子进行细菌dna分离处理。然后分离的宏基因组dna可用于ngs样品制备。
[0196]
将从鸡git拭子中纯化的宏基因组dna制备用于16s群落测序，如下所示：通过将20μl分子生物学级水以0.1-10ng/μl添加到5μl纯化的dna中，以1∶5稀释dna。然后将2μl稀释的dna与25ul不含ung的abi universal taqman反应混合物(abi universal taqman reaction mix)(赛默飞世尔公司(thermofisher)#4326614)、0.1ul 100um的每种pcr引物和24.8ul分子生物学级水一起添加到pcr反应中，总体积为50ul。使用的pcr引物是illumina-v4-515f-rj：tcgtcggcagcgtcagatgtgtataagagacaggtgccagcmgccgcggtaa和illumina-v4-806r-rj：gtctcgtgggctcggagatgtgtataagagacagggactachvgggtwtctaat。
pcr反应为：95℃10min，然后95℃15秒 55℃30秒 72℃持续2min的35个循环。根据制造商的说明，使用安捷伦bravo自动机器人工作站，使用ampure xp磁珠(贝克曼库尔特公司(beckman coulter)a63881)对扩增反应进行纯化。然后在第二个pcr反应中使用illumina xt索引引物(illumina xt index primers)(illumina xt v2.0#fc-131-2001-2004)在与上述相同的条件下进行15个循环来对2μl的每个扩增子池进行索引化。然后将索引化的扩增子汇集并在安捷伦bravo自动机器人工作站上使用ampure xp磁珠进行纯化。根据制造商的说明，使用kapa illumina文库定量试剂盒(kapa illumina library quantification kit)(kapa#kk4835)对汇集的、索引化的扩增子进行定量。将纯化、定量、索引化的池与15％illumina phix(illumina fc-110-3001)一起加载到illumina miseq上，终浓度为8pm。将测序运行2x250个配对末端循环。
[0197]
对来自illumina miseq测序的16s扩增子数据进行了分析。配对末端读段首先由flash合并(mogoc等人，bioinformatics.[生物信息学]2011；27：2957-63)。从合并的读段中去除正向和反向引物，并通过rdp初始处理工具(rdp initial process tool)(fish等人，front microbiol.[微生物前沿]2013；4：291)将总体质量得分低于20的读段舍弃。由于源自鸡线粒体的读段长度短于200bp，该步骤还将这些读段去除。在下一步骤中，通过rdp分类器将读段分配给细菌和古菌分类法(wang等人，appl environ microbiol.[应用与环境微生物学]73(16)：5261-5267)。将通过以上质量处理步骤的读段通过cd-hit以98％聚类(li和godzik，bioinformatics[生物信息学]，2006；22：1658-9)，以获得运算分类单元(otu)。将来自每个otu的代表性序列通过rdp双序列比对工具(fish等人，front microbiol.[微生物前沿]2013；4：291)针对经过审查的16s参考数据库分配给最近的物种，该参考数据库主要包含来自模式菌株和公共基因组的16s基因。样品中otu的相对丰度是分配给该otu的读段的分数。如果otu与参考数据库中的某一物种具有至少98％的同一性，则将该otu分配给该物种。将小肠中的聚生体中物种的平均丰度计算为来自每种处理的duo、jej和ill样品的该物种的平均相对丰度。
[0198]
还使用qpcr对netb基因的相同dna制剂进行了定量。netb是产气荚膜梭菌的重要毒力因子。使用1.5μl dna连同10μl taqman universal master mix、0.2μl 100um正向和反向引物、0.05μl taqman探针和9.55μl分子生物学级水运行每个测定。qpcr反应条件如下：在abi quant studio qpcr仪器上，95℃10min 以下的40个循环：95℃15秒 60℃60秒。使用来自netb阳性产气荚膜梭菌的基因组dna对样品数据进行定量。所用的引物和探针序列在下表5中。
[0199]
表5：qpcr引物和探针
[0200]
靶标引物名称方向序列(5'至3')总细菌16s16s-t1-1369f正向cggtgaatacgttcycgg 16s-t1-1492r反向ggwtaccttgttacgactt 16s-t1-1389t探针cttgtacacaccgcccgtc产气荚膜梭菌cperf165f正向cgcataacgttgaaagatgg cperf269r反向ccttggtaggccgttaccc cperf187t探针tcatcattcaaccaaaggagcaatccnetb基因netb-rj-fwd正向tggtgctggaataaatgcttcat
ꢀ
netb-rj-rev反向tgcatcatcttttctttgaattgttc netb-rj-mgb探针atactataagctatgaacaacc
[0201]
用于表征乳杆菌分离株附着于粘蛋白和胶原蛋白的能力的结合测定：小肠中粘液膜的主要组分是粘蛋白，并且使用与粘蛋白结合的能力来评估其粘附胃肠道的能力。结合测定在无菌的未经tc处理的聚苯乙烯板上用96孔进行。初始步骤是在板上涂覆粘蛋白(ii型或iii型猪粘蛋白，西格玛公司(sigma))。通过搅拌几个小时直到获得均匀的悬浮液来制备粘蛋白溶液(1％)。将溶液在使用前高压灭菌。将120μl粘蛋白溶液添加到每个96孔中，并将板在4℃孵育过夜。使用前，去除未结合的粘蛋白并用125μl分子生物学级水冲洗两次。
[0202]
对于结合测定，使用在37℃或40℃时在mrs培养基中生长的新鲜过夜培养物。首先通过离心收集培养物，并用1x pbs培养基洗涤一次。将1od(600nm)的100μl培养物添加到洗涤过的粘蛋白涂覆板的每个孔中，并将板在37℃厌氧室或厌氧罐中孵育2小时。孵育后，将板用100μl 1x pbs洗涤两次，并通过添加100μl的在水中稀释的0.1％结晶紫溶液(来自西格玛公司的1％储备溶液)对每个孔中的附着细胞进行染色。让板在室温下静置5至10min。去除未结合的染料，并将每个孔用100μl 1x pbs洗涤三次。为了测量与附着细胞结合的染料，使用100μl的1x pbs通过上下移液来重新悬浮结合的细胞。替代性地，使用100μl乙醇来溶解染料。20min后，在570或590nm处测量染料强度。读数反映了附着细胞的数量。
[0203]
使用类似的程序来评估乳杆菌菌株结合来自康宁公司(corning)的biocoat胶原蛋白iv板的能力。据报道，胶原蛋白结合是产气荚膜梭菌的重要毒力因子之一(vet microbiol.[兽医微生物学]2015年11月18日；180:299-303)。dfm的潜在有益特性之一可能是这种细胞外基质的竞争性结合。
[0204]
用于表征乳杆菌分离株对产气荚膜梭菌的抗微生物活性的抗微生物测定：使用来自鸡git样品的乳杆菌分离株的上清液进行基于微孔板的抗微生物测定。将分离株接种在mrs液体培养基中，并在37℃厌氧条件下生长2至3天。将培养物以4500rpm离心5min，并将上清液收集在costar 96孔板中并过滤。将20或25μl上清液用于测定。
[0205]
将来自新鲜板的靶病原体产气荚膜梭菌在37℃接种在bhi培养基中，并在厌氧条件下生长过夜。用bhi培养基将产气荚膜梭菌培养物稀释成0.1的od(600nm)。将175或180μl稀释的产气荚膜梭菌培养物添加到每个含有20或25μl上清液的孔中至终体积为200μl。对于对照，使用20或25μl的mrs培养基。将测定板在厌氧条件下于37℃孵育18小时，然后测量od(600nm)。将相对于对照的生长量用于衡量抗微生物活性。替代性地，使用微量滴定读数器(microtiter reader)连续监测生长。
[0206]
产气荚膜梭菌引起的坏死性肠炎的动物模型：已广泛使用针对肉鸡的激发致病模型(front microbiol.[微生物前沿]2016,7:1416；j anim sci biotechnol.[动物科学与生物技术杂志]2018,9:25；poult sci.[家禽科学]2018年11月18日)。在该实验中，将鸡在第9天首先用活的1x艾美虫病疫苗(球虫病疫苗，内布拉斯加州林肯huvepharma公司(huvepharma,inc.,lincoln,ne)68528)进行激发。实验组和对照组各有十七(17)只禽类。将疫苗用水稀释，并且每只鸡口服接受1ml。在第11天，每只鸡口服接受1ml的病原体混合物。病原体混合物由从患病组织中分离出的五种产气荚膜梭菌菌株组成。基于基因组分析，所有菌株均含有netb和tpel基因。这些菌株在熟肉培养基(西格玛公司)中单独生长过夜，并将新鲜培养物在手套箱中以等体积混合以制成混合物。将混合物在同一
天使用以诱导坏死性肠炎。
[0207]
使用这种疾病模型，对乳杆菌分离株对产气荚膜梭菌感染的功效进行了评估。使乳杆菌菌株在厌氧条件下在mrs培养基中生长。以等体积混合新鲜培养物，并将针对每种聚生体的混合细胞悬浮液等分到血清瓶中。将血清瓶在80℃储存并在使用前解冻。从第1天开始，每天通过灌胃给每只鸡饲喂乳杆菌聚生体。在第15天，收集鸡肠用于组织病理学分析，并将粘膜样品用于dna分离，同上所述。
[0208]
实例2：从鸡小肠分离的乳杆菌菌株的结合与抗微生物特性
[0209]
表6总结了如根据实例1中方法所述的乳杆菌菌株的抗微生物能力和它们与粘蛋白或胶原蛋白结合的能力的体外测定结果。虽然活性是菌株依赖性的，但来自唾液乳杆菌分离株的上清液具有很高的抗微生物活性。来自罗伊氏乳杆菌的那些具有较低的抗微生物活性，但也有相当一部分具有出色的与胶原蛋白结合的能力。
[0210]
表6：乳杆菌菌株的体外测定结果
[0211][0212][0213]1结合活性测量为570nm处的od。
[0214]2抗微生物活性测量为相对于对照的抑制百分比。
[0215]
实例3：产气荚膜梭菌引起的坏死性肠炎的动物模型：
[0216]
在动物模型中评价了dfm候选者对产气荚膜梭菌感染的功效。对于动物研究，基于
乳杆菌菌株的系统发育多样性和广泛的体外测定结果的代表性将这些乳杆菌菌株按聚生体分组。聚生体及其菌株组成列于表7。使这些菌株在厌氧条件下在mrs培养基中生长，并将新鲜培养物在手套箱内以等体积混合，以制成用于动物试验的指定聚生体。在手套箱内，在厌氧条件下，将每种聚生体的混合细胞悬浮液等分到血清瓶中。将血清瓶在80℃储存并在使用前解冻。从第1天开始，每天通过灌胃将每种聚生体饲喂给鸡。在第15天，收集鸡肠用于组织病理学分析，并将粘膜样品用于dna分离，如实例1所述。
[0217]
表7：用于动物研究的乳杆菌菌株列表
[0218][0219]
如实例1所述，使用来自第15天的样品基于16s分析的产气荚膜梭菌丰度总结在表8中。在未使用乳杆菌菌株的对照组(疾病模型)中，观察到小肠中的坏死性肠炎。与该结果一致，基于16s分析和netb qpcr定量，产气荚膜梭菌丰富。饲喂了聚生体e和c的鸡显示出与对照组中鸡相似的高丰度产气荚膜梭菌。这两组鸡都患有坏死性肠炎。这表明这两种聚生体在动物试验中没有显示出对病原体扩张的功效。另一方面，产气荚膜梭菌的丰度在聚生体a、d、h和s中要低得多。组织病理学显示没有坏死性肠炎的迹象。该结果表明这四种聚生体在预防产气荚膜梭菌感染方面具有功效。从该动物研究中可以清楚地看出，对产气荚膜梭菌感染的功效取决于聚生体的具体组成，因为聚生体c和e两者与a、d、h和s中的聚生体具有一些相同的乳杆菌物种。
[0220]
表8：动物试验的结果
[0221][0222]
1-cp丰度＝16s cp序列读段/总16s序列读段(实例1)
[0223]
2-netb qpcr＝qpcr netb拷贝数/qpcr总16s
[0224]
实例4：用于评估聚生体的改善的死亡率益处的大规模动物试验
[0225]
2020年2月，位于美国的四家商业肉鸡舍分别饲养了大约56,000只鸡(本研究使用
了大约共224,000只鸡)。影响美国大规模养鸡生产的坏死性肠炎通常在11月至4月的几个月期间最为流行。
[0226]
将每个鸡舍分成两半；向50％的鸡补充了直接饲喂微生物(dfm；3种罗伊氏乳杆菌菌株s1、s2和s3的组合)，每个鸡舍的其余50％用作未加以补充的对照。鸡舍的每一半都经由不同的水管获得水。所有鸡都随意饲喂典型的美国玉米/大豆基颗粒饲料。
[0227]
于第1天放置鸡，并于第52天屠宰。在生产的第17天、第18天、第19天、第20天和第21天，对4个鸡舍中的三个和在第17天仅对一个鸡舍(第17天起与一年中这个时候通常在野外观察到的坏死性肠炎爆发率最高的时间相吻合)经由涂药器向水管中补充剂量为1.2x108cfu/鸡/天的dfm。
[0228]
收集了每个鸡舍的鸡群死亡率数据，并显示在图1中。对照鸡的综合死亡率约为11％，而接受dfm补充的鸡的死亡率为6.9％(即在研究过程中死亡率总共降低了61.5％)。
[0229]
进行了生存概率分析，并以每百万只鸡为基础计算了生产成本节约。为了计算dfm补充所带来的成本节约，考虑了以下参数：每周死亡率、每周饲料消耗量、饲料成本($0.11/lb)、雏鸡成本($0.34usd/雏鸡)和近似淘汰(approximate condemnation)。在该研究中，dfm补充和相关的死亡率降低使得每百万只鸡避免损失约$5769usd或节约$51,514usd。
[0230]
实例5：抗微生物药物抗性(amr)基因的鉴定和去除
[0231]
该实例证明了从聚生体成员中鉴定和去除抗微生物药物抗性(amr)基因。amr基因，特别是与可移动遗传元件相关联的那些，值得关注，因为它们在一些情况下可以在不同的细菌细胞之间转移，从而促进抗生素抗性。为了防止这些amr标志物的传播并遵守法规要求，将它们从用作家畜中的dfm的菌株中去除可能是有益的。
[0232]
使用短读段测序技术illumina和长读段测序技术平台(如oxford nanopore技术或pacbio)的组合对来自不同聚生体的菌株进行测序。使用标准修剪程序对来自菌株的读段进行处理，并使用标准工具将其组装成序列，这些标准工具例如有spades(bankevich等人,.2012,j comput biol[计算生物学杂志]19:455-477)、unicycler(wick等人.,2017,plos comput biol[公共科学图书馆
·
计算生物学]13:e1005595)、和pilon(walker等人.,2014,plos one[公共科学图书馆
·
综合]9:e112963)。随后使用prokka(seemann,2014,bioinformatics[生物信息学]30:2068-2069)或patric(wattam等人2018,methods mol biol[分子生物学方法]1704:79-101)对序列进行注释。使用card(综合抗生素抗性数据库(comprehensive antibiotic resistance database))(alcock等人.,2020,nucleic acids res[核酸研究]48:d517-d525)和partic(davis等人,2016,sci rep[科学报告]6:27930)鉴定了抗微生物药物抗性(amr)基因。随后检查通过这些数据库鉴定的任何amr基因在周围10kb内的可移动遗传元件。
[0233]
发现菌株s3不含amr基因，而s1和s2都具有两个与可移动遗传元件相关联的不同amr基因：lnuc，一种转座子介导的核苷酸转移酶，和vate，一种转座子介导的乙酰转移酶。两个基因都靠近转座酶。发现amr基因和转座酶的侧翼是一组间接和直接重复序列(achard等人,2005,antimicrob agents chemother[抗微生物制剂与化疗]49:2716-2719)。在整个基因组中分布有四个lnuc拷贝，并且在s1中鉴定了一个vate拷贝，而在s2中发现了任一基因的一个拷贝。该菌株s2还包含tetw基因，该基因与基因周围10kb内的任何可移动遗传元件不相关联。
[0234]
基于lnuc(470,273正向、995,196反向、1,149,997正向、1,775,176正向)和vate(1,439,964)的pacbio杂交序列鉴定了这些基因在s1中的位置，并基于lnuc(161,023正向)、vate(457,661正向)和tetw(818,067反向)的ont杂交序列鉴定了这些基因在s2中的位置。
[0235]
使用标准分子工具如重组工程(zhang等人,2018,j bacteriol[细菌学杂志]200；ozcam等人,2019,appl environ microbiol[应用与环境微生物学]85)或基于crispr的方法(oh和van pijkeren,2014,nucleic acids res[核酸研究]42:e131)去除了这些基因及其相关转座酶。
[0236]
序列
[0237]
敏捷乳杆菌菌株h3 16s rrna
[0238][0239]
唾液乳杆菌菌株a1 16s rrna
[0240][0241]
敏捷乳杆菌菌株a3 16s rrna
[0242][0243]
唾液乳杆菌菌株d2 16s rrna
[0244][0245]
敏捷乳杆菌菌株d1 16s rrna
[0246][0247]
卷曲乳杆菌菌株d3 16s rrna
[0248][0249]
罗伊氏乳杆菌菌株s1 16s rrna
[0250][0251]
罗伊氏乳杆菌菌株s2 16s rrna
[0252][0253]
罗伊氏乳杆菌菌株s3 16s rrna
[0254][0255]
唾液乳杆菌菌株h2 16s rrna
[0256][0257]
母鸡乳杆菌菌株h1 16s rrna
[0258][0259]
罗伊氏乳杆菌菌株a2 16s rrna
[0260]