作为用于抗微生物剂的佐剂的纤维蛋白原和疗法的制作方法

1.本发明涉及一种增加微生物对抗微生物剂的敏感性的方法和疗法，特别是该方法可以用于降低生物膜对抗微生物剂的耐药性。


背景技术：

2.病原体的抗微生物剂耐药性是全世界日益关注的问题。常常，病原体已经设法逃脱了曾经强大的抗微生物剂化合物诸如青霉素的作用。使用不同的策略来克服抗微生物剂耐药性问题：1)正在开发新的抗微生物剂，2)正在使用采用两种或更多种现有抗微生物剂的联合疗法，以及3)将用作抗微生物剂佐剂的治疗策略和产品与现有抗微生物剂联合使用，以降低病原体对这种抗微生物剂的耐药性。抗微生物剂佐剂产品和治疗策略包括抗耐药性的药物(如β-内酰胺酶抑制剂)、抗毒性药物(如细菌毒素抑制剂)和宿主导向疗法(如先天免疫系统激动剂)。
3.微生物用来增加对抗微生物剂和疗法的耐药性的机制之一是形成聚集体、小菌落或生物膜。已知生物膜或聚集体中的病原体对抗微生物剂的耐药性比浮游形式的自由漂浮病原体高10至1000倍。当生物膜在留置医疗装置(诸如导管、支架、心脏瓣膜、起搏器和关节置换物)上形成并导致总感染的65％时，这在医疗装置领域是严重的问题。生物膜的形成可以导致装置的失效和与装置相关联的感染的传播。现在推荐的方法是移除装置然后进行抗生素治疗或与抗生素治疗相结合，以及在根除感染之后更换装置。已经提出了移除和替换的替代方案。kretlow等人(2014)plast reconstr surg.2014,133(l):28e-38e描述了用抗生素珠原位治疗左心室辅助装置。
4.另一个复杂因素是存在包含某些真菌和病毒或真菌和细菌的多微生物生物膜，导致对抗病毒剂、抗细菌剂和抗真菌剂的耐药性增加。
5.由于病原体的粘附对于定殖和随后的疾病发展是必需的，因此一些研究集中于防止病原体粘附到表面以防止生物膜的形成。纤维蛋白原是最丰富的宿主血浆蛋白之一，被认为是促进生物膜形成的重要宿主蛋白。flores-mireles等人在j urol 2016:416中描述了纤维蛋白原沉积为泌尿病原体的积聚表面。kwiecinski等人(j.infect.dis.2016:213)描述了纤溶酶如何防止生物膜的形成。
6.纤维蛋白原也被认为会增加生物膜对抗生素的耐药性。bedran等人(biomed research international vol.2013,article id 431465)报告了纤维蛋白原诱导的变异链球菌生物膜形成的体外结果，变异链球菌对青霉素的耐药性增加。jorgensen等人(microorganisms2016:4)描述了特异性降解纤维蛋白原或纤维蛋白的纤维蛋白溶解酶如何显著增加体外细菌生物膜对抗生素的易感性。这些出版物表明，在体外，纤维蛋白原的存在刺激生物膜的形成，并且导致纤维蛋白原消耗的纤维蛋白溶解提高了抗生素在生物膜感染治疗中的功效。
附图说明
7.图1金黄色葡萄球菌对不同固定化纤维蛋白原种的粘附。
8.图2与在预先涂覆有不同纤维蛋白原种类的表面上体外形成的生物膜相关联的存活的金黄色葡萄球菌细菌。
9.图3在生物膜形成期间，在细菌培养基中用血浆fib或rhfibγ
′
在未预先涂覆表面上体外形成的生物膜中检测到的存活的金黄色葡萄球菌细菌。
10.图4在预先涂覆有血浆fib或rhfibγ
′
、植入小鼠皮下并用金黄色葡萄球菌细菌感染的ptfe笼上体内形成的生物膜中检测到的存活的金黄色葡萄球菌细菌。
11.图5在预先涂覆有不同纤维蛋白原种类并随后暴露于不同剂量的万古霉素或氨苄青霉素的表面上体外形成的生物膜中检测到的存活的金黄色葡萄球菌细菌。
12.图6在细菌培养基中存在血浆fib(6a和6c)或rhfibγ
′
(6b和6d)的情况下，在未预先涂覆表面上体外形成的生物膜中检测到的存活的金黄色葡萄球菌细菌；6e)随后暴露于万古霉素的血浆fib和rhfibγ
′
的50/50混合物。
13.图7在治疗性(7a)和预防性(7b)达托霉素处理后，在预先涂覆有血浆fib、rhfib wt或rhfibγ
′
、植入小鼠皮下的ptfe笼上体内形成的生物膜中检测到的存活的金黄色葡萄球菌细菌。
具体实施方式
14.本发明涉及包括纤维蛋白原的组合物用于治疗或预防个体的抗微生物剂耐药性的用途。
15.根据本发明的用途减轻了微生物对抗微生物剂的耐药性问题。特别地，它增加了微生物对抗微生物剂疗法的易感性，并且特别有利于对抗典型地对抗微生物剂化合物极不易感的微生物，诸如生物膜、聚集体或小菌落中的微生物。众所周知，生物膜(其为微生物群落)对抗微生物剂具有耐药性，即这些生物膜逃脱了曾经强大的抗微生物剂化合物的作用。根据本发明的用于用途的组合物可以与现有的抗微生物剂药物一起用作抗微生物剂佐剂，以降低微生物的生物膜或聚集体对这些抗微生物剂药物的耐药性。
16.在一个实施方案中，根据本发明的用于用途的组合物增加了细菌对抗微生物剂化合物的敏感性。抗菌化合物是停止细菌生长(抑菌)或杀死细菌(杀菌)的化合物，且包括抗生素、噬菌体及其内溶素、抗菌或抗微生物肽和抗菌抗体。本领域技术人员将会理解，针对一些细菌的杀菌化合物可能对其他细菌是抑菌的，反之亦然。优选地，抗微生物化合物是天然的、合成的或半合成的抗生素。合适的天然的、合成的或半合成的抗生素包括氨基糖苷类、抗菌咪唑类、β-内酰胺类、大环内酯类、肽抗生素、多克隆或单克隆抗体、喹诺酮类、磺胺类和四环素类及其衍生物。
17.氨基糖苷类的实例是庆大霉素和妥布霉素。抗菌咪唑的实例是咪康唑和甲硝唑；β-内酰胺的实例是青霉素，包括天然青霉素、氨基青霉素、β-内酰胺酶耐药性青霉素、羧基青霉素，诸如阿莫西林、氨苄青霉素和青霉素；头孢菌素，诸如头孢氨苄；和碳青霉烯类，诸如美罗培南和多里培南。大环内酯的实例是酮内酯和大环内酯抗生素，诸如克拉霉素、红霉素和泰利霉素。肽抗生素的实例是糖肽抗生素，诸如万古霉素，和脂肽抗生素，诸如达托霉素。抗体的实例是针对金黄色葡萄球菌聚集因子a、α毒素、脂磷壁酸和磷壁酸的抗体。喹诺
酮的实例是氟喹诺酮，诸如环丙沙星和左氧氟沙星。磺酰胺的实例是磺胺醋酰和磺胺甲唑。四环素类的实例是四环素和强力霉素。在一个实施方案中，抗菌化合物是青霉素或肽抗生素。在另一个实施方案中，抗微生物化合物是羧基青霉素、糖肽抗生素或脂肽抗生素。在另一个实施方案中，抗微生物化合物选自由氨苄青霉素、万古霉素、达托霉素和妥布霉素组成的组。
18.技术人员将熟悉这样的事实，即一些抗微生物剂用于对抗几组微生物。例如，一些抗微生物肽可以用于对抗细菌感染和病毒或真菌感染两者。
19.该组合物也可以用于治疗包括几种类型微生物的感染。该组合物可以用于增加一种类型微生物或几种类型微生物的抗微生物剂易感性。例如，可以使得细菌生物膜中的病毒或酵母对抗病毒剂或抗酵母剂更易感。
20.生物膜或聚集体中的传染性微生物也可以称为病原体。可以用本发明的佐剂方法治疗的生物膜相关联感染中的臭名昭著的病原体是细菌金黄色葡萄球菌，特别是耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(mrsa)。
21.根据本发明的用于用途的组合物增加了微生物的抗微生物剂易感性。根据本发明处理的微生物优选呈簇的形式，诸如聚集在一起或簇集在一起，或者它们可以粘附在表面上，例如在生物膜中。与自由漂浮形式的微生物相比，呈簇的形式或在生物膜中的微生物对抗微生物剂不太易感。在生物膜中，微生物典型地被来自由微生物自身分泌或从宿主募集的聚合物质(eps)(诸如糖蛋白)的细胞外基质包围。生物膜在本领域中也被称为糖萼。
22.附着表面包括活体表面，诸如组织、细胞表面和伤口床，以及惰性表面，诸如医疗装置，特别是留置医疗装置或植入物，包括导管、心脏植入式电子装置(cied)、心脏瓣膜、固定器、关节置换物、支架、气管造口术和伤口引流管。导管的实例是外周插入中心导管(picc管线)、植入式端口和导尿管。cied的实例是起搏器、左心室辅助装置(lvad)和植入式除颤器。固定器的实例是针、板、杆、螺钉和线材。关节置换物的实例是髋关节、膝关节和肩关节假体。装置可以包括金属、陶瓷或不可生物降解的合成聚合物，或者由金属、陶瓷或不可生物降解的合成聚合物组成，如塑料或聚四氟乙烯(ptfe，teflon(商标))，或可生物降解的聚合物，如胶原、透明质酸、聚乳酸或聚氨酯。医疗装置优选为留置装置或植入物，其将在体内停留数天、数周、数月或数年。
23.根据本发明的用于用途的组合物包含纤维蛋白原。组合物中的纤维蛋白原可以是血浆纤维蛋白原(血浆fib)，它是健康个体血液中存在的所有不同纤维蛋白原变体的混合物；或者它可以是从血浆(或血浆纤维蛋白原)中分离的或通过重组蛋白生产技术生产的这些特异性纤维蛋白原变体中一者或多者的制剂。组合物中的纤维蛋白原优选包含人血浆纤维蛋白原、人wt纤维蛋白原、人纤维蛋白原γ
′
、人纤维蛋白原α延伸变体或人纤维蛋白原α截短变体。在一个实施方案中，组合物中的纤维蛋白原由人血浆纤维蛋白原、人wt纤维蛋白原、人纤维蛋白原γ
′
变体、人纤维蛋白原α延伸变体或人纤维蛋白原α截短变体组成。人纤维蛋白原是指具有在大多数人体中发现的氨基酸序列的纤维蛋白原。
24.血浆纤维蛋白原是指从血浆中分离的纤维蛋白原，典型地包括由选择性剪接、蛋白水解降解或翻译后修饰产生的天然纤维蛋白原变体的混合物。血浆纤维蛋白原可能来自一个个体，也可能来自多个个体。优选地，血浆纤维蛋白原具有高纯度，即包括在包括至少95％w/w、至少97％w/w或至少98％w/w血浆纤维蛋白原的组合物中。纯度可以由凝结性决
定。
25.wt纤维蛋白原是指人纤维蛋白原的成熟的主要形式，占循环中血浆纤维蛋白原总量的60-80％，具有610个氨基酸的aα链、461个氨基酸的bβ链和411个氨基酸的γ链。在文献中，这种形式的纤维蛋白原也被称为高分子量(hmw)纤维蛋白原或完整纤维蛋白原。纤维蛋白原γ
′
变体具有两条α多肽链、两条β多肽链和两条γ多肽链，其中γ多肽链中的至少一条是γ
′
多肽链。在人类中，γ
′
多肽链有427个氨基酸。如果纤维蛋白原分子包含一条wtγ多肽链(γ411)和一条γ
′
多肽链(γ427)，则这种变体在此被称为纤维蛋白原γ
′
异二聚体或fibγ427/411。如果两条γ多肽链都是γ
′
型(γ427)，则这种变体被称为纤维蛋白原γ
′
同二聚体或fibγ427/427。根据本发明的用于用途的组合物可以包括γ
′
变体的混合物(诸如纤维蛋白原γ
′
异二聚体和同二聚体的混合物)或由其组成，或者它可以包括一种类型的γ
′
变体或由其组成。
26.纤维蛋白原α延伸变体具有两条α多肽链(其中α多肽链中的至少一者是α延伸多肽链)、两条β多肽链和两条γ多肽链(其中γ多肽链中的至少一者是γ
′
多肽链)。在人类中，α延伸的多肽链有847个氨基酸。如果纤维蛋白原分子包括一条wtα多肽链(aα610)和一条α延伸多肽链(aα847)，则这种变体在此被称为纤维蛋白原α延伸异二聚体或rhfib aα847/aα610。如果两条α多肽链都是α延伸型(aα847)，则这种变体被称为纤维蛋白原α延伸同二聚体或fib aα847/847。根据本发明的用于用途的组合物可以包括α延伸变体的混合物(诸如纤维蛋白原α延伸异二聚体和同二聚体的混合物)或由其组成，或者它可以包括一种类型的α延伸变体或由其组成。
27.纤维蛋白原α截短变体具有两条α多肽链(其中α多肽链中的至少一者在第251位的氨基酸与第610位的羧基末端氨基酸之间被截短)、两条β多肽链和两条γ多肽链。如果纤维蛋白原分子包含一条wtα链(aα610)和一条截短的α多肽链(aα《610且》251)，则这种变体在此被称为纤维蛋白原α截短的异二聚体或fib aα610/截短的》251(当从血浆中分离时，在文献中也被称为lmw纤维蛋白原)。如果两条α多肽链都是α截短型(aα《610和》251)，则这种变体被称为纤维蛋白原α截短的同二聚体或纤维蛋白aα截短型(当从血浆中分离时，在文献中也被称为lmw
′
纤维蛋白原)。已经公开了纤维蛋白原的氨基酸序列，参见例如wo2010/004004中的α、β和γ链及其变体的序列。
28.根据本发明的用于用途的组合物可以包括α截短变体的混合物(例如纤维蛋白原α截短异二聚体和同二聚体的混合物)或由其组成，或者它可以包括一种类型的α截短变体或由其组成。
29.将α链变体(延伸的或截短的)与γ
′
变体结合的纤维蛋白原，包括对于两种变体多肽链都是异二聚体、对于α或γ变体是异二聚体以及对于两种变体多肽链都是同二聚体的纤维蛋白原，可以用于根据本发明的用于用途的组合物中。
30.组合物中的纤维蛋白原可以通过本领域已知的方法获得。例如，血浆纤维蛋白原可以通过从血浆中分离获得，或者它可以在商业上获得，例如从英国斯旺西的enzyme research labs以fib 3或fib 1获得。优选地，使用纯化的血浆纤维蛋白原，例如至少95％的可凝结的纤溶酶原耗尽的纤维蛋白原。具体的纤维蛋白原变体可以通过从血浆或从市售血浆纤维蛋白原中纯化获得。可替换地，具体的纤维蛋白原变体可以通过重组生产获得，例如通过编码基因组或cdna的克隆或化学合成，随后使用宿主细胞或细胞培养系统诸如哺乳
动物或人细胞培养系统进行转染。蛋白质的重组生产比使用血浆来源的材料有许多优点。这些优点包括其优选的安全特性，以纯粹的方式制造变体的可能性，以及存在无限供应的事实。
31.为了以经济可行的方式生产它，需要完整的、功能性的纤维蛋白原或其变体的高表达水平。此外，对于特定的应用，需要适当的翻译后修饰(例如糖基化)。因此，在本发明的一个实施方案中，对于药物标准，纤维蛋白原优选在哺乳动物细胞培养系统中产生，诸如在幼仓鼠肾(bhk)细胞、nso细胞、sp2/0细胞、per.c6细胞、fiek293细胞、昆虫细胞、中国火烈鸟卵巢(cfio)细胞或非洲绿猴来源的cos细胞中产生。在一个优选实施方案中，根据本发明的用于用途的组合物中的哺乳动物纤维蛋白原在cho细胞中产生。
32.在一个优选实施方案中，根据本发明的用于用途的组合物中的纤维蛋白原由人纤维蛋白原γ
′
组成，人纤维蛋白原γ
′
优选呈其同二聚体形式并且优选重组产生。
33.在另一个优选实施方案中，根据本发明的用于用途的组合物中的纤维蛋白原由优选呈其同二聚体形式延伸的重组人纤维蛋白原α组成。
34.在另一个优选实施方案中，根据本发明的用于用途的组合物中的纤维蛋白原由重组人纤维蛋白原组成，所述重组人纤维蛋白原将γ
′
多肽链与α延伸多肽链结合，对于γ和α变体多肽链都优选呈其同二聚体形式。
35.组合物可以用于在植入前预先涂覆用于植入的医疗装置，或在包扎或封闭前涂覆伤口表面。与未涂覆的表面相比，用组合物(预先)涂覆增加了细菌对体内抗生素的敏感性。涂层可以是薄的，诸如薄膜，也可以是厚的，包括几层。该组合物可以制成气雾剂、滴剂、干粉、乳剂、泡沫剂、凝胶剂、软膏剂、糊剂、油膏剂、半凝胶剂、喷雾剂或混悬剂。优选地，组合物被配制成喷雾剂、糊剂或凝胶剂。
36.涂层可以是连续的或不连续的。可以通过在37℃与含10-100μg/ml纤维蛋白原的pbs中的纤维蛋白原溶液一起温育几个小时，或者通过在室温下喷洒浓度为100-1000μg/ml的溶液，任选与凝血酶溶液组合，来进行医疗装置的预先涂覆。伤口或组织表面的原位涂覆可以通过喷洒含有1-50mg/ml的纤维蛋白原溶液(任选地与凝血酶溶液结合)来进行。典型地，每平方厘米涂覆表面0.1-1ml的涂覆溶液就足够了。为了确保最终涂层在医疗装置或细胞组织的整个表面上的均匀功效，组合物优选均匀分布在医疗装置或组织的给定宽度上，使得待涂覆表面的每单位面积的纤维蛋白原浓度变化至多50％，诸如至多25％，诸如至多10％。在一个实施方案中，涂覆溶液包括至少1μg/ml、至少5μg/ml、至少10μg/ml、至少25μg/ml或至少50μg/ml的纤维蛋白原。
37.可以使用涂药器、敷料、伤口填塞物、绷带或药签将组合物施用于医疗装置或伤口组织。
38.根据本发明的方法增强了微生物对抗微生物化合物的敏感性或易感性。与未使用该组合物的对照情况相比，敏感性的增强可以以多种方式反映，诸如通过较慢的生长或细胞死亡，这可能是显而易见的，例如通过较低的干重、菌落形成单位(cfu)的减少、代谢活性的降低。在一个实施例中，cfu的减少在1个对数至5个对数之间。在另一个实施方案中，在小鼠实验中，抗生素敏感性明显增加，当使用组合物时，从6个对数或更多减少到0cfu，如果不使用组合物，仅减少3个对数。与不含纤维蛋白原的对照组相比，治愈率可提高至少25％。在另一个实施方案中，治愈率增加了5％至100％、或5％至60％、或60％至100％。
39.以这种方式可能对抗生素更敏感的细菌是革兰氏阳性或革兰氏阴性、厌氧、兼性厌氧或需氧细菌。合适的细菌的实例包括属于不动杆菌属、芽孢杆菌属、拟杆菌属、伯克霍尔德氏菌属、弯曲杆菌属、梭菌属、肠球菌属、埃希氏菌属、克雷伯氏菌属、李斯特菌属、分枝杆菌属、奈瑟氏球菌属、假单胞菌属、沙门氏菌属、耶尔森氏菌属、葡萄球菌属和链球菌属的细菌。特别是众所周知的抗生素耐药性和抗生素易感性低的种类，诸如鲍曼不动杆菌、芽孢杆菌、拟杆菌、洋葱伯克霍尔德氏菌、弯曲杆菌、艰难梭菌、粪肠球菌、大肠杆菌、肺炎克雷伯氏菌、李斯特菌、结核分枝杆菌、淋病奈瑟菌、绿脓杆菌、沙门氏菌、耶尔森氏菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、变异链球菌和化脓性链球菌。
40.优选地，细菌属于假单胞菌属、葡萄球菌属或链球菌属。更优选地，细菌是金黄色葡萄球菌菌株，包括耐氨苄青霉素金黄色葡萄球菌、耐万古霉素金黄色葡萄球菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(诸如金黄色葡萄球菌300wt或金黄色葡萄球菌43300)、耐苯唑西林金黄色葡萄球菌和多重耐药金黄色葡萄球菌。
41.根据本发明的用于用途的组合物可以有利地用于治疗或预防任何感染，涉及在个体体内不正常存在或以异常量存在的微生物的入侵或繁殖。感染可能是亚临床的，没有症状，也可能是临床的，有明显的症状。可以治疗或预防的感染包括菌血症、骨感染、胸部感染、心内膜炎、硬膜外脓肿、生殖器感染、脑膜炎、骨关节感染、腹膜炎、呼吸道感染，诸如肺炎；假体关节感染、皮肤感染，诸如痤疮和酒渣鼻；败血症、脓毒性血栓性静脉炎、中毒性休克综合征、尿路感染和伤口感染。
42.根据本发明的纤维蛋白原组合物可以包括治疗有效量或预防有效量的纤维蛋白原。治疗有效量是指在必要的剂量和时间段内达到所需治疗效果的有效量。变体纤维蛋白原或其组合物的治疗有效量可以由本领域技术人员确定，并且可以根据诸如个体的疾病状态、年龄、性别和体重以及哺乳动物纤维蛋白原或组合物在个体中引发所需反应的能力等因素而变化。治疗有效量也是本发明的变体纤维蛋白原或组合物的任何毒性或有害作用被治疗有益作用超过的量。预防有效量是指在必要的剂量和时间段内达到所需预防效果的有效量。典型地，由于预防剂量用于患病前或患病早期的受试者，因此预防有效量将低于治疗有效量。
43.用于预先涂覆装置的组合物的纤维蛋白原含量以组合物的重量计优选为0.0001％w/w至0.1w/w，诸如0.001％w/w至0.05％w/w、0.001％w/w至0.1％w/w、或0.005％w/w至0.1％w/w。用于涂覆伤口或组织表面的组合物的纤维蛋白原含量以组合物的重量计优选为0.01％w/w至10％w/w，诸如0.1％w/w至5％w/w。
44.在本发明的另一个实施方案中，根据本发明的纤维蛋白原组合物是药物组合物或制剂，优选无菌的。因此，根据本发明的用于用途的组合物可以还包括药学上可接受的赋形剂，诸如抗粘附剂、抗氧化剂、粘合剂、填充剂、载体、着色剂、崩解剂、稀释剂、填充剂、调味剂、润滑剂、防腐剂、溶剂、表面活性剂、甜味剂、运载体或湿润剂。赋形剂不应不利地影响制剂中组合物的稳定性。术语“药学上可接受的”是指适于制备药物组合物，诸如通常被认为是安全无毒的。
45.可用作药学上可接受的赋形剂的材料的一些实例包括缓冲剂，诸如但不限于氢氧化镁和氢氧化铝；海藻酸；无热原的水；等渗盐水；林格氏溶液；乙醇和磷酸盐缓冲溶液，以及其他无毒的赋形剂，诸如十二烷基硫酸钠和硬脂酸镁，以及防腐剂和抗氧化剂，它们也可
以存在于组合物中。技术和制剂通常可以在“remington’s pharmaceutical sciences”(meade publishing co.,easton,pa.)中找到。优选地，载体、运载体或稀释剂包括无菌水、无菌等渗盐水、无菌林格氏溶液或无菌乳酸盐溶液，其选择是本领域技术人员熟知的。合适的溶剂包括水、等渗盐水、油酸乙酯、甘油、羟基化蓖麻油、醇如乙醇和磷酸盐缓冲溶液。系统性组合物中溶剂的量可以为80％至约99.95％w/w或w/v。
46.根据本发明的用于用途的组合物可以还包括激活剂，诸如凝血酶或类凝血酶，诸如蛇毒凝血酶或巴曲酶，或者非酶激活剂，诸如结合纤维蛋白原的肽。凝血酶和类凝血酶通过分别从α链和β链裂解纤维蛋白肽a或b，将纤维蛋白原单体转化为纤维蛋白聚合物。裂解的纤维蛋白(原)单体自发地聚合成双链原纤维，该原纤维随后可以生长并形成构成三维纤维蛋白网络的纤维蛋白聚合物。优选地，激活剂是从血浆中分离或重组产生的人凝血酶，最优选呈纯化形式。
47.非酶激活剂是包括至少2个纤维蛋白原结合位点的物质，并且通过与2个不同的纤维蛋白原分子(其具有2个激活剂结合位点，因为纤维蛋白原是对称的二聚体)结合，引入具有类似于凝血酶诱导的纤维蛋白的性质的纤维蛋白原的聚合物形式。
48.根据本发明的用于用途的组合物可以用作抗微生物剂佐剂，并且可以与抗微生物剂结合使用，以降低病原体对这种抗微生物剂的耐药性。抗微生物剂可以与包括纤维蛋白原的组合物分开施用或一起施用。如果分别施用，则抗微生物剂和纤维蛋白原可以同时施用，或者在彼此之前或之后施用。如果抗微生物剂和纤维蛋白原一起施用，则它们可以存在于单独的组合物中或者组合在一个组合物中。因此，根据本发明的用于用途的组合物还可以还包括一种或多种抗微生物剂，包括抗生素剂、抗真菌剂、抗酵母剂和抗病毒剂。在一个实施方案中，根据本发明的方法的用于用途的组合物与抗生素一起单独地或在同一组合物中供应。
49.该组合物可以用于增加任何有需要的个体的抗微生物剂易感性，个体诸如人类和哺乳动物，包括羊驼、野牛、水牛、猫、牛、鹿、狗、驴、马、小鼠、猪、兔和羊。对于动物的治疗，典型地优选使用人纤维蛋白原的动物等同物。
50.另一方面，本发明涉及一种涂覆有纤维蛋白原的医疗装置，特别是留置装置或植入物，其将在体内停留数天、数周、数月或数年。医疗装置的实例如上所述，并且包括导管、气管内管、肠饲管、心脏瓣膜、关节置换物、支架、气管造口术和伤口引流管。该装置可以是供应的或商业上获得的预先涂覆的，或者可以是在使用前(诸如在使用前几小时、几分钟或几秒钟)预先涂覆的。
51.在又另一方面，本发明涉及一种用于增加微生物的抗微生物剂易感性的方法。在一个实施方案中，该方法包括向人或动物个体提供包括纤维蛋白原的组合物，以预防或治疗个体中微生物的感染，任选地与抗微生物剂结合以降低微生物对抗微生物剂的耐药性。在另一个实施方案中，该方法包括将纤维蛋白原组合物施用到医疗装置或伤口床。在一个实施方案中，在将医疗装置植入或引入人类或动物个体体内之前，将纤维蛋白原组合物离体施用于医疗装置。包括纤维蛋白原的组合物可以是上面已经描述的根据本发明的供使用的任何组合物。
52.本领域技术人员将会理解，所提及的用于使用组合物的实施方案和优选实施方案也可以施用于医疗装置和用于增加微生物的抗微生物剂易感性的方法，反之亦然。
53.实施例
54.材料和方法
55.细菌
56.耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(mrsa)菌株usa 300和usa 43300获自attcc，并常规生长于37℃的胰蛋白酶大豆肉汤(tsb)或胰蛋白酶大豆琼脂(tsa)平板培养基中。
57.纤维蛋白原
58.纯化的血浆纤维蛋白原(血浆fib)从英国斯旺西的enzyme research labs获得。rhfib wt和rhfibγ
′
和rhfibα延伸和rhfibγ
′
/α延伸通过标准重组dna蛋白质生产技术制备。将编码纤维蛋白原aα610(wt)链、aα847(α延伸)链、bβ链、γ411(γ)链和γ427(γ
′
链)的cdna序列克隆到pcdna 3.1质粒(美国加利福尼亚州卡尔斯巴德的invitrogen)中，以构建不同纤维蛋白原链的表达载体。通过使用hek 293细胞(life technologies expi293系统)根据制造商的说明进行瞬时表达，或者通过在cho细胞中进行稳定表达，使用含有cdna的编码aα、bβ和γ链的表达质粒的组合来生产不同的完全组装的重组人类种类。cho细胞在proch05细胞培养基(荷兰勒斯登的westburg)中生长，并根据制造商的说明使用amaxa装置(荷兰勒斯登的westburg)进行电穿孔转染。使用杀稻瘟菌素和博莱霉素作为选择标记，使用先前描述的elisa方法选择产生纤维蛋白原的克隆(hoegee-de nobel e.等人，thrombosis haemostasis 1988dec22；60(3):415-8)。选择的cho克隆在cd forticho细胞培养基(荷兰布莱斯维克的life technologies europe)中在37℃和5％co2下生长7至10天。通过离心或过滤收集细胞上清液，并且重组纤维蛋白原变体使用亲和纯化法在gprp柱上纯化，基本上如kuyas c等人所述(thrombosis haemostasis1990jun 28；63(3):439-444)，并在ph7.4的磷酸盐缓冲盐水(pbs)中以2-40mg/ml的浓度配制。
59.刃天青法
60.用于测量细胞代谢活性的刃天青方法如lee a.和jain e.tip biosystems application note an016 rev.1.0mar 2017所述进行。
61.简而言之，基于刃天青的生物膜敏感性分析如下进行。含有1
×
108cfu/ml的usa300金黄色葡萄球菌的工作储备液(od
600
大约0.1au)是通过在tsb培育细菌制备的。在ph7.4的pbs中制备纤维蛋白原稀释液。向96孔组织培养微量滴定板加入90μl的tsb和90μl的纤维蛋白原稀释液。随后，向每个孔加入20μl的金黄色葡萄球菌工作储备液，并在37℃温育24小时，以形成生物膜。用0.9％无菌盐水洗涤平板三次，并且向96孔板加入100μl具有不同浓度抗生素(0-100μg/ml)的阳离子调节的mueller hinton肉汤(camhb)，并在37℃温育24小时。向每个孔加入10μl(样品体积的10％)的alamarblue(刃天青)溶液中，轻轻摇动，并在37℃温育1-4小时。测量570nm和600nm处的吸光度以确定细胞活力。
62.实施例1：金黄色葡萄球菌对不同纤维蛋白原种类的体外粘附
63.结合实验基本上如前所述进行(flick m.等人，blood 2013mar 7；121(10):1783-94)。简而言之，结合测定如下进行：
64.通过在37℃过夜温育，用磷酸盐缓冲盐水(pbs)(0-25μg/ml)中的纤维蛋白原溶液涂覆96孔微量滴定板。洗涤和阻断后，将孔与pbs中的金黄色葡萄球菌usa 300悬浮液(od 600nm大约0.4)在37℃温育2小时。洗涤后，将平板与0.1％结晶紫溶液一起温育30分钟，并且洗涤后，将结合的结晶紫溶解在10％乙酸中，并测量570nm处的吸光度以定量细菌粘附。
65.图1显示金黄色葡萄球菌细菌与纯化的血浆fib、rhfib wt和rhfibα延伸结合，但不与rhfibγ
′
或rhfibα延伸/γ
′
结合。这表明金黄色葡萄球菌对纤维蛋白原的粘附依赖于含有agdv基序的纤维蛋白原γ链(γ411)的羧基末端的存在。不同长度的α链(aα610vsaα847)对金黄色葡萄球菌与纤维蛋白原的结合没有影响。这些结果与文献数据一致。
66.实施例2在预先涂覆有不同纤维蛋白原种类的表面上的体外生物膜形成。
67.在预先涂覆的聚苯乙烯表面上的体外生物膜形成先前已有描述(flarrison jj.et al.2010nature protocols 5,1236-1254)并根据制造商方案使用innovotech(加拿大阿尔伯塔省的edmonton)mbec测定法进行。
68.简而言之，分析如下进行。具有96个peg的96孔微量滴定板的聚苯乙烯盖通过将peg在0.25ml的含有溶解在pbs缓冲液中的浓度为10或100μ升/ml的不同纤维蛋白原种类的溶液中在37℃浸没24小时进行预先涂覆。洗涤后，将预先涂覆的peg(和未预先涂覆的对照)与在tsb 1％葡萄糖中的约10e6 cfu/ml的细菌悬浮液在35℃温育24小时以允许生物膜形成。在洗涤peg以去除浮游细菌后，将具有生物膜的peg与camfib在37℃温育24小时。洗涤后，通过温和的超声处理将活细菌从表面分离，并通过铺在tsa平板上来确定存活细菌的数量。对菌落进行计数以确定cfu/peg表面。结果如图2所示。
69.与涂覆有rhfib wt或rhfibα延伸的peg相比，在未预先涂覆的对照和rhfibγ
′
预先涂覆的peg上观察到大约1个对数的存活细菌的少量减少。
70.鉴于在实施例1(和文献)中观察到的结合的非常显著的差异，这些结果是令人惊讶的，这些差异证明结合强烈依赖于含有agdv结合基序的纤维蛋白原的羧基末端的可用性。结果表明，结合到生物膜中的存活细菌的数量仅略微依赖于与预先涂覆的纤维蛋白原的相互作用。
71.总之，用纤维蛋白原对表面进行体外预先涂覆不会显著增加或减少在这样的表面上形成的生物膜中的存活细菌的数量。
72.实施例3：在细菌培养基中存在不同纤维蛋白原种类的情况下，在未预先涂覆表面上的体外生物膜形成。
73.使用上述刃天青测定法确定在表面生物膜形成期间溶液中存在的不同纤维蛋白原种类的影响(与生物膜形成前的预先涂覆表面相比)。
74.向tsb加入浓度在0-250μg/ml之间的纯化血浆fib或rhfibγ
′
，然后用细菌接种这个混合物，随后在37℃温育24小时，以使纤维蛋白原的涂覆和生物膜的形成在聚苯乙烯表面上同时发生。通过在加入刃天青后测量od 570nm来比较在不同条件下形成的生物膜中的存活细菌的数量。
75.结果显示在图3中，并显示出生物膜中存活细菌的数量在所有条件下没有显著差异。然而，与没有纤维蛋白原相比，在存在血浆纤维蛋白的情况下形成的生物膜中观察到存活细菌的少量增加。这些结果非常类似于使用预先涂覆有纤维蛋白原的表面的实施例2中获得的结果，并证实与生物膜相关联的存活细菌的数量在很大程度上与纤维蛋白原无关。
76.实施例4：预先涂覆表面上的体内生物膜形成
77.用不同的纤维蛋白原种类进行预先涂覆对金黄色葡萄球菌usa43300生物膜形成的体内作用基本上如前所述进行(nowakowska j等人，antibiotics 2014,3,378-397)。简而言之，研究如下进行。
78.将聚四氟乙烯笼和未预先涂覆的对照物植入c57bi小鼠的皮下，所述聚四氟乙烯笼通过在37℃用含10μg/ml或100μg/ml rhfib wt或rhfibγ
′
的pbs中的纤维蛋白原溶液培养24小时而预先涂覆。笼感染了大约400cfu金黄色葡萄球菌/笼。植入两天后，取出笼，并且用温和的超声处理将细菌从表面分离然后铺在tsa平板上来测量粘附存活细菌，并且对菌落进行计数以确定每个笼中cfu的数量。
79.图4中的结果显示，在未预先涂覆的笼与用rhfib wt预先涂覆的笼之间，cfu的数量没有差异。观察到与未预先涂覆和rhfib wt预先涂覆的笼相比涂覆有rhfibγ
′
的笼中cfu的数量的小的临床上不显著的减少(大约1个对数)。
80.这些结果表明，在体内，在未预先涂覆的笼上和在预先涂覆有rhfib wt的笼上形成的生物膜中的粘附性细菌的数量实际上是相同的，而预先涂覆有rhfibγ
′
的笼包含的粘附性细菌的数量略低(大约1个对数)。
81.这些体内结果与实施例2和实施例3中的体外结果一致，并支持生物膜中存活的粘附性细菌的数量在很大程度上与纤维蛋白原的预先涂覆无关的发现。
82.实施例5：预先涂覆表面上形成的生物膜的抗生素敏感性的体外分析
83.为了确定用不同纤维蛋白原种类预先涂覆表面对生物膜中细菌抗生素敏感性的影响，如实施例2所述进行体外实验。在与cambfi的温育步骤中，存在不同浓度(0μg/ml至100μg/ml)的万古霉素或氨苄青霉素。抗生素温育后，用温和的超声处理表面以从表面释放细菌，并确定与表面相关联的cfu。
84.结果显示在图5中，并且显示出在未预先涂覆的peg或预先涂覆有rhfibγ
′
或rhfibα延伸的peg上形成的金黄色葡萄球菌usa300生物膜与在预先涂覆有rhfib wt的peg上形成的生物膜相比，对万古霉素和氨苄青霉素更敏感。
85.这些结果表明，在未预先涂覆的peg上或在预先涂覆有rhfibγ
′
或rhfibα延伸的peg上形成的生物膜比在rhfib wt预先涂覆的peg上形成的生物膜对抗生素更敏感。换句话说，在体外，生物膜的抗生素敏感性通过使用rhfibγ
′
和rhfibα延伸而增加。
86.实施例6：在未预先涂覆表面上形成的生物膜的抗生素敏感性的体外分析
87.为了确定生物膜形成期间溶液中不同纤维蛋白原种类及其混合物的存在对生物膜中细菌的抗生素敏感性的影响，如实施例3所述，使用上述刃天青测定法进行体外实验。从570nm和600nm处的od测量值计算与对照组相比的存活细胞百分比，所述对照组包含0μg/ml抗生素。
88.对于纯化的血浆fib，图6a中的万古霉素结果显示与对照组相比有更多的存活细菌。这表明，如果存在血浆fib，则生物膜对万古霉素的耐药性与对照组相比增加了。对于氨苄青霉素，观察到类似的结果(图6c)。
89.对于rhfibγ
′
，图6b中的万古霉素结果显示，与对照组相比，存活细菌的数量相似。这表明，如果存在rhfibγ
′
，则生物膜对万古霉素的耐药性与对照组相比没有改变。对于氨苄青霉素(图6d)，与对照组相比，较高rhfibγ
′
浓度导致较低的活菌数。这表明，在体外，使用rhfibγ
′
可以增加氨苄青霉素耐药性菌株对氨苄青霉素的易感性。
90.图6e中的结果显示，与仅预先涂覆有血浆fib的表面相比，在细菌培养基中用1mg/ml的血浆fib/rhfibγ
′
的50/50混合物体外在未预先涂覆的表面上形成并用万古霉素处理的生物膜含有显著更少的存活的金黄色葡萄球菌细菌。这个结果表明rhfibγ
′
能够增加抗
生素易感性，在wt纤维蛋白原存在时也是如此，这使其具有临床相关性。
91.实施例7：预先涂覆表面上生物膜的抗生素敏感性的体内分析
92.为了确定用不同纤维蛋白原种类预先涂覆的表面对生物膜中细菌的抗生素敏感性的体内影响，如实施例4中所述在小鼠中进行研究，并添加预防性和治疗性达托霉素处理。将未预先涂覆或预先涂覆10μg/ml或100μg/ml纯化血浆fib、rhfib wt或rhfibγ
′
的聚四氟乙烯笼植入c57bi小鼠的皮下。
93.在植入和感染前30分钟，用达托霉素(50mg/kg)处理预防组中的小鼠。在植入和感染后24小时，用达托霉素(50mg/kg)处理治疗组中的小鼠。用剂量为400-600cfu/笼的金黄色葡萄球菌43300感染小鼠。在感染后48小时时，笼被移出、清洗并用超声波处理以从笼表面释放细菌。cfu确定与笼相关联的cfu。
94.治疗性处理(图7a)和预防性处理(图7b)的结果清楚地表明，尽管用达托霉素进行了预防性或治疗性处理，但所有(100％)未预先涂覆的笼(对照)都含有大量存活的浮游和粘附的金黄色葡萄球菌细菌。这表明在体内未预先涂覆表面上形成的生物膜对抗生素治疗具有高度耐药性。这与实施例5的体外结果相反，实施例5的体外结果是，在未预先涂覆表面上体外形成的生物膜对抗生素处理敏感。显然，体外结果对体内结果没有预测价值。
95.不希望被理论所束缚，对这种差异的解释可以是，在体内实验中，宿主细胞外蛋白(例如纤连蛋白)粘附到植入的未预先涂覆的笼，并且这导致使细菌对抗生素治疗具有耐药性的生物膜。
96.在用达托霉素进行治疗性(图7a)或预防性(图7b)处理后，预先涂覆有血浆fib(10μg/ml和100μg/ml涂层)的笼中仅有50-60％含有存活的粘附金黄色葡萄球菌细菌。这表明，在预先涂覆有血浆fib的表面上体内形成的生物膜仅提供了对抗生素治疗的部分耐药性。预先涂覆有rhfib wt(10μg/ml和100μg/ml)并用达托霉素治疗(图7a)的笼观察到类似的结果，56-67％的笼含有存活细菌。这些结果似乎与实施例5中的体外发现相反，这可能是由于与体内宿主防御机制的协同作用。
97.在用达托霉素进行预防性(图7b)或治疗性(图7a)处理后，预先涂覆有rhfibγ
′
(10μg/ml和100μg/ml)的笼显示出存活细菌的最强减少。图7b显示，预先涂覆有rhfibγ
′
并用达托霉素预防性处理的笼中仅7％含有存活细菌(未预先涂覆的笼为100％)。当使用治疗性达托霉素治疗时(图7a)，预先涂覆有rhfibγ
′
的笼中有37％含有存活细菌(未预先涂覆的为100％，而血浆fib/rhfib wt涂覆的为55-67％)。rhfibγ
′
预先涂覆对生物膜中细菌抗生素处理敏感性的这种令人惊讶的强体内效应(5-6个对数的减少)似乎与体外结果(实施例5)一致，该体外结果显示在rhfibγ
′
预先涂覆的表面上体外形成的生物膜中的细菌对抗生素的敏感性增加。然而，与体外效果相比，体内观察到的效果更加明显。
98.图7a和图7b中的数据表明，用纤维蛋白原预先涂覆医疗装置或涂覆组织表面增加了生物膜相关联的细菌对杀菌治疗诸如抗生素治疗的敏感性。用rhfibγ
′
的结果更明显。
99.实施例8：不同葡萄球菌的生物膜的抗生素敏感性的体内分析。
100.为了确定用不同纤维蛋白原种类的预先涂覆的表面对由几种葡萄球菌形成的生物膜的抗生素敏感性的体内影响，如实施例7所述在小鼠中进行研究，并预防性添加达托霉素。包括的种类中的一种是表皮葡萄球菌，它通过其β链结合纤维蛋白原。rh fib wt和rhfibγ
′
中的β链是相同的。
101.将预先涂覆有10μg/ml或100μg/ml纯化血浆fib、rhfib wt或rhfibγ
′
的聚四氟乙烯笼植入c57bi小鼠的皮下。未涂覆的笼作为对照物。在植入和感染前30分钟，用达托霉素(50mg/kg)处理小鼠。细菌剂量为400-600cfu/笼。在感染后48小时时，笼被移出、清洗并用超声波处理以从笼表面释放细菌。确定与笼相关联的cfu。结果如表1所示，并显示出预先涂覆有任何类型的纤维蛋白原比不预先涂覆效果更好。
102.表1
[0103][0104]
结果显示，当用纤维蛋白原预先涂覆生物膜表面时，与没有涂覆相比，生物膜中的细菌显示出增加的敏感性，并因此对抗生素的耐药性较低。当用rhfibγ
′
预先涂覆表面时，可获得最佳效果，对表皮葡萄球菌生物膜也是如此。
[0105]
实施例9：假单胞菌生物膜的抗生素敏感性的体内分析
[0106]
用铜绿假单胞菌菌株pa01重复实施例8并预防性添加妥布霉素，以确定用纤维蛋白原预先涂覆表面对革兰氏阴性细菌的生物膜的抗生素敏感性的体内影响。铜绿假单胞菌是一种革兰氏阴性细菌，没有已知的纤维蛋白原结合位点。使用妥布霉素(50mg/kg)代替达托霉素，因为妥布霉素典型地用作抗革兰氏阴性细菌的抗生素。结果如表2所示，并显示出预先涂覆有纤维蛋白原比不预先涂覆效果更好。当用纤维蛋白原预先涂覆生物膜表面时，与没有涂覆相比，生物膜中的革兰氏阴性细菌对抗生素的敏感性增加。
[0107]
表2
[0108] 没有存活粘附性铜绿假单胞菌的小鼠％ 妥布霉素(50mg/kg)预先涂覆 无50rhfibγ
′
100